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巨噬细胞范文1
关键词:内毒素；信号传导；内毒素结合蛋白；蛋白酪氨酸激酶
内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成份，其化学本质为脂多糖，为细菌死亡或活跃繁殖时所释放。LPS本身无毒性作用，但能够刺激体内多种细胞合成并释放众多内源性生物活性因子而表现出生物学活性。
内毒素由结构和功能不同的四部分组成：0-物异侧链、外核心、内核心和类脂A。类脂A是LPS的生物学活性组份，人工合成的类脂A具有LPS的所有生物学活性，因此，细胞对类脂A的识别必是LPS诱导细胞反应的起始步骤。不同革兰氏阴性细菌来源的类脂A的化学结构高度保守，对其组成已了解得比较清楚。然而，对LPS的三维结构及具有活性的构象知之甚少，对其与脂多糖结合蛋白（LBP）和/或CD14结合时的构象更无研究。因为是它们介导了激活细胞的信号传导，对这些复合物结构的研究会更有意义。信号由CD14介导从胞外传到胞内后，最终将导致基因转录事件的发生，LPS至少使哺乳动物20种以上基因发生转录，只有充分认识此信号传导途径，才能综合利用各种手段控制由内毒素引起的不良反应。
1 LBP的结构和功能
LBP的发现是近几年来研究LPS如何刺激细胞过程中最重要的突破。1986年，Tobias等[1]首次从兔急性反应血清中分离纯化出LBP，酶联免疫吸附试验表明LPS通过类脂A与LBP结合，核心多糖和0-抗原对其无影响，结合比例为1：1。人LBP是由肝细胞合成的单链多肽，糖基化后以60KDa的糖蛋白进入血流，合成受细胞因子和类固醇激素的调节。LBP与另外一种LPS/类脂A结合蛋白即细菌穿透增高蛋白（BPI）具有较高同源性，氨基酸序列分析表明LBP和BPI与其它脂类载体蛋白具有部分相同序列，可以断定LBP是结合中级两性分子并在亲水环境中运输这类分子的蛋白家庭一员。
LBP最重要的生物学功能是使LPS与CD14结合。它有两个功能域，一个与LPS结合，另一个介导LPS与CD14的相互作用。BPI的LPS结合功能区位于氨基末端的25kDa片段，氨基末端的蛋白水解片段和切割突变片段都有结合LPS的功能。在这启示下，现已发现LBP的氨基末端片段LBP1-197也显示出与LPS的结合能力，然而，LBP1-197缺乏提呈LPS与CD14的能力，并且不能代替LPS刺激THP-1细胞株产生TNF-α，但能有效抑制LBP依赖的LPS与CD14的结合及刺激腹腔巨噬细胞产生TNF-α。虽然BPI与LPS结合的亲和力大于LBP，但它不能促进LPS与CD14的结合，说明BPI缺乏参与LPS提呈的功能域或LPS与CD14的较大亲和力抑制了此作用。
LBP能提高类脂A刺激腹腔巨噬细胞产生TNF-α的灵敏度和反应性，也能增强LPS诱导其它细胞因子和NO的产生。去除血浆中的LBP能抑制LPS激活细胞的功能，体内实验也表明抗-小鼠LBP抗体能阻止LPS引起的小鼠死亡。但另一方面，LBP在LPS或革兰氏阴性菌引起的免疫保护反应中起了至关重要的作用，LBP-/-小鼠对LPS或革兰氏阴性菌的抵抗力明显低于正常小鼠[2]。可见，LBP在对LPS免疫应答中的作用是双方面的。
2 CD14介导细胞激活的信号传导
LPS-LBP复合物需进一步与CD14结合才能刺激细胞，使信号向胞内传递而表现出生物学活性。作为LPS受体，CD14以两种形式存在：①由甘油磷脂酰肌醇尾巴（GPI）锚定在单核巨噬细胞表面（mCD14），②缺乏GPI的可溶性CD14（sCD14）。与GPI结合的CD14羧基端的具置尚未确定。sCD14有多条生成途径，在磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C作用下，CD14阳性细胞能释放此分子；CD14也能通过蛋白酶从膜上降解；一种磷脂酶D也能催化CD14的释放，但其作用还不清楚；CD14还可以由髓系细胞直接分泌。
LBP作为一种调理素，促进LPS与髓系细胞的结合。E-LPS和LBP混合，就和 单核巨噬细胞形成玫瑰花现象，预先用抗-CD14单抗或磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C处理细胞就能阻止玫瑰花的形成，并且，当抗-CD14单抗事先加入全血中，再加入LPS，在一定浓度范围内就无刺激产生细胞因子的能力。
虽然，LBP/CD14途径的阐明，是对LBP刺激细胞机制认识的一个飞跃，但同时也提出了许多目前无法回答的问题。最根本的问题是：象CD14这种GPI锚定的分子，本身并不直接与细胞内其它分子交换信息，是如何介导信号传导的？目前普遍认为LPS受体是多种分子的聚合体，而mCD14只是其中的配基结合亚单位，跨膜信号的传递由其它亚单位来执行。现已有不少证据支持这一假说。Hazio[3]等发现，LPS诱导铜蓝蛋白、LBP等急性时相反应蛋白的表达并不需要CD14的存在。但当LPS通过非CD14依赖途径发挥生物学功能时，通常需要超一定剂量的高浓度。抗-CD14单抗对LPS激活髓系细胞的抑制功能只有在低于一定浓度的LPS条件下有效。有人研究了表达GPI锚定的或膜整合形式的CD14的70Z/3细胞[4]，LPS对这两种细胞都有激活功能，因此，GPI本身对CD14参与信号传导并不重要，只使CD14与胞膜整合。
