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多能干细胞范文1
【中图分类号】R542.22 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）12-0067-02
随着人们生活水平提高，缺血性性心脏病人呈上升趋势，目前对于缺血性心脏病的治疗主要包括药物治疗、介入治疗及手术治疗。但有一部分缺血性心脏病的患者虽然经过积极的血运重建，但最终因存活的的心肌细胞减少而死亡，而心脏移植又因供体及免疫排斥限制尚不能广泛开展。干细胞移植作为缺血性心脏病的一种富有前景的治疗策略，大部分动物实验和临床实验均表明干细胞确实能改善缺血心肌的血液灌注和心脏功能。关于胚胎多能干细胞治疗缺血性心脏病的动物和临床实验开展的较少，我市仅我科开展。
1 临床资料
11例患者，男6例，女5例；年龄42-65岁。均为我院住院确诊为心力衰竭的患者，所有病例均符合 WHO 规定的心力衰竭诊断标准。
2 护理
我科对11例缺血性心脏病人进行研究，病人没有感觉带来很大痛苦，和以往静脉输液相似，病人都愿意接受 ，输注干细胞过程中，会有一名年资高、学历深的护士在旁守护，持续为病人晃动输液瓶，使干细胞全部输入到病人体内，严格执行无菌操作原则，边操作边询问病人感受，观察病人状态，由于我们采取了新研制的干细胞移植术的护理方法，病人未出现不良反应。
术前准备：选取接受住院治疗的缺血性心脏病病人；遵医嘱行超声心动图检查，左室射血分数（LVEF≤40%）者使其理解并签署知情同意书。检测生命体征，肺脏（双肺罗音情况）、心脏（心界大小、心音、心率、节律、心脏杂音）。 实验室检查血、尿常规，血凝，血糖，离子，肝功，肾功，肌钙蛋白T，血浆脑钠肽（BNP）水平。心彩超测定左室舒末容积，每搏量，射血分数及室壁运动情况。向病人讲解输注过程，做好心理护理，避免紧张。
术中护理：移植术前嘱病人平卧，肌注盐酸异丙嗪注射液25毫克，选取上肢肘静脉用输血器生理盐水250毫升开通静脉通路，嘱其输液上肢避免活动，再次确定输液针头在血管内，连接干细胞悬液瓶（内含胚胎多能干细胞8*107-1*108个），30分钟内在护士监护下静脉滴注，术中注意避免细胞成团，不停晃动输液瓶，避免细胞贴附在输血器滤网上，用手轻弹滴壶，并严密观察生命体征变化及有无不适。细胞输毕，用20-40毫升无菌生理盐水注入细胞瓶内冲洗瓶内使其全部细胞流入输液器，拔出针头插入生理盐水250毫升瓶冲洗输液管，使管内细胞全部输入体内后拔针。
术后护理：于移植术后即刻、1小时、6小时监测生命体征。严密观察有无不适症状，进行健康指导。于移植术后7天，3个月，6个月评价心功能、呼吸困难评估、3个月，6个月评估射血分数、6分钟步行试验评估、血浆脑钠肽水平。
适用范围及优点：
适用于所有缺血性心脏病患者，该方法患者收到了良好的治疗效果，由于采取了科学化的护理，病人未出现不良反应。
3 结果
充分的移植术前准备、科学的静脉输注流程、移植术后护理观察，全面实用的健康指导是保证移植治疗术后远期效果、安全性，促进患者康复，为缺血性心脏病的治疗提供新的方法和实验数据。
4 结论
通过对11例患者的护理，我们认识到：（1）充分的移植术前准备是保证移植术顺利进行的前提。干细胞及各种物品准备是保证多能干细胞移植治疗心力衰竭顺利进行的关键。（2）科学的静脉输注流程是保证多能干细胞移植治疗心力衰竭顺利进行的基础。（3）护士在移植术前、后通过护理观察及时发现问题，减少并发症的发生。（4）实施正确有效的护理措施是提高多能干细胞移植治疗心力衰竭成功率的保障。（5）全面实用的健康指导是保证移植术后远期效果、促进患者康复的重要环节。此种方法普遍被患者接受，也广泛应用于临床护理工作中。
干胞移植治疗缺血性心脏病的新方法，是世界上最前沿、最热门的医疗技术之一，它与心脏移植治疗方法相比，该项技术兼备替代功能和加强功能的治疗作用，不存在免疫排斥。此技术风险小、痛苦少、费用低，疗效相对持久，这项新技术必将给众多的心衰患者带来新生，随着多能干细胞移植技术在临床广泛应用，探索适合干细胞移植治疗缺血性心脏病的有效护理措施及观察方法，以确保多能干细胞移植的顺利进行，提高移植术成功率和保障远期效果，其间接社会效益、经济效益非常可观。
21世纪是生命科学的时代，也是为人类的健康长寿创造世界奇迹的时代，胚胎多能干细胞在缺血性心脏病的护理研究应用将有广阔前景。
参考文献：
[1] 中华医学会心血管病分会.病态窦房结综合征诊断标准.中华心血管杂志，1993，21（ 1） ： 17.
