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纤维素酶范文1
纤维素酶分为葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶或纤维二糖酶、β－葡萄糖苷酶。
纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单体酶，而是起协同作用的多组分酶系，是一种复合酶，主要由外切β－葡聚糖酶、内切β－葡聚糖酶和β－葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶。作用于纤维素以及从纤维素衍生出来的产物。微生物纤维素酶在转化不溶性纤维素成葡萄糖以及在果蔬汁中破坏细胞壁从而提高果汁得率等方面具有非常重要的意义。
（来源：文章屋网 ）
纤维素酶范文2
关键字:担子菌;纤维素酶;分离纯化
中图分类号:Q814.1 文献标识码:A
文章编号:1674-0432(2010)-05-0030-2
国内外对纤维素酶纯化研究主要集中于木霉和嗜热毛壳菌等微生物所产纤维素酶的纯化,对担子菌纤维素酶纯化研究较少。国家粮食局科学研究院唐芳等筛选到高产纤维素担子菌LKY01菌株。本实验将此菌产纤维素酶进一步分离纯化。纯化担子菌LKY01纤维素酶属于外分泌蛋白,将担子菌LKY01纤维素酶纯化后用于食品业、饲料业、制药业相对其他菌种所产纤维素酶安全性较高。纤维素酶是一组相互协作的酶系,菌种来源不同,酶系组成亦不同;真菌纤维素酶为糖蛋白,且具有多型性,这些特点使得纤维素酶在分离纯化过程中难度增大。国内外多采取硫酸铵沉淀法得到粗酶液,也有少数使用双水相萃取技术和微晶纤维素亲和技术对纤维素酶进行初步分离,国内也有报道采用超临界萃取法提取纤维素酶。本实验使用硫酸铵分级沉淀法获得粗酶液。在除盐过程中,为避免透析袋被纤维素酶降解,本实验采用超滤法除盐,较常用的透析法方便省时。
一、材料与方法
(一)材料
1.菌种:本实验室筛选高产纤维素酶担子菌菌种LKY01。
2.纯化仪器:AKTAbasic层析系统产于Amersham公司。
(二)方法
1.纤维素酶的纯化方法。
(1)粗酶液的制备。自筛菌株液体发酵培养7d,然后将酶液用两层纱布过滤后收集,4℃,5000r/min,离心10min。所得上清液即为粗酶液。
(2)硫酸铵分级沉淀将所提取的粗酶液加入固体硫酸铵至30%饱和度,室温磁力搅拌2h,5000r/min,离心10min,收集上清;将上清收集液再加入固体硫酸铵至80%饱和度,4℃静置过夜,5000r/min离心10min,收集沉淀,用适量的缓冲液A(50mmol/LTris-Hcl缓冲液,pH值8.0)将沉淀蛋白溶解。
(3)超滤除盐浓缩。上述的硫酸铵盐析的蛋白回溶液,经0.45mm滤膜过滤后用截留分子量为10KD的超滤离心管脱盐浓缩,5000r/min,离心20min后,加缓冲液A稀释后再离心脱盐,重复3次。
(4)DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子柱层析。将超滤浓缩的蛋白溶液上样于经缓冲液A平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子柱(1.6×26cm),酶蛋白先用5倍柱床体积的缓冲液溶液A洗脱至A280不变后,再用缓冲液A和含1mol/L NaCl的相同缓冲液进行梯度洗脱。将每管进行活性测定,收集所有出峰的酶液。
(5)Superdex-75分子筛层析 将离子交换层析后收集的酶液超滤浓缩,施于经缓冲液A平衡好的Superdex-75分子筛层析柱(1.6×62cm),用缓冲液A洗脱,流速为0.3mL/min,2.5min收集1管,将每管进行活性测定。
2.检测方法。
(1)酶活测定。羧甲基纤维素酶活力(CMC)测定 取0.5mL酶稀释液,于25mL刻度试管中,加入0.5mL 2%的CMC溶液(溶于pH4.80.10mol/L 柠檬酸缓冲液),摇匀,于50℃恒温水浴反应30min,加入3.0mL DNS溶液,沸水浴5min,冷却后,定容至25mL,于540nm波长比色。
滤纸酶活力(FPA)测定 取0.5ml酶稀释液,于25mL刻度试管中,加入1.0mL 0.10mol/L 柠檬酸缓冲液(pH4.8),再加入折叠的Whatman No.1纸1张(6cm×1cm,约50mg),于50℃恒温水浴反应60min,加入3.0mL DNS溶液,沸水浴5min,冷却后,定容至25ml,在540nm波长比色。酶活力单位定义:在规定的实验条件下,1.0mL酶液 30min酶解底物产生1μmol还原糖为一个国际单位(IU)。
(2)蛋白质含量测定蛋白质含量测定参照Bradford的方法(1976),以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白。
(3)蛋白质纯度鉴定采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定蛋白质纯度。参照Michaud的方法(1993)
(4)蛋白质分子量的测定SDS-PAGE法测定蛋白质分子量参照Michaud等的方法(1993),结果用UVBand处理系统分析。
二、结果
(一)硫酸铵分级沉淀
30%硫酸铵盐析后,离心上清液FPA酶比活力为0.33U/mg提纯倍数为2.20倍,CMC酶比活力为2.71U/mg提纯倍数为1.46倍。80%硫酸铵盐析后,离心沉淀回溶液FPA酶比活力为0.27U/mg提纯倍数为1.80倍,CMC酶比活力为2.31U/mg提纯倍数为1.24倍。此过程中硫酸铵盐对酶活测值有很大影响。