对sCD14的研究较少，一般认为它在LPS刺激内皮细胞、上皮细胞等本身无mCD14的细胞中起了一定作用[5]。
3 内毒素激活巨噬细胞的胞内信号传导
在内毒素刺激细胞的胞内信号传导途径中，研究最多的是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），多种因素都能激活此途径，尤其是多肽生长因子。LPS与CD14的结合导致蛋白酪氨酸激酶（PTK）的活化，从而激活下游的MAPK。一些实验表明，PTK抑制剂能抑制LPS诱导巨噬细胞产生TNF-α、IL-β及其杀瘤细胞活性[6]。Src酪氨酸激酶家族成员p53/56Lyn（可能与胞膜相连）能被LPS激活，并导致其自身磷酸化一过性减少而后增加[7]。其它被LPS激活的酪氨酸激酶包括p58/64hck和p59c-fgr等。但最近，Meng等[8]发现hck-/-fgr-/-lyn-/-小鼠来源的腹腔和骨髓巨噬细胞对LPS刺激产生IL-1，IL-6和TNF-α的反应皆正常，他们认为，LPS可能是激活了其它酪氨酸激酶如p72syk等。Raf-1能和ras直接作用而激活MAPK，通过ras依赖或非依赖途径，BAC-1.2F5巨噬细胞受LPS刺激导致Raf-1的快速磷酸化而活化，而酪氨酸磷酸化抑制剂，抑制Raf-1/MAPK的活化，表明它们的激活发生在PTK之后。
介导LPS信号传导的另一种途径是神经酰胺，它是由神经鞘磷脂酶催化神经鞘磷脂水解而生成。神经酰通过神经酰胺激活的蛋白激酶（CAK）而传递信息。CAK也能激活Raf[9]，这又提供了一条进入MAPK途径的通道。LPS直接激活神经酰胺信号传导途径的依据有：①类脂A和神经酰胺结构相似，②神经鞘磷脂酶和透细胞性的神经酰胺类似物能诱导巨噬细胞对LPS的部分反应，③LPS依赖于CD14而激活CAK，④来源于C3H/HeJ小鼠（内毒素耐受）的腹腔巨噬细胞对神经酰胺无反应。
另外，PKC、C蛋白等信号传导途径在内毒素激活细胞中也起重要作用[6，10]。但由于内毒素生物学效应的多样性、细胞来源的不一致性、检测传导途径指标的不同及各种传导途径相互联系，致使对其研究显得十分困难。
4 与内毒素激活细胞有关的转录因子和反应元件
转录因子家族Ets由三十种以上蛋白质组成，存在于多种生物，DNA结合部分为位于羧基末端含85个氨基酸残基的高度保守序列。Ets通过识别富含嘌呤的10对碱基对而调节目的基因的转录，TNF-α、IL-1β等多种LPS诱导的基因启动子中存在Ets结合位点。目前已证实Ets-2、Elk-1可由LPS诱导，而它们恰好又是MAPK信号传导途径的作用点[11]，酪氨酸激酶抑制剂genestein能阻止LPS导致其磷酸化[12]。Ets家族的另一成员Pu.1只表达在巨噬细胞和B淋巴细胞[13]，因此，Pu.1有可能是介导巨噬细胞特异基因表达的转录因子。
许多LPS反应基因都有κB/rel转录因子家族识别的位点，核转录因子NF-κB通过识别保守序列5′GGG（ATrich）5CC3′在许多细胞中诱导多种基因的转录。NF-κB是调节 转录活性的多基因家族，其成员包括NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52/p49）、RelA（p65）、c-rel和relB。保守区域rel控制其与DNA结合、二骤化和核移位。在静息细胞中，NF-κB与其抑制因子IκB形成无活性的胞浆复合物，生长因子、丝裂原等使IκB磷酸化而使NF-κB释放出来并进入核内，LPS激活巨噬细胞也是如此。IκB也是多基因家庭，至少包括MAD3/IκBα、IκBγ和bcl-3，它们与rel的结合有特异性。但仅是NF-κB的激活对内毒素刺激细胞的信号传导是不够的，LPS能激内毒素刺激细胞的信号传导是不够的，LPS能激活内毒素反应正常和内毒素耐受小鼠来源巨噬细胞的NF-κB，但只能使内毒素反应正常小鼠的巨噬细胞表达TNF-α和iNOS。最近，Xie[14]报道LREAA（一种脂多糖反应元件）结合蛋白的激活在LPS刺激巨噬细胞产生iNOS是必需的。其它转录因子，如NF-IL6等在LPS刺激细胞中的作用也有涉及，但其具体细节不清。
5 结语
由于LPS发挥生物学效应的配基的复杂性、新受体的发现、不同巨噬细胞反应的不同及与其它信号传导途径相互联系，以至于对其激活细胞的信号传导机制研究的进展并不令人满意。许多信号传导途径并非LPS激活细胞所特有，而往往与其它信号传导途径相互交叉。目前迫切的任务是找到LPS激活细胞特有的信号传导途径，但如果巨噬细胞的基因调节是由多条途径相互作用，这种努力也许将最终失败。
参考文献
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巨噬细胞范文2
