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基因重组范文1
1.实例
镰刀型细胞贫血症：正常人的红细胞是圆饼状，而镰刀型细胞贫血症患者的红细胞却是弯曲的镰刀状。这样的红细胞易破裂，使人患溶血性贫血症，严重时还可能危及生命。镰刀型细胞贫血症是一种由于正常基因发生突变后形成致病基因而导致的遗传病。正常人的血红蛋白是由四条多肽链共574个氨基酸构成的，检查镰刀型细胞贫血症患者血红蛋白的氨基酸组成发现，有一条多肽链上的某一位置应是谷氨酸（正常人），而被缬氨酸代替了，这种改变最终导致了镰刀型细胞贫血症的发生。
2.概念
DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构的改变，叫做基因突变（gene mutation）。基因突变的类型有四种：（1）碱基置换突变：即一对碱基置换造成的，如镰刀型细胞贫血症；（2）移码突变：即某位点增添或缺失1—2对碱基造成的；（3）缺失突变：即基因内部缺失某个DNA小片段造成的；（4）插入突变：即基因内部增添了1—n个脱氧核苷酸对导致的。例如：在肺炎双球菌的转化实验中，无荚膜菌活化插入一小段有荚膜菌的DNA，突变形成了有荚膜菌。
例1 若生物体的DNA分子增加或减少一个碱基，这种变化是（ ）。
A.细菌转化 B.基因的自由组合
C.基因突变 D.等位基因分离
解析
基因突变的方式至少有两大类，一类是碱基的替换，一类是碱基对数目的改变。
答案 C
二、基因突变的结果与特点
1.突变结果
基因突变是染色体的某一个位点上基因的改变。基因突变使一个基因变成它的等位基因，由Aa，叫隐性突变，由aA，叫显性突变，通常会引起性状的改变。
2.基因突变的特点
（1）普遍存在，无论是低等生物还是高等生物都可能发生。
（2）随机发生，它可以发生在生物个体发育的任何时期和生物体的任何细胞。
（3）突变频率低。
（4）大多数基因突变对生物体是有害的。
（5）基因突变是不定向的，一个基因可以向多个方向发生突变，形成一个以上等位基因。
3.基因突变的意义
对生物来说，基因突变可能破坏生物体与现有环境的协调关系，而对生物有害，但有些基因突变，也可能使生物产生新的性状，适应改变的环境，获得新的生存空间。还有些基因突变既无害也无益。基因突变尽管是随机的、不定向的，在自然状态下突变频率很低，但却是普遍存在的。基因突变是新基因产生的途径，是生物变异的根本来源，是生物进化的原始材料。
例2 某二倍体植物的抗逆特性由4个基因A、a1、a2、a3控制，且它们的抗逆作用A>a1>a2>a3，请据所学遗传学知识回答下列问题：
（1）基因A、a1、a2、a3的根本来源是___，该现象说明变异具有___的特点。遗传时A与a1、a2、a3之间遵循___定律。
（2）为探究基因之间的显、隐性关系，某实验小组将两纯合子a1a1、a2a2杂交，子二代共有__种基因型。若表现型有__种，则表明这两个基因之间有明显的显隐性关系；若表现型有__种，则表明这两个基因之间无明显的显隐性关系。
（3）经实验验证，A有显性作用，a1、a2、a3之间没有明显的显隐性关系，且基因的作用有累加效应（如个体a1a2的抗逆性由两个基因作用的累加共同决定），则该植物共有__种抗逆类型。
（4）研究得知该植物的抗逆性和细胞内的水杨酸、多胺、脱落酸等物质有关，请据所学知识推测基因控制该植物抗逆性的机理：_____。
解析 本题综合考查遗传知识和逻辑分析能力。等位基因的来源是基因突变，等位基因的多样性体现了基因突变的不定向性（多方向性）。等位基因的遗传遵循基因的分离定律。a1a1、a2a2杂交，子二代共有a1a1、ala2、a2a2i种基因型，若a1a2单独表现一种性状，说明两基因之间没有显隐性关系，若a1a2表现型和a1a1或a2a2中的一种相同，则说明两种基因之间有明显的显隐性关系；若a1、a2、a3之间没有明显的显隐性关系，则该植物的抗逆类型有AA、Aax、a1a1、a2a2、a3a3、a1a2、ata3、a2a3；水杨酸、多胺和脱落酸都不是蛋白质，不会由基因直接决定形成，根据基因对性状控制的两种方式，可以推测基因通过控制酶的合成，间接控制这些物质的生成，进而控制抗逆性状。
答案（1）基因突变 不定向性 分离 （2）3 2 3 （3）8 （4）基因通过控制有关酶的合成，间接控制这些物质的产生，从而控制抗逆性状。
三、基因重组的概念及意义
1.概念
基因重组是指生物体在进行有性生殖的过程中，控制不同性状的基因的重新组合。无性生殖不能产生基因重组。基因重组只是后代中生物个休的基因型改变，生物个体的基冈本身的结构并没有改变。基因的自由组合定律告诉我们，在生物体通过减数分裂形成配子时，随着非同源染色体的自由组合，非等化基因也自由组合。这样，由雌雄配子结合形成的受精卵，就可能具有与亲代不同的基因型，从而使子代性状发生改变。另一种类型的基因重组发生在减数分裂形成四分体时期，位于同源染色体上的等位基因有时会随着非姐妹染色单体的交换而发生交换，导致染色单体上的基因重组。举例来说，人的同卵双胞胎，由于基因组成的相同，性状十分相像。除此之外，没有两个同胞兄弟或同胞姐妹在遗传上完全相同。
2.意义
通常的解释是，有性生殖的基因重组有助于物种在一个无法预测将会发生什么变化的环境中生存。这是因为，基因重组能够产生多样化的基因组合的子代，其中可能有一些子代会含有适应某种变化的、生存所必需的基因组合。所以说，基因重组也是生物变异的来源之一，对生物的进化也具有重要的意义。
四、基因突变和基因重组比较
两个值得注意的问题：
（1）基因重组与基因突变的区别
基因重组是指在生物体进行有性生殖过程中，控制不同性状的基因的重新组合。它包括两种类型：一是由基因的自由组合产生的基因重组，二是由基因的互换产生的基因重组。它们的共同特点是只能产生新的基因型，不能产生新的基因。而基因突变产生的是新基因。基因突变导致原来的基因变为它的等位基因。基因突变如果发生在生殖细胞，突变基因有可能通过受精作用而传给下一代，如果发生在体细胞，则只影响当代，不向下一代传递。
（2）基冈突变是生物变异的根本来源和生物进化的重要因素
基因突变虽然是多数有害，少数有利，但由于它能产生新基因，从而产生了前所未有的新性状，为自然选择提供了大量的变异材料。它与基冈重组的不同之处在于，基因重组仅仅是基因型的改变，而基因突变是基因发生了改变，一个基因变成了新的等位基因，所以基因突变是生物变异的根本来源和进化的重要因素。
例3 下列有关基因重组的叙述中。正确的是（ ）。
A.基因型为Aa的个体自交，因基因重组而导致子代性状不同
B.基因A因替换、增添或缺失部分碱基而形成它的等位基因a属于基因重组
C.同源染色体上非姐妹染色单体问的互换可能导致基因重组
D.造成同卵双生姐妹间性状上差异的主要原因是基因重组
解析Aa个体自交，后代的性状分离是由于等位基因的分离和配子间自由组合而形成的；基因A因替换、增添或缺失部分碱基属于基因突变；同卵双生是由一个受精卵发育而来的，细胞核内的遗传物质是一样的，性状差异主要是外界环境引起的。
答案 C
例4 下列不属于人工诱变的实例的是（ ）。
A.一定剂量的γ射线引起变异得到新品种
B.用一定剂量X射线处理青霉素菌株获得高产菌株
C.玉米单株自交后代中出现一定比例的白化苗
D.激光照射植物或动物引起突变得到新品种
解析
本题主要考查对人工诱发基因突变的理解。人工诱变是指利用物理的或化学的因素来处理生物，使它发生基因突变的方法，而供选答案中的γ射线、X射线、激光都是人工诱变使用的手段之一，所以，A、B、D三项都是人工诱变的实例，只有C项属于自然突变。
答案 C
练习
1.用紫外线照射红色细菌的培养液，几天后出现了一个白色菌落，把这个白色菌落转移培养，长出的菌落全部是白色的，这种性状的改变属于（ ）。
A.染色体变异 B.基因重组 C.自然突变 D.人工诱变
解析 细菌进行无性生殖，在生殖过程不进行减数分裂。因而细菌的变异不可能是由于基因重组而引起。染色体引起的生物变异，它可以改变生物个体的基冈含量、基因的相互关系，但不会产生新的基因，进而不表现出全新的性状，而且细菌是原核生物，无染色体。在紫外线的作用下，基因内部的碱基种类、数量和排列次序发生改变，产生新的基因，控制合成新的蛋白质，表现出新的性状。
答案 D
2.在北京培育出的优质甘蓝品种，叶球最大的只有3.5 kg，当引种到拉萨后，由于昼夜温差大，日照时间长，叶球可重达7 kg左右，但再引种回北京后，叶球又只有3.5 kg，从甘蓝引种过程可以看出（ ）。
A.甘蓝具有遗传性，而不具有变异性
B.仅由环境条件引起的变异不能遗传
C.环境的改变可引起生物产生可遗传的变异
D.甘蓝在生殖过程中无基因重组发生