多能干细胞范文2
【关键词】 结核分枝杆菌; 抗原提呈; T细胞亚群; 流式细胞术; 激光共聚焦显微镜
［Abstract］ AIM: To explore whether the human peripheral γδ T cells stimulated by polypeptide heat resistant antigen from Mycobacterium tuberculosis (MtbHAg) express phenotype and have the fuction of antigen presentation. METHODS: The monocytes isolated by adhesion method from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were cultured with GMCSF， IL4 and induced into the mature dendritic cells by adding LPS. PBMCs were stimulated with MtbHAg and IL2 to expand predominantally γδ T cells that were further purified by flow sorting. The pure T cells were isolated from PBMCs using adhesion revomal and nylon column method， labeled with CFSE， and cultured in alone with Mtb secretory antigen (MtbSAg)， in monocytes with MtbSAg， or with MtbSAg prepulsed dendritic cells or MtbHAg activated γδ T cells for 11 days. The proliferation of the CD4+T cells were measured by flowcytometry. The MtbHAg activated γδ T cells were incubated with FITC labelled MtbSAg for different time， and the ingestion of MtbSAg by γδ T cells was measured by flowcytometry and observed with laser confocal microscopye. RESULTS: The expressions of MHCII and costimulatory molecules CD80 and CD86 on γδ T cells that activated by MtbHAg marketly incrased in comparison with that on the resting γδ T cells. The expanded cell counts and proliferation index of the pure nave T cells that induced by MtbSAg pretreated activated γδ T cells were similar to that induced by mature DC. By using flowcytometer and laser confocal microscope， FITC labellaed MtbSAg was ingested by the activated γδ T cells. CONCLUSION: γδ T cells stimulated by polypeptide MtbHAg express the phenotype of professional antigenpresenting cells and they are able to present MtbSAg to nave T cells to induce the proliferation of CD4+T cells.
［Keywords］Mycobacterium tuberculosis; antigen presentation; T lymphocyte subpopulation; flow cytometry; laser confocal microscope
以往的研究表明机体在抗结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis， Mtb）感染免疫中， 主要有αβ T细胞（CD4＋和CD8＋T细胞）和巨噬细胞发挥重要作用， 而近年的许多研究证明， γδ T细胞在抗Mtb感染中也起到重要的防御作用， 并可能通过与其他免疫细胞之间相互作用， 影响机体在抗Mtb感染中的免疫应答过程。在健康人外周血中， γδ T细胞仅占T细胞库的2%～10%， 根据其TCRδ链V区片段不同又可以分为Vδ1+和Vδ2+二种亚型， Vδ1+T细胞主要分布在黏膜上皮和皮肤组织， 而Vδ2+T细胞则主要分布在外周血中。已有研究发现Vδ2+T细胞能识别小分子的非肽类抗原， 并在此类抗原的刺激下产生显著的扩增［1， 2］。有研究发现， 从扁桃体分离的未活化的γδ T细胞用异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate， IPP) 和来自大肠埃希菌的非肽类抗原4羟基3甲基2烯基焦磷酸［(E)4hydroxy3methylbut2enyl pyrophosphate， HMBPP］刺激后， 表达协同刺激分子和MHCⅡ类分子的能力与单核细胞来源的， 脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）刺激诱导成熟的树突状细胞（dendritic cell， DC）相似［3］。但以往的研究， 以及我们以前的实验发现来自结核杆菌的多肽类耐热抗原也可优势扩增人Vδ2+T细胞［4， 5］。本实验中， 我们用多肽类Mtb耐热抗原(Heat resistant antigen， MtbHAg)优势扩增人外周血中的γδ T（Vδ2+）细胞， 观察活化后的γδ T细胞是否能表现出抗原提呈细胞的表型以及是否具有抗原提呈的功能， 探讨γδ T细胞在抗Mtb感染的天然免疫和获得性免疫中的桥联作用。
