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白藜芦醇范文1
酿酒葡萄渣由河北和新疆提供;白藜芦醇标准品(中国药品生物制品检定所生产);甲醇为上海化学试剂有限公司生产，色谱纯;其他试剂均为市售分析纯。料处理酿酒葡萄渣在60℃的电热恒温鼓风干燥箱中烘24h，粉碎后过40目筛，置干燥器中备用。白藜芦醇的提取［13－15］精密称取30g酿酒葡萄渣原料，以80%乙醇作为提取溶剂，液料比为10mL∶1g，提取温度为60℃，共提取3次，每次提取时间为2h，第2、3次提取前各超声10min，合并3次所得滤液，在40℃条件下用旋转蒸发仪浓缩至干，用三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(体积比4∶4∶0．5∶0．2)溶解，置于10mL容量瓶中，定容得酿酒葡萄渣提取样品。
样品预净化处理(1)白藜芦醇的定性鉴定。白藜芦醇在365nm处显蓝紫色荧光。用薄层层析法检测，展开剂为三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(体积比4∶4∶0．5∶0．2)时，根据标准品Rf值=0．638定性鉴定白藜芦醇的存在，从而能有效控制预处理过程。点样:取活化好的硅胶GF254板，薄层板尺寸为:10cm×20cm，距薄板一端约1．5cm处，用铅笔轻轻划1条与底边平行的直线，确定各样品点样位置。然后分别用毛细管吸取白藜芦醇标准溶液、酿酒葡萄渣溶液进行点样。样点之间的距离约1cm，薄层两边距离约1cm。展开:将点样好的薄层板置于展开剂中，上行展开15cm，取出，挥干溶剂。检测:在365nm紫外灯下观察荧光斑点。(2)样品预净化处理。准确吸取0．5mL提取样品，加样于硅胶柱上(硅胶10g，硅胶柱为10mm×250mm的玻璃柱，湿法装柱)。用约35mL三氯甲烷－丙酮－乙醇－水(体积比4∶4∶0．5∶0．2)洗脱，依据上述方法跟踪鉴定，收集白藜芦醇组分，浓缩至干。用甲醇溶解，置于10mL容量瓶中定容，用0．45μm滤膜过滤得样品溶液。平行处理3个样品，待HPLC测定。1．3．4白藜芦醇含量测定(1)检测波长的选择。以甲醇作为溶剂空白，在220～400nm处对白藜芦醇标准品溶液进行扫描，确定白藜芦醇的最大吸收波长。(2)HPLC色谱分析条件。色谱条件:色谱柱HypersilODS(4．6mm×250mm，5μm);流动相－甲醇－水(体积比45∶55);流速0．8mL/min;柱温35℃;检测波长:306nm;色谱工作站:ShimadzuClass－VP。(3)外标曲线的测定。准确称取白藜芦醇标准品，用甲醇－水(体积比50∶50)溶解后，置于25mL容量瓶中定容。分别从中吸取1、2、3、4、5mL用50%甲醇分别定容至10mL，用0．45μm滤膜过滤，得浓度分别为1．65、3．3、4．95、6．6、8.25μg/mL的白藜芦醇标准溶液。在上述色谱条件下进样10μL，平行测定3次，求其峰面积的平均值，计算得外标曲线。(4)酿酒葡萄渣中白藜芦醇含量测定。将“1．3．3”预净化处理过的样品进样20μL，平行测定3次，计算白藜芦醇的峰面积，根据外标曲线求出白藜芦醇的含量。
检测波长的选择白藜芦醇的紫外吸收光谱图见图1。可见最大吸收波长为306nm，与前人研究结果一致，故本研究选择306nm为检测波长。
外标曲线的确定白藜芦醇标准品的HPLC图见图2。以对照品进样量(μg)x对峰面积积分值y进行线性回归，结果表明，白藜芦醇在0．0165～0．0825μg范围内线性关系良好，其线性方程为y=7×106x－82231(r=0．9999)。
重现性试验按“1．3．4”(4)方法处理样品，平行5份，测定白藜芦醇的峰面积，其5次测定的RSD为4．8%，重现性好。
稳定性试验按“1．3．4”(4)方法处理样品，精密吸取同一样品溶液，于0、1、2、3、4、5、6、12、24h分别进样测定峰面积，RSD为1.2%(n=9)，可见样品在24h内基本稳定。
加样回收率试验加20μg白藜芦醇标准品于酿酒葡萄渣样品中，平行5份，按“1．3．4”(4)方法处理样品并进行HPLC测定，每个样品平行测定3次，求平均峰面积，根据外标曲线计算加样回收率。5次测定的白藜芦醇的回收率为94．1%、95．3%、96.7%、102．9%和105．6%，平均回收率为98．9%，RSD为5.04%(n=5)。
酿酒葡萄渣中白藜芦醇的含量测定酿酒葡萄渣预处理样品的HPLC图谱见图3。经过一步硅胶柱预处理，不仅白藜芦醇得到了富集，且白藜芦醇峰与其他杂质峰得以完全分离，无杂质峰干扰，预处理净化效果好。试验测得河北酿酒葡萄渣中白藜芦醇的含量为6．482μg/g干葡萄渣，而新疆酿酒葡萄渣中未检测到白藜芦醇。
白藜芦醇范文2
[关键词] 癫痫；白藜芦醇；异常放电；炎性反应
[中图分类号] R742.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）07（b）-0038-03
[Abstract] Epilepsy is a chronic， recurrent paroxysmal disease. About 20%-30% of epilepsy patients cannot be effectively controlled after rational therapy. Epilepsy pathogenesis complex and the antiepileptic drugs have certain shortcomings and some side effects. Resveratrol is a pleiotropic phytoalexin， which has a certain effect on epilepsy treatment. The antiepileptic mechanism of resveratrol includes inhibitting the abnormal discharge of epilepsy， reducing the inflammatory reaction after seizure， playing the antagonistic role on cell apoptosis induced by seizure and protective effects on neurons.
[Key words] Epilepsy； Resveratrol； Abnormal discharge； Inflammatory reaction
癫痫是神经系统常见疾病，由脑血管疾病、器质性病变、感染性疾病、遗传等多病因引起的综合征，全世界癫痫患病率为1%，约有5000万例癫痫患者[1-2]。长期反复的癫痫发作不仅使患者躯体受到损害，而且在一定程度上可导致患者心理障碍及一系列的社会问题。抗癫痫药物如卡马西平、丙戊酸等可有效地控制部分癫痫患者，但仍有20%～30%的患者经正规的抗癫痫治疗后发作不能得到有效控制，成为难治性癫痫。另外一方面，由于目前现有的抗癫痫药物均有副作用，且药理及药力动力学上存在一定的不足，因此临床上一直在找寻一种新型的抗癫痫药物。白黎芦醇（resveratrol，Res）是一种天然多酚类，广泛存在于葡萄皮、虎杖等多种植物中。Res具有抗氧化、清除氧自由基、抗癫痫等多种生理活性[3]。在其众多生物与药理活性作用中， 目前越来越引起人们关注的是Res抗癫痫作用[4]，已成为新的研究热点。本文就Res来源和体内代谢过程、抗癫痫及神经保护作用及临床应用所面临的问题作一综述。
1 Res的来源、利用及代谢
Res的化学名称为3，5，4-三羟基二苯乙烯，是一种植物抗毒素，其结构为一种多酚化合物，广泛存在于葡萄皮、虎杖等植物中。天然存在的Res有反式和顺式两种同分异构体，其中以反式结构较为稳定，生物活性更好[5-6]。在人体内主要以白藜芦醇苷的形式存在。Res可以先与葡萄糖结合，生成相应的苷类，在肠道中糖苷酶的作用下可以释放出Res而发挥药理学活性。体外研究显示50%～98%的Res可与白蛋白、低密度脂蛋白及血红蛋白结合[7-8]。在人类大约50%的Res代谢产物通过结合蛋白转运；70%～98%的Res在24 h内在肾脏被代谢掉[9]。
2 Res参与癫痫治疗的作用机制
2.1 Res抑制异常放电
癫痫发作由神经元细胞发生异常放电所致，神经元异常放电的确切机制至今尚未完全阐明。目前有癫痫病理学研究发现，癫痫最明显的病理学特征是海马苔藓纤维发芽（mossy fiber sprouting，MFS），有实验表明，海马CA1区神经元大量丢失，使其下位突触空缺，诱导存活神经元异常芽生，从而参与MFS生长，引起神经元网络重组，改变痫样放电的方向和传播途径，避开一些抗癫痫药物作用的重要靶点，导致难治性癫痫的形成[10-11]。目前有研究发现Res可明显地抑制MFS，降低了海马内神经元同步化放电和癫痫自发发作的频率，具有较好的抗癫痫作用[12]。尤竹燕等[13]通过正常大鼠海马脑片灌流γ-氨基丁酸受体拮抗剂引起癫痫样活动以及在正常大鼠海马CA1区注射海人藻酸建立颞叶癫痫大鼠模型，应用离体脑片细胞外场电位记录，发现随着Res灌流浓度增加到50 μmol/L，可部分抑制两者诱发的癫痫样活动，并指出 Res抑制异常放电的可能机制为通过调节N-甲基-D-天冬氨酸受体的功能抑制海马CA1区的癫痫放电。目前有研究指出中枢神经系统内兴奋性和抑制性氨基酸比例的失衡可能是导致癫痫发作的直接原因[14]，李敏等[15]发现低剂量Res对慢性癫痫大鼠海马谷氨酸（Glu）/γ-氨基丁酸（GABA）比值失衡具有明显保护作用，但对皮层 Glu/GABA 比值失衡没有明显保护作用。