解析 由遗传物质变化引起的变异能够遗传，仅仅由环境的变化引起，没有涉及遗传物质的变异不能遗传。同一品种的甘蓝含有相同的遗传物质，若在相同的环境条件下，其表现出来的性状是一样的。同一品种的甘蓝在北京和拉萨两地的低产和高产，是两地环境因素不同造成的，而非遗传物质改变引起。而任何生物只要有遗传性，它一定具有变异性，变异可发生在个体发育过程中，也可发生在有性生殖中。
答案 B
3.蕃茄中红果（H）对黄果（h）显性，将红果蕃茄的花粉授到黄果蕃茄的雌蕊柱头上，结了一个半边红色半边黄色的果实。产生这一果实最可能的原因是（ ）。
A.最终发育成该果实的那个花芽中某些细胞发生基因突变
B.提供花粉的花药组织中某个花粉母细胞发生基因突变
C.提供花粉的红果蕃茄是杂合子（Hh）
D.接受花粉的黄果蕃茄是杂合子（Hh）
解析 本题考查的是基因突变的特点。根据题意可知该果实出现半边红色半边黄色的现象，最可能的原因就是发生了基因突变。而发生基因突变的如果是黄果番茄的整个雌蕊或提供花粉的红果番茄的花药组织中某个花粉母细胞，那么就应该是全部红色或全部黄色。所以最可能是最终发育成果实的那个花芽中某些细胞发生基因突变。
答案 A
4.一株世代都是开红花的植物，在一次突然性冰冻后，有一个枝条上出现了一朵白花，白花授粉后所结的种子种下去长成的植株都开白花。试分析该白花是来自于___，其原因是____，使发育成该花芽的细胞在_____发生差错，从而使__的分子结构发生了改变。
基因重组范文2
这一重大发现被美国《科学》杂志列入2007年度十大科技突破之中，同时，英国《自然》杂志将其评为年度十大科技新闻之首。
这项研究对人类有何意义？为何科学界对“胚胎干细胞”不息溢美之辞？记者专访了中科院上海生命科学院、上海交通大学医学院健康科学研究所金颖研究员。
另辟蹊径―――
诱导性多能干细胞由来
人的胚胎干细胞素有“万能细胞”的美誉，但胚胎干细胞研究面临巨大的伦理压力，导致研究之路困难重重。然而，科学界从2006年便开始另辟途径，试图寻找一种方法，将人体正常的体细胞直接转化为具有胚胎干细胞功能的细胞，从而避开伦理之争。
早在2006年8月，日本京都大学山中教授研究小组发现，只要用4个转录因子过量表达就可以把老鼠成纤维细胞逆转到细胞分化前的状态，获得功能与胚胎干细胞类似的准“诱导性多能干细胞(iPS)”，从那时起，全球胚胎干细胞研究界就立刻跟进。
人们通俗地用“皮肤干细胞”来称呼“诱导性多能干细胞”。这项研究简单说来，就是把原本不是多能的细胞(已经分化的细胞)，通过诱导，使之成为多能的细胞(未分化的细胞)。所谓多能的细胞，就是具有变成多种细胞能力的细胞。
里程碑式的突破
2007年11月20日，日美科学家同天宣布利用基因重组技术，向皮肤细胞中植入4个基因，将人体皮肤细胞改造成几乎可与胚胎干细胞相媲美的干细胞。从理论上看，这项研究首次证实了人类已分化的体细胞同样可以被“重新编程”转化为类胚胎干细胞，从而成功避开长期以来争论不休的伦理问题，有望大大推动与干细胞有关的疾病疗法研究。
科学界立即对这个结果给予高度评价，致力于人体胚胎克隆技术研究的美国细胞高级技术研究所首席科学家罗伯特・兰扎甚至将这项研究称为“了不起的科学里程碑。从生物学意义上讲，相当于莱特兄弟制造的第一架飞机”。
但是，日本和美国的发现都有局限。日本研究小组向皮肤细胞中植入的4个基因中，有一个是与癌症相关的基因。美国研究小组虽然没有使用这个基因，但是其研究中用于搬运基因的“慢病毒”也会改写染色体的遗传信息。这些风险，使得两个研究小组的成果离临床应用还有一段距离。
迅速发展―――
小步前进，成果不断
2007年12月6日，日本京都大学的研究小组改进了研究方法，他们通过改变培养环境而摒弃了那个与癌症有关的基因，提高了这种干细胞技术在临床应用中的安全性。
12月7日，美国怀特黑德生物医学研究所的科学家在美国《科学》杂志上说，他们利用皮肤细胞改造而来的干细胞在治疗老鼠的镰刀状细胞血症获得进展。这是科学界利用诱导性多能细胞进行医疗研究的首次尝试。12月23日，哈佛大学研究小组在英国《自然》杂志上说，他们直接从志愿者身上提取皮肤细胞，并成功地改造成诱导性多能细胞。而11月20日发表的研究成果是利用实验室培养过的专用人体皮肤细胞进行的。这个微小的差别，表明了从任何人身上提取皮肤细胞进行该项研究都是可行的。
这些研究虽然都是“皮肤干细胞”研究的小步成果，但却鼓舞人心。
重大意义―――
解决免疫排除反应问题
诱导性多能干细胞，除了避开干细胞研究的伦理之争外，将大大促进干细胞在疾病治疗方面的应用。
首先，它解决了干细胞治疗中的排斥问题。金颖研究员介绍说，人胚胎干细胞来源于人类早期胚胎，其分化的细胞应用于病人时，由于是同种异体移植，植入的细胞会受到病人免疫系统细胞的排斥。为此，建立没有免疫排斥的人胚胎干细胞系移植是干细胞研究人员的努力方向。体细胞核移植，也就是人们常说的治疗性克隆，可以产生与病人基因型基本一致的胚胎干细胞。
事实上，核移植的低效率和人未受精卵母细胞来源的限制，人类在建立体细胞核移植来源的胚胎干细胞系方面尚无成功报道。即使成功，用于临床疾病的治疗也不现实。虽然科学家还在努力进行着其他尝试，但是尚无令人满意的途径。而“诱导性多能细胞”可以来源于任何人的体细胞，经过体外的培养和诱导使这些体细胞成为具有多种分化潜能和大量扩增能力的细胞。当把此种细胞分化为病人所需要的细胞(如神经细胞)再植入病人时，病人的免疫系统细胞不会对它们实行免疫排斥，从而解决了干细胞治疗中的排斥问题。
用于人体尚需时日
虽然目前已成功建立了诱导性多能干细胞，但并不意味这些细胞可以立即应用于临床。“它的意义更多在于证明了一个原则，即已经分化的细胞在几种因子的诱导下，可以去分化成为多能的细胞。这是人们过去一直梦想却未能实现的事情。但是，在应用于临床之前，还有许多问题需要解决。找到新的方法将新的基因导入分化的细胞，而不是用病毒载体，这本身就是一个巨大的挑战。”金颖说。
专家连线―――
记者：干细胞研究的重要性是不是还在于，它可以用于人类疾病的治疗和新药的研究？
金颖（中科院上海生命科学院、上海交通大学医学院健康科学研究所研究员）:细胞移植是很多疾病的重要治疗手段，如糖尿病、神经系统疾病等。但是，供体细胞的不足严重限制了细胞替代治疗的进行。干细胞能在体外大量扩增，同时又具有分化为多种细胞的能力，可以为细胞移植提供来源。由于药物筛选和安全性检验不可以直接在人体进行，但是可以利用体外培养的人的干细胞。所以，人的干细胞也成为大规模的新药筛选和药物研究的理想模型。
记者：能把皮肤细胞转化为干细胞，是不是就可以对胚胎干细胞的研究不重视了呢？
金颖：应该更加重视胚胎干细胞的研究。这4个基因的发现是源于科学家们20多年来对胚胎干细胞的研究。毫无疑问，没有胚胎干细胞的研究就不会有诱导性多功能细胞的建立。科学家们长期对胚胎干细胞增殖、分化、移植等的研究都是当前和今后诱导性多能细胞研究所不可缺少的宝贵基础。继续深入研究胚胎干细胞将无疑大大促进诱导性多能干细胞的研究进程。因此，忽视对胚胎干细胞的研究是极不应该的。
记者：现在很多科学家都在质疑这种研究成果的安全性，您是怎么看的？
基因重组范文3
摘要： 目的 建立一种简便、快速基因分型方法，对广西人类免疫缺陷病毒（HIV-1）重组毒株gag基因区进行亚型鉴定。方法 从HIV阳性样本中提取核酸，使用HIV-1 M组通用引物对gag区进行第1轮扩增，第2轮使用分别检测C亚型和CRF01-AE重组型的二套特异性引物放入同一反应管中进行扩增，根据不同亚型扩增的目的带位置不同判断亚型。另外设计了一套引物，专门用于检测B'/C重组毒株。扩增出的所有样本均进行基因测序和系统树分析以验证结果。结果 54份样本中，经基因测序和系统树分析证实CRF08-BC样本4份（741%)， CRF01-AE样本46份（8518%)， 4份（741）无法确定亚型。经亚型特异性引物PCR法检测出4份（100%) B'/C重组毒株，45份（9783%) CRF01-AE重组毒株，灵敏度为98%，特异性为100%。2种方法检测结果经差异性检验显示，P>005，差异无统计学意义，结果一致性高达9815%。与基因分析结果吻合。重复实验显示，B'/C的平均重复性为100% (20/20)，CRF01-AE为983% (59/60)。结论 该方法具有简便、快速，高度灵敏度和特异性的特点，可直接对广西HIV -1重组毒株CRFO 1-AE gag基因区进行分型。
关键词：人类免疫缺陷病毒1型；基因型；聚合酶链反应
Rapid identification for gag region of circulating recombinant form of humanimmunodeficiency virus type 1