1 材料和方法
1.1 材料 Mtb耐热抗原(MtbHAg)和Mtb分泌性抗原(MtbSAg)由本实验室从培养的MtbH37Ra株制备获得， 羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰胺酯(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester， CFSE) 购自Molecular Probes公司; RPMI1640培养液(GIBCO公司) 补充L谷氨酰胺2 mmol/L、 二巯基乙醇(2ME)50 μmol/L、 丙酮酸钠1 mmol/L、 庆大霉素50 mg/L和新生小牛血清(NBS， 杭州四季青公司) 100 mL/L后为完全RPMI1640培养液; 异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC) 和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide， DMSO) 购自Merk 公司; 荧光抗体小鼠抗人CD4PE、 小鼠抗人TCRγδPE、 小鼠抗人CD14FITC、 小鼠抗人HLADRPecy 5.5和小鼠抗人CD83FITC等购自Caltag公司; 小鼠抗人CD80FITC和CD86FITC购自eBioscience公司。
1.2 方法
1.2.1 γδ T细胞的活化和分选纯化 抽取健康志愿者外周血5～10 mL， 肝素抗凝， 用淋巴细胞分离液和梯度离心法常规分离获取外周血单个核细胞（peripheral blood monouclear cells， PBMC）， 将PBMC用RPMI1640完全培养液调整细胞密度为1×109/L， 加入24孔板， 再加入Mtb耐热抗原(MtbHAg) 2.5 mg/L， 置于37℃、 50 mL/L CO2中培养5 d后分孔培养， 每隔3 d加入rhIL2 5×104 U/L， 约9 d即可得到富含γδ T细胞的活化T细胞， 经抗TCRPE染色后， 用PBS制备分选用细胞悬液(1×1010/L)， 在流式细胞仪FACSCalibur上进行分选获取纯化的γδ T细胞。
1.2.2 DC的体外培养及检测 常规方法分离获取PBMC， 加入24孔板中， 细胞密度为每孔5×109/L， 37℃、 50 mL/L
CO2培养2 h后吸去悬浮细胞， 并用预热的RPMI1640轻洗培养孔， 以去除残留悬浮细胞， 即获得贴壁细胞。补充培养液后加入rhGMCSF 100 μg/L， IL4 100 μg/L， 第3天时半量换液， 并再次添加GMCSF和IL4， 第6 天半量换液的同时再加入LPS 1 mg/L， 第8天收获悬浮细胞， 分别用小鼠抗人CD83FITC， CD14FITC和HLADRPeCy5.5标记后在流式细胞仪检测外周血单核细胞来源DC的成熟程度。
1.2.3 尼龙毛柱法分离纯化T淋巴细胞 常规方法分离获取PBMC， 调整细胞密度为1×109/L， 加入6孔板中， 2 mL/孔， 置于37℃、 50 mL/L CO2中培养2 h后， 吸出悬浮细胞， 调整细胞密度为1×1010/L， 注入已制备好的尼龙毛柱内， 另加入5 mL的完全RPMI1640液， 密封， 37℃、 50 mL/L CO2中孵育1 h后， 用RPMI1640完全培养液冲洗毛柱， 收集冲洗出来的细胞， 即为纯化T细胞（purified T， pu T)。
1.2.4 CFSE标记pu T 将获得的pu T调整细胞密度为5×109/L， 每毫升细胞悬液加入1 μL CFSE， 使其终浓度为2 μmol/L， 37℃染色10 min后取出用含100 mL/L NBS的完全RPMI1640培养液洗2次后将染色后pu T制成细胞悬液(1×109/L)。此即为CFSE标记的pu T (pu TCFSE)。
1.2.5 FITC标记MtbSAg 将MtbSAg(1 g/L) 1 mL加入已处理过的透析袋中， 扎紧袋口放入pH9.5碳酸盐缓冲液透析过夜， 透析后取出， 加DMSO配制FITC溶液（1 g FITC/L）混合， 使FITC/MtbSAg的比例为50 μg∶1 mg。室温避光在水平振荡器上慢速振摇2 h后转入透析袋中， 对200 mL PBS透析8 h后换液， 共3次。4℃避光保存。
1.2.6 四种不同的培养方法刺激αβ T细胞扩增 CFSE标记的pu T， 调整细胞密度为1×109/L， 加入24孔板培养， 每孔1 mL， 并按以下四种不同方法加入MtbSAg或抗原提呈细胞。a: CFSE标记的pu T单独培养， 同时加入MtbSAg 25 mg/L。b: CFSE标记的pu T中加入单核细胞 (单核细胞: pu TCFSE为1∶100)， 加MtbSAg 25 mg/L。c: 体外培养的单核细胞来源的成熟DC(MDC)与终浓度25 mg/L 的MtbSAg孵育， 37℃ 2 h后， RPMI1640洗涤3次， 加入pu TCFSE (DC∶Pu TCFSE为1∶100) 中培养。d: 流式分选纯化的MtbHAg活化γδT细胞与终浓度为25 mg/L的MtbSAg孵育， 37℃ 2 h后， RPMI1640洗涤3次， 加入到pu TCFSE(活化的γδT细胞: pu TCFSE为1∶100)中培养。上述4种细胞培养在第4天时加IL2 (5万U/L)扩增细胞， 隔天半量换液并添加同量的IL2以维持细胞生长。
1.2.7 FCM和激光共聚焦检测活化γδ T细胞对FITC标记MtbSAg的摄入 将MtbHAg活化的γδ T细胞的密度调整为1×1010/L， 取100 μL细胞悬液， 加FITC标记的MtbSAg 10 μL， 抗TCRγδPE 3 μL， 避光 37℃， 水浴30 min 至120 min后， PBS洗涤3次， 尽量去除残余液体， 加入10 g/L多聚甲醛200 μL 固定后用流式细胞仪检测FITC阳性细胞数， 表示摄入MtbSAg细胞的比率。同时将水浴90 min的试管轻弹混匀后取出2 μL， 加少量甘油混合后滴在载玻片上， 加上盖玻片后即在激光共聚显微镜（Nikon C1 Si）下观察和拍摄记录， 获取的图象文件用Freeviewer软件分析显示。