2.2 Res与癫痫发作后的细胞凋亡
细胞凋亡是一种特殊的细胞死亡类型，其受生理及病理诱导而发生，该过程包括细胞内信号系统的激活，相应凋亡程序的启动，最终实现细胞的自我破坏、自我死亡。反复和长期的癫痫发作易导致大脑尤其是海马区神经元的发生坏死和凋亡[16-17]。不少临床及动物模型证明了癫痫发作继而发生海马硬化、神经细胞变性，都可直接导致大脑海马萎缩，这种体积的改变是神经细胞凋亡的结果。凋亡是一个精细调控过程，其中包括了不同基因表达的改变。其中Bax和Bcl-2是调控细胞凋亡的重要基因，Bcl-2是抗凋亡基因Bcl-2家族中的重要成员，其在调控细胞线粒体介导的凋亡中发挥着重要的作用。Bcl-2的高表达对神经细胞有一定的保护作用[18]。另外一方面Bax可以促进细胞凋亡的发生，其具体机制可能与破坏线粒体膜及促进细胞色素C释放有关[19]。当细胞凋亡发生时，细胞内Bax和Bcl-2的比率升高[20-21]。郭家智等[22]发现，经Res预处理的癫痫大鼠海马内抗凋亡Bcl-2表达及Bcl-2阳性细胞量均增加。促凋亡因子Caspase-3和Bax表达被抑制，Caspase-3和Bax阳性细胞总量减少，提示了Res可抑制癫痫大鼠海马凋亡相关蛋白的表达，对抗癫痫发作所诱导的细胞凋亡过程。
2.3 Res减少癫痫发作后炎性反应
目前大量的实验和临床研究证实炎性反应在癫痫的发生和发展中起重要的作用[23-25]。癫痫发作后的炎性反应提高了神经元兴奋性，继而进一步损伤仍存活的神经元细胞。有研究显示癫痫能激活雷帕霉素哺乳动物靶点（mammalian target of rapamycin，mTOR），提高核转录因子kappa B（nuclear transcription factorkappa B，NF-κB）活性，促进炎症因子一氧化氮合酶、环氧合酶-2等的表达，从而发挥抗癫痫作用[26]。
2.4 Res与癫痫发作后神经元保护作用
除了抑制癫痫发作的异常放电，Res具有神经元的保护作用也是其治疗癫痫的理想方法[27]。而近年来针对神经退行性疾病、脑损伤实验研究均提示Res具有神经元保护作用[28-29]，且对正常大脑具有维护线粒体功能、神经保护的活性[30]。目前已有大量的临床研究证实了癫痫反复发作可导致认知功能障碍。近期研究发现Res对戊四氮致痫大鼠同时具有抗癫痫和改善其空间学习记忆能力的两重作用，与其保护神经元的作用有关，但具体作用机制尚不明确[31]。
3 Res在癫痫治疗上局限及展望
综上所述，Res通过抑制异常放电、抗凋亡、抗炎以及神经元保护作用等多个途径来实现治疗癫痫。但目前的研究多局限于动物实验和细胞实验，临床应用的研究报道较少，而对于其临床应用安全性、有效性的研究目前未见有报道。在今后的工作中，研究重点应当逐步转移到人体内的机制研究、 临床试验以及安全性的探索，为Res作为治疗癫痫药物的开发提供更多有力依据。
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白藜芦醇范文3
【关键词】 虎杖 白藜芦醇 微波辅助提取 正交实验 紫外分光光度法
虎杖别名花斑竹、酸筒杆、酸桶笋、酸汤梗、川筋龙、斑杖根，为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum，的干燥根茎和根。多生于山谷、溪旁或岸边，分布在我国中部及南部。产于江西、福建、云南、四川、贵州等地。药理作用：（1）对心血管系统的影响：强心扩血管作用；抑制血小板聚集、抗血栓；改善微循环、抗休克作用；降血脂；（2）对呼吸系统的影响：镇咳、平喘作用；（3）对消化系统的影响：胃肠道作用、保肝用；（4）止血抗炎作用；（5）镇静作用；（6）修复损伤的DNA及保护大脑皮层神经元功能、对酶活性抑制作用、对内分泌的影响、对基因表达的影响、利尿作用等[1]。研究结果表明虎杖含有如下多种化学成分：含有大黄素、大黄素-6-甲醚、大黄素-8-单甲醚、大黄酚、大黄酸及蒽苷大黄素-6-甲醚-8-β-D-葡萄糖苷和大黄素-8-β-D-葡萄糖苷等[2]；含有白藜芦醇和白藜芦醇苷（虎杖苷）.其中白藜芦醇和白藜芦醇苷为主要药用成分。白藜芦醇（3，4，5，-三羟基二苯乙烯；trans-resveratrol）是一种活性多酚物质，在虎杖、葡萄、花生、毛穗藜芦、毛脉酸模等植物中存在[3]。白藜芦醇的功能作用：首先，具有抗癌作用，可用于预防与治疗慢性炎症和癌症。对肿瘤的起始、促进、发展三个阶段均有抑制作用，可作为天然的化学防癌剂。其次，在心血管方面的作用。适量饮用葡萄酒有利于心血管健康的观点已得到普遍认同。另外，白藜芦醇还具有抗氧化、抗自由基，保护肝脏，抗菌，消炎，抗过敏等多种有益人体的功能作用[4]。目前，国内在白黎芦醇的提取方面研究较多。一般是采用有机溶剂提取，如乙醇、甲醇、丙酮等，以丙酮提取率最高。提取方式有浸渍提取、回流提取、超声提取等，硅胶柱层析或大孔吸附树脂吸附分离的方法来提纯白黎芦醇；检测多以高效液相色谱。本实验以微波辅助提取，具有省时、方便等作用，微波辅助提取中药有效成分具有选择性好、提取纯度高和高效快速的特点，已在中草药化学成分提取方面得到广泛应用。 有关虎杖中白藜芦醇、白藜芦醇苷和大黄素含量测定方法的研究报道较多，主要有分光光度法、胶束薄层色谱法、电化学发光法、高速逆流色谱法、高效液相色谱等[5-6]，其中以分光光度法最为简单方便。本研究探讨微波辅助提取虎杖中白藜芦醇的工艺研究，并建立测定白藜芦醇含量的紫外分光光度法，旨在为虎杖的药理作用研究以及科学合理利用提供试验依据。
1 实验部分
1.1 原料、试剂与仪器
（1）实验原料、试剂；虎杖，产地：福建三明； 95%乙醇；乙酸乙酯；石油醚；均为化学纯；白藜芦醇，产地：美国，分析纯。（2）实验仪器；TR-02型药材粉碎机：（武义县屹立工具有限公司）；LWMC-205型可调功率微波化学反应器 ：（南京陵江科技开发有限责任公司）；SHB-III循环水式多用真空泵：（郑州长城科工贸有限公司）；UV-2550型紫外分光光度计：（厦门精艺兴业科技有限公司）；FA1604N型电子天平：（上海精密科学仪器有限公司）；RE-52B旋转蒸发仪：（上海博经经贸公司）；SYP智能型玻璃恒温水浴锅：（巩义市予华仪器责任有限公司）；玻璃仪器气流烘干器：（巩义市予华仪器责任有限公司）722S-可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司。
1.2 分析方法
本方法采用紫外分光光度计在306.4nm出测量所提取液的吸光度。一定的波长下有吸收峰进行测定。白藜芦醇的英文名Resveratrol简写RES，分子式C14H12O3，分子量228.25，无味、白色晶体难溶于水，易溶于乙醇，甲醇，丙酮等有机溶剂，本实验以白藜芦醇为对照品，以乙醇为溶剂，采用分光光度法在306.4nm波长下直接进行白藜芦醇吸光度值的测定，从而分析计算其含量。
1.3 实验步骤
（1）备料；把虎杖根茎烘干、把干净的虎杖用粉碎机粉碎，过40目筛后放存储瓶中备用。（2）配制溶液；分别配制45%、55%、65%、70%、75%、80%的乙醇溶液：乙酸乙酯：水为1：1的溶液。（3）供试品溶液制备；按照实验方案准确称取1.0g若干份虎杖根茎粉末，分别置于三角锥形瓶中，加入相应浓度和体积的乙醇浸泡6小时，置于微波化学反应器中按方案提供的条件提取，冷却室温后抽滤；加石油醚洗涤至上层清液为无色，滤液再用乙酸乙酯：水为1：1的溶液萃取3次（每次所用溶液为20ml），将萃取液转入旋转回流蒸发仪中，40℃水浴浓缩，样品浓缩后，至于50ml容量瓶中加95%乙醇至刻度，摇匀，分别取2ml至25ml容量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试液备用。（4）微波辅助提取虎杖中白藜芦醇及测定的工艺流程；虎杖根茎干燥粉碎烘干过筛（40目）按料液比浸渍微波提取冷却石油醚洗涤1：1的乙酸乙酯：水溶液萃取旋转回流蒸发仪（40℃水浴）蒸发定容（50mL容量瓶）移取2.00mL定容（25mL容量瓶）测定吸光值分析计算提取率。
1.4 标准曲线的绘制
（1）对照品溶液的制备；准确称取白藜芦醇标准品10.00mg至50mL容量瓶中，用无水乙醇配成浓度为0.2mg/mL的对照品溶液。（2）最大吸收波长的选择；准确吸取对照品溶液0.3mL，置于10mL容量瓶中，加人95%乙醇定容，再取95%的乙醇溶液为空白对照液，及所制取的供试品溶液，将三种溶液用UV-2550型紫外分光光度计于波长为200——400nm范围进行扫描。结果表明：供试品溶液及对照品溶液均在波长306.4nm处有最大吸收峰，因此选择306.4nm为测定波长。（3）标准工作曲线：分别精确吸取0.2mg/mL的白藜芦醇对照品溶液0.0mL、0.15mL、0.3mL、0.45mL、0.6mL、0.75ml、0.9ml置于10ml容量瓶中定容，同时以95%乙醇试剂空白对照，在306.4nm处测定吸光度。以白藜芦醇标准溶液的浓度为横坐标，测定的吸光度为纵坐标，作图得到标准曲线，其回归方程为：Y=0.1614X+0.0682， R=0.9991。本品在3.0μg～18.0μg/ml范围内线性关系良好。结果见（图1）。