Abstract： Objective To develope a simple and rapid subtype-screening assay for the gag region of the circulating recombinant form (CRF) of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1）in Guangxi.Methods Proviral DNA from HIV-positive samples were extracted and subjected to the first round PCR with universal primers for the gag region that can detect HIV-1 M group isolates.In the second round PCR，two pairs of subtype-specific primers that were designed to detect subtype C and CRF01-AE respectively were added into one tube.The PCR products of different subtypes could be distinguished in agarose-gel electrophoresis.Another pair of subtype-specific primers exclusively detecting the the prevalent recombinantstrains CRF07-BC and CRF08-BC was designed and used.Additionally，all of these samples were sequenced and analyzed phylogenetically.Results DNA sequencing and phylogenetic analysis of the gag region of the 54 samples showed that 4 samples (7.41%) were infected with CRF08-BC，46 (85.18%) with CRF01-AE and 4 (7.41%) remained unclassifiable.Detection of the subtype-specific primer sets revealed that 4 were B'/C (100%)，and 45 were CRF01-AE (97.83%)，with an adequate sensitivity (98%) and a high specificity (100%).Non-specific bands occasionally appeared but did not interfere with interpretation of the results.The phylogenetic analysis was consistent with subtype-specific primer sets and the consistent rate was 98.15%.The average reproducibility was 100% for B'/C samples and 98.3% for CRF01-AE samples.Conclusion A simple，rapid and low cost assay is developed for subtype-screening of CRFO1-AE in Guangxi.For the B'/C strains in Guangxi，it needs to be verified further by increasing samples.
Key words： human immunodeficiency virus type 1(HIV-1）；genetic subtype；polymerase chain reaction (PCR)
人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）高度变异，不同亚型毒株其生物学特性及；分子流行病学特征均有所不同〔1〕，若能快速、准确地对HIV进行基因分型不仅有助于了解HIV-1转播规律，而且可为阐明HIV基因型与生物表型关系、药物耐药性等研究提供资料。近年来，我国学者〔2〕建立了一种多重巢式PCR法对我国HIV-1主要流行株进行鉴定亚型。然而，由于HIV-1的基因变异度极高，在传播过程中可产生许多具有相对独立的基因序列型别，使得不同地区各亚型间具有其自身的特异性。广西壮族自治区为国内HIV感染的高发区，大部分感染发生在经济尚不发达地区的人群中。因此，建立广西HIV-1主要流行株快速基因分型方法十分必要。目前，广西的优势流行株为CRF01-AE和CRF08-BC重组毒株〔3，4〕。为此，本研究针对这2种重组毒株gag基因区建立了一种亚型特异性引物PCR法的快速基因分型法。
1 材料与方法
11 样本来源 从广西HIV-I主要流行区采集54份样本，经ELISA初筛和免疫蛋白印迹（WB）确认为HIV阳性样本。
12 核酸提取 采用QIAamp Bloodes Mini Kit试剂盒（德国QiaGen公司）从每位感染者的抗凝全血中提取细胞DNA，并冻存于-80℃冰柜备用。
13 HIV-1亚型特异性引物的设计 亚型特异性引物的设计是整个方法建立的关键。设计的基本原则：设计的引物位点必须在各个亚型间高度特异，而在同一种亚型内部高度保守。在Primer50软件的帮助下设计出gag区的亚型特异性引物（表1)。
14 HIV-1 gag基因区的扩增 用nested-PCR对HIV-1 gag基因区进行扩增，第1轮使用引物GagF2/Gage2，模板15μl，反应条件：94℃ 5min，52℃ 1min，72℃ 2min 30s，1个循环；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1min 30s，30个循环；72℃ 10min。第2轮模板5μl，使用分别检测C亚型和CRF01-AE重组型的2套亚型特异性引物（Cag-c1/Cag-c2，Cag-ae1/Cag-ae2) ，争套引物放入同一反应管中，为减少非特异性反应，使用热启动和降落PCR (TD-PCR）技术〔5〕，94℃ 5min，52℃ 1min，72℃ 2min 30s，1个循环；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 1min，3个循环；94℃ 30s，51℃ 30s，72℃ 1min，3个循环；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min，3个循环；94℃ 30s，49℃ 30s，72℃ 1min，3个循环；94℃ 30s，48℃ 30s，72℃ 1min，25个循环，72℃ 10min。如果特异性引物PCR扩增出的目的条带判断为C亚型，则用专门用于检测B'/C重组毒株（包括CRF07-BC和CRF08-BC）的亚型特异性引物Cgag-c1/Cgag-bc为内侧引物再进行PCR扩增，以判断是否为重组形式。反应条件：94℃ 2min，48℃ 1min，72℃ 2min，1个循环；94℃ 30s，48℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min。同时使用引物306/Cn-gag扩增所有样本并进行基因测序，用于系统树分析及亚型鉴定以验证特异性引物分型结果是否正确。反应条件：94℃ 2min，50℃ 50s，72℃ 1min，1个循环；94℃ 30s， 50℃ 30s， 72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min。第1轮和第2轮PCR反应体系均为50μl，dNT/P浓度为200μmol/L，Taq酶为25U，引物浓度为04μmol/L，MgCl2浓度为15mmol/L。表1 gag区PCR扩增使用的引物 （略）内侧特异性引物注：R=A或G
15 PCR产物检测 取5μl第2轮PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭（EB）染色检测，紫外摄影拍照，根据Markers分子量大小来判定结果。C亚型片段190bp;CRF01-AE片段881bp;B' /C片段1079bp。
16 序列测定 对于全部经引物306/Cn-gag扩增的样本，经切胶，纯化后，以306为测序引物，提纯的PCR产物为模板，采用DNA测序试剂盒（美国ABI公司），在PTC-220型多通道PCR仪（美国MJ公司）上进行测序反应。反应产物经提纯后，采用310型全自动毛细管DNA测序仪（美国ABI公司）进行序列测定和分析。