1.2.8 统计学分析 实验数据以x±s表示， 数据处理采用SPSS13.0统计软件。样本均数的两两比较， 采用t检验， P＜0.05表示有统计学意义。
2 结果
2.1 外周血单核细胞来源DC的表型检测 PBMC来源的单核细胞经GMCSF， IL4培养6 d后加入LPS诱导为成熟的DC后， 用FCM检测其表型， 发现HLADR仍为高表达（81.89%)， 代表DC成熟的CD83与培养前低表达（7.83％）相比非常显著地高表达(85.40%)， 而单核细胞的特征标志CD14从培养前的87.2%降低到5.31%。
2.2 活化的γδT细胞表达协同刺激分子 检测健康人外周血中静止的γδ T细胞表面CD80、 CD86和HLADR的表达水平非常低， 分别为(1.37±2.36)%， (4.13±3.33)%和(8.84±5.44)%; 而经MtbHAg活化后γδ T细胞CD80、 CD86和HLADR的表达分别增加到(62.33±7)%、 (89.12±3.5)%、 (80.56±7.29)% (图1)。
2.3 不同培养方法对纯化初始T细胞增殖总数的影响 在4种不同培养方案中， 加入的纯化T细胞数均为1.0×106， 单独加MtbSAg的a组， 和加单核细胞和MtbSAg的b组， 培养到第11天时， 细胞数分别为1.2×106和5.6×106。而纯化T细胞加入预先与MtbSAg处理的DC（c组）和γδ T细胞（d组）， 培养11 d后的细胞数分别为7.79×106和8×106(图2)。
2.4 FCM分析CD4+T细胞的增殖情况和Modfit软件分析CD4+T细胞的增殖指数 用CFSE标记的纯化T细胞用4种方法培养到第11天时， 标记CD4荧光mAb后用流式细胞仪测定和分析， 结果表明纯化T细胞单独加MtbSAg的a组， 增殖的CD4+T细胞仅占4.5%; 加单核细胞和MtbSAg的b组， 增殖的CD4+T细胞所占比例为35.4%， 而加入MtbSAg预处理的成熟DC和活化γδT细胞的c组和d组， 增殖的CD4+T细胞所占比例分别达到56.4%和57.1%（图3A）。用Modfit软件中的增殖分析模块进行分析， 得到CD4+T细胞各代细胞所占百分率， 增殖指数(Proliferation Index， PI， 即增殖后细胞总数与增殖前细胞总数的比值。在加入MtbSAg预处理的DC（c组）和活化γδT细胞（d组）， 培养第11天时CD4+T细胞的PI分别为58.9和51.9， 且增殖的代数主要集中在第9、 10代， 分别为75.93%和75.71%。加入单核细胞的b组CD4+T细胞的PI为24.39， 第9、 10代所占的比例为57.65%， 而仅有纯化T细胞的a组中， CD4+T细胞的PI和第9、 10代所占的比例仅为4.5%和4.04%（图3B）。
2.5 激光共聚焦显微镜观察活化的γδ T细胞摄入SAg MtbHAg刺激活化的γδ T细胞与FITC标记的MtbSAg在37℃孵育90 min 时， 同时加入抗TCRγδ PE荧光抗体， 在激光共聚焦显微镜下观察， 发现细胞膜被染成红色的γδ T细胞内分布有大量呈绿色荧光（FITC）细小散点物质(图4)。
2.6 流式细胞术检测活化的γδ T细胞摄入MtbSAg MtbHAg激活的γδ T细胞与FITCMtbSAg在37℃孵育时， 加入抗TCRγδ PE荧光抗体， 用流式检测发现， MtbSAg摄入率即γδ T细胞中FITC+细胞百分数随时间延长不断增加。在孵育30、 60和90 min时， 摄入率分别为(26.68±3.58)%、 (48.09±3.29)%和(53.32±3.29)%; 但是在120 min时降低至(31.28±5.80)% (图5)。
3 讨论
为了探讨多肽类抗原激活的人γδ T细胞是否也具有抗原提呈作用， 首先考虑是否有涉及抗原提呈细胞有关的表型分子的表达。本实验采用多肽类的MtbHAg作为优势激活γδ T细胞的抗原， 其中具有激活γδ T细胞效应的主要组分是Mr在10 000～14 000的非分泌性耐热多肽［4， 5］。用这种多肽抗原激活的γδ T细胞在培养增殖到第11天时， 其表面HLADR和协同刺激分子(CD80和CD86)从培养前的低表达（1％～8％）显著上调为高表达（62％～89％）， 表明这些细胞已具有抗原提呈细胞的表型。
Brandes等［3］发现IPP活化γδ T细胞摄入可溶性抗原后与初始αβ T细胞共同培养促使细胞增殖。本实验中纯化T细胞（几乎均是αβ T细胞）与MtbSAg掺入的DC培养11 d后数量增加7倍， 而与MtbSAg掺入的活化γδ T细胞共同培养后， αβ T细胞的数量增加8倍。我们进一步用CFSE标记初始纯T淋巴细胞后， 再与MtbSAg掺入的DC或γδ T细胞培养， 流式细胞术检测后用Modfit软件进行分析CD4+T细胞各代细胞所占百分率， 发现由活化γδ T细胞和成熟DC作为抗原提呈细胞的二组， 培养到晚期时增殖的细胞绝大多数均是集中在第9、 10代。说明引起CD4+T细胞增殖的能力几乎相同。这些结果表明， 用MtbHAg活化的γδ T细胞和成熟DC一样， 具有提呈可溶性抗原给初始T细胞， 引起CD4+T增殖的能力。这与 Brandes报道的用非肽类抗原刺激的γδ T细胞提呈可溶性抗原的结果相一致。
为了证实MtbHAg活化的γδ T细胞能摄入蛋白抗原， 本实验将活化的γδ T细胞与FITC标记的MtbSAg在37℃的条件下孵育， 流式细胞术检测显示γδ T细胞摄入SAg的能力随着时间的增加而增加（30 min 至 90 min）。同时， 在激光共聚焦显微镜下也观察到γδ T细胞能将抗原摄入胞内。
综上所述， 经MtbHAg活化γδ T细胞具有抗原提呈作用， 其功能活性似乎与成熟DC没有明显差别， 但γδ T细胞更容易获取和体外操作。因此， 这种活化的γδ T细胞可在制备疫苗和免疫治疗中成为新的目标［6］。
参考文献
［1］ Hayday A， Theodoridis E， Ramsburg E， et al. Intraepithelial lymphocytes: exploring the third way in immunology［J］. Nat Immunol， 2001， 2(11): 997-1003.