(二)超滤除盐浓缩
上述的硫酸铵盐析的蛋白回溶液,经0.45mm滤膜过滤后用截留分子量为10KD的超滤离心管脱盐浓缩,总体积由173ml浓缩至151ml。
(三)DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析
在离子交换层析结果中出现3个平衡峰和5个洗脱峰,收集各峰测酶活,从洗脱液中选出酶活相对高的洗脱峰峰3各管做电泳。离子交换层析法分离担子菌发酵液并不能将其中各种酶完全分开,但各峰中含蛋白种类减少。洗脱峰峰3对应的电泳条带相对少,酶活相对高,因此将洗脱峰峰3定为下一步分离的目标峰。此过程中洗脱峰峰3的FPA酶比活力为2.03U/mg提纯倍数为13.56倍,CMC酶比活力为13.47U/mg提纯倍数为7.24倍。
(四)Superdex75凝胶层析
DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析后,将蛋白峰3各管收集,合并浓缩至约0.5mL后进行分子筛层析。Superdex 75凝胶层析检测结果有2个主要蛋白峰。将收集液分别测定酶活和电泳蛋白纯度鉴定,FPA酶和CMC酶活主要集中在峰2中。电泳中两个蛋白其分子量分别为36.2kd和34.6kd。由于主峰2中两各蛋白分子量接近,很难在凝胶层析中分开,SDS-PAGE中可以很好的分开。此过程中峰3的FPA酶比活力为4.03U/mg提纯倍数为26.86倍,CMC酶比活力为45.43U/mg提纯倍数为24.42倍。
(五)纤维素酶的各纯化步骤结果
三、结论
本实验将担子菌LKY01 7天发酵液经硫酸铵分级沉淀,0.45mm滤膜过滤,超滤管超滤除盐,DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱分离,Superdex 75分子筛层析再次分离,得到一定纯化程度的纤维素酶,FPA酶和CMC酶的纯化倍数为26.86倍和24.42倍,经测酶活及电泳实验分析,FPA酶和CMC酶分子量为36.2kd和34.6kd。两种酶属于新酶,未见国内外报道。
参考文献
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纤维素酶范文3
【摘要】
目的优选黄芪总黄酮的提取工艺。方法用正交设计法探讨了影响纤维素酶法提取黄芪中总黄酮的主要因素，并确定了最佳提取工艺。结果纤维素酶法提取黄芪总黄酮的最佳工艺条件为:酶解时间为120 min，酶解温度为30℃，酶量为8 mg，pH值为4.5。结论此工艺简单可行，是一条提取黄芪总黄酮类物质的有效途径。
【关键词】 纤维素酶 黄芪 总黄酮 正交设计法
Abstract：ObjectiveTo opmtimize the extraction technics for total flavonoids from Astragalus. MethodsThe orthogonal design was conducted to investigate the main cellulose enzymatic extraction of total flavonoids from Astragalus and the best extraction technics was determined. ResultsThe optimum conditions cellulose enzymatic extraction of total flavonoids from Astragalus were as follows: enzymolysis time 120min， hydrolysis temperature 30 ℃， enzyme volume 8mg， PH value 4.5.ConclusionThis method is simple and feasible. It is an effective way for extraction of total flavonoids from Astragalis.
Key words：Cellulase; Astragalus; Total flavonoids; Orthogonal design
黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus Technology或膜夹黄芪Astragalus membranaceus的干燥根，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌等功效。黄芪中的主要有效成分为多糖、皂苷和黄酮类化合物，其中黄酮类化合物主要包括毛蕊异黄酮(calycosin ) 及其糖苷芒柄花素 (formononetin)和芒柄花苷(ononion) 等［1］ 。研究证实黄芪中的黄酮类成分具有多种药理活性，具有清除氧自由基、抑制脂质过氧化、增强免疫力、抗病毒以及促进细胞增殖的作用［2～3］。