17 序列分析 （美国Los Alamos国家实验室HIV核酸序列库中提供）基因分型工具BLAST程序进行基因型鉴定；用Clustal X进行排序和MEGA version 21软件进行分析。亚型分析使用的各个亚型参考序列来自美国Los Alamos HIV基因数据库。
18 检测该方法的重复性 在CRF01-AE样本中随机选取12份，CRF08-BC 4份，共16份样本使用上述方法重复5次。
2 结果
21 样本基因测序和系统树分析 54份阳性样本中通过引物306/Cn-gag扩增最终获得50份样本的基因序列，经BLAST程序鉴定出4份样本gxmu0402，gxmu0416、gxmu0418和gxmu0419为CRF08-BC重组毒株，余下46份为CRF01-AE重组毒株。将50份基因序列与国际各亚型标准株的基因序列进行系统树分析显示。4份CRF08-BC样本与CRF08-BC98CN006和CRF08-BC97CNGX7f靠得很近，而46份CRF01-AE中，有44份与CRF01-AE97CNGX2f聚成一簇，另外2份样本gxmu0432和gxmu0439与CRF01-AE93JPNH 1和CRF01-AE93TH057十分接近。
22 亚型特异性引物PCR扩增 部分样本经亚型特异性引物PCR扩增后的电泳结果见图1和图2。根据不同亚型扩增出的目的带位点不同，判断出亚型结果。54份样本中，采用特异性引物共扩增出49份样本，其中C亚型4份，CRF01-AE重组毒株45份（9783%，45/46)。进一步使用B'/C重组特异性引物扩增C亚型特异性引物鉴定出来的4份样本，发现这4分样本均为B'/C重组毒株（100%，4/4)。以基因测序法为金标准，可知亚型特异性引物PCR法的灵敏度为98%，特异性为100%。
23 亚型特异性引物PCR法的重复性 重复实验采用4份CRF08-BC样本和12份CRF01-AE随机样本进行5次重复。结果显示，CRF08-BC重组毒株平均重复性为100%（20/20），而CRF01-AE在5次重复中有1次出现1份样本检测不出，其平均重复性为983%（59/60）。M：DNA分子量；1：H2O；2：阴性对照；3：xmu0433;4:gxmu0440;5:gxmu0451;6:gxmu0462图1 部分CRF01-AE样本琼脂糖电泳结果（略） M：DNA分子量；1：H2O；2：阴性对照；3:gxmu0418;4:gxmu0419 图2 B'/C样本琼脂糖电泳结果
24 基因测序法与亚型特异性引物PCR法比较 54份己确认的阳性样本，基因测序法检测并正确分型的样本是50份，检出率为9260%，特异性引物PCR法为49份，检出率为9074%。2种方法检测结果经差异性检验显示，χ2=0，P>005，差异无统计学意义，结果一致性高达9815%。
3 讨论
本研究结果表明，亚型特异性引物PCR方法对于亚型的鉴定结果与基因测序、系统树分析得到的结果是吻合的，该方法的特异性达100%。用亚型特异性引物扩增样本时，有时一会出现非特异性扩增条带，干扰实验结果。非特异性条带位置一般不在特异性位置。为防止误判，可以通过跑厚胶并且延长电泳时间，使目的条带与非特异性条带充分分开。通常在紫外灯下，非特异性条带要比目的条带弱。出现非特异性扩增条带通常有如下的原因：(1)引物与模板错配扩增产生，引物与模板亚型相符，不仅能在特异性位点上与模板结合，亦能在远离特异性位点的地方与模板结合，这种情况错配通常靠近引物5′端的位置，电泳时会出现两条带；(2)引物之间形成的引物二聚体，一般出现在80bp左右的位置，通过长时间电泳可使此条带消失；(3)某一亚型的特异性引物与另一亚型的模板错配扩增产生，因2套引物放入同一反应管中，所以可能出现此情况，为了避免此情况发生，因此，在设计引物时使引物在3′端与别亚型的模板至少有2个碱基产生错配。用本研究所建立起的方法对54份样本的gag基因区进行检测，发现有些样本在1200bp左右的位置会出现一条非特异性扩增，因第1轮PCR扩增的条带位置在1242bp，因此怀疑此非特异性扩增条带为第1轮PCR扩增出的目的带，将第1轮PCR产物与用亚型特异性引物扩增出的第2轮产物同时进行电泳，证实了这一推测。为了减少此情况的发生，可减少第1轮反应的模板量，同时在加入反应体系、模板和酶后尽量减少室温放置时间或在冰盒上操作。本实验结果表明，亚型特异性引物PCR法，灵敏度为98%，特异性为100%，结果显示，其灵敏度和特异性均较好。重复性实验显示，B'/C亚型的平均重复性为100%，CRF01-AE重组毒株为983%，说明一该方法在实际中是可行的。但由于CRF08-BC样本例数不多，因此，本研究所建立起的方法对于HIV-1 B'/C重组毒株分型的准确性有待扩大样本量进一步证实。
参考文献
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基因重组范文4
[关键词]血管内皮生长因子；预构皮瓣；基因治疗；腺病毒
[中图分类号]R622 Q813 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2009）03-0332-04
Improve survival of prefabricated flap with adenovirus vectors encoding for VEGF in rats
DING Zhi,ZHENG Jiang-hong,DENG Zhi-ming,YANG Song-lin
(Department of Plastic Surgery, the Sixth People′s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University,
200233,Shanghai,China)
Abstract: Objective This study investigated the feasibility of local administration of adenovirus vectors encoding for VEGF to induce regional angiogenesis and improve the survival of prefabricated flap in rat prefabricated flap model, so as to provide experimental evidence for a new method with which we can accelerate maturation of prefabricated flap in clinics. Methods 40 prefabricated flaps were created on the left and right abdominal walls in 20 SD rats. Two prefabricated flaps in each rat were randomly allocated to experiment group or control group, and each group contains 20 flaps. In all animals, two 3cm×2cm rectangular skin flaps were designed obliquely on the abdominal wall so that the short side would lie parallel to inguinal ligament. Longitudinal incisions were made on both hind limbs starting from the midpoint of the short side down to the ankle. 