1.5 微波辅助波提取虎杖白藜芦醇的影响因素
微波时间：5—25min；微波功率：200W—600W；溶剂：不同浓度的乙醇（45%-80%）
料液比：1：15—1：35。
（1）微波辅助提取单因素实验；准确称取1.0g干燥的白藜芦醇根茎粉末，用不同微波时间、微波功率、乙醇浓度、料液比分别进行单因素实验。其中相同的提取条件分别是微波时间5min、微波功率400W、乙醇浓度70%、料液比1：25。（2）微波波提取正交优化实验设计；实际操作中各因素相互交叉影响，为了全面考察影响因素，在单因素的基础上，选取各单因素的较优条件，设计4因素3水平正交实验L9（34），确定白藜芦醇的最佳提取条件。
1.6 虎杖中白藜芦醇提取量的计算方法
白藜芦醇提取率：x（%）=（a×50×25/2m）/106
式中：x为样品中白藜芦醇的含量%；a为对应标准曲线上所对应的样品中白藜芦醇的质量（ug）；m为样品的质量（g）。
2 结果分析与讨论
2.1 虎杖中白藜芦醇提取的单因素实验
（1）料液比的选择；料液比即提取过程中原料与提取溶剂的比例（为便于换算，使用质量w/体积v）。料液比对提取过程的影响主要体现在相同的提取条件下，白藜芦醇等化合物的溶解度一定，此时若增大提取溶剂，则溶解的化合物的量也增大。理论上，在原料一定时，提取溶剂增大，三萜类化合物的浸出量增大；但提取溶剂并非能无限增大，若提取溶剂用量太大，一方面回收溶剂的成本增加，另一方面提取过程加热的能耗增加。为寻求最佳的料液比，本实验考察在70%乙醇﹣水体系，微波功率为400W、微波提取时间为5min，不同料液比条件下白藜芦醇的提取率，结果见图2所示。
（2）乙醇浓度的选择；白藜芦醇是多酚化合物，主要来源于蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的根茎提取物。白藜芦醇为无味的白色晶体；难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。考虑到甲醇和丙酮的毒性和挥发性，所以本实验采用乙醇-水为溶剂，根据相似相容原理，调节乙醇水比例，使其极性与白藜芦醇相近，从而使得白藜芦醇在提取溶剂中达到最大溶解度。在乙醇﹣水体系下，微波功率为400W、微波提取时间为5min、料液比1∶25，三萜类化合物的提取率见图3。结果表明随乙醇体积分数的增大，提取率增大，浓度增大有利于增大白藜芦醇的溶解度，当达到一定程度时提取率不再增大，所以选择乙醇浓度70%为最佳浓度。
（3）微波提取时间的影响；白藜芦醇从虎杖的根茎中溶解到溶剂中是需要一定的时间，当破碎的细胞中的白藜芦醇溶于溶剂中后，采用微波直接作用于虎杖根茎分子，使细胞破裂是需要一定的时间，时间的长短可能决定着虎杖根茎细胞的破裂程度，从而影响虎杖中白藜芦醇的提取率。为寻找最佳微波提取时间，在微波功率为400W时，料液比1∶25，乙醇浓度70%的条件下，按不同微波提取时间进行提取实验，结果如（图4）。
（图4）表明提取率随时间的延长而增大，当提取时间到达15min后，随着微波时间的延长，提取率增大的不明显或已经停止增长，说明15min时提取率已经达到最大值，所以采取15min为最佳微波时间。
（4）微波功率的影响；粉碎至一定粒度后的药材，一部分虎杖根茎细胞可能会碎裂，其中所含的白藜芦醇可直接被溶剂萃取而转入溶剂中，溶剂与虎杖根茎粉末固体之间的浸泡过程，溶剂不断向固体内部扩散，在细胞内溶解白藜芦醇。当破碎的细胞中的白藜芦醇溶于溶剂中后，采用微波可直接作用于虎杖根茎分子，使分子的热运动加剧，从而引起温度升高，这种热效应可以快速破坏细胞壁，使虎杖中的白藜芦醇有效成分更快的分离提取出来，为寻找最佳微波功率，在微波时间为5min时，料液比1∶25，乙醇浓度70%的条件下，按不同微波功率进行提取实验，结果如（图5）。
（图5）表明提取率随微波功率而增大，但不是很明显，当达到500W时就已经达到了最大提取率，为节约能源的消耗，只需取500W就为最佳提取功率。
2.2 微波辅助波提取虎杖白藜芦醇的正交优化
（1）因素水平；试验选择以下4个因素：微波时间（A）、微波功率（B）、乙醇浓度 （C）、料液比（D）作为考察对象，每个因素取3个水平（表1），以提取物中白藜芦醇含量为评价指标，采用L9（34）正交表进行正交试验设计。
（2）正交实验方案与结果（见表2）.
（3）极差分析；由（表2）的极差计算结果得出，影响虎杖白藜芦醇提取率的因素主次顺序为A>C>D>B，即微波辅助时间对试验结果影响最大，乙醇浓度、料液比影响次之，微波功率影响最小。最佳提取工艺条件应为A2 B3 C2 D3因而，微波辅助波优选提取虎杖白藜芦醇的最佳工艺条件实际为：微波辅助作用时间15min，以70%的乙醇为提取剂，料液比1：30，微波辅助功率为500W。因最佳组合不在试验设计中，须做验证试验。
2.3 验证实验
为了验证优化计算结果的可靠性，选微波辅助作用时间15min以70%的乙醇为提取剂，料液比1：30，微波辅助功率为500W进行验证实验，平行做3组，计算得平均提取率为0.750%，虽然比试验中的最大提取率第4组只大一点，但由于微波功率的影响最小，所以在此条件下的确实确实优于其他条件，为最佳条件。
3 结语
（1）以70%乙醇水体系为白藜芦醇的提取溶剂，溶解度大，无毒而且溶剂回收容易，价格低廉对工业生产具有成本优势。（2）正交实验结果能验证单因素实验，各因素对白藜芦醇提取率影响程度大小依次为：微波辅助作用时间>乙醇浓度>料液比>微波辅助功率，同时能得到最佳的提取参数范围。在最佳提取参数范围取一组参数结果让人满意，最佳提取工艺参数为：微波辅助作用时间15min以70%的乙醇为提取剂，料液比1：30，微波辅助功率为500W，在该条件下，白藜芦醇的提取率为0.750%，关于虎杖中微波辅助提取白藜芦醇并测定其含量的报到相比，本实验方案采用的溶剂无毒、低成本、方法简单、检测采用分光光度法操作方便，且的到的提取率高，这是本文的独特之处。（3） 微波辅助波与传统的醇溶剂浸提法相比，操作时间明显缩短，能达到降低成本、省时、高效、节能、减少污染的目的。
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白藜芦醇范文4
关键词：白藜芦醇;细胞自噬;肿瘤;凋亡
1通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，白藜芦醇抑制乳腺癌干细胞样细胞（BCSCs）增殖和诱发细胞自噬[1]。天然多酚类化合物白藜芦醇，大量存在于植物性食物，其抗癌特性已被广泛的研究。考虑到癌症干细胞在乳腺肿瘤发生和进展中的重要作用，白藜芦醇对肿瘤干细胞的影响是值得研究。白藜芦醇显著抑制BCSCs的增殖，和减少了BCSCs的百分比，因此在非粘着球状群中，减少了乳腺球的大小和数量。因此， 给NOD / SCID小鼠（不肥胖的糖尿病/严重联合免疫缺陷）注射白藜芦醇（100毫克/公斤/天）有效地抑制移植肿瘤的生长和在肿瘤细胞减少BCSC。原发肿瘤细胞再植入二级老鼠30 d后，6个对照组都产生肿瘤，而用来源于白藜芦醇处理老鼠肿瘤细胞植入6只老鼠只有1只产生肿瘤。进一步，通过TEM（透射电子显微镜） 分析 puncta LC3-II形成，用免疫印迹分析GFP-LC3-II，Beclin1和Atg 7，表明白藜芦醇诱发BCSCs自噬。此外，白藜芦醇在BCSCs中，抑制了Wnt /β-catenin信号途径;通过转染质粒过表达的β-catenin明显减少了白藜芦醇诱导的细胞毒性和BCSCs的自噬。我们的研究结果表明， 通过抑制Wnt /β-catenin信号通路，白藜芦醇抑制BCSCs增殖并诱发细胞自噬。
2 白藜芦醇引起人K562凋亡、红系分化和自噬[2]。白藜芦醇（Res）是一种天然植物抗毒素具有促白血病细胞凋亡和诱导球蛋白的作用，但它潜在的诱导红系细胞分化的作用并不完全理解。在这里，我们调查了白藜芦醇对人类红系巨核细胞白血病细胞系K562 的影响。在处理细胞中， 抑制了细胞增殖，发生了细胞凋亡和细胞死亡。通过红系细胞实验，我们发现Res可能增加了血型糖蛋白的表达（GPA），HBA1、HBB，和γ-globin基因的表达并且加强了GPA，CD71，Band3蛋白质的表达。当Res的浓度增加了50或100μM时，Res也诱导K562细胞自噬。我们的研究结果表明，Res不仅能诱导凋亡也能诱导红细胞分化和K562细胞自噬。这些结果认为Res可能是治疗慢性粒细胞性白血病治疗候选人。