近年来，酶技术应用于中草药有效成分的分离提取取得了不少新的成果，尤其应用纤维素酶可破坏细胞壁的致密结构，加速药用有效成分的溶出，提高药用有效成分的提取率。酶解过程的实质是通过酶解反应促进传质过程。纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称。纤维素是黄芪细胞壁的主要成分，亦是胞内黄酮等大分子溶出的主要屏障，利用纤维素酶水解细胞壁，利于胞内成分溶出［4～9］。但将纤维素酶应用于提取黄芪中总黄酮的研究鲜见报道。本实验将上海伯奥生物科技有限公司提供的绿色木酶（主要成分为纤维素酶，以下简称纤维素酶）用于黄芪总黄酮的提取，应用正交设计优化酶法提取黄芪总黄酮的工艺条件，探讨各因素对黄芪总黄酮提取率的影响，以期达到提高提取率、缩短提取时间、减少能耗和有效保存黄芪总黄酮的生物活性，并为植物酶技术在中药有效成分的提取方面的应用提供依据。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
HH-6恒温水浴锅（江苏金坛市宏华仪器厂）；RE-52CS旋转蒸发器(巩义市英峪予华仪器厂)；予华牌循环水真空泵(河南省巩义市英峪予华仪器厂)；UV1101紫外/可见分光光度仪(上海天美科学仪器有限公司)；AY120电子分析天平（日本岛津公司）；KH-400KDB型高功率数控超声清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；摇摆式高速中药粉碎机(大德中药机械有限公司)。
1.2 试剂
乙醇（无水乙醇）；5%亚硝酸钠；10%硝酸铝；4%氢氧化钠；乙酸（冰醋酸）；无水乙酸钠；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号:050923）， 黄芪购自广州致信中药饮片有限公司，纤维素酶 (活性单位≥15 U／mg)由上海伯奥生物科技有限公司提供。
2 方法与结果
2.1 黄芪总黄酮成分提取
称取纤维素酶8 mg，用pH=4.5的HAc-NaAc缓冲液10 ml混合后与1g黄芪粉末（过50目筛）混合均匀，在30℃ 下处理1 h后加95％ 的乙醇20 ml，在70℃ 下浸提1 h过滤，用20 ml体积分数85％ 的乙醇洗涤残渣过滤，合并滤液，回收乙醇，残渣溶于质量分数为85%的乙醇，定容至25 ml，精密吸取1 ml于25 ml的容量瓶中，30%乙醇定容，得供试品溶液。
2.2 黄芪总黄酮含量的测定
2.2.1 芦丁对照品溶液的制备
准确称取于芦丁对照品10 mg， 置于50 ml 容量瓶中， 加30%的乙醇30 ml， 超声使之溶解， 冷却至室温， 并稀释至刻度， 摇匀， 得浓度为200 μg/ml 的芦丁对照品溶液， 冷藏， 备用。
2.2.2 吸收波长的选择
对照品测定波长的确定：取对照品溶液1 ml，按标准曲线项下的方法进行，在400～700 nm波长范围内扫描，结果在500 nm波长处为最大吸收。样品测定波长的确定：取样品的乙醇提取液1 ml，按标准曲线项下的方法进行，在400～700 nm波长范围内扫描，结果在500 nm波长处有最大吸收。
2.2.3 标准曲线制备
精密称取芦丁对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml分别至25 ml容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.3 ml，摇匀，放置6 min，加入10%硝酸铝溶液0.3 ml，放置6 min，加入1 mol氢氧化钠溶液4 ml，分别用30%的乙醇定容，放置15 min，置比色皿中，在500 nm波长处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线。经回归统计，得标准曲线方程：A=0.010 9C-0.001 3，r=0.999 8。浓度在0～400 μg/ml范围内与吸光值线性关系良好。
2.3 黄芪中总黄酮提取率的测定
取黄芪中总黄酮提取液用紫外分光光度计于500nm下测出吸光度A代入以下回归方程式及下列公式，计算出黄芪中总黄酮的提取率。 提取率（%）=（C×V×10-6）W，式中V为定容体积（ml），W为黄芪药粉质量（g），C为黄芪提取液浓度（μg/ml）。
2.4 单因素实验及正交实验酶法提取的整个工艺分为酶解和浸提两部分，准确称取黄芪1g，加入缓冲溶液和一定比例的酶，黄芪经酶解后在相同的条件下浸提，过滤，按标准曲线方法测定吸光度。
2.4.1 考察酶解温度对总黄酮提取率的影响
称取纤维素酶8 mg，用pH=4.5的HAc-NaAc缓冲液10 ml混合后与1 g黄芪粉末（过50目筛）混合均匀，分别在30，35，40，45，50，55℃ 下处理1 h后加95％ 的乙醇20 ml，在70℃ 下浸提1 h过滤，用20 ml体积分数85％ 的乙醇洗涤残渣过滤，合并滤液，回收乙醇，残渣溶于质量分数为85%的乙醇，定容至25 ml，精密吸取1 ml于25 ml的容量瓶中，30%乙醇定容，按标准曲线操作测定总黄酮含量。绘制单因素图见图1。由于一般纤维素酶的活性多在40～60℃较好，因此考察酶解温度为30，40，50，60，70℃对黄芪中总黄酮提取率的影响。由图1可知，在40℃以下总黄酮的提取率随温度的升高而增大，温度为40℃时，黄芪总黄酮提取率最大，随后温度进一步升高黄芪总黄酮收率逐渐减小，温度在60℃，70℃时提取率稳定，趋向一致。这是因为40℃时纤维素酶发挥最大活性，有利于黄酮类化合物的溶出，提高黄芪总黄酮提取率。而温度进一步提高，则不利于酶活力的发挥，温度过高会使酶蛋白变性失活，丧失催化能力，因而提取效果变差。
2.4.2 考察酶解时间对总黄酮提取率的影响
称取纤维素酶8 mg，用pH=4.5的HAc-NaAc缓冲液10 ml混合后与1 g黄芪粉末（过5目筛）混合均匀，在45 ℃下分别处理30，60，90，120，150 min后加95％ 的乙醇20 ml，在70℃下浸提1 h，过滤定容方法同上，单因素图见图2。从图2中可知，随着酶解时间的延长，总黄酮的提取率也随着提高，当酶解2 h即可达到最佳效果，在2 h之前，延长酶解时间可明显提高总黄酮提取率，但在2.5 h实验时的总黄酮的提取率仅比2 h略高，说明酶解已经基本完成，没有再增加酶解时间的必要。