2cm long femoral artery, vein were dissected as a bundle and ligated distally. A tunnel was created in the subcutaneous tissue between dermis and panniculus carnosus at the central axis of each planned skin flap. The subcutaneous tissue around the tunnel was injected with adenovirus vectors encoding for VEGF(Ad-VEGF) in experiment group, and with saline in equal amounts in control group. The prepared femoral vessel bundle was then turned over and passed through correspond tunnel. Two weeks later, abdominal island flap based solely on the implanted vessel was elevated. Select one flap from each group to observe the expression of VEGF. Other flaps were resutured into position. Flap viability and neovascularisation were evaluated on postoperative day 7 after the second surgical intervention. Results There was a significant increase in mean survival rate of prefabricated flaps in the Ad-VEGF group compared to the control group: Ad-VEGF, (90.48±1.89)%vs. saline, (69.75±2.36)(P
Key words: vascular endothelial growth factor; prefabricated flap; gene therapy; adenovirus
预构皮瓣应用中要解决的重要问题是知名血管植入预构区域后，建立新的血供系统所需时间较长。近年来，有报导一些多肽类生长因子如VEGF（Vascular endothelial growth factor, 血管内皮生长因子）、bFGF、TGF-β等[1-2]通过直接或间接刺激血管生成作用被用于促进预构皮瓣的再血管化进程，特别是VEGF能特异性地促血管内皮细胞分裂增殖、增加血管通透性,为血管内皮的迁移及基质形成创造条件，故备受研究者青睐。但生长因子蛋白半衰期短、疗效不稳定、需反复应用、副作用多，本研究应用基因治疗技术，将人VEGFcDNA 通过腺病毒载体，一次性注射于大鼠腹部预构皮瓣血管束周围软组织内，通过观察VEGF 的表达情况及对预构皮瓣再血管化进程和成活的影响，探讨腺病毒-VEGF基因重组体促进血管化和皮瓣成活的可能性。
1材料和方法
1.1 腺病毒-VEGF基因重组体的制备：重组复制缺陷型腺病毒pcDNA3/hVEGF165由中科院细胞所构建。将hVEGF165插入pcDNA3的EcoRI和HindIII多克隆位点,并转化DH5进行扩增，凝胶电泳证实hVEGF165已插入pcDNA3多克隆位点，测序证实hVEGF165无突变。以标准的磷酸钙共沉淀法(Promega, Inc.Kit)转染20ug pcDNA3/hVEGF165到PA317细胞，通过G418的集落筛选，扩大培养，测定包装细胞上清中病毒的滴度，计算3个梯度中的cfu（clone forming unit），取最高cfu的包装细胞系集落，在32℃的条件下培养48h。琼脂糖凝胶电泳结果显示hVEGF16经过EcoI和HindIII双酶切后产生2个分别约5.4kb和560bp的hVEGF165片段，经测序证实无突变，说明腺病毒-VEGF基因重组体构建成功。
1.2 动物模型的建立：雄性SD大鼠20只，每只体重0.3～0.4kg，每只腹部两侧各构建一个预构皮瓣，共构建40个皮瓣，每只大鼠两侧皮瓣按随机原则进行不同的处理，分别归于实验组或对照组，每组各20个皮瓣。1%的氯胺酮腹腔内注射麻醉(1ml/100mg)、硫化钡液脱毛及仰卧位固定后，于大鼠腹部两侧各标记3cm×2cm矩形预构区,短边平行于腹股沟韧带，自尾侧短边中点向后纵向切开后肢皮肤，在显微镜下仔细剥离出长约2cm的股动静血管束，远端结扎切断。在两侧预构区域的中轴线上，用18G注射器针头于真皮与肉膜层间各制作一长2cm、宽0.3cm的皮下隧道，使用1ml注射器向实验组的隧道壁皮下组织内注射携带有VEGF基因的腺病毒，分4个点，每点注射0.1ml浓度为4×109cfu/L的pcDNA3/hVEGF165，同法向所有对照组的隧道壁软组织内注射等量生理盐水。将已剥离好的血管束向颅侧翻转置入相应预构区的皮下隧道内，血管束末端用缝线固定于附近皮肤以防回缩，6-0丝线缝合切口（图1），动物返回笼中。所有预构区域2周后均沿前述腹部预构区标记线切开皮肤，于肉膜层下方剥离形成以植入股血管束为蒂的岛状皮瓣，从两组中各选一个皮瓣进行免疫组化染色，观察有无VEGF生成，其余岛状皮瓣均缝回原处（图2）。
1.3 检测指标
1.3.1 免疫组化检测：血管束植入预构区域后2周，分别切取Ad-VEGF基因治疗组和生理盐水对照组中的一个预构皮瓣进行免疫组化检测：组织切片经脱蜡、浸水处理后用H2O2处理（室温，10min），应用羊血清封闭（37℃，30min）,直接滴加浓度为1∶100的抗人VEGF一抗（小鼠来源单克隆抗体，Santa Cruz公司，美国），4℃孵浴12h，PBS清洗，滴加二抗（生物素标记为山羊抗鼠，DAKO公司，丹麦），DAB（DAKO公司，丹麦）染色，光镜下放大100倍观察有无棕黄色颗粒表达从而确定有无VEGF蛋白生成。
1.3.2 皮瓣存活率：形成岛状皮瓣后第七天，按前述方法麻醉动物，相同物距下数码相机拍照后，将图像输入KS400 图像分析系统，经图像增强、分割、待测面积的二值化处理，精确测量皮瓣存活部分及坏死部分面积，根据公式：皮瓣存活率 = 皮瓣存活表面积/皮瓣总表面积×100%，算出两组各19个皮瓣的存活率，再计算各组皮瓣存活率的均数。
1.3.3 放射显影：岛状皮瓣拍照后，从两组中各选取一个皮瓣，手术显微镜下解剖出蒂部股血管束，分别向两侧股动脉内灌注60%泛影葡胺约3ml，结扎蒂部的股动静脉并切下皮瓣，放射科拍摄钼靶X光片，获得植入血管及新生血管的放射显影图。
1.3.4 组织学观察：岛状皮瓣拍照后，从两组中各选取一个皮瓣，切下其存活部分后立即浸入10%甲醛溶液中固定48h，经酒精梯度脱水二甲苯透明后石蜡包埋，莱卡切片机切成4μm薄片,苏木精-伊红染色封片，光镜下放大100倍观察植入的血管束周围新生的小血管情况。
1.4 统计分析：数据表示为x±s,用SPSS 11.0 版统计软件对数据进行统计，两两之间的比较采用t检验，P＜0.05示差异有统计学意义。
2结果
2.1大体观察及皮瓣存活率：制成岛状皮瓣后，多数皮瓣边缘出现程度不等的青紫肿胀，继而颜色发黑干性坏死，有的破溃形成形状各异的创面，一般5～7天后坏死范围稳定，成活与坏死界限分明，皮瓣成活区质地均柔软（图3），两个实验组皮瓣局部可见皮下小血肿。VEGF基因治疗组与生理盐水对照组皮瓣平均存活率分别为(90.48±1.89)%、(69.75±2.36)%，两组存活率差异有统计学意义（P＜0.01）（表1）。
2.2血管新生情况：血管放射显影显示，实验组植入血管周围见广泛白色显影，尤以血管两端明显，而对照组新生血管显影仅局限于植入血管周围(图4)；HE染色组织学切片显示实验组植入血管周围新生血管丰富，以毛细血管为主，并见肉芽成份，对照组新生血管相对较少，两组间新生小血管管腔大小则无明显差异(图5)。
2.3免疫组织化学检查：光镜下放大100倍观察来自两组的免疫组化染色切片，VEGF基因治疗组见到大量棕黄色颗粒表达,弥漫分布于新生小血管周围，对照组切片上未看到棕黄色颗粒（图6）。
3讨论
植入血管与皮肤、皮下组织间建立起新的血液循环是预构皮瓣成功的关键，新血管系统形成的速度、数量和范围直接决定着预构皮瓣的成熟时间和成活范围，因此如何促进植入血管束多形成新生小血管并与皮瓣的小血管之间建立有效的吻合成为当前预构皮瓣的研究热点。研究发现，一些多肽类生长因子能通过促进血管新生，从而促进缺血皮瓣的成活，1993年Iwasawa M[3]用TGF-β、 2000年Li QF[4]用VEGF来促进预构皮瓣的成熟，也取得了预期效果。研究显示，VEGF是迄今发现的作用最强的血管形成因子，能特异性地与血管内皮细胞表面的相应受体结合，通过启动有丝分裂原活化蛋白激酶来诱导内皮细胞增殖[5]，其家族中VEGF165在体内分布最广，表达水平最高。由于VEGF在体内的半衰期很短，一般不超过6min，必须反复使用才能发挥其血管生成作用，极为不便，不但增加感染机会，而且蛋白价格昂贵，这些情况限制了临床应用前景。后来有人曾利用凝胶态的聚乙烯乙醇作为缓释剂，试图延长VEGF作用时间，发现并未提高VEGF的疗效[6]。近年来，日渐成熟的基因重组和转染等生物技术为VEGF保持其在局部的持续存在和作用提供了新颖的途径：将VEGF基因插入到某种载体形成基因重组体，再转染作用部位细胞，将VEGF基因带入转染细胞的细胞核内，使得转染细胞成为 VEGF 的“缓释库”，较长时间内不断产生VEGF蛋白，充分发挥其生物学效应。目前该基因治疗技术已被报道用来改善缺血皮瓣的血供[7]以及提高自体颗粒脂肪移植成活率[8]，也有学者用于治疗临床上一些缺血性疾病[9]，取得了一定的疗效。我们在此基础上设想应用此项技术促进预构皮瓣再血管化和增加皮瓣成活率，以便缩短预构成熟时间。研究结果显示，注射基因重组体后两周时的实验组标本切片免疫组化染色可见大量棕黄色颗粒，证实pcDNA3/hVEGF165已进入血管束周围细胞内并持久表达了VEGF蛋白，证明基因治疗技术同样能保持VEGF在预构皮瓣中的持久存在。在HE染色组织切片及血管放射显影的光镜检查中，实验组标本的新生小血管较对照组的丰富，说明Ad-VEGF基因治疗组在局部VEGF的持续刺激下，诱导形成了大量的新生小血管，有利于预构皮瓣的存活，表现为治疗组岛状皮瓣存活率高于对照组，这些结果说明应用基因治疗技术产生VEGF促进预构皮瓣成熟是可行的。