3白藜芦醇诱导的自噬抑制α-MSH引起的黑色素生成[3]。自噬通过自噬小体和溶酶体的协同作用降解细胞组件和细胞器。尽管自噬主要调节细胞组件的更新，但是自噬在黑素原生成上的作用还没有得到很好的解决。在这里，我们表明， 抑制自噬会进一步抑制白藜芦醇（RSV）的抗黑素原生成的活性，白藜芦醇是一个著名的抗黑素原生成药物。白藜芦醇能够强烈地增加黑色素细胞的自噬。然而，在黑色素细胞中，ATG5的损耗显著抑制了白藜芦醇介导的黑素原生成以及白藜芦醇诱导的细胞自噬。此外，在α-MSH处理的细胞中，白藜芦醇可下调酪氨酸酶和TRP1。然而抑制ATG5恢复了酪氨酸酶和TRP1的水平。最重要的是，电子显微镜分析表明，α-MSH和白藜芦醇联合处理细胞后，自噬体吞噬了黑色素或黑素体。总的来说，这些结果表明白藜芦醇介导的自噬调节黑素原生成。
4白藜芦醇抑制人鼻咽癌细胞内质网扩展和内质网天冬氨酰酶介导的凋亡[4]。自噬和内质网（ER）应激反应对肿瘤细胞保持恶性肿瘤和抵抗治疗是重要的。在人类鼻咽癌（NPC）细胞，白藜芦醇，非黄酮类药物，可以诱导细胞凋亡。在这项研究中，将探究肿瘤特异性的ER应激反应和自噬在白藜芦醇介导的细胞凋亡中的作用。透射电子显微镜（TEM）的图像表示，白藜芦醇明显增加了自噬小体的尺寸，新月形的单层膜的液泡包含多薄片状膜结构也增多。延长白藜芦醇处理时间会引起ER膨胀的大量积累。使用EGFP-LC3B转染和激光共聚焦显微镜的方法，我们发现了白藜芦醇诱导的用内质网跟踪红素共定位的EGFP-LC3 斑点，暗示LC3II参与了ER扩张。用ATG7的siRNA抑制自噬或用bafilomycin A1阻断自噬流，白藜芦醇的促凋亡效应被增强，但那用siRNA有针对性的沉默IRE1和CHOP后白藜芦醇的促凋亡效应没有改变。使用半胱天冬酶抑制剂，我们了证实了ucasp12的上调和casp4的激活与白藜芦醇诱导的促凋亡相关，通过caspase-9 / caspase-3途径。有趣的是，casp12的敲出，但不敲出caspase-4，减弱了NPC细胞对白藜芦醇介导的细胞凋亡的敏感性。此外，我们表明，白藜芦醇加了神经酰胺，且存在剂量依赖。使用丝氨酸棕榈先转移酶 （SPT，新创神经酰胺的生物合成的关键酶）的抑制剂（L-cycloserine和myriocin），我们发现神经酰胺积累的增加与白藜芦醇的促细胞凋亡的作用密切相关。本研究揭示了ER的扩张和ER casp12的一起上调可能表明白藜芦醇具有深远的生物效应和促进NPC细胞死亡。针对ER应激的不同状态可能会提供一个合理的癌症治疗策略。
5葡萄种子提取物和白藜芦醇通过AMPK活化和相关的生物反应抑制4-硝基喹啉氧化物引起小鼠的口腔癌变[5]。对口腔癌变的预防措施是迫切需要来保证降低全球性的恶性肿瘤相关的高发病率和死亡率。在这里，我们调查了，在4-nitroquinoline-1-oxide（4NQO）引起舌头肿瘤C57BL / 6小鼠体内，葡萄籽提取物（GSE）和白藜芦醇（Res） 的化学预防疗效。用4 nqo处理老鼠8周，用ain - 76饮食或饮食含有0.2% GSE Res（w / w）或0.25%（w / w）处理随后的8周，同时用4 nqo处理老鼠。在16周终止研究，对舌头做组织结构上的评估，增生，组织发育不良，状病变。然后用免疫组织化学分析分子靶点。GSE和Res喂养8周，虽然只是适度减少发病率，但明显阻止了4 nqo诱导的肿瘤出现前的肿瘤病灶的多重性和严重性，没有任何明显的毒性。在4 nqo + GSE和4 nqo + Res处理组老鼠舌组织降低了扩散 （BrdU标记指数），但增加了凋亡（TUNEL-positive细胞）相对去4 nqo组。此外，舌组织4 nqo + GSE和4 nqo + Res组显示增加了激活的代谢调控子phospho-AMPK（Thr172）和减少了自噬通流标志p62。这些发现表明，GSE和Res通过调制AMPK活化可以有效防止4 nqo诱导的口腔肿瘤发生，从而，抑制扩散和诱导凋亡和自噬。
6硫代物为白藜芦醇生成提供了胞内池并引起肿瘤细胞衰老和自噬[6]。临床前研究表明植物化学分成白藜芦醇可以产生许多有益健康的好处，但白藜芦醇快速的新陈代谢和低的生物利用度可能会限制他的应用。白藜芦醇代谢物可能促进体内化合物的再生活动。我们分别用硫酸和葡糖苷酸偶联白藜芦醇来定量在人血浆和组织中的白藜芦醇。志愿者和癌症患者重复摄入白藜芦醇。随后用resveratrol-3-O-sulfate和resveratrol-4 -O-sulfate喂养小鼠，这些代谢物口服吸收，但生物利用度分别只有14%和3%。体内硫酸水解释放的自由白藜芦醇，占老鼠血浆白藜芦醇总数的约2%。单硫酸酯代谢物能也转入人类大肠细胞。细胞吸收的程度依赖于特定的膜转运蛋白和抗增殖活动决定。硫酸代谢物诱导自噬和人类肿瘤细胞衰老; 硫酸酯酶抑制剂可废除这些影响包含，并且减少细胞内白藜芦醇。综合在一起，我们的研究表明，白藜芦醇是以稳定sulfate-conjugated形式被送到目标组织和在特定的细胞中化合物是逐渐地再生和这种模式可能使白藜芦醇产生有益的影响。
7白藜芦醇依赖Ca（2+）/AMPK/mTOR途径诱导人肺癌A549细胞自噬性死亡[7]。白藜芦醇有许多生物效应，包括抗肿瘤、抗病毒，和保护血管。最近的研究表明，白藜芦醇通过诱导自噬发挥抗肿瘤效应， 但是其机制还是未知的。在这项研究中，我们调查了在人类肺癌A549细胞，自噬参与白藜芦醇诱导细胞死亡过程中的作用和其潜在的分子机制。用MTT和克隆实验来分析评估白藜芦醇引起的生长抑制和细胞死亡。用自噬用磺酰尸胺，透射电子显微镜，自噬标记蛋白LC3的表达来检验自噬的激活。免疫印迹分析用于研究细胞自噬引起死亡的相关信号通路。用Fura2-AM染色检测细胞内自由钙。我们的研究结果表明，白藜芦醇诱导A549细胞死亡是由自噬介导的。自噬抑制剂3-methyladenine，抑制了白藜芦醇诱导的细胞自噬死亡。用siRNAs抑制自噬相关基因Atg5和Beclin-1 的表达，逆转了白藜芦醇诱导细胞死亡。白藜芦醇的实施立即导致细胞内自由钙的积累。自由钙的积累导致phospho-AMPK和phospho-Raptor的激活和phospho-p70S6数量的减少。AMPK抑制剂和钙离子螯合物可以逆转这些影响。总之，我们证明白藜芦醇通过Ca（2 +）/ AMPK-mTOR细胞自噬死亡信号途径，诱导A549细胞死亡。
8白藜芦醇在宫颈瘤中通过凋亡和自噬引起细胞死亡[8]。宫颈肿瘤是女性最常见的癌症之一，与高危人瘤病毒（HPV）感染有关。天然多酚的化学物质白藜芦醇， 基于他有可能作为化疗药物来治疗癌症已经引起了人们相当大的兴趣。这项工作中，我们在几种宫颈癌细胞系中，分析了白藜芦醇诱导细胞死亡的类型。白藜芦醇 （150 - 250年？mol / l）处理C33A（p53突变）和海拉细胞（HPV18阳性），以及在CaSki SiHa细胞系（HPV16阳性）48 h增加了停留在G1期周的细胞。Annexin-V流式细胞术分析，在所有的细胞系中，白藜芦醇诱导了细胞凋亡，，尤其是在CaSki细胞。HeLa，，CaSki，SiHa细胞线粒体膜电位下降（凋亡）和C33A，CaLo（HPV18阳性），和Hela细胞系溶酶体渗透率增加（自噬）。此外，当我们使用IC50 of each line，我们发现白藜芦醇产生了类似的效果，表明这种作用不依赖于白藜芦醇浓度。有趣的是，白藜芦醇处理后， HPV18阳性细胞系（CaLo和hela）p53的表达减少，然而HPV16阳性细胞系（CaSki和SiHa）和C33A细胞p53的表达却增加。在除了SiHa细胞系外所有细胞，p65的表达（一个NF-κB亚基）下降。这些数据表明， 在来自宫颈癌的细胞系中，白藜芦醇通过不同的机制来诱导细胞死亡。
9白藜芦醇可以通过激活自噬，衰老或有丝分裂灾难导致活细胞死亡[8]。在工业化国家癌症的死亡率和发病率的最大原因。在天然产物的药物化学领域，大量研究报道反式白藜芦醇作为化学预防药物的有趣属性，能够对抗对癌症、炎症和病毒感染。肿瘤生长抑制与白藜芦醇联系在一起能够停滞细胞周期的进程和触发细胞死亡。本文综述集中阐述白藜芦醇诱导的细胞死亡的途径。白藜芦醇能够影响线粒体功能 （呼吸链、肿瘤蛋白、基因表达等），这些过程涉及到p53蛋白的磷酸化和乙酰化的形成。白藜芦醇也影响死亡受体的分布，在神经酰胺丰富的膜平台上捕获并聚集受体分子，并在细胞中促进形成死亡诱导信号复合体。对于诱导细胞凋亡，白藜芦醇能激活神经酰胺/鞘磷脂途径，促进神经酰胺的生成和下游级联激酶激活。白藜芦醇可以通过激自噬，衰老或有丝分裂灾难导致活细胞死亡等。此外，之前已有无数人尝试用白藜芦醇类似物来提高分子阻止细胞增殖和诱导细胞死亡的能力。此外， 天然酚类物质结构上的修饰有望产生有用的类似物，来研究构效关系。最后，在各种癌症类型，白藜芦醇的行为作为一个化疗增强剂降低细胞对典型的抗癌剂的死亡阈值和抵消肿瘤细胞药物抗性。
10白藜芦醇在人肝癌Huh-7细胞株中引起细胞周期停滞和促进细胞凋亡[6]。白藜芦醇已被证明具有抗癌，抗衰老，抗炎，抗菌，保护神经活性。在本研究中，我们在一个新的人类肝癌细胞株丙型肝炎病毒的系统Huh-7细胞中，研究了白藜芦醇的抗增殖特性及其分子机制。结果表明，白藜芦醇显著抑制Huh-7细胞增殖（50%抑制浓度= 22.4μg /毫升）和有效地诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡。它上调了p21 / WAF1 的表达，但细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A和周期蛋白依赖性激酶2的表达被抑制。白藜芦醇也增加了促凋亡/抗凋亡蛋白的比例，这与线粒体膜去极化和半胱天冬酶活性的增加有关。白藜芦醇对Fas ，Fas配体，细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）和P38的表达没有影响，但减少了磷酸化ERK 和p38的表达。此外，发现白藜芦醇通过增加自噬相关蛋白Atg5，Atg7，Atg9，Atg12蛋白质，引发自噬性细胞死亡。这些结果表明，白藜芦醇可能是丙型肝炎病毒感染肝癌的重要化学预防剂。