2.4.3 考察酶用量对总黄酮提取率的影响
分别称取纤维素酶4，6，8，10，12 mg，用pH=4.5的HAc-NaAc缓冲液10 ml混合后与1g黄芪粉末（过5目筛）混合均匀，在45℃下处理1 h后加入95%的乙醇20 ml，在70℃ 下浸提1 h。过滤定容方法同上，其单因素图见图3。由图3可看出，在酶用量在8 mg之前，随着酶用量的增大，总黄酮的提取率逐步提高，酶用量到8 mg之后，总黄酮的提取率上升趋势不明显。纤维素酶用量对酶解用一定的影响，在一定的酶浓度范围内，随着酶量的增加，纤维素酶解率增大。由于一定量的纤维素在一定条件下，纤维素分子能和酶分子结合的结合点数有限当这些结合点全部被纤维素酶分子占据后，再增加纤维素酶用量，起不到酶解作用，而从经济角度考虑，酶用量也要尽可能的少。因此最佳的酶用量为8 mg。
2.4.4 正交实验上面讨论了各单因子的影响，但是在实际的操作中，各因素是相互交差影响的。因此，为全面考查影响因素，设计了4因素3水平正交实验，结果见表1～2。从表2的K值和极差R值可以看出，在4个影响总黄酮提取率的因素中，影响顺序为：酶解温度（B）＞酶量（C）＞酶解时间（A）。其中A3B1C3为最佳优化条件，即酶解时间为120 min，酶解温度为30℃，酶量为12 mg，pH值为4.5。经测定，在此最优工艺条件下，黄芪中总黄酮的提取率为0.402%。比较初步优化和正交优化的结果可以看出，两者的条件基本不同。原因可能在于4个主要因素相互影响，有相互作用。表1 正交实验的因素及水平，表2 酶法提取黄芪中总黄酮的正交实验结果（略）。
3 讨论
实验结果表明，酶解时间的延长、酶量的适当加大、适当的温度和pH值有利于提高黄芪有效成分提取率。各因素对总黄酮的提取率的影响大小次序先后为：酶解温度＞酶量＞酶解时间。各因素的优化工艺参数为：A3B1C3，即酶解时间为120 min，酶解温度为30℃，酶量为12 mg，pH值为4.5。在此最优工艺条件下，黄芪中总黄酮的提取率为0.402%。如“2.4.3”项结果，在本实验参数的基础上，为了获得较高的提取率、节省酶用量，酶用量取8 mg。此工艺简单可行，是一条提取黄芪总黄酮类物质的有效途径。
纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称。黄芪细胞的细胞壁主要由纤维素构成，纤维素酶可以将其水解为葡萄糖，使其内容物更容易被提取出来。纤维素酶只是破坏黄芪细胞的细胞壁，其细胞内部物质并不含有纤维素类物质，因此纤维素酶对其内容物的成分没有任何影响。中草药种类繁多，有效成分结构复杂。为了提高中草药有效成分的提取率，可应用酶法提取中药有效成分。随着酶技术在中草药有效成分提取方面研究的不断深入，应用纤维素酶、果胶酶以及复合酶提高中草药药用有效成分的提取率，将成为充分利用中草药资源的有效途径，酶技术必将在中药现代化进程中发挥重要作用。
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纤维素酶范文4
关键词：小麦秸秆；糖化发酵；NaOH预处理
中图分类号：TQ353 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）18-4355-04
第二代生物质乙醇是利用不同的原料如木材、农业或者森林废弃物来生产，纤维素乙醇作为一种重要的可再生能源，具有能够支撑全球能源消耗20%～100%的潜力。在纤维素乙醇的生产过程中非常重要的一步就是将半纤维素和纤维素水解为单糖，目前最具发展前景的水解方法为纤维素酶水解。为了使纤维素酶能够与纤维素有效接触，需要在水解之前对木质纤维素材料进行预处理，解除木质素、半纤维素等对纤维素的保护作用，同时破坏纤维素的结晶结构，增加其比表面积[1]，从而提高纤维素的水解糖化效率。
NaOH溶液的润涨处理是发现最早、应用最广的预处理手段之一，其处理温度和压力都低于其他预处理手段[2]。NaOH预处理打开了交联木质素和木聚糖的酯键，能够部分溶解原料中的木质素、半纤维素，降低纤维素的结晶度，同时增大了木质素材料的比表面积，能够得到较高的酶解糖化率，是一种较为有效的预处理方法[3]。
本试验使用NaOH溶液对小麦秸秆进行预处理，分别研究了NaOH质量分数、小麦秸秆固体含量、预处理时间等因素对小麦秸秆纤维素酶水解过程的影响，得到了最佳的NaOH预处理条件，之后对经最佳条件预处理后的小麦秸秆进行了同步糖化发酵试验，并在电子显微镜下观察了预处理前后的秸秆结构变化，进一步明确了NaOH预处理的效果。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料 小麦秸秆取自太湖农村，机器收割，不含秸秆根部和麦穗。
1.1.2 酶制剂 纤维素酶购自Sigma公司，为淡黄色液体纤维素酶。
1.1.3 酵母菌 试验所用酵母为酿酒酵母BY4742， 于4 ℃下保存。
1.2 方法
1.2.1 小麦秸秆预处理 小麦秸秆粉碎后过80目筛，烘箱中55 ℃干燥，设置不同质量分数的NaOH、小麦秸秆固体含量及预处理时间，在121 ℃、0.2 MPa的条件下在高压灭菌锅中进行预处理。预处理结束后冷却至室温，加入适量的稀盐酸调节pH至中性，之后使用高速离心机进行离心并清洗3～5次。预处理后的小麦秸秆于105 ℃烘干，保存于干燥皿中备用。