本研究采用腺病毒作为VEGF基因的载体，是因为其转导效率高，而且腺病毒一般不与转染细胞的染色体整合，故比较安全[10]。在HE染色组织切片上，治疗组见到明显炎性肉芽成份，这与以前的有关研究报导相符合，可能与腺病毒导致的宿主免疫反应[11]有关。研究中发现治疗组一些皮瓣内出现小血肿，可能是VEGF增加了局部血管通透性所致，所以寻找合宜的剂量和用药浓度以最大程度的发挥其促血管生成作用而尽量避免副作用是今后研究的问题之一。
建立合理的实验模型是研究预构皮瓣再血管化的前提，以往的预构皮瓣实验研究中，多是先掀起随意型皮瓣，然后将血管载体固定于皮瓣肉面，其缺点是手术创伤大，易引起严重纤维化影响预构皮瓣的质地；此外，掀起皮瓣还会因手术创伤触发内源性血管生长因子产生[12]，干扰对外源性VEGF发挥促进血管新生作用的观察。本研究在一期手术中，并未掀起皮瓣，只是在预构区域形成一包容血管束的皮下隧道，这无疑最大程度地减少了内源性VEGF的产生，而且手术创伤小，保证了皮瓣质地柔软，操作也简便，有临床推广价值。以往有研究认为，VEGF在非缺血组织中生物活性低[13]，本研究预构区血液循环良好，VEGF同样显示了良好的促进血管新生作用，这也许和腺病毒诱发的炎症反应有关。在剥离股血管束时，我们保留了少许管周组织，以防止损伤血管束内动、静脉之间的微细血管通道[14]，保证移位的血管束早期不致栓塞，但如果管周组织保留过多，一部分管周组织会因为早期缺血发生纤维化，从而妨碍血管束新生小血管。血管束植入动物肉膜层与真皮层之间，是因为肉膜层内小血管网及真皮下血管网均较丰富，便于新生血管与其吻接沟通，同时制作岛状皮瓣时也提供了解剖标志。
总之，本研究证明基因治疗方法能够保持VEGF在预构皮瓣中的持久存在，从而促进预构皮瓣血管新生和皮瓣成活，未见明显并发症，为临床上加速预构皮瓣成熟提供了新的途径。但腺病毒作为目的基因载体，是否会使人体基因发生突变，是否会导致病毒感染，以及如何提高基因转染效率，寻找恰当的给药途径、用药剂量与浓度等问题尚需要继续研究。
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基因重组范文5
【关键词】 NT4ApoptinHA2TAT 重组腺相关病毒 肿瘤 融合基因
近年来不损伤正常细胞的蛋白质和相关肽的发现为肿瘤的基因治疗带来了转机， 利用重组腺病毒转导这类基因， 注射实体瘤之后， 可以在一个较长的时间内持续表达杀伤肿瘤的蛋白［1］。体外合成或基因工程表达的CAVVP3蛋白Apoptin能特异地诱导多种人源性恶性肿瘤细胞的凋亡， 但对正常二倍体体细胞无作用［2］。本研究在前期工作的基础上拟构建神经生长因子4(NT4)信号肽引导的可分泌表达ApoptinHA2TAT的重组腺相关病毒高效表达载体， 为下一步进行Apoptin应用于基因治疗奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 克隆载体pGEMT/Apoptin质粒有本课题组构建［3］; 限制性内切酶NaeⅠ、 XhoⅠ、 EcoRⅠ、 SalⅠ购自宝泰克生物公司; Taq DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶购自华美生物公司; pUC19/NT4质粒、 pGEMT/HA2TAT、 腺病毒穿梭质粒pSSCMV及辅助质粒pAAV/Ad、 腺病毒质粒pFG140， 大肠杆菌DH5α及293细胞系、 小鼠成纤维细胞NIH3T3、 HepG2人肝癌细胞系均由西安华广生物工程公司提供。
1.2 方法
1.2.1 pUC19/NT4ApoptinHA2TAT载体构建 碱裂解法大量制备重组质粒pGEMT/Apoptin、 pGEMT/HA2TAT， 分别用限制性内切酶NaeⅠ、 KpnⅠ、 XhoⅠ消化， 切取Apoptin、 HA2TAT用T4 DNA连接酶连入带有相同末端的已线性化pUC19/NT4载体。用连接反应产物转化制备好的感受态细菌E.coli DH5α菌株， 随机挑选单个菌落， 接种于含有氨苄西林的LB培养基内， 37℃增殖培养， 碱裂解法小量提取质粒， 用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切， 筛选出含有约710 bp左右的重组质粒pUC19/NT4ApoptinHA2TAT。
1.2.2 腺病毒穿梭质粒pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT的构建 EcoRⅠ和SalⅠ双酶切腺病毒穿梭质粒pSSCMV和EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pUC19/NT4ApoptinHA2TAT， 低熔点凝胶回收NT4ApoptinHA2TAT和线性化的pSSCMV， T4 DNA连接酶连接， 转化E.coli DH5α感受态细菌， 挑选转化的菌落， 提取质粒， EcoR Ⅰ 和Hind Ⅲ 双酶切筛选并鉴定阳性克隆。
1.2.3 重组腺相关病毒的包装与鉴定及滴度测定 采用磷酸钙沉淀法三质粒共转染HEK293细胞获取重组腺相关病毒。转染3 d后， 质粒在细胞内同源重组构建出重组腺相关病毒， 毒斑出现， 反复冻融含病毒栓子的培养基， 提取病毒， 收集含病毒的上清液感染80%成片的HEK293细胞。Dot blot法测定重组病毒滴度。
1.2.4 重组腺相关病毒对HepG2细胞存活率的影响 将HepG2细胞以每孔10 000个细胞的量接种于96孔培养板中， 每孔体积200 μL， 培养24 h后分实验组、 正常细胞小鼠成纤维细胞NIH3T3组和空病毒组， 各加入10MOI的空病毒或重组病毒， 病毒作用2 h后更换新鲜正常培养液， 在病毒作用后的24、 48、 72 h分别终止培养(以上每组各设3个复孔)， 加入MTT试剂(5 g/L)20 μL， 37℃孵育4 h， 将含MTT的培养液移去， 加入二甲基亚砜150 μL， 摇匀15 min， 使反应产物充分溶解。在测定波长为490 nm的酶标仪上测定光密度A值。
2 结果
2.1 重组质粒pUC19/NT4ApoptinHA2TAT的构建 Apoptin和HA2TAT被酶切后插入pUC19/NT4载体， 转化E.coli， 挑选克隆， 用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切， 筛选出含有约710 bp左右的重组质粒pUC19/NT4ApoptinHA2TAT（图1）。
2.2 重组腺相关病毒穿梭质粒pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT的构建与鉴定 NT4ApoptinHA2TAT插入pSSCMV载体， 转化E.coli， 挑选克隆， 进行酶切鉴定。重组质粒pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT的大小为5 860 bp。用EcoR I 和Hind Ⅲ双酶切获得5 100 bp和760 bp两个片段（图2）。
图1 pUC19/NT4ApoptinHA2TAT重组质粒基因酶切鉴定（略）
Fig 1 The result of pUC19/NT4ApoptinHA2TAT digested with restriction enzyme
1: λDNA/Hind Ⅲ marker; 2: 100 bp DNA marker; 3: Digested with EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ; 4: Digested with EcoR
Ⅰ; 5: pUC19/NT4ApoptinHA2TAT.