【关键词】小鼠；巨噬细胞；分离；培养；鉴定
0.引言
巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞， 具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用[1， 2] ， 被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价[3] 。有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞，但这些方法大多都是繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象， 探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。
1.材料与方法
1.1实验对象
清洁级巴贝斯小鼠，体重在（30-32g），由兰州大学实验动物中心提供。
1.2实验方法
1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养
随机选取巴贝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用PBS洗涤2遍。再用含10%成牛血清的RPMI-1640培养液（0.1%双抗溶液）调节至2×106ml-1，接种于培养瓶及6孔板，置37℃，5%CO2培养箱培养2h，弃上清。用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃CO2培养箱中继续培养[4]。倒置显微镜观察细胞形态。
1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定
（1）台盼蓝染色计算存活率。
4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。（也可买Gibco的成品）； 胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9：1混合混匀。（终浓度0.04%） ； 计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。
（2）瑞氏染色计算细胞纯度。
细胞涂片自然干燥后，用蜡笔在两端画线，以防染色时染液外溢。随后将玻片平置于染色架上，滴加染液3-5滴，使其盖满涂片，大约1分钟后，滴加等量或稍多的II液，用吸耳球轻轻混匀。冲洗：染色5-10分钟用流水染液，待干。 结果观察，将干燥后的血涂片置显微镜下观察。先用低倍镜观察涂片，再用油镜。
2.结果
2.1小鼠巨噬细胞的分离培养
（1）巨噬细胞的观察与鉴定.
巨噬细胞体外培养24h观察结果。如图1
（2）台盼蓝染色结果。
从腹腔分离出来的巨噬细胞进行台盼蓝染色结果显示巨噬细胞的成活率>95%，如图2
（3）瑞氏染色结果。
从腹腔分离出来的巨噬细胞进行瑞氏染色结果显示巨噬细胞的纯度>98%，如图3
图1巨噬细胞体外培养24h观察 图2台盼蓝染色结果
图3 瑞氏染色结果
3.讨论及结论
巨噬细胞广泛分布于体内，它不仅参与非特异性免疫，而且是特异性免疫中一类关键的细胞，参与集体众多的生理和病理反应过程，如巨噬细胞的吞噬和消除病原微生物[5]，通过加工处理提成抗原，启动特异性免疫应答[6]，以及巨噬细胞通过细胞凋亡清除吞噬的致病病原体等。由于腹腔巨噬细胞多游离存在于腹腔的腹水中，易于获得，因此许多实验室在进行基础或配合临床研究巨噬细胞功能及其与疾病的关系、或筛选免疫增强药物和探讨其作用机制时，往往选用小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象。
虽然腹腔巨噬细胞的提取方法都是灌胃洗腹腔后，吸出含有巨噬细胞的灌洗液了，但具体操作略有差异[7]。预先注入的巨噬细胞刺激剂有淀粉溶液、肉汤、糖原等，以产生大量的巨噬细胞计入腹腔。虽然这些刺激剂能分离收集到大量的巨噬细胞，但注入的大分子抗原物质对巨噬细胞吞噬功能有一定的影响，获得的巨噬细胞已不再是原体内巨噬细胞的基础功能。本实验提取巨噬细胞的方法是对文献中方法的改进，关键在于活体腹腔注射不含血清的培养液，轻揉腹部后静置几分钟，然后颈椎脱臼致死小鼠，无菌打开腹腔吸取腹腔液[4]。此方法相对处死小数后进行系列操作而言，洗出的灌洗液中混杂的白细胞少，提取局势细胞的纯度高，是一种简便的小鼠腹腔巨噬细胞的分离方法，为巨噬细胞的相关研究奠定了基础。
【参考文献】
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巨噬细胞范文3
急性心肌梗死(AMI)的发生与冠状动脉粥样硬化(AS)斑块不稳定密切相关，炎症反应在不稳定斑块的发生发展过程中起着重要作用，其中巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory，MIF)是近几年的研究热点。