1.2.2 纤维素酶水解 分别取未经预处理以及经NaOH预处理的秸秆各4.0 g，定容至100 mL，根据本课题组前期研究结果[4]，选取纤维素酶投加量为30 FPU/g秸秆，温度40 ℃，柠檬酸盐调节pH为4.8，共水解120 h，每隔24 h取样1次，离心后取上清液进行HPLC分析。
1.2.3 同步糖化发酵 根据本课题组关于同步糖化发酵条件的研究，分别取未经预处理以及最优条件下NaOH预处理后的秸秆各1.6 g，确定固体含量为0.16 g/mL，纤维素酶投加量为35 FPU/g秸秆，酵母菌浓度8 g/L，柠檬酸盐调节pH为4.0，温度设置为38 ℃，同步糖化发酵120 h，每隔24 h取样分析。
1.3 分析方法
1.3.1 小麦秸秆成分分析 小麦秸秆纤维素、半纤维素和木质素含量的测定采用NREL实验室提供的方法[5]。
1.3.2 还原糖及乙醇含量测定 样品中纤维二糖、葡萄糖、木糖、乙醇浓度采用Shimadzu高效液相色谱分析仪检测，检测器为示差折光检测器，色谱柱为Aminex HPX-87P Column。检测条件：柱温65 ℃，检测器温度60 ℃，流动相为超纯水，流速0.8 mL/min，进样量20 μL。
1.3.3 小麦秸秆结构分析 采用电镜扫描观察。样品在室温风干之后平铺于导电胶上，进行离子溅射金处理45 s，用JSM-7401F场发射扫描电子显微镜观察。
1.3.4 计算公式 纤维素水解产生葡萄糖的化学方程式如方程式（1）所示，理论上，100 g纤维素水解可产生111.1 g葡萄糖。葡萄糖发酵产乙醇的化学方程式如方程式（2）所示，理论上，100 g葡萄糖发酵可产生51.1 g乙醇和48.9 g CO2。由此可知，100 g纤维素理论上可产生56.8 g乙醇。
2 结果与分析
2.1 不同NaOH预处理条件对小麦秸秆酶解效果的影响
2.1.1 NaOH对小麦秸秆酶解效果的影响 本试验首先考察了不同质量分数的NaOH预处理条件下，纤维素酶水解小麦秸秆的效果。分别以0.25%、0.50%、1.00%、2.00%和4.00%的NaOH溶液预处理已粉碎干燥的小麦秸秆，之后进行120 h的水解试验，并每隔24 h取样进行还原糖含量分析。经不同NaOH溶液预处理后小麦秸秆水解产物中还原糖情况如图1所示。预处理过的小麦秸秆经过酶解后，主要产生了纤维二糖、葡萄糖、木糖3种还原糖，由图1可以看出，随预处理NaOH质量分数的增加，酶解液的还原糖含量逐渐升高，其产量均在NaOH质量分数为1.00%时达到最高，其中葡萄糖含量在酶水解48 h时达到最高，为14.13 g/L。之后NaOH质量分数继续增大时，还原糖产量开始下降，可能因为在预处理过程中NaOH溶解半纤维素和木质素的同时也水解了部分纤维素，还原糖进入了液相，在进行固液分离时损失[6-8]。
2.1.2 固体含量对小麦秸秆酶解效果的影响 本试验设置预处理时的小麦秸秆固体含量分别为0.025、0.050、0.100、0.150和0.200 g/mL，采用在“2.1.1”方法中确定的NaOH预处理最佳质量分数1.00%对小麦秸秆进行预处理，之后进行120 h的酶解试验，每24 h取样测定其还原糖含量。不同固体含量下NaOH预处理产物中还原糖含量如图2所示。由图2可见，预处理过程中在小麦秸秆固体含量提高到0.050 g/mL时，酶解液中的3种还原糖含量均达到最高。其中葡萄糖在纤维素酶水解48 h时其浓度达到最大值14.13 g/L。之后固体含量继续增大时，其还原糖产量下降。分析其原因可能是预处理过程中固体含量对预处理强度产生影响，固体含量过高时，因NaOH溶液的量相对减少，难以与秸秆充分接触，从而影响了预处理效果[9，10]。
2.1.3 预处理时间对小麦秸秆酶解效果的影响 本试验设置预处理时间分别为15、30、50、60和90 min，采用“2.1.1”方法得到的预处理最佳NaOH质量分数1.00%和“2.1.2”方法得到的最佳固体含量0.050 g/mL对小麦秸秆进行预处理，之后进行120 h酶解，每隔24 h取样测定其还原糖产量。不同预处理时间下3种还原糖的产量如图3所示。
由图3可见，随着预处理时间的增加，小麦秸秆酶解液3种还原糖含量在60 min时达到最大。其中葡萄糖浓度在酶水解24 h后达到最大值15.30 g/L。预处理50 min以上时，NaOH溶液对木质素和半纤维素的溶解基本完成，纤维素充分暴露出来，预处理时间增加到60、90 min时，酶解产生还原糖的浓度变化不大，考虑到增加预处理时间会显著增加能耗，故将60 min确定为最佳预处理时间。
2.2 NaOH预处理对小麦秸秆酶解效果的影响
通过上述试验可以得到NaOH预处理小麦秸秆的最佳条件为NaOH质量分数1.00%，小麦秸秆固体含量0.050 g/mL，预处理时间60 min。将经过预处理的小麦秸秆残渣酶解120 h，其反应进程见图4。
由图4可知，在最佳预处理条件下，酶解24 h时，酶解液总还原糖产量达到最大，为34.65 g/L，其产率为86.61%。而未经预处理的小麦秸秆在酶解刚开始时总还原糖产量便开始下降，最高仅为4.80 g/L，其产率仅为12.01%。最佳预处理条件下的总还原糖产率也明显高于常规的稀碱预处理的总还原糖产率[3]。这是因为NaOH预处理对半纤维素和木质素均有较好的去除效果，解除了木质素和半纤维素对纤维素的保护作用，同时破坏纤维素大分子之间的结晶结构，增大了小麦秸秆的比表面积，改善了底物与纤维素酶的接触效果，同时也有效减少了木质素对纤维素酶的特异性吸附，使纤维素酶可以充分作用于底物，有效提高了小麦秸秆的酶解效果[11，12]。