图2 pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT质粒酶切鉴定结果（略）
Fig 2 The result of pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT digested with restriction enzyme
1: pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT; 2: Digested with EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ; 3: λDNA/Hind Ⅲ marker; 4: 100 bp DNA marker.
2.3 NT4ApoptinHA2TAT重组腺相关病毒包装与滴度测定 将构建好的pSSCMV/NT4ApoptinHA2TAT质粒与辅助质粒pAAV/Ad、 腺病毒质粒pFG140， 应用磷酸钙DNA共沉法共转染80%融合的293细胞， 包装得到NT4ApoptinHA2TAT重组腺相关病毒。用收获的毒种感染293细胞， 至MOI为10时， 加PBS液细胞冰融， 离心取上清-20℃保存备用。将所获得的病毒液对数比稀释后， 利用Dot blot法测定滴度为3.14×1015 pfu/L。
2.4 MTT比色法测定重组腺相关病毒对肿瘤细胞的杀伤作用 AAVmock和NT4ApoptinHA2TAT重组腺相关病毒分别感染HepG2细胞和NIH3T3细胞。随着作用时间的延长， NT4ApoptinHA2TAT重组腺病毒组比AAVmock组的HepG2细胞的存活率明显降低， 而对NIH3T3组无影响， 说明NT4ApoptinHA2TAT重组腺相关病毒对肿瘤细胞有选择性诱导凋亡作用（图3）。
3 讨论
目的基因或载体对正常组织的毒性和肿瘤细胞对治疗的耐受等是限制肿瘤基因治疗临床应用的瓶颈， 而Apoptin的发现给抗肿瘤的基因治疗带来了转机。体外合成或基因工程表达的Apoptin能特异的引起多种人源性恶性肿瘤细胞凋亡， 对正常二倍体体细胞无作用; 而且这种选择性凋亡作用既不依赖于p53的介导， 也不被Bcl2过表达所抑制， 而大部分肿瘤的耐药产生都是由p53的缺失（突变）或Bcl2的过表达引起。对恶性细胞的选择性凋亡且对抗耐药的特点使Apoptin成为基因治疗的理想目的基因（蛋白）。近来的大量研究表明， 无论是和免疫制剂［4］还是和化疗药物［5］联用都能增强治疗效果， 显示出了凋亡素的巨大应用前景。
图3 AAV/NT4apoptinHA2TAT对HepG2细胞和NIH3T3细胞存活率的影响（略）
Fig 3 The effect of AAV/NT4ApoptinHA2TAT on HepG2 cells and NIH3T3 cells
A: The effect on NIH3T3 cells; B: The effect on HepG2 cells. bP
但是， 现行的Apoptin肿瘤基因治疗中， 多数以肿瘤细胞为靶细胞， 在这种治疗模式下， 虽然降低毒副作用， 但治疗效应往往随肿瘤细胞的凋亡而终止， 增加了治疗的难度和费用。基于此， 本研究在Apoptin基因的两端融合进3个基因片段: NT4为信号肽， 可以引导NT4ApoptinHA2TAT通过膜性结构并在经过脂质膜时通过信号肽酶切位点切下信号肽（NT4）， 从而使成熟肽分泌（ApoptinHA2TAT）到细胞外; TAT［6］为HIV中的穿膜肽， 可介导分泌之胞外的ApoptinHA2TAT以巨胞饮作用进入细胞; HA2［7］为流感病血毒凝素2亚单位的NH2的结构域， 为pH依赖性融合胎， 在低pH环境中可增强ApoptinHA2TAT从巨胞饮体中逃逸。
如果应用含有NT4ApoptinHA2TAT的重组腺相关病毒转染间质干细胞或其他相关细胞会输体内， 将大大提高治疗基因的表达效率和延长分泌时间， 同时依赖于Apoptin的特异性杀伤和对抗耐药的特性， 则解决了基因治疗的有效性和安全性的关键问题。
应用MTT法检测感染重组病毒的人肝癌HepG2细胞和小鼠成纤维细胞NIH3T3活性， 结果显示分泌表达目的基因的重组AAV对HepG2细胞的诱导凋亡作用， 而对正常细胞无作用， 说明融合蛋白没有改变Apoptin的肿瘤特异性杀伤特性， 且融合蛋白能够被分泌表达且发挥了生物活性。其对表达效率和分泌时间的正影响及转染间质干细胞的在体效应， 则有待于进一步研究。
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基因重组范文6
【摘要】
目的研究南山茶子拮抗孕激素作用。方法用系统溶剂分离法将南山茶子醇提物分成极性不同的组分，利用重组人孕激素受体基因酵母生物检测法筛选南山茶子拮抗孕激素活性部位。结果5个组分都表现出拮抗孕激素的效应，活性强弱依次为醋酸乙酯层>正丁醇层>石油醚层>水层>醇提物。结论醋酸乙酯部位可能为南山茶子拮抗孕激素的活性部位。
【关键词】 南山茶 重组人基因酵母 孕激素受体 拮抗作用
Abstract：ObjectiveTo study the antiprogestin active parts of the seeds of Camellia serrdserrate Chi.MethodsThe seeds of Camellia serrdserrate Chi. extract was separated into four fractions according to polarity， its antiprogestin active parts was investigated by a recombinant yeast screening assay. ResultsThe five fractions showed antiprogestin activity， and the order of the estrogenic activity of these fractions was ethyl acetate> normal butyl alcohol> petroleum ether > water extract > alcohol extraction.ConclusionThe ethyl acetate is the antiprogestin active parts of the seeds of Camellia serrdserrate Chi..