11白藜芦醇通过AMPK- 和 p62/SQSTM1依赖的自噬性的慢性粒细胞白血病细胞死亡[7]。白藜芦醇（RSV）是一个有吸引力的治疗癌症的候选人，因为它具有干预AMPK / mTOR途径各级水平的能力。事实上，RSV是独一无二的，它可以抑制mTOR和S6并且可以激活AMPK。我们的最近的数据表明，RSV引发了自噬性的细胞死亡（ACD），在慢性粒细胞性白血病（CML）细胞中，通过活化AMPK和JNK介导的 p62 / SQSTM1表达。在这里我们将讨论白藜芦醇如何调控CML细胞的ACD，也将探讨白藜芦醇通过AMPK/mTOR和 JNK/p62通路，抗CML和其他造血恶性肿瘤的可能性。
12白藜芦醇引起U373神经胶质细胞瘤中自噬[6]。在真核生物中，自噬是一种细胞内蛋白质运输过程，导致细胞器和长时间使用的蛋白质降解。自噬的下调与肿瘤发展相关。这项研究调查了在人类神经胶质瘤细胞中，天然化合物白藜芦醇诱导的自噬，。神经胶质瘤细用白藜芦醇处理，对细胞生长和自噬水平进行评估。白藜芦醇抑制了U373神经胶质瘤细胞的生长和诱导细胞死亡。白藜芦醇处理后，神经胶质瘤细胞稳定表达GFP融合LC3，细胞产生了更多GFP-LC3-labeled自噬小体，含有GFP-LC3-labeled自噬小体细胞的百分比增加。此外，在白藜芦醇处理的神经胶质瘤细胞种， 用P38或ERK1/2抑制剂预处理，减少了自噬水平，这表明白藜芦醇诱导的自噬被P38和ERK1/2途径调控。Akt/ mTOR途径与白藜芦醇诱导的自噬无关。我们的研究结果表明， 通过诱导自噬白，藜芦醇对神经胶质瘤细胞具有抗癌效果。
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白藜芦醇范文5
[关键词]白藜芦醇;模拟日光照射;红斑;表皮厚度;日晒伤细胞
[中图分类号] [文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)09-1306-03
Protective effects of resveratrol on solar simulator ultraviolet irradiation induced photodamage
JIA Li-li1,2, LI Yuan-hong1, WU Yan1, ZHENG Ying-na1, GAO Xing-hua1
(1.Department of Dermatology, the First Hospital of China Medical University, Key Laboratory of Immunodermatology, Ministry of Health,China Medical University,Shenyang 110001, Liaoning China; 2. Department of Dermatology, the Fourth Hospital of Jilin University)
Abstract:ObjectiveTo investigate the protective effects of resveratrol on the back skin irradiated by solar simulator ultraviolet irradiation (ssUVR). Materials and methods Eleven healthy female volunteers were enrolled in this study. Six sites on the non-exposed back skin were marked for the experiment. Sites 1～4 were applied with resveratrol(Res)+antioxidant(Aox), antioxidant, resveratrol, vehicle, and followed by ssUVR at a dosage of 1.5 minimal erythema dose(MED) 30min later. Site 5 received ssUVR but without any test materials(positive control)and site 6 received neither ssUVR nor test materials (negative control). The subjects exposure to ssUVR once a day for 4 days.EI value were assessed pre- and after-irradiation. The skin biopsies were taken 24 hours after the last ssUVR. The specimens were stained with hematoxylin eosin (HE) staining. epidermal thickness (ET) was measured and the number of sunburn cell (SC) was counted under the microscope. ResultsOn negative control site, no erythema and sunburn cell (SC) was observed and EI value , epidermal thickness (ET) were 194.81 and 69.25 respectively.On positive control and Vehicle+UV sites, obvious erythema was developed, EI values,ET & SC significantly increased to 432.09,123.75 and 20.38 respectively. Whereas on Res+Aox+UV site, only slightest erythema was seen, EI value,ET and SCreached 335.42, 91.25 and 9.13 respectively, with the least changes comparing to other irradiated sites(P
Key words:resveratrol; solar simulator ultraviolet irradiation; erythema
紫外线(ultraviolet, UV)照射可引起皮肤红斑、水肿、色素沉着,日晒伤细胞形成,免疫抑制,甚至皮肤癌等[1]。研究表明白藜芦醇具有抗炎,抗氧化,抑制血小板聚集,以及抑制各种癌细胞生长等多种生理功能[2]。本研究旨在观察白藜芦醇对模拟日光照射(solar simulator ultraviolet irradiation, ssUVR)诱导的急性光损伤的是否具有保护作用。
1材料和方法
1.1 志愿者:招募11名健康女性志愿者,每位志愿者均签署了知情同意书。年龄45～58岁。入选标准:无系统性疾病或皮肤病;未接受系统性治疗或皮肤局部治疗;无光敏史;非妊娠或哺乳妇女。试验于2009年1～2月(北方冬季)进行,以尽量减少外界环境中紫外线的影响[3]。
1.2 试验材料:白藜芦醇+抗氧化剂、抗氧化剂、白藜芦醇、基质均由雅诗兰黛公司(美国纽约)提供。基质霜为保湿霜,不含防晒剂,SPF值
1.3 实验仪器:日光模拟器(GS2006 3.0E版,中国计量科学研究院,北京),氙灯光源,可发射出15倍太阳强度的模拟日光。窄波段反射分光光度计(Mexameter MX18),测量皮肤erythema index(EI)值,每个部位测三次,取平均值。
1.4 方法
1.4.1 试验开始前测定每位志愿者最小红斑量(minimal erythema dose,MED)[4]。
1.4.2 在志愿者背部6个部位进行如下操作:部位1～4分别涂抹白藜芦醇+抗氧化剂、抗氧化剂、白藜芦醇、基质半小时后予1.5倍MED的ssUVR,部位5仅予照射而不涂抹试验样品(阳性对照),部位6既不照射亦不涂抹试验样品(阴性对照)。详见表1。各照光部位每日照射1次,连续照射4天。
1.4.3 试验开始前和末次照射结束后测定EI值。
1.4.4 末次照射后24h对受试部位皮肤进行取材,行HE染色,用测微尺测量表皮厚度并进行日晒伤细胞计数。
1.5 数据处理:EI差值=末次照射后EI值-试验开始前EI值
1.6 统计学分析:采用16.0版SPSS软件包进行统计学分析。各组间数据比较采用方差分析。P
2结果