［2］ Chen ZW， Letvin NL. Adaptive immune response of Vγ9Vδ2T cells: a new paradigm［J］. Trends Immunol， 2003， 24(4): 213-219.
［3］ Brandes M， Willimann K， Moser B. Professional antigenpresentation function by human γδ T cells［J］. Science， 2005， 309(5732): 264-268.
多能干细胞范文3
干细胞是种子
具有分化为多种细胞能力的干细胞，可以被分为两类，一类是人类胚胎干细胞，取自于人类胚胎，另一类是诱导性多能干细胞（iPS cell），是皮肤或者血液细胞经过人工诱导而转化成的干细胞。获取前一种干细胞时因为需要破坏胚胎，因此受到道德上的质疑，所以通过诱导性多能干细胞来治疗疾病是现在干细胞研究的主流。
例如，日本横滨城市大学的研究者便利用人类的诱导性多能干细胞在实验中分化出了肝内胚层细胞、间充质干细胞、内皮细胞。人类胚胎在自然发育的过程中，正是这三种细胞构成了肝脏。当研究者把这三种细胞混合在一起后，它们生长成为一个“肝芽”——虽然不是成熟的肝脏，但却具有发展成为肝脏的潜力的立体结构。研究者把肝芽移植到小鼠体内，它的血管与小鼠的血管连接在了一起，并且开始执行成熟肝脏具有的功能。
这是第一例由诱导性多能干细胞制造出的具有功能的人类器官。无数器官衰竭的患者都在等待供体中绝望地死去，诱导性多能干细胞的未来发展关乎更多这类患者是否能够得救。诱导性多能干细胞就像一粒种子，把它“种”到老鼠等动物体内，就能够收获所需的器官，例如这次实验中的肝脏。
动物的身体是田地
然而，小鼠身上长出的人类器官有些“迷你”。小鼠的身体就像是贫瘠的土地，并不适合“耕种”人类器官。于是有科学家把目光瞄准了猪，因为它们的器官大小和形状都与人类的非常相似。也许在猪的体内，能够长出完美的人类器官，并在将来用于器官移植。东京大学的研究者就正在进行此类实验。
首先，研究者利用基因技术制造出了缺少某种器官的猪，如果需要肾脏，那么制造的猪就会天生缺少肾脏。然后，研究者将人类的诱导性多能肾细胞植入这种猪的胚泡（早期阶段的胚胎）中。这个胚泡发育成的猪体内会混合有人类细胞和猪细胞，但只有肾脏是完全由人类细胞构成的。这个肾脏能够移植给肾脏衰竭的患者，并且不会诱发排异反应。
在东京大学2010～2013年的实验中，研究者已经把人类的诱导性多能干细胞植入了缺少各种器官的动物体内，例如没有胰腺的老鼠和猪身上。
困难重重的耕种过程
让动物长出人类器官，已经足够惊悚，还要把动物体内长出的器官移植到人的身体中，这么做是否真的行得通呢？这些器官中会否混有动物的细胞，并在移植后引起剧烈的反应呢？有学者提出，这些器官连接的血管中可能还带有动物的细胞。为了解决这个问题，研究人员随后制造出了天生缺乏动脉、静脉以及胰腺的老鼠，在此类老鼠的胚泡中植入人类的诱导性多能干细胞后，生长出的胰腺以及所有血管都由人类细胞组成，这样便不用担心移植时混入老鼠细胞了。
多能干细胞范文4
1 生产hiPSC衍生细胞以供药物毒性检测多潜能干细胞沿着特定的谱系分化的技术使研究细胞发育和细胞特异性的毒性成为可能。事实上,hiPSC分化而成的细胞的概念验证毒性试验支持大规模基于人类细胞的毒性筛选试验。但是,对于iPSC在药物筛选中的应用还有以下三个限制。其一是重编程的效率和分化的可重复性,对于hiPSC,重编程方法的效率低于0.1%。而分化过程同样在效率和差异性上面不令人满意并且需要很长的培养时间。其二是在iPSC的分离,诱导和成熟中发生的遗传和表观遗传改变,造成试验结果难于被解读。其三是获得成熟表型的细胞,获得一个完全成熟的细胞是个挑战,这会限制依赖于成熟细胞生化过程的毒性检测。
2 hiPSC在毒性评估的几大应用人源诱导多能干细胞可以应用在毒性评估中的很多方面,下面主要讨论几个方面。
2.1 发育毒性胚胎干细胞检测,作为动物检测的替代方法,是一种评估致瘤性危害的体外实验。该实验探讨了包括细胞毒性,终端分化,生物化学指标,蛋白组和基因组的检测值,以提高敏感性和检测额外的细胞毒性机制。生化通路的种属间差异危害是人源化此类发育毒性试验的原动力。由于hiPSC分化方法目前还不成熟,所以利用此类细胞的发育毒性研究局限在早期分化阶段,诱导分化方法的日益发展必将可以拓展评估致瘤性危害的发育窗口期。