Key words：Camellia serrdserrate Chi.; Recombinant yeast; Progesterone receptor; Antagonistic effect
正常人骨代谢的平衡是离不开体内一种特殊物质调节的，这种特殊物质就是激素。激素是由内分泌器官所分泌的一种高效能有机化合物，人体内很多种激素，其中目前已经明确与骨质疏松有关联的8种：雌激素、甲状腺激素（PTH）、降钙素、活性维生素D、甲状腺激素、雄激素、皮质类固醇激素、生长激素。其中前4种更为重要。这些激素或通过影响破骨细胞的数量及活性来调节骨吸收过程，或通过影响成骨细胞的活性来调节骨形成过程，从而调节骨代谢。当这些激素在人体内达到某一浓度时能够维持骨吸收与骨形成的平衡，但当它们在体内的含量发生异常变化时，便会使骨代谢失去平衡，导致骨量的减少，从而引起骨质疏松。已有大量的文献报道［1，2］：孕激素受体能够降低雌激素受体(ER)的转录活性，也就是说对孕激素受体活性的抑制能够增强体内雌激素受体活性的表达。
南山茶Camellia serrdserrate Chi.属于山茶科山茶属植物，广泛分布于我国的西南部和东南部，集中分布于我国长江以南的亚热带地区，资源非常丰富［3］，其化学成分主要有黄酮，皂苷和多酚这三大类［4］，我们在对山茶属植物药用价值的研究过程中发现，南山茶种子乙醇提取物对维甲酸所致骨质疏松的大鼠有很强的抗骨质疏松活性，并且明显高于阳性对照药。为了具体确定南山茶子抗骨质疏松的有效部位，我们首先用95%乙醇提取南山茶子得到醇提物，对其中三类化学成分的含量进行了测定，总黄酮4.07%，总皂苷12.15%，总酚4.30%［5］，并分别依次用石油醚、醋酸乙酯、水饱和正丁醇进行萃取，浓缩至干，再用转基因酵母的生物检测方法对它们是否有拮抗孕激素受体的作用进行研究，从而从另一角度来阐明南山茶子抗骨质疏松的作用机理。
1 仪器与试药
Laborata 4000型旋转蒸发仪（Heidolph，Germany）；酶标仪（Spectra Fluor plus，TECAN，Austria）；分光光度计（WFZ UV-2000，上海）；恒温振荡摇床（HZQ-F，哈东联）；恒温平板摇床（Titramax 1000，Heidolph，Germany）；百级超净工作台（DL-CJ-1F，哈东联），旋涡混合器（MS2，广州IKA Works），96孔培养板，96孔酶标板（比利时 Orange）。ONPG（Sigma，USA），二甲基亚砜（99.9%，Sigma，USA），酵母氮碱（Difco，USA）。
南山茶种子（2006年3月采集于广西省平南县六陈镇，经昆明植物民裴盛基教授鉴定）；重组人孕激素受体（hPR）基因酵母（Gaido赠送）；SC培养基；孕酮（PG）（MP. Bio medical公司）；酶反应底物邻硝基苯基β－D－半乳糖苷（Sigma）；二甲基亚枫(Sigma)，所用试剂均为分析纯，溶于超纯水（Milli-Q，USA）。
2 方法
2.1 试剂的配制
2.1.1 SC培养液称取36 mg赖氨酸，12 mg组氨酸，6.7 g无氨基酵母氮源，20 g葡萄糖溶于1 000 ml超纯水中，用0.22 μm滤膜过滤除菌后于4℃下冷藏保存。
2.1.2 基础缓冲液称取21.5 g Na2HPO4·12 H2O，6.22 g NaH2PO4·2H2O，0.75 g KCl，0.25 g MgSO4·7H2O溶于1 000 ml超纯水中，于4℃下冷藏保存。
2.1.3 邻硝基苯基β－D－半乳糖苷溶液（ONPG）溶液（13.3 mmol·L-1）称取0.4 g ONPG溶于100 ml基础缓冲液中即可（现配现用）。
2.1.4 Na2CO3溶液（1 mol·L-1）称取10.6 g无水Na2CO3溶于100 ml超纯水中，于4℃下冷藏保存。
2.1.5 CuSO4溶液（50 μmol·L-1）称取1.196 g CuSO4·5H2O溶于100 ml超纯水中，于4℃下冷藏保存。
2.2 酵母接种的培养重组人孕激素受体基因酵母由Gaido赠送，培养基为增加硫酸铜（50 μmol·L-1）、腺嘌啉、赖氨酸、色氨酸的SC培养基，室温避光保存［6］。
将1 ml新鲜冻融的酵母菌株接种到9 ml SC培养液中加10 μl CuSO4，置于转速130 r·min-1，温度为37℃的空气浴摇床中培养过夜，用分光光度计测定10倍稀释的酵母菌株培养液在600 nm波长处的吸光度（以培养基为空白），要求吸光度值在0.15～0.5，用培养液将酵母菌液稀释到A600=0.75作为工作液［7］。
2.3 南山茶的抗孕激素活性测定分别称取南山茶子醇提物，石油醚层浸膏，醋酸乙酯层浸膏，正丁醇层浸膏以及水层浸膏各50 mg，用1 ml DMSO溶解，得浓度为50 mg·ml-1的溶液。取990 μl工作菌液至对应的EP管中，分别加入5 μl DMSO（空白），5 μl用DMSO溶解的孕酮（PG，阳性对照，1×10-7mol·L-1）和5 μl用DMSO溶解的样品涡旋混匀。在加入5 μl样品的EP管中再加入5 μl PG（浓度为1×10-7mol·L-1）涡旋混匀，将以上溶液各200 μl依次转移至96孔板中，然后于恒温平板摇床800 r·min-1，37℃振荡培养2 h。酶标仪测定A595后，吸取150 μl溶液弃去，加入120 μl测试缓冲液和20 μl氯仿，在30℃的恒温摇床上预培养10 min。加入40 μl ONPG（4 mg·L-1）反应液将酶反应启动至出现明显的黄色后加入100 μl 1 mol·L-1Na2CO3溶液终止反应，吸取200 μl上清液转移到酶标板中测定A420的值［7］。
2.4 β-半乳糖苷酶活性以及孕激素抑制活性的计算
U=［(A420-A′420)/T×V×A595］×D
式中U代表酶活力，A420代表样品在420 nm处的吸光度，A′420为空白溶液（即DMSO）在420 nm处的吸光度，A595为样品在595 nm处的吸光度，T代表反应时间，V为反应菌液的稀释倍率，D为稀释因子。
抑制率(%)=1-U样U阳×100%
U样为加入样品后标准品所表现出的酶活性，U阳为对照品PG的酶活性。
3 结果
实验最后的总体积为200 μl，样品的反应时间都为60 min，样品稀释倍率为0.2，将我们所测得A420和A595值带入上面的公式，就可以计算出相应的β-乳糖苷酶的活力值和抑制率。结果见表1和图1。表1 加入南山茶各样品后孕酮的酶活值/U和抑制率（略）
由表1和图1可以看出，样品南山茶子的醋酸乙酯部位抗孕激素活性最强，抑制率达到50%，其他各个组分基本相当，因此通过以上的数据分析我们可以判断南山茶子醇提物的醋酸乙酯部位为其拮抗孕激素的活性部位。
4 讨论
重组孕激素受体基因酵母是一种快速、有效的检测化合物是否有孕激素活性或抗孕激素活性的方法。它是将人孕激素受体基因（hPR）和孕激素受体响应元件（PRE）相连的β-半乳糖苷酶（LacZ）报告基因这两个基因片段引入到酵母中，当被测物质加入培养基中诱导或抑制PR时，都会启动基因的转录，产生和分泌β-半乳糖苷酶。通过测定A420的吸光度值来反应β-半乳糖苷酶的活性，从而可以得出被测物质对孕激素受体的作用。
植物雌激素与雌激素受体结合，在体内具有双向调节作用。当体内雌激素水平较低时，它就表现出雌激素样活性，当体内雌激素超过正常水平时，它就发挥出抗雌激素的作用［8］。重组雌激素受体基因酵母筛选南山茶子抗骨质疏松有效部位的实验的结果显示醋酸乙酯部位对雌激素受体表现出双向调节的作用，具有较明显的雌激素活性同时又有较强的抗雌激素活性，因此推断雌激素样作用可能是南山茶子发挥抗骨质疏松作用的主要机理之一，但是， 醋酸乙酯部位具有抑制孕激素受体的作用，同样能够导致生物体产生类雌激素样的结果。因此，同时应用重组雌激素和孕激素受体基因酵母，可以更加准确筛选出南山茶子抗骨质疏松的活性部位。
致谢：本实验是在中科院生态研究中心水生态毒理研究组完成，在此特别向王子健研究员给予本实验的帮助和支持表示最诚挚的谢意，感谢本实验室所有的老师和同学。
参考文献
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