1MIF的生物学特性
MIF是在结构上高度保守的，独特的免疫调节因子，它具有许多趋化因子的功能，因此被归类于“趋化因子样功能”的细胞因子。它是一种强有力的炎症前细胞因子，主要来自T细胞和单核巨噬细胞，同时，发生AS斑块的内皮细胞和血管平滑肌细胞也能够高表达MIF〔1〕，它是免疫和炎症反应中的关键成分〔2，3〕。MIF活性的发挥需与多种胞内蛋白相互作用，而这首先需要MIF信号的跨膜传递。克隆表达和功能分析发现CD74是MIF的高亲合力膜结合蛋白，起着MIF跨膜受体的作用。在重组可溶性CD74分子，MIF结合于其109-149氨基酸残基部位，从而活化胞外丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号传导、细胞增殖分化和前列腺素E2的产生〔4，5〕。MIF生物学作用概括起来主要有以下几方面：①作为致炎因子，抑制巨噬细胞的游走，促进巨噬细胞在炎症局部的聚集、增生、激活及分泌一些细胞因子如白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，以此来增强巨噬细胞对感染和组织损伤的反应能力〔6〕。②对抗调节糖皮质激素免疫抑制效应，与激素共同调节炎症反应的强度。对抗糖皮质激素对外周血单核细胞合成释放TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和花生四烯酸的作用，以及对抗激素在核转录因子(NF-κB/IκB)信号转换通路中的效应，进而阻断了其对炎症因子表达的限制作用〔7，8〕。③维持CD3介导的T细胞增殖及炎性因子分泌，抑制自然杀伤(NK)细胞杀伤活力的潜能，参与免疫反应〔9，10〕。④作为脓毒
血症的重要介质，与TNF-α、IL-1β一样，MIF是炎症反应中的重要介质，它可以通过抑制糖皮质激素的抗炎效应而使炎症反应和抗炎反应之间达到平衡〔6〕。Mitchell等〔11〕给小鼠行脂多糖(LPS)腹腔注射，与野生型小鼠相比，MIF基因缺失小鼠的腹腔巨噬细胞生存率明显降低，表达的细胞因子也显著减少。尽管两种巨噬细胞表达的NO水平未见明显差别，但NO仍被认为是MIF基因缺失巨噬细胞凋亡增加的最重要原因。NO可促使细胞内p53蛋白的聚集，显著增强凋亡，MIF则可对抗NO的上述作用。2003年Leng等〔4〕研究发现，MIF可能通过与细胞膜表面蛋白CD74的细胞外基团结合，激活MAPK家族成员之一的细胞外信号调节激酶(ERKl/ERK2)传导通路发挥作用。Mitchell等〔11〕也证实，MIF可快速和持续磷酸化激活ERKl/ERK2 MAPK信号转导途径，使处于生长静止期的成纤维母细胞(NIH/3T3)活化增生。研究发现，MIF基因缺失小鼠体内的巨噬细胞对LPS和革兰阴性细菌如伤寒沙门菌反应低下，细胞因子分泌减少，体内的伤寒沙门菌浓度高，而对缺氧等刺激的反应却不受影响，这可能与MIF上调Toll样受体4(TLR-4)的表达有关，提示MIF可以促进保护性的T辅助细胞
的免疫反应〔12〕。⑤参与肿瘤的发生，刺激肿瘤生长和肿瘤血管的形成〔13〕。肿瘤抑制因子p53主要从两方面来阻止不适当的细胞增殖：诱导细胞分裂周期停止和凋亡。MIF通过拮抗myc活性诱导的P53依赖的凋亡来保持巨噬细胞的存活及促炎功能的抑制，使病理细胞生长加快，炎症扩大。因此，MIF促细胞生长的特性可能是参与多种炎症性疾病病理过程的重要机制之一〔11，14〕。
2MIF与AMI
MIF在AS中的表达是在研究高胆固醇血症兔时首次被发现的，在兔的整个腹主动脉存在各个阶段的广泛病变〔15〕。有研究报道称MIF能够激活趋化因子受体(CXCR2)和CXCR4，因此能促使炎性细胞如单核细胞和T细胞的募集〔16〕。Bernhagen等在小鼠身上研究发现应用中和抗体抑制MIF的作用，可以减少斑块内单核细胞和T细胞的数量并减缓斑块的进展〔16〕。目前研究发现MIF能够诱导单核细胞和T细胞向AS病变区聚集，可以调节血管平滑肌细胞的迁移和增殖，促进病变巨噬细胞向泡沫细胞转变并增加细胞外基质金属蛋白的降解，MIF的这些作用可能促进病变的发展，导致斑块的不稳定〔15〕。最近的文献报道〔17〕，糖皮质激素可以影响促进AS的发生的某些因子的表达，MIF作为一种糖皮质激素诱导分化的前炎性细胞因子，在AS的发病机制中起了相当重要的作用。Lin等〔15〕发现无论在AS早期的脂纹阶段或是在后期的斑块形成阶段，血管内皮细胞(ECS)和血管平滑肌细胞(VSMCs)都能表达MIF mRNA，并有MIF蛋白水平的增加，MIF在巨噬细胞聚集的病变部位高表达，还能诱导血管内皮细胞表达细胞间黏附分子-1(ICAM-1)，因此MIF的上调可能在巨噬细胞的黏附，向内皮的迁移、聚集尤其是转化形成泡沫细胞中起作用。余文辉等〔18〕观察了AMI患者37例，不稳定型心绞痛(UA)患者26例，稳定型心绞痛(SA)患者39例，接受经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)患者26例，有非典型胸痛而冠状动脉造影正常的对照组31例。这几组病人分别在发病第1、2、3天抽取血样，用ELISA法检测MIF水平。结果发现在发病第1～3天，AMI病组与SA组、UA组、PTCA组、对照组等比较，AMI病组血浆MIF水平明显高于其他病组(P