2.1 EI值:EI值反映皮肤的红斑程度。试验前6个部位EI值波动于184.15～200之间,差异无统计学意义(P>0.05)。研究结束时,5个照光部位EI值均显著升高:以部位4及部位5升高尤为显著,由治疗前的200及189.57分别升至419.21及432.09;而部位1升高最少,由治疗前的195.36升至335.42。部位1与部位4、5相比,EI差值的差异具有统计学意义(P
2.2 表皮厚度:表皮厚度反映皮肤的水肿程度。连续照射4次后,所有照光部位的表皮不同程度增厚。以部位4、5增厚最为显著,而部位1、2、3表皮轻度增厚,与部位4、5相比具有统计学差异(P
2.3 日晒伤细胞:部位6为正常皮肤,无日晒伤细胞(胞核固缩,胞质粉染)。连续照射4次后,所有照光部位均有日晒伤细胞形成。部位4、5的日晒伤细胞最多,而部位1、2、3的日晒伤细胞相对较少,与部位4、5相比具有统计学差异(P
3讨论
白藜芦醇是植物界分布较广的羟基二苯乙烯类化合物,在新鲜葡萄皮中的含量最高[5]。唐桦等[6]研究发现,不同浓度的白藜芦醇对正常HaCaT细胞增殖无明显影响。白藜芦醇在体外对UAB 照射后的HaCaT细胞有保护作用,其机制可能与提高氧化酶活性、清除自由基有关。Afaq F等[7]表明白藜芦醇能抑制UVB诱导的皮肤炎症和水肿。
本研究观察了白藜芦醇对模拟日光照射诱导的皮肤急性光损伤的保护作用。研究结果显示各照光部位EI值均不同程度升高。由于EI值反映皮肤的红斑情况,可间接反映皮肤中血红素的含量,因而EI值可用于皮肤颜色的定量分析。EI越大则皮肤越红。经模拟日光照射后,未抹任检测何物质的阳性对照部位及仅涂抹基质的照光部位出现了明显的红斑,EI值显著升高,提示光照诱发皮肤显著变红。单独涂抹抗氧化剂或白藜芦醇部位红斑较轻, EI 值上升幅度均较上述部位轻,提示上述两种物质分别可一定程度地减轻ssUVR引起的皮肤红斑;白藜芦醇和抗氧化剂联合外涂部位红斑最轻,EI值升高程度显著低于其它照光部位,提示白藜芦醇联合抗氧化剂能有效地保护急性ssUVR引起的皮肤红斑。
紫外线照射后,皮肤的最初反应为血管扩张,表现为皮肤红斑和水肿[8]。表皮厚度可以反应皮肤的水肿程度。Roy等[9]发现用2倍最小红斑量的模拟日光照射皮肤,可引起皮肤厚度增加。本研究的病理结果显示,在所有照光部位表皮均不同程度增厚,其中阳性对照部位和仅涂抹基质部位表皮增厚最为显著,而涂抹白藜芦醇联合抗氧化剂和仅单独涂抹白藜芦醇或抗氧化剂的部位表皮轻微增厚,提示联合外用白藜芦醇和抗氧化剂或单独外用二者之一均能有效地保护模拟日光照射诱发的表皮水肿。
紫外线照射能增加氧自由基的生成,而氧自由基能引起DNA损伤,角质形成细胞凋亡。日晒伤细胞是典型的凋亡的角质形成细胞,表现为胞核固缩,胞质嗜酸性[10]。研究表明紫外线照射的最严重后果是表皮中日晒伤细胞形成[11]。本研究结果显示,经过1.5最小红斑量的模拟日光连续照射4次后,各照光部位均有不同数量的日晒伤细胞形成,其中阳性对照部位和仅涂抹基质部位日晒伤细胞数量最多,而涂抹白藜芦醇联合抗氧化剂和仅单独涂抹白藜芦醇或抗氧化剂的部位日晒伤细胞数量相对较少,提示联合外用白藜芦醇和抗氧化剂或单独外用二者之一均能有效地保护模拟日光照射诱导的日晒伤细胞形成。
4结论
单独外用白藜芦醇或抗氧化剂对模拟日光照射引起的急性的光损伤具有一定保护作用,当二者联合外用时保护作用更强。
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白藜芦醇范文6
目的：探讨白藜芦醇（resveratrol， Res）体内外抗白血病作用的分子机制。
方法：采用HuT78、Jurkat和L1210 3种白血病细胞株，不同浓度Res作用不同时间后，应用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium， MTT）比色法检测细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞凋亡，蛋白印迹法检测Bcl2和Bax蛋白表达，免疫沉淀法检测信号转导子和转录激活子（signal transducers and activators of transcription，STAT）3及其磷酸化活性（phosphoTyr705STAT3， pSTAT3）。BALB/c小鼠随机分为模型组和12.5、25、50 mg/(kg·d) Res组，皮下注射L1210细胞建立白血病模型。逆转录聚合酶链式反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction， RTPCR）检测各组白血病小鼠外周血T淋巴细胞白细胞介素6（interleukin6， IL6）基因表达，流式细胞仪检测IL6蛋白分泌，免疫组织化学法和蛋白印迹法检测肝脏活性pSTAT3蛋白表达。
结果：Res能抑制白血病细胞HuT78、Jurkat、L1210的生长增殖，诱导细胞凋亡，同时明显下调Bcl2/Bax比值、降低活性pSTAT3的蛋白表达；Res还能够剂量依赖地下调白血病小鼠外周血T淋巴细胞IL6 mRNA表达及其胞内分泌，同时降低小鼠肝组织中活性pSTAT3蛋白表达水平。
结论：Res体内外均具有明显的抗白血病效应，其作用机制可能与其对IL6及pSTAT3的影响有关。
【关键词】 白藜芦醇; 细胞凋亡; 白血病; 白细胞介素6; STAT3转录因子; 信号转导接头蛋白类; 小鼠; 体外研究
Methods: Three kinds of leukemia cell lines， HuT78， Jurkat and L1210 cells， were used in this study. After different doses of Res treatment， methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetry was used to detect the cell proliferation; apoptosis was detected by flow cytometry; Western blot and immunoprecipitation method were used to detect the Bcl2 and Bax proteins expression and the activity of phosphosignal transducer and activator of transcription 3 (pSTAT3). Besides， a total of 40 BALB/c mice were randomly pided into untreated group and 12.5， 25 and 50 mg/(kg·d) Res groups. Then， leukemiabearing model was established by L1210 cells subcutaneous injection. Interleukin6 (IL6) was detected to determine the secretion function of T lymphocytes of the mice; the IL6 mRNA expression in the liver tissue of mice was also detected by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR)， and the expression of the pSTAT3 protein was measured by Western blot and immunohistochemical method.
Results: The results indicated that resveratrol could inhibit the proliferation of HuT78， Jurkat and L1210 cells and significantly induce the cell apoptosis. At the same time， the radio of Bcl2/Bax and expression of pSTAT3 protein were decreased either. Furthermore， resveratrol could reduce the expression of IL6 mRNA and intracellular content of IL6， and decrease the expression of pSTAT3 protein in the liver of leukemic mice at a dosedependent manner.
Conclusion: Resveratrol can function as an antileukemic agent through inducing apoptosis， modulating IL6 and STAT3 both in vitro and in vivo.