2.3 小麦秸秆成分分析
使用NREL实验室的方法分别测定未经NaOH预处理的小麦秸秆与经过最优条件预处理过的小麦秸秆成分，结果如表1所示。由表1可见，小麦秸秆在经过了最优条件预处理后，木质素的含量由25.73%降低至11.75%，同时纤维素的含量由39.31%升高至58.84%。表明NaOH能够提高纤维素在底物中所占比例，同时降低木质素等所占比例[13]，有利于后续酶解进程。
2.4 同步糖化发酵结果
未经NaOH预处理的小麦秸秆与经过最佳条件预处理的小麦秸秆经同步糖化发酵后上清液成分如表2所示。
由表2可见，未经NaOH预处理的小麦秸秆由于结晶以及木质结构的保护，酶解过程受到抑制，进而影响了酵母菌对还原糖的发酵。而经过最佳NaOH预处理条件处理后，乙醇的产量大幅上升，由处理前的7.98 g/L上升到38.32 g/L，乙醇产率由22.40%上升至71.70%，无法被酵母菌利用的木糖含量也由处理前的0.80 g/L上升到了12.94 g/L。
由此可见，NaOH预处理不仅能够有效去除木质素，而且基本不影响纤维素[14]，纤维素可以进一步水解并发酵产生乙醇，NaOH预处理是一种高效的木质纤维素产乙醇的预处理方法。
2.5 NaOH预处理前后小麦秸秆结构分析
小麦秸秆粉末在NaOH溶液质量分数为1.00%、固体含量0.050 g/mL、121 ℃、0.2 MPa的条件下预处理60 min，恢复至室温干燥后备用。同时准备一份未经预处理的小麦秸秆粉末，干燥后备用。样品平铺在导电胶上，喷金45 s后用扫描电镜观察，其SEM结果如图5所示。
由图5可见，未经NaOH预处理的小麦秸秆表面光滑，纤维排列比较整齐，没有明显的破损和孔隙，结构致密。经过NaOH预处理后的小麦秸秆的半纤维素、纤维素和木质素的部分结构遭到破坏、分离，纤维和纤维束出现卷曲和折叠，变得柔软疏松，排列凌乱；秸秆表面由预处理前的致密变得疏松，有序排列变得杂乱无章；原来光滑的表面上出现了片状的物质，这可能是溶出的半纤维素和木质素[15]。经过预处理的小麦秸秆的比表面积大大增加，这更有利于纤维素酶的吸附，有利于水解，从而提高了酶水解液中还原糖的得率。
3 结论
1）NaOH预处理小麦秸秆的最佳条件为：NaOH质量分数1.00%，小麦秸秆固体含量0.050 g/mL，预处理时间60 min。
2）经过NaOH预处理的小麦秸秆水解液还原糖得率可提升74.60个百分点。
3）通过SEM观察发现，经过NaOH预处理后，秸秆表面变得粗糙，有利于纤维素酶的吸附及进一步水解。
4）经过最佳条件NaOH预处理的小麦秸秆进行同步糖化发酵其乙醇产率提高了49.30个百分点。
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纤维素酶范文5
[关键词] 青蒿素；纤维素酶；提取
[中图分类号] R965.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）08（c）-0014-03
青蒿素（artemisinin，C15H22O5）是治疗疟疾的特效药，具有速效、高效和低毒等抗疟性能[1]。目前，青蒿素主要从黄花蒿（Artemisia annua L.）中提取[2]。近年来，用于天然产物提取的新技术如微波技术、酶技术等迅速涌现，并取得显著的成效[3]。酶技术具有反应效率高、条件温和、专一性强和有效成分破坏少等优点[4]，受到广泛关注。
我国是黄花蒿的主产国，将酶技术应用于青蒿素的提取过程，对提高提取效率、充分利用资源有重要意义。本研究对纤维素酶辅助提取青蒿素的条件进行研究，分析各因素对提取率的影响，并采用正交实验的方法对酶辅助提取工艺进行优化，为纤维素酶在青蒿素提取工艺中的应用提供参考。
1材料与方法
1.1 材料
青蒿药材购于广州市清平中药材市场（生产批号120711），经鉴定为菊科植物黄花蒿的干燥地上部分，药材经粉碎后过40目筛备用。纤维素酶Cellulase T4（来源于绿色木霉Trichoderma viride，生产批号20120922）购自天野酶制剂（上海）有限公司。青蒿素标准品（生产批号A2118）购自百灵威科技有限公司，无水乙醇、95%乙醇、氢氧化钠、乙酸、乙酸钠等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂公司。
1.2 仪器设备
FW135型中药粉碎机，SHA-2型恒温水浴振荡器，HH-4型恒温水浴锅，752型紫外可见分光光度计，SHZ-D型循环水真空泵。
1.3 方法
1.3.1纤维素酶辅助提取青蒿素的方法
称取1 g粉碎后的青蒿样品置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液，先常温下浸泡10 min，再加入一定量的纤维素酶，然后在一定温度下水浴振荡进行酶反应。酶反应结束后，抽滤，将滤饼置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml 无水乙醇，在45℃下水浴振荡1 h，抽滤，取滤液测定青蒿素含量。
1.3.2青蒿素含量的测定方法
青蒿素仅在紫外区203 nm处有较弱的末端吸收，但与碱反应后，生成一化合物Q292，该物质在292 nm处有最大吸收，可用紫外分光光度法检测[5]。取样品溶液0.5 ml加入95%乙醇4.5 ml，再加入0.2% NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加热30 min，取出快速冷却，在292 nm处测定吸光值，每组测定3个平行样品，取平均值。根据标准曲线换算出青蒿素含量。