3小结
MIF不仅在AS的形成过程中发挥着重要作用，在疾病的进展，斑块的稳定性方面也可以通过调节各种炎症反应起着至关重要的作用;另外，MIF基因的多态性与AMI易感性也有着一定的相关性，因此测定MIF在体内的表达水平对预测疾病的发展、指导疾病的治疗方面有着重要意义。心血管疾病特别是AMI业已成为威胁人类生命健康的严重疾病，对此国内外学者不断的进行研究，发现炎症在疾病的发生发展过程中有着至关重要的作用。MIF具有趋化因子的功能，能够促进单核细胞和巨噬细胞向AS病变部位聚集、活化，释放一系列的炎性因子，从而导致疾病不断进展，斑块破裂发生AMI，进而威胁人类的生命，但是其在AMI发生发展过程中的作用机制以及它们作为AMI的预测指标乃至潜在的治疗耙点仍不很确定，有待于进一步的研究。
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巨噬细胞范文4
近年来，随着人们对创面愈合认识的深化，临床多采用外用生长因子促进创面愈合，有一定效果，但仍缺乏安全有效的加速创面愈合的积极措施［1］。中医药对于难愈性创面组织修复的疗效显著［2－3］。在长期临床实践中，用灸法治疗慢性难愈性创面取得了较好的效果，在加速创面愈合的同时还能够降低其病理性瘢痕的形成［4－5］。我们曾报道温和灸可缩短难愈性创面的愈合时间，改善创面组织修复的微循环［6］，但关于灸法降低难愈性创面病理性瘢痕形成的作用机制尚不完全明确。本实验旨在通过制造慢性难愈性创面模型，观察温和灸对慢性难愈性创面修复组织表面巨噬细胞数和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量的影响，初步探讨温和灸减少慢性难愈性创面瘢痕形成的可能作用机制。
1材料与方法
1．1实验动物选用健康成年雄性清洁级SD大鼠80只，体质量200～220g，由河北医科大学实验动物中心提供（合格证号：1006107）。随机分成4组，即温和灸治疗组（以下简称为温灸组）24只、TDP治疗仪治疗组（以下简称为TDP组）24只、模型组24只、正常组8只。单笼饲养，恒温，自然光照，喂食正常饲料和饮水。实验动物的使用及操作方法均经河北医科大学实验动物管理委员会审核批准。
1．2仪器与试剂艾灸专用鼠盒［7］（专利号：201120193244．8）；单头温灸器、无烟艾粒（河南南阳卧龙汉医艾绒厂）；TDP治疗仪（中国重庆巴山仪器厂）；FD12－158J正置金相显微镜（桂林方天光学仪器有限公司）；RM2125型LEICA切片机（德国LEICA公司）；CMIAS98A图像分析系统（北京航空大学图像中心）。注射用氢化可的松琥珀酸钠（天津生物化学制药有限公司）；浓缩型DAB试剂盒、免疫组化染色试剂盒（北京中杉金桥生物科技有限公司）；胶原蛋白Ⅰ抗体（COL1－18）：sc－8784、胶原蛋白Ⅲ抗体（COL3－15）：sc－8781试剂盒（美国胡佛斯有限公司）。
1．3模型制备大鼠常规饲养1周后，除正常组外，各组大鼠以盐酸氯胺酮（150mg／kg）腹腔注射麻醉，造模区（腰椎正中偏上）剪毛，用直径20mm的塑料瓶盖在造模区标记造模面积，新洁尔灭酊棉球皮肤消毒，沿标记线剪去皮下组织至肌筋膜，建立全层皮肤缺损开放性创面模型［8］229－230，止血，消毒纱布敷料覆盖伤口。除正常组外，自造模次日起，各组大鼠大腿根部肌肉注射氢化可的松琥珀酸钠100mg／kg，隔日1次，共注射7次，制成慢性难愈性创面动物模型［9］。
1．4各组处理方法自造模次日起，温灸组大鼠置于自制艾灸专用鼠盒中，用单头温灸器距离创面或穴位15cm，温和灸创面局部及双侧“肾俞”“足三里”穴［10］各15min；TDP组大鼠置于鼠盒中，用TDP治疗仪距离创面或穴位15cm，照射创面局部及双侧“肾俞”“足三里”穴各15min；模型组及正常组大鼠均置于自制鼠盒中15min，每日1次，不做治疗。各组大鼠分别于治疗后第7、10、14天各取8只，脱颈处死后，自创面边缘至创面中心，取大约0．5cm×0．5cm的创面肉芽组织，进行指标检测。
1．5观察指标及检测方法修复组织表面巨噬细胞数的测定：取创面组织40μm石蜡切片，HE染色，每张切片400倍光镜下采集5个视野的图像，统计巨噬细胞数，求平均值。修复组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量的测定：取创面组织40μm石蜡切片，脱水、酶消化处理、COL1A1、COL3A1抗体处理、免疫染色，每张切片400倍光镜下采集3～4个视野的图像，用CMIAS98A图像分析仪对Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白平均吸光度进行测定。