Keywords: resveratrol; apoptosis; leukemia; interleukin6; STAT3 transcription factor; signal transducing adaptor proteins; mice; in vitro study
白藜芦醇（resveratrol， Res）化学名称芪三酚，结构为3，5，4'三羟基二苯乙烯，分子式为C14H12O3。含有Res的常见中药材有决明、藜芦和虎杖等，食物有葡萄和花生等。Jang等［1］对Res在肿瘤发生、发展各阶段的抑制作用进行了系统的报道，从而使Res成为肿瘤预防和治疗领域的一个研究热点。虽然Res的抗肿瘤作用已在诸多细胞系中得到证实［2， 3］，但其具体应用在不同的研究中存在较大差异，而且现有的研究多局限于功能水平。因此，阐明Res抗肿瘤作用的具体分子机制，是对其开发利用及理论研究的重要前提之一。本课题以3种不同来源的白血病细胞株及白血病腹水瘤小鼠作为研究对象，选用Res为干预药物，采用体外细胞培养与整体动物实验相结合的方法，以探讨Res的抗白血病作用及其可能的分子机制。
1 材料和方法
1.1 主要材料 Res（纯度98.36％，由陕西地区生产的虎杖中提取），购于陕西赛德生物股份有限公司；Bcl2和Bax抗体，购于Labvision公司；CD3藻红蛋白（phycoerythrin，PE）Cy5、CD4异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate， FITC）、CD8PE和IL6PE，购于Ebioscience公司；信号转导子和转录激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）多克隆抗体及其磷酸化（phosphoTyr705STAT3， pSTAT3）抗体，购于Santa Cruz公司；链霉卵白素（histostainstreptavidinperoxidase， SP）免疫组化染色试剂盒，购于北京中杉金桥生物有限公司。小鼠淋巴细胞白血病细胞株L1210，由西安交通大学生命学院王一理老师惠赠；人皮肤T细胞淋巴瘤细胞株HuT78和人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat，由西安交通大学医学院第一附属医院陈颖老师惠赠。BALB/c小鼠，6周龄，雄性，体质量（20±2）g，西安交通大学医学院实验动物中心提供，动物合格证号为SYXK（陕）2007003。
1.2 药物处理及细胞增殖分析 Res溶于二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide， DMSO）成1 g/L，滤过除菌，－20 ℃贮存。用时以RPMI 1640细胞培养基稀释至所需浓度，使DMSO终浓度不高于0.1%，此时对细胞生长活性无影响。台盼蓝染色法活细胞计数≥95%，调整细胞浓度为5 000个/ml，以6.25、12.5、25、50、100和200 μmol/L Res分别培养HuT78、Jurkat和L1210细胞12、24和48 h。加入5 mg/ml甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），终浓度0.2 mg/ml，再培养4 h，弃上清，加入DMSO溶解沉淀，570 nm处测定吸光度（absorbance， A）值，计数细胞生长抑制率及半数抑制浓度（inhibiting concentration 50%， IC50）。
1.3 AnnexinV法检测细胞凋亡 调细胞终浓度为1×105个/ml，用100 μmol/L Res培养HuT78、Jurkat和L1210细胞12、24和48 h，空白对照组加等体积RPMI 1640培养基。FITC标记的AnnexinV和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色后，通过流式细胞仪(FACScan型，美国BD公司)定量检测各组细胞凋亡情况。
1.4 蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl2、Bax的相对表达 以IC50Res培养各组白血病细胞24 h，蛋白印迹法分析Res对凋亡相关蛋白Bcl2和Bax的影响。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis， SDSPAGE），半干法转膜1.5 h，加入相应一抗（1︰200稀释）及辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）标记的二抗（1︰5 000稀释），增强化学发光（enhanced chemiluminescence， ECL）法检测，最后进行图片扫描和分析，采用Quantity One软件进行数据处理，以βactin蛋白为内参照进行半定量分析。
1.5 免疫沉淀法检测活性pSTAT3蛋白表达 0.5%血清饥饿12 h，以25、50和100 μmol/L Res培养HuT78、Jurkat和L1210细胞24 h，并设空白对照组。提取细胞蛋白，以充分重悬的蛋白G琼脂糖（protein G agarose）进行沉淀，BCA法测定蛋白浓度，分别取各组细胞50 μg总蛋白进行SDSPAGE电泳，pSTAT3稀释倍数为1︰1 000，以非磷酸化抗体作内标参考。
1.6 动物给药及模型建立 参见文献方法［4］，40只BALB/c小鼠随机分为L1210对照组和L1210+12.5、25、50 mg/(kg·d) Res组，每组10只，药物干预组小鼠连续灌服Res 3周。给药5 d后，腹腔接种L1210 （1～5）×107个/ml细胞一次，0.2 ml/只。肿瘤接种后继续灌胃治疗16 d，并于接种后第3天起，每天眼眶静脉丛采血进行外周血白细胞计数及血涂片瑞吉氏染色，找到白血病细胞证实小鼠白血病模型建立成功。
1.7 逆转录酶聚合酶链式反应法检测小鼠T淋巴细胞白细胞介素6 mRNA表达 治疗结束后，收集各组小鼠外周血T淋巴细胞，逆转录聚合酶链式反应法（reverse transcriptionpolymerase chain reaction， RTPCR）检测小鼠白细胞介素6（interleukin6， IL6） mRNA表达，按试剂盒说明操作。采用异硫氰酸胍一步法提取RNA，分光光度计测A260/A280比值在1.8～2.0之间。IL6和βactin引物序列由北京奥科生物技术有限责任公司提供。IL6上游引物5'CTG GTG ACA ACC ACG GCC TTC CCT A3'；下游引物5'ATG CTT AGG CAT AAC GCA CTA GGT T3'；扩增片段长度为600 bp。βactin上游引物5'ACC TCT ATG CCA ACA CAG3'；下游引物5'GTA ACA GTC CGC CTA GAA G3'；扩增片断长度为266 bp。采用Promega公司的逆转录试剂盒，按说明书进行cDNA的合成。PCR扩增条件为25 μl PCR反应体系，包括10×PCR buffer 2.5 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，上下游引物各1 μl，Taq酶 2.5 U，cDNA 10 μl。预变性94 ℃ 3 min后，93 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30个循环，循环结束后72 ℃ 5 min。取扩增产物5 μl在1.0%琼脂糖凝胶中电泳（150 V恒压电泳0.5 h），应用GelDoc2000型全自动凝胶成像分析仪照相并测定每条带的光密度值，以βactin的表达量为内参照，计算并比较各组样本目标片段的相对表达量。
1.8 流式细胞术检测小鼠T淋巴细胞内IL6分泌 治疗结束后，收集各组小鼠外周血T淋巴细胞，加入12十四酸佛波酯13乙酸盐（phorbol 12myristate 13acetate，PMA）（使其终浓度为25 ng/ml）和布雷菲德菌素A（brefeldin A，BFA）（终浓度为10 ng/ml），混匀，37 ℃、5% CO2培养4～6 h，将10 μl CD4FITC、10 μl IL6PE、100 μl激活后的T淋巴细胞（2×106/ml）混匀，孵育1 min。加入溶血素，室温暗处孵育10 min，固定，破膜，加入IL6PE（0.5 μg/106细胞）孵育30 min，流式细胞仪分析胞内IL6的分泌情况。
1.9 免疫组化法检测小鼠肝脏活性pSTAT3蛋白表达 取各组小鼠肝脏，后固定1 d，20％、30％蔗糖梯度脱水，冰冻切片（8 μm），其余步骤依据试剂盒说明操作。以胞浆或胞核出现棕黄色连续或灶性颗粒状分布为阳性表达。半定量分析活性pSTAT3蛋白的阳性表达率。
1.10 蛋白印迹法检测小鼠肝脏活性pSTAT3蛋白表达 按照试剂盒说明方法提取小鼠肝脏组织细胞核蛋白，蛋白印迹法操作步骤同前。pSTAT3一抗1︰500稀释，HRP标记的二抗1︰5 000稀释，以非磷酸化抗体作内标参考。
1.11 统计学方法 计量资料数据以x±s表示，所有数据均用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，采用多因素重复测量数据的方差分析或单因素方差分析进行组间比较。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 Res对白血病细胞的生长抑制作用 不同浓度Res作用12、24、48 h，其对白血病细胞的增殖抑制作用呈一定的时间剂量依赖性。Res对白血病细胞的增殖抑制最高生长抑制率约为82.66％（HuT78）、63.95％（Jurkat）以及70.69%（L1210）。Res作用HuT78、Jurkat、L1210细胞24 h的IC50分别为106.38、172.12和99.66 μmol/L。见表1。
2.2 Res诱导白血病细胞凋亡 100 μmol/L Res能以时间依赖性的方式诱导白血病细胞凋亡，同样条件下，Res对HuT78细胞与L1210细胞的促凋亡作用强于Jurkat细胞。流式细胞术分析可见，100 μmol/L Res作用48 h时，（84.33±2.14）％的HuT78细胞发生了凋亡，Jurkat细胞和L1210细胞的凋亡率分别为（41.99±1.73）％和（50.94±2.56）％。见图1和图2。
2.3 Res影响白血病细胞凋亡相关蛋白Bcl2和Bax的表达 以各组细胞的IC50Res培养24 h，βactin作内标参考，蛋白印迹结果显示，Res下调HuT78、Jurkat与L1210细胞Bcl2蛋白的表达水平，明显增加Bax蛋白表达，Bcl2/Bax值显著降低，与相应空白对照相比，差异有统计学意义（P
表1 白藜芦醇对白血病细胞HuT78、Jurkat及 L1210的生长抑制作用（略）
Table 1 Growth inhibition of resveratrol to leukemia cells HuT78， Jurkat and L1210 in vitro
**P
图1 流式细胞仪检测100 μmol/L白藜芦醇干预24 h后对白血病细胞凋亡的影响（略）
Figure 1 Effects of 100 μmol/L Res on apoptosis of leukemia cells after 24hour treatment in vitro detected by flow cytometry
The apoptotic and necrotic cell distribution is analyzed by Annexin V binding and PI uptake. Positioning of quadrants on Annexin V/PI dot plots is performed， and living cells (Annexin V-/PI-)， early apoptotic/primary apoptotic cells (Annexin V+/PI-)， late apoptotic/secondary apoptotic cells (Annexin V+/PI+) and necrotic cells (Annexin V-/PI+) are distinguished. Therefore， the total apoptotic proportion includes the percentage of cells with fluorescence Annexin V+/PI- and Annexin V+/PI+. A， C， E: HuT78， Jurkat and L1210 cells treated with 100 μmol/L resveratrol; B， D， F: Control of HuT78， Jurkat and L1210 cells.