2.2 验证继发性药理学脱靶效应研究普遍利用细胞系统来完成。iPSC分化细胞可以在更生理化环境中表达相关靶标,当药理学特性依赖于靶标表达水平和信号转导蛋白相互作用时,则显得尤为关键,例如GPCRs,此靶标的相对丰度和细胞背景可以影响受体的药理学,因此,结合hiPSC和可在自然表达水平上分辨GPCR功能的技术[5]可以用来更加准确的评估一个候选药物的脱靶效应。
2.3 评估器官特异毒性毒理学家一直努力发展各种分子、生化和细胞模型来重现已知毒性物质的特殊在体反应以及描述毒性物质作用通路。研究主要集中在肝脏,心脏,和大脑。例如,lin和will评估了549种分别有肝毒性,心毒性,神经毒性物质对来源于肝脏、心脏、和肾脏细胞其中ATP水平的作用,大部分的毒性物质对三种细胞都有着相同的效果,显示了不能用这样的一般指标来预测器官特异性毒性。器官特异性毒性可能来源于该组织特殊的生物特性,结合hiPSC分化细胞特异的功能参数可以阐明利用永生化细胞观察不到的毒性物质作用通路。结合兼容高通量的新技术,可以检测大量的合成物。这有助于在药物筛选早期对关键安全性危害进行评估并且有助于进一步利用追踪试验进行验证以确定安全性界限。
多能干细胞范文5
让你变成“蜥蜴人”
干细胞是人类最原始的细胞，早在受精卵只有几天大小时，它们便已经存在，能分化成为所有种类的人体细胞。这种“特异功能”能够让受损的身体组织再生，让“罢工”的器官系统重启，甚至让残疾人像蜥蜴一样长出断肢。
医疗中的万能材料
通过改变干细胞的成长环境或者注入特定基因，科学家能在实验室中让它分化成为所需的特化细胞，如心脏肌肉细胞、血液细胞或者神经细胞，再将这些特化细胞移植到患者身上。例如，干细胞分化出的健康心脏细胞将被移植到心脏病患者的心脏肌肉中，并担负起修复受损心脏细胞的责任。相比器官移植，干细胞移植引起的排异反应要小得多，而且患者也无需长时间等待适合的器官。
“羊毛”出在“羊”身上
虽然干细胞可以在实验室中分化出各种各样的身体细胞，但是最初的干细胞从哪里来呢？胚胎、脐带血、成人身体中都存在干细胞。
胚胎干细胞
来源：胚胎干细胞是从一星期左右大的人类受精卵中分离出来的。在胚胎中，干细胞能分化成为各种细胞，最终形成一个完整的人体。
特点：胚胎干细胞在实验室中是“永生”的，而且能够制造包括从骨细胞到脑细胞的所有人体细胞。
弊端：分离时会损害受精卵。目前，大多数的胚胎干细胞来源于不孕不育治疗中剩余的人类胚胎，也有女性专门为干细胞研究捐献卵子。
链接：除了分化出所需的特化细胞，胚胎干细胞还可以让研究者深入了解受精卵发展成人的过程。有基因缺陷的胚胎干细胞有助于科学家研究先天疾病是如何形成的。胚胎干细胞还可用于新药物测试，让研究者直接看到人类机体而非动物对药物的反应。
脐带血干细胞
来源：脐带血是在婴儿娩出后立即从胎盘和脐带中收集的血液。
特点：获取脐带血干细胞不会对婴儿和母亲造成任何伤害，其多功能性介于胚胎干细胞和成人干细胞之间。
弊端：私人保存脐带血所需不菲，而且孩子将来用到脐带血的几率微乎其微。即使孩子未来真的需要自身脐带血干细胞，已被保存多年的干细胞可能已经不适用于医疗了。
链接：早在20世纪80年代，脐带血干细胞就被用于兄弟姐妹之间的干细胞移植。现在，世界各地都有公共脐带血干细胞库，但并不用于私人医疗，在那里保存脐带血相当于给科学研究捐献脐带血干细胞。
成人干细胞
来源：成年人的骨髓、血液、角膜、肠道、肝脏、肌肉、脂肪、神经系统、大脑、胰腺和皮肤当中也保留了一些干细胞。
特点：提取时不会破坏胚胎，而且不存在保存问题。
弊端：这些干细胞只能够分化出其所在部位的组织细胞。另外，环境中的毒素以及DNA复制时的错误可能使成人干细胞出现问题。
链接：成年人骨髓中的造血干细胞能够源源不断地补充各种血液细胞，让白血病患者受损的造血系统重新启动。骨髓中的另一种干细胞，间叶干细胞可分化成肌肉、脂肪、皮肤、软骨等细胞。刺激已有的成人干细胞，使其达到并且修复人体中受损的组织，是科学家们正在努力的方向。