1．6统计学处理实验数据均用均数±标准差（x珚±s）表示，采用SPSS13．0统计软件进行统计分析，样本均数间比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P＜0．05为差异有统计学意义。
2结果
2．1各组大鼠创面修复组织表面巨噬细胞数（见图1)与正常组相比，温灸组、TDP组、模型组创面修复组织巨噬细胞数均明显增多（P＜0．05）；在治疗第7天，温灸组表面巨噬细胞数多于模型组（P＜0．05），温灸组与TDP组比较差异无统计学意义（P＞0．05），TDP组与模型组比较差异无统计学意义（P＞0．05）；在治疗第10天，温灸组、TDP组表面巨噬细胞数均多于模型组（P＜0．05），且温灸组多于TDP组（P＜0．05）；在治疗第14天，温灸组、TDP组表面巨噬细胞数均较模型组减少（P＜0．05），且温灸组少于TDP组（P＜0．05）。
2．2各组大鼠创面修复组织Ⅰ型胶原的表达（见图2）大鼠创面修复组织Ⅰ型胶原蛋白表达的平均吸光度，在治疗后第7天，温灸组、TDP组均较模型组升高（P＜0．05），温灸组与TDP组比较差异无统计学意义（P＞0．05）；在治疗后第14天，温灸组、TDP组均较模型组升高（P＜0．05，P＜0．01），温灸组高于TDP组（P＜0．01）。
2．3各组大鼠创面修复组织Ⅲ型胶原的表达（见图3）大鼠创面修复组织Ⅲ型胶原蛋白表达的平均吸光度，在治疗后第7天，温灸组、TDP组均较模型组高（P＜0．01），温灸组与TDP组比较差异无统计学意义（P＞0．05）；治疗后第14天，温灸组、TDP组均较模型组高（P＜0．01），温灸组高于TDP组（P＜0．01）。
2．4各组大鼠创面修复组织Ⅰ、Ⅲ胶原蛋白比值Ⅰ、Ⅲ胶原蛋白的比值，在治疗后第7天，与正常组比较，模型组显著升高（P＜0．05），TDP组明显低于模型组（P＜0．05）；在治疗后第14天，与正常组比较，模型组仍明显升高（P＜0．05），温灸组、TDP组明显低于模型组（P＜0．05，P＜0．01），温灸组与TDP组比较，差异有统计学意义（P＜0．05）。见图4。
巨噬细胞范文5
基金项目：国家自然科学基金（81101410，81160233）；江西省自然科学基金（20122BAB205002）
作者单位：330006 南昌，南昌大学第一附属医院重症医学科（刘芬、江榕、曾振国、聂成、赵宁、黄彩雪、夏亮、钱克俭），肿瘤科（李勇）
通信作者：钱克俭，Email：
【摘要】目的 观察脂多糖 （lipopolysaccharide， LPS） 刺激大鼠肺泡巨噬细胞NR8383后乙酰胆碱酯酶 （acetylcholinesterase， AChE） 的表达变化，为研究胆碱能抗炎通路的调控提供新的实验依据。
访法 将体外去致热源培养的NR8383细胞分为对照组及LPS （1 μg/mL） 刺激组，于刺激后3、6、12、24 h各时间点分别离心收集上清液及细胞沉淀，采用酶联免疫吸附法 （enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA） 测定上清液中肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α， TNF-α） 的变化，实时定量PCR检测细胞中AChE mRNA的表达改变，蛋白质免疫印迹法 （Western blot） 检测细胞中AChE蛋白的表达变化，乙酰胆碱酯酶T-CHE测试盒检测上清液中AChE活性的变化。组间多重比较采用单因素方差分析，进一步采用LSD-t检验进行两两比较，P
结果 与对照组相比，TNF-α的含量在LPS刺激NR8383细胞后3 h开始显著上升 （P
结论 LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞后，AChE的表达增加，提示其可能参与肺泡巨噬细胞炎症反应的调控；LPS刺激后24 h，AChE mRNA仍处于高表达水平，AChE蛋白及活性却下降，提示在肺泡巨噬细胞炎症反应中可能存在AChE转录后水平的调控。
【关键词】乙酰胆碱酯酶；脂多糖；肺泡巨噬细胞；炎症反应；脓毒症
Changes of acetylcholinesterase expression in alveolar macrophages stimulated by lipopolysaccharide Liu Fen， Jiang Rong， Li Yong， Zeng Zhenguo， Nie Cheng， Zhao Ning， Huang Caixue， Xia Liang， Qian Kejian. Department of Critical Care Medicine， the First Affiliated Hospital of Nanchang University， Nanchang 330006， China
Corresponding author： Qian Kejian， Email：