图2 流式细胞仪检测100 μmol/L白藜芦醇干预不同时间后对白血病细胞凋亡的影响（略）
Figure 2 Effects of 100 μmol/L Res on apoptosis of leukemia cells after 12， 24， 48hour treatment in vitro detected by flow cytometry
**P
图3 蛋白印迹法检测白藜芦醇干预24 h后对白血病细胞Bcl2和Bax蛋白表达的影响（略）
Figure 3 Effects of Res on expressions of Bcl2 and Bax proteins in leukemia cells after 24hour treatment in vitro detected by Western blotting
1: HuT78 control group; 2: Jurkat control group; 3: L1210 control group; 4: HuT78 IC50 Res group; 5: Jurkat IC50 Res group; 6: L1210 IC50 Res group.
2.4 Res对白血病细胞活性pSTAT3蛋白表达的影响 不同浓度Res处理各组白血病细胞24 h后，经反复检测，Res作用前，在分子量89 kD处可见一较深的STAT3酪氨酸磷酸化蛋白带，与对照相比，Res以剂量依赖的方式减弱HuT78与L1210细胞STAT3的酪氨酸磷酸化表达；而对于Jurkat细胞，只有100 μmol/L Res可见pSTAT3水平下调，余者变化不明显。各组STAT3非磷酸化蛋白的表达水平无明显变化。见图4。
2.5 Res调控白血病细胞IL6的表达与分泌 Res剂量依赖性地下调白血病小鼠T淋巴细胞IL6 mRNA表达。此外，通过流式细胞术对胞内IL6水平的检测可见，Res能以剂量依赖的方式降低白血病小鼠T淋巴细胞内IL6的分泌水平。见图5和图6。
2.6 Res下调白血病小鼠活性pSTAT3蛋白的表达 各组小鼠解剖后可见白血病小鼠肝脏明显肿大。免疫组化结果显示，pSTAT3呈强阳性表达，Res组肝组织中pSTAT3蛋白表达均下调。模型组阳性率为（86.55±5.26）％，12.5 mg/(kg·d) Res组阳性率为（78.3±3.32）％，与模型组比较差异无统计学意义；25、50 mg/(kg·d) Res组阳性率分别为（43.5±2.55）％和（23.5±3.31）％，与模型组比较，差异有统计学意义（P
蛋白印迹法结果显示，灌服不同剂量Res后，荷瘤小鼠肝组织中活性pSTAT3蛋白表达呈剂量依赖性下调，同时，非磷酸化STAT3蛋白表达无显著变化。见图8。
图4 免疫沉淀法检测白藜芦醇干预24 h后对白血病细胞活性pSTAT3和STAT3蛋白表达的影响（略）
Figure 4 Effects of Res on expressions of pSTAT3 and STAT3 proteins in leukemia cells after 24hour treatment in vitro detected by immunoprecipitation method
1: Blank control group; 2: 25 μmol/L Res group; 3: 50 μmol/L Res group; 4: 100 μmol/L Res group.
图5 RTPCR检测白藜芦醇对小鼠T淋巴细胞IL6 mRNA表达的影响（略）
Figure 5 Effects of Res on the expression of IL6 mRNA in T lymphocytes in mice detected by RTPCR
1: Blank control group; 2: 12.5 mg/(kg·d) Res group; 3: 25 mg/(kg·d) Res group; 4: 50 mg/(kg·d) Res group.
图6 流式细胞术检测白藜芦醇对小鼠T淋巴细胞内IL6含量的影响（略）
Figure 6 Content of IL6 in T lymphocytes in mice detected by flow cytometry Positioning of quadrants on FITC/PE dot plots was performed and intracellular IL6 (FITC＋/PE＋) were determined.
A: Blank control group; B: 12.5 mg/(kg·d) Res group; C: 25 mg/(kg·d) Res group; D: 50 mg/(kg·d) Res group. *P
图7 免疫组化法检测白藜芦醇对小鼠肝脏中活性pSTAT3表达的影响(光学显微镜，×400)（略）
Figure 7 Effects of Res on expression of pSTAT3 protein in liver tissue in mice detected by immunohistochemistry
(Light microscopy， ×400)
A: Blank control group; B: 12.5 mg/(kg·d) Res group; C: 25 mg/(kg·d) Res group; D: 50 mg/(kg·d) Res group.
图8 蛋白印迹法检测白藜芦醇对小鼠肝脏中活性pSTAT3表达的影响（略）
Figure 8 Effects of Res on expression of pSTAT3 protein in liver tissue in mice detected by Western blotting
1: Blank control group; 2: 12.5 mg/(kg·d) Res group; 3: 25 mg/(kg·d) Res group; 4: 50 mg/(kg·d) Res group.
3 讨论
白血病的常规疗法主要是放疗和化疗，但是由于缺乏选择特异性，往往对正常组织、器官（特别是骨髓和消化道）造成功能性或器质性的损伤。有研究显示，Res对造血系统毒性小［5］，提示它在白血病的治疗中具有潜在的应用价值。本研究通过对3种淋巴系白血病细胞的研究发现，Res具有良好的增殖抑制和诱导凋亡作用。
Bcl2基因是血液系统恶性肿瘤最为重要的抗凋亡基因，Bax基因能够与Bcl2组成同源或异源二聚体，通过抑制Bcl2而发挥促进细胞凋亡的作用。现有研究已证实，Bax表达增加和（或）Bcl2表达抑制均可导致线粒体膜渗透性转换，引起线粒体细胞色素C释放，进而诱发Caspase激活以致细胞凋亡［6］。本研究显示，Res能不同程度地减少白血病细胞抗凋亡蛋白Bcl2表达，增加Bax蛋白表达，使Bcl2/Bax比值降低，提示这可能是其诱导白血病细胞凋亡的分子机制之一。但是，白血病细胞凋亡是一个多基因相互作用的复杂事件，这一过程可能还涉及其他的调控基因和信号途径。因此，本研究继续探讨了Res对IL6及信号转导分子的调控作用。
研究显示，炎症往往导致细胞恶性转化或者是致癌过程的起始阶段，肿瘤细胞能持续产生大量IL6，急性淋巴细胞白血病和急性非淋巴细胞白血病患者血清IL6含量明显高于正常水平，IL6可能通过自分泌机制与白血病的发病相关［7， 8］。这些发现使IL6与白血病的关系日益受到人们关注。Takada等［9］比较了几种非甾体抗炎药物，发现Res是其中最强的抗炎和抗增殖物质。本研究中，白血病小鼠T淋巴细胞内IL6水平显著增高，提示其在白血病的病理进程中的确具有重要作用。Res干预后小鼠IL6 mRNA的基因表达明显下调，不过，仅仅从mRNA水平检测IL6的变化还不能揭示Res对IL6蛋白水平的影响。因此，本文进一步采用胞内细胞因子染色的方法检测胞内IL6的分泌。PMA能够刺激T细胞产生IL6，BFA则通过阻断胞内高尔基复合体介导的转运，使IL6聚集在胞内，再通过标记的CD4+分析特异性T细胞分泌IL6的情况。本研究发现，Res对胞内IL6的释放具有较明显的抑制作用。目前已经明确两条信号通路——激活蛋白(activator protein， AP)和蛋白激酶C（protein kinase C， PKC）通路参与IL6的基因表达与调控，Res的作用是否与这两条通路有关及其调控IL6的具体分子机制尚需进一步研究阐明。
STAT信号通路是IL6介导的信号转导途径之一。正常情况下STAT的激活是一过性的，但是白血病细胞中存在STAT的持续性激活，其中活化的主要是STAT1和STAT3。当STAT3被磷酸化激活后形成二聚体并转入核内，通过与DNA作用元件结合，激活与生长增殖有关的基因转录或者增加抗凋亡蛋白（如Bcl2）的表达，最终引起癌变［10］。本研究中，Res剂量依赖地下调白血病细胞pSTAT3和Bcl2表达，提示其可能是通过阻断STAT3信号转导通路，使靶基因Bcl2表达受阻，进而诱导细胞凋亡，发挥抗白血病效应。此外，本研究还检测了白血病小鼠肝组织中pSTAT3的水平。Res使STAT3的酪氨酸磷酸化活性表达降低、STAT3信号的组成性激活明显减弱。Wung等［11］也证实Res能通过减弱STAT3磷酸化抑制IL6诱导的细胞间黏附分子1（intracellular adhesion molecule1， ICAM1）基因表达，与我们的研究结果一致。
本文通过体外细胞培养和动物实验，较为全面、深入地探讨了Res抗白血病、调控IL6及其信号通路的作用。虽然Res体内外均具有较好的抗白血病效应，并且与IL6及STAT3信号通路存在较为密切的相关性，但是由于不同信号转导通路间存在网络交叉，除了IL6外尚有多种细胞因子参与STAT3信号通路，Res是否还影响其他信号分子与转导通路尚不清楚，而且Res对白血病细胞的作用具有高变性，不同细胞对其敏感性各不相同，这些问题都有待于进一步研究阐明。揭示Res发挥作用的具体分子机制，也许能为发展新的白血病治疗策略提供更多启示。
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