链接：今年“两会”期间，辽宁省糖尿病治疗中心院长、政协委员冯世良认为我国的干细胞产业“鱼龙混杂”，并建议规范干细胞临床及应用监管模式。在我国干细胞产业的乱局中，科技部门“鼓励干”，卫生部门紧闭双眼“不让干”，药监部门眼盯美国“看着干”，学者专家崇尚信仰“大胆干”，医疗机构追名逐利“偷着干”，美容机构胡说八道“忽悠干”，而数万患者为了不被当做小白鼠“花钱干”，实在有必要了解干细胞这一最前沿的科学技术到底是什么。
干细胞新动向
什么让干细胞如此给力
德国Max Delbrück分子医学中心发现，干细胞的特殊能力来源于一种钙黏附蛋白。根据这一发现，研究者希望通过DNA重组，让普通的体细胞转化成为拥有钙黏附蛋白的多功能细胞，即诱导性多能干细胞。而该研究在小鼠实验中已经取得了初步成果。一旦技术成熟，人类的体细胞也可以在干细胞医疗中被用于治疗心脏病、阿兹海默症、帕金森和糖尿病。
胎儿的干细胞治疗母亲的
心脏病
美国纽约市西奈山医学院的研究人员先诱发了怀孕小鼠的心脏病，然后在两周后杀死它们。解剖结果发现，母小鼠受损的心脏组织中存在一些小鼠胎儿的干细胞，并且曾帮助修复受损组织。研究者解释，这可能是一种进化机制――胎儿为了提高自身的生存率而保护母亲的心脏。也许在未来，我们可以从胎盘中提取干细胞用于修复母亲受损的心脏，这些干细胞易于提取而且不易引起排异反应。
宝贵的母乳胚胎干细胞
西澳大利亚大学最近从母乳当中成功分离出了胚胎干细胞。胚胎干细胞可以分化成为任何人体细胞，具有极大的医疗价值。但是获取胚胎干细胞会损害能够发育成胎儿的受精卵，因而一直备受争议。从母乳中获取胚胎干细胞则避免了这一点。
寻找自我复制的开关
不分化的干细胞会不停地自我复制，这种复制与癌细胞的快速生长相似。美国明尼苏达州大学最近发现了一种可以决定干细胞是分化还是自我复制的蛋白质（Klf4），以及控制该蛋白质的两种酶。一旦科学家掌握了干细胞自我复制的开关，便可以在移植干细胞时，根据需要决定干细胞是分化还是自我复制。另外，该发现可能启发研究者找出抑制癌细胞生长的方法。
延长女性的生育能力
卵子是由卵母细胞发育而成的。以往我们认为，一位女性在出生时，她的卵母细胞数量便固定了（约200万个），并在一生中逐渐减少，能发育为成熟卵子排出的约400~500个。而美国麻省总医院的研究人员却发现，在卵母细胞总数减少的同时，也有新的卵母细胞生成。这让他们联想到了卵巢中可能存在干细胞，并最终通过一种卵细胞中独有的蛋白质，在卵巢组织中找出了卵巢干细胞。也许将来，中老年女性和卵巢早衰的女性能够通过刺激卵巢干细胞来重新排卵，生育能力得到延长和修复。
干细胞研究大事件
1968年――非亲属之间的骨髓移植中首次成功运用了干细胞技术
1998年――实验室中培育的人类胚胎干细胞可形成人类的任何身体组织
2001年――美国前总统乔治・W・布什颁布了多项关于联邦经费用于人类胚胎干细胞研究的禁令
2005年――成人干细胞用于治疗心脏病的最大规模临床研究失败
2006年――普通皮肤细胞被转化成为诱导性多能干细胞，据称，其功能与人类胚胎干细胞一样
2008年――诱导性多功能干细胞分化出能分泌胰岛素的胰岛细胞
2008年――首次在气管移植手术中成功运用了患者自身的干细胞
2009年――美国总统奥巴马解除了前总统布什关于干细胞研究的禁令
2010年――治疗脊椎受伤患者时首次使用了人类胚胎干细胞
多能干细胞范文6
关键词：生物技术；伦理问题；思考
中图分类号：Q81 文献标识码：A
文章编号：1009-0118（2012）07-0199-01
21世纪是生命科学的世纪，生物技术的发展对人类和社会的影响深远。而生物技术引发的伦理问题，已成为世界的焦点议题。如何合理的应用生物技术造福人类和社会，是众多学者和科学家急需解决的问题。
一、现代生物技术研究的新进展
进入21世纪，生物技术正处于发展成熟阶段，生物技术的应用已经渗透到我们生活中许多与生物无关的角落。生物技术的发展至今已经揭示了许多生命现象的本质及其规律，但生命现象极其复杂，目前仍有许多课题有待深入研究和探索。目前在克隆、胚胎干细胞、转基因食品、人类基因组计划、组织工程等研究和实际应用等领域取得了成果。
（一）克隆技术。克隆原意是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因都是相同的。克隆技术首先用于动物，动物克隆就是通过无性繁殖方式，由动物细胞产生的遗传形状相同的动物个体。克隆羊多莉是首例克隆成功的动物。动物克隆为我们进一步揭示生命的奥妙及人类的自我认识展现了全新的视野。