【Abstract】Objective To observe the changes of acetylcholinesterase （AChE） in rat alveolar macrophages NR8383 stimulated by lipopolysaccharide （LPS） in order to provide a novel experimental evidence for studying the regulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway.Methods The NR8383 cells cultured with pyrogen-free in vitro were divided into control group and LPS （1 μg/mL） stimulation group. Culture supernatants and cell pellets were collected by centrifugation at 3 h， 6 h， 12 h and 24 h after stimulation， respectively. The level of tumor necrosis factor-α （TNF-α） in the supernatant was assayed by using enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The expression of AChE mRNA in cells was detected by using real time quantitative RT-PCR， The level of AChE protein in cells was analyzed by using Western blot， The activity of AChE in the supernatant was measured by using True Choline esterase assay kit （T-CHE）. One-way analysis of variance （ANOVA） was used for comparisons between two groups， and LSD-t test was performed for further comparison， and difference was statistically significant at P < 0.05. Results The level of TNF-α began to increased significantly at 3 h after stimulation of NR8383 cells with LPS （P
【Key words】Acetylcholinesterase； Lipopolysaccharide； Alveolar macrophage； Inflammatory response； Sepsis
乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase， AChE）是一种特异性催化水解神经递质乙酰胆碱 （acetylcholine， ACh）的酶[1]。最近有研究表明炎症反应时迷走神经末梢通过释放ACh可与巨噬细胞上的α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor， α7nAChR）相互作用，减少肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）等促炎因子的释放，形成一条胆碱能抗炎通路调控炎症反应[2-3]。AChE因其水解抗炎介质ACh的作用，成为研究炎症反应的新靶点。但AChE在肺泡巨噬细胞炎症反应中的表达变化未见文献报道。本研究以脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）刺激大鼠肺泡巨噬细胞为炎症反应模型，观察并分析炎症反应时AChE在肺泡巨噬细胞中的表达变化，为研究胆碱能抗炎通路的调控提供新的实验依据。
1材料与方法
1.1 材料
大鼠肺泡巨噬细胞株（NR8383）购自中国科学院细胞库；Ham’s F-12K培养基、LPS（E. coli， O111： B4）购自美国Sigma-Aldrich；胎牛血清购自美国Gibco；大鼠TNF-α ELISA检测试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司；TRIzol、实时定量PCR引物购自美国Invitrogen；PrimeScript逆转录试剂盒，SYBR实时荧光定量试剂盒购自大连TaKaRa；山羊抗大鼠乙酰胆碱酯酶多克隆抗体购自美国abcam；小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体购自美国anbo；辣根酶标记兔抗山羊IgG、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG购自北京中衫金桥生物技术有限公司；乙酰胆碱酯酶T-CHE测试盒购自南京建成生物工程研究所。