2结果
2.1青蒿素含量测定的标准曲线
精确称取青蒿素标准样品10 mg，溶于95%的乙醇溶液，定容至100 ml容量瓶中，配制成0.1 g/L的标准溶液。分别取标准溶液0、1、2、3、4、5 ml，加95%的乙醇溶液至5 ml，再加入0.2%NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加热30 min，取出快速冷却，在292 nm处测定吸光值，每组取3个平行样品，取平均值。以青蒿素样品浓度x（g/L）为横坐标，292 nm吸光值y为纵坐标作图，结果见图1。在292 nm下，青蒿素浓度在0～1 g/L的范围内，与吸光值呈良好的线性关系，表明测定方法准确可靠。
2.2 不同酶反应时间对青蒿素提取的影响
按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纤维素酶，在45℃下水浴振荡反应，酶反应缓冲液pH值为4.5，反应时间分别为1、2、3、4、5 h，测定酶辅助提取后样品青蒿素含量。以不加入纤维素酶进行提取的样品中青蒿素含量为100%进行对照，结果见图2。随着时间的延长，青蒿素的提取率逐渐增加，在3 h左右达到最大值，再延长提取酶反应的时间，青蒿素的提取率基本不变。
2.3 不同加酶量对青蒿素提取的影响
按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中分别加入0.1、0.2、0.3、0.4g纤维素酶，在45℃下水浴振荡反应，酶反应缓冲液pH值为4.5，反应时间1 h，测定酶辅助提取后样品青蒿素含量。以不加入纤维素酶进行提取的样品中青蒿素含量为100%进行对照，结果见图3。随着酶添加量的增加，青蒿素的提取率逐渐增加，当加入0.3 g的纤维素酶时，达到最大值，再增加酶用量，青蒿素的提取率基本不变。
2.4 不同酶反应温度对青蒿素提取的影响
按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纤维素酶，分别在40、45、50、55℃下水浴振荡反应，酶反应缓冲液pH值为4.5，反应时间为1 h，测定酶辅助提取后样品青蒿素含量。以不加入纤维素酶进行提取的样品中青蒿素含量为100%进行对照，结果见图4。随着温度的增加，青蒿素的提取率呈现先增加后减小的趋势，在酶反应温度为45℃时达到最大值。
2.5不同酶反应pH值对青蒿素提取的影响
按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纤维素酶，在45℃下水浴振荡反应，酶反应缓冲液pH值分别为4.0、4.5、5.0和5.5，反应时间为1 h，测定酶辅助提取后样品青蒿素含量。以不加入纤维素酶进行提取的样品中青蒿素含量为100%进行对照，结果如图5。酶反应的pH值对青蒿素的提取率基本无影响，在pH值为4.5时，青蒿素提取率达到最大值。
2.6 纤维素酶辅助提取青蒿素工艺条件的优化
在纤维素酶辅助提取青蒿素的过程中，酶反应时间、酶的添加量和酶反应温度对青蒿素的提取影响较大，而酶反应过程中缓冲液的pH值对青蒿素的提取基本无影响。因此，选取酶反应时间、酶添加量和反应温度作为主要影响条件，利用试验设计软件Design expert 7.5作三因素两水平正交实验L4（23），正交实验水平见表1。
按照软件设计的正交实验表中各因素水平，开展实验，然后对试验结果进行分析。正交实验表和结果分析见表2。对实验结果进行极差分析表明：酶辅助提取反应各条件对提取率的影响试验中，酶反应时间（A）的最优值为水平1，酶添加量（B）的最优值为水平2，温度（C）的最优值为水平2，实验中各因素对辅助提取反应的影响顺序为：酶反应时间>酶添加量>温度。
利用Design expert7.5对实验结果进行方差分析，方差分析结果见表3。方差分析结果表明：在P
3讨论
黄花蒿为菊科艾属一年生草本植物，在我国各地均有分布[6]。青蒿素是从黄花蒿干燥地上部分分离提取得到的一种新型化合物，其具有含过氧基团的倍半萜内酯结构，与已知抗疟药物化学结构完全不同[7]，被世界卫生组织称为“唯一有效的疟疾治疗药物”。由于青蒿素的化学合成尚未显示出商业可行性，目前商用的青蒿素主要通过植物提取[8]。工业化提取青蒿素中应用范围最广的是有机溶剂提取法，但存在提取效率低、提取率不高、溶剂消耗大和安全隐患等问题[3]。
天然产物的有效成分主要存在细胞质中，细胞壁的阻碍影响了提取率。纤维素酶是最常见的破壁酶，它可作用于天然产物纤维素为主的细胞壁，破坏细胞壁的致密结构，增加细胞内活性成分的溶出量，提高提取率[9]。纤维素酶Cellulase T4来源于绿色木霉，本实验结果表明，纤维素酶能够有效降解青蒿植物的细胞壁，增加青蒿素的提取率。不同的纤维素酶有不同的最佳反应条件，常见的影响因素有温度、pH、酶的用量、激活剂和抑制剂等[10]。本文单因素及正交实验结果表明Cellulase T4水解青蒿植物细胞壁的最佳条件为酶反应时间为2 h，酶添加量为0.30 g，反应温度为45 ℃，酶反应pH值4.5。在最优条件下，纤维素酶辅助提取青蒿素较未使用酶辅助的提取方法，提取率提高了1.96倍。本实验为纤维素酶在青蒿素提取方面的应用提供了理论指导，为酶技术在中药制药方面的研究和应用开拓了更为广阔的空间。
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纤维素酶范文6