（二）胚胎干细胞。干细胞是生物体在生长发育过程中起“主干”作用的高度未分化细胞，它具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能。干细胞分为三大类：全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。全能干细胞之所以全能，是指它可以分化成人体全部细胞类型，进而构建心、肝、肾、肺等多种组织和器官，最终发育成一个完整的个体。全能干细胞再进一步分裂、分化中又形成了各种多能干细胞。多能干细胞具有分化为多种细胞组织的潜能，但是却失去了发育成完整个体的能力。
（三）转基因食品。转基因食品是利用生物技术将某些生物的基因转移到其他物种中去，从而改造生物的遗传物质，使其在性质、消费品质等方面向人类所需要的目标转变。以转基因生物为直接食品或以这种生物为原料，加工出来的食品都被称为转基因食品。转基因食品在欧美应进入人们的日常生活中。有资料表明，在欧洲，玉米钻心虫每年要毁坏4000万吨玉米，占世界玉米总产量的7%，但是如果把分离出来的抗钻心虫基因植入玉米中去，就可培育出抗虫害的玉米，这种玉米就是转基因食品。
二、现代技术发展引发的伦理问题
（一）关于克隆人的争议。从“多莉”羊的克隆成功，待几年来其他克隆动物的尝试，克隆技术正不断发展。目前科学界把对人体的克隆分为治疗性克隆和生殖性克隆。科学界和伦理界对治疗性克隆普遍支持。但生殖性克隆，即克隆完整的人则遭到很大的抵制。克隆人给伦理道德方面带来了巨大的冲击，对现有的社会关系、家庭结构造成了巨大的冲击。另外，克隆人的身份难以认定，使人伦关系发生模糊、混乱乃至颠倒，进而冲击传统的家庭观以及权利与义务观。
（二）胚盘干细胞研究中的生命伦理问题。由于胚盘干细胞的制备是离不开人类卵子、胚盘以及克隆技术的，而卵子与胚盘在一些不同的国家和宗教界被视为是生命的起源，与活着的婴儿没有什么不同，所以在许多国家是被严格禁止的。坚持认为可以用人类胚胎做实验的人认为：1、早期胚胎仅是一团细胞，尚难称其为人的一条生命，从胚泡内细胞培养成人的胚胎干细胞，并没有杀死细胞，只是改变细胞的命运；2、培养胚盘干细胞是用于治疗现在还无法治愈的组织坏死性疾病，让病人恢复健康，完全是合乎人类伦理道德。
（三）转基因食品的潜在危险。对转基因食品发展有两种态度：支持者极力宣传其带给人类充足的粮食和新型抗病虫策略；反对者则强调人为地用基因技术改变神武，会给人体健康和环境带来危害。基因表达调控是个复杂的生命现象。目前，人类对基因的活动实施了解还不够透彻，还没有十足的把握控制基因中组后的结果。1993年英国的一份报告列出了一些人们对于转基因食品应用的来努力方面的主要担忧：1、人类基因转入食品动物，如将人类基因因子与凝血的蛋白质的基因转入绵羊中；2、某些宗教团体禁止食用的动物基因转入他们通常食用的动物中，这可能触怒犹太人和穆斯林，列入将猪的基因转入绵羊；3、动物基因转入植物中，可能会引起一些素食者的特别关注。
三、现代生物技术发展存在的伦理问题对策
现代生物技术的飞速发展，引发诸多伦理问题，发人深思。为了促进生物技术的和谐发展，应采取相应对策和措施。科学预言，21世纪是生物技术发展的黄金时期，全国普及大众伦理学知识尤为重要，设置伦理学咨询机构，利用各种媒体宣传伦理学知识，增强大众的伦理学意识，提高全民族的整体伦理水平。同时，我们还应改变传统伦理观念，发展中国特色的生命伦理学。总体上，生命伦理学应和国际生命伦理学保持一致，但又要保持中国的特色。另外，培养生命伦理专业人才，解决人才匮乏的局面。生命伦理学的发展任道重远，生命伦理学人才匮乏问题需要解决，设置生命伦理学专业，加快专业人才培养规模势在必行，特别应注重研究生、博士生的培养。
四、结语
现代生物技术的高速发展再给人类和社会带来积极影响的同时，必然会出现各种各样的问题。其中，导致的伦理问题尤其受人们的重视。我们应该正确看待这些问题的发生，并应用学习的科学知识尽力将其引导到好的方面发展。因此，我们任道而重远，希望通过我们的努力使现代生物技术应用给人类带来更多的实惠。
参考文献：
［1］傅继梁.基因组研究引发的伦理思考［J］.科学,2002,54(3)：30-31.