【摘要】 目的 探讨血管生成素（Ang2）、血管内皮生长因子（VEGF）和尿激酶纤维酶原激活剂（UPA）在乳腺癌中表达的意义。方法 利用SP免疫组织化学方法， 检测89例乳腺癌和36例乳腺腺瘤中Ang2、VEGF和UPA的表达。结果 Ang2、VEGF在Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌阳性率明显高于Ⅰ、Ⅱ期（P
【关键词】 乳腺癌；乳腺腺瘤；血管生成素;血管内皮生长因子;尿激酶型纤维酶原激活剂；免疫组织化学
目前认为血管生成素（Ang）家族，血管内皮生长因子（VEGF）和尿激酶型纤维素酶原激活剂（UAP）对肿瘤内血管新生和瘤细胞间质降解有直接影响〔1～3〕。它们的过表达为恶性肿瘤内血管增殖和癌细胞浸润转移建立了物质基础，也是导致抗肿瘤治疗失败的主要原因。关于Ang2、VEGF和UPA的临床意义各家认识不一，为进一步探讨Ang2、VEGF和UPA在乳腺癌中表达的意义和它们之间的相关性，我们利用SP免疫组织化学技术对乳腺肿瘤标本进行检测，并分析它们之间的相关性，为乳腺肿瘤早期诊治提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 临床资料
2008年6月至2009年7月收集张家口市河北北方学院附属第一医院、第三附属医院和张家口市第五医院外科乳腺癌手术切除标本89例，腺瘤标本36例，全部病例均为女性，乳腺癌患者年龄27～73(平均54)岁，中位年龄52岁；腺瘤患者年龄23～51(平均40)岁，中位年龄41.5岁。
1.2 标本处理及染色
将新鲜标本固定于10%中性甲醛液，行常规石蜡包埋，制备切片厚度5 μm，行免疫组化染色。鼠抗人Ang和VEGF和UPA单克隆抗体、SP免疫组织化学试剂盒和DBA显色剂均购自北京中杉金桥生物技术公司。染色程序严格按照试剂盒规程要求进行。阳性对照为已知Ang、VEGF和UPA阳性胃癌切片。阴性对照以PBS代替Ⅰ抗。
1.3 结果判断
UPA、VEGF和Ang阳性者，癌细胞质呈棕黄色，近胞膜处着色更深。凡10个高倍视野阳性细胞＞15%者为阳性病例；阳性细胞少于15%者为阴性病例。
1.4 统计学处理
采用SPSS13.0软件进行χ2检验。
2 结 果
2.1 Ang2、VEGF和UPA在不同年龄段的乳腺腺瘤和腺癌中的表达
Ang2、VEGF和UPA在乳腺癌中表达率高于腺瘤(P＜0.01)，且阳性率在31～50岁年龄组阳性率偏高，但30岁以下组和51岁以上组相比差异不显著。见表1。表1 Ang2、VEGF及UPA在不同年龄段乳腺良恶性肿瘤表达〔n（略）〕
2.2 Ang2、VEGF和UPA在乳腺癌表达与病理学特点
Ang2、VEGF和UPA在浸润性癌组阳性率明显高于非浸润癌组（P＜0.01）；VEGF和UPA在Ⅲ，Ⅳ期患者阳性率高于Ⅰ，Ⅱ期（P＜0.05）；Ang2和UPA在有淋巴转移组阳性率明显高于无淋巴转移组（P＜0.05）。见表2。表2 Ang2、VEGF和UPA表达与乳腺癌病理学特性分析结果〔n（略）〕
2.3 Ang2、VEGF和UPA之间的相关性 Ang2与VEGF正相关(r＝0.952)；Ang2与UPA正相关(r＝0.480)；VEGF与UPA正相关(r＝0.725)。
3 讨 论
3.1 Ang2生物学特性及其过表达意义
Ang是一种分泌型单链碱性蛋白，是促血管生成因子中唯一具有核糖核酸酶（Rnase）活性的物质。Ang有四个亚型，分别称为Ang1，2，3，4，其中对Ang2的研究较多〔3〕。目前证明Ang2基因定位于8号染色体（8p21），编码蛋白分子量为75 kD，其在肿瘤及血管内皮细胞中有表达，表明其参与血管形成的全过程，即在血管新生的初始阶段，当VEGF存在表达的情况下Ang2诱导内皮细胞分裂增殖，向新的方向移位；在第二阶段能够增强内皮细胞迁移能力〔4〕。本实验提示Ang2过表达与癌浸润行为和转移有关系。
3.2 VEGF生物学特性
VEGF家族有5个成员分别称为VEGFA，B，C，D和PIGF，它们由于mRNA前体剪切方式不同而形成多种异构体，它们具有酪氨酸激酶活性，可以与血管内皮细胞上的酪氨酸受体结合，引起一系列信号传递效应，促进血管内皮细胞增殖、迁移，导致新生血管形成，为肿瘤细胞浸润、转移提供营养和通道〔5～7〕。本研究发现VEGF在乳腺癌中阳性率明显高于乳腺肿瘤阳性率，而在良、恶性肿瘤的阳性率与患者年龄差异相关性不明显。VEGF在浸润型乳腺癌中阳性率明显高于非浸润癌。因此本实验提示VEGF高表达是乳腺癌预后不良的指标。
3.3 UPA的生物学性质及其高表达的意义
UPA是一种高度特异性的丝氨酸蛋白酶，相对分子量为55 kD，基因定位于10号染色体。UPA能使纤溶酶原激活形成纤溶酶，后者能降解细胞外基质和基膜中的纤维蛋白，层黏蛋白和纤维结合素，使癌细胞周围间质降解和易于癌细胞浸润、转移，有报道〔8，9〕胃癌中UPA阳性率达67.11%（51/76），浸润组和有转移组阳性率增高明显，而且阳性者生存期明显低于阴性组。本实验提示UPA是参与乳腺癌浸润，转移的重要因素，高表达者预后不良。
3.4 关于Ang2，VEGF和UPA在乳腺癌〔10，11〕中表达的相关性 肿瘤发生、浸润和转移是一个多因素、多阶段、多步骤和多基因参与的复杂过程。Ang2、VEGF和UPA在这个其中具有重要作用，本实验证实它们对肿瘤细胞内血管新生，降解基质，促进癌细胞的转移有重要作用。本实验提示Ang2、VEGF和UPA在乳腺癌发生、浸润和转移中有协同作用，但其具体作用机制，有待进一步研究。
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