1.2细胞培养
所用细胞培养物品均行去致热源处理。将大鼠肺泡巨噬细胞NR8383培养于含15%去致热源胎牛血清的Ham’s F-12K完全培养基中，置于大气压下37 ℃、5% CO2的恒温湿培养箱中培养。2～3 d更换一次培养基，当细胞融合至80%以上时进行传代。
1.3 实验分组及处理
将NR8383细胞按1×106 个/mL密度接种于六孔板中，每孔2 mL。实验分为对照组及LPS刺激组，将终质量浓度1 μg/mL的LPS加至LPS刺激组培养基中，于刺激后3、6、12、24 h各时间点分别离心收集上清液及细胞沉淀，上清液用于TNF-α及AChE活性检测，细胞沉淀用于提取总RNA及总蛋白。
1.4 肺泡巨噬细胞上清液中TNF-α蛋白浓度的检测
采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定上清液中TNF-α质量浓度，遵照ELISA试剂盒检测说明书进行操作。
1.5 肺泡巨噬细胞中AChE mRNA表达的检测
采用TRIzol试剂提取细胞总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定所提的总RNA质量，紫外分光光度计测定总RNA在260 nm和280 nm处光密度值，以确定浓度及纯度。参照PrimeScriptRT reagent Kit逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，10 mL反应体系。反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。参照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒说明书进行实时定量PCR反应，20 mL反应体系。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。在ABI StepOne定量PCR仪上进行扩增反应，选取β-actin作为内参照，采用2-ΔΔCt 方法计算AChE mRNA的相对表达量。
1.6 肺泡巨噬细胞中AChE蛋白表达的检测
采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测AChE蛋白表达。细胞经RIPA试剂冰上裂解后提取总蛋白，通过BCA法测定蛋白浓度，加入2×上样缓冲液后沸水中水浴变性5～10 min。各取20 μg/孔，进行10% SDS-PAGE垂直凝胶电泳分离（浓缩胶电压80 V，分离胶电压120 V），随后电转移至NC膜上（电流100 mA，时间1.5 h）。5% 脱脂奶粉封闭1 h，一抗（山羊抗大鼠AChE抗体1∶200，小鼠抗大鼠β-actin抗体1∶3000）4℃孵育过夜。TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（兔抗山羊1∶10 000，山羊抗小鼠1∶3000）室温孵育1 h，TBST洗膜后，滴加免疫荧光化学发光法发光底物，曝光，显影。以β-actin为内参照，分析条带灰度值。
1.7 肺泡巨噬细胞上清液中AChE活性的检测
收集上清液按乙酰胆碱酯酶T-CHE测试盒操作说明书进行反应测定，AchE活性 （U/mL）=（测定管OD值-对照管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）×标准品浓度 （1 μmol / mL） ×样本测试前稀释倍数。
1.8 统计学方法
采用SPSS 17.0软件处理数据，结果以均数±标准差（x±s）表示，不同时间点多个均数多重比较采用单因素方差分析，若差异具有统计学意义，不同时间点均数两两比较则进一步采用LSD-t检验。以P
2 结果
2.1 肺泡巨噬细胞上清液中TNF-α的浓度变化
LPS（1 μg/mL）刺激NR8383细胞后，通过ELISA检测上清液中TNF-α的变化，结果显示，与对照组相比，TNF-α的含量在LPS刺激后3 h开始显著上升（P
2.2 肺泡巨噬细胞中AChE mRNA的表达变化
LPS（1 μg/mL）刺激NR8383细胞后，采用实时定量PCR方法检测AChE mRNA的相对表达变化，结果显示，在LPS刺激后3 h、6 h、12 h、24 h，AChE mRNA的表达水平与正常对照组相比分别上调（3.19 ± 0.44）倍（P
2.3 肺泡巨噬细胞中AChE蛋白的表达变化
LPS（1 μg/mL）刺激NR8383后12 h、24 h，对细胞AChE蛋白采用Western blot方法进行分析，结果如图3A所示，在LPS刺激后12 h，AChE 蛋白条带比对照组条带增粗，颜色加深；在LPS刺激后24 h，与对照组相比，AChE 蛋白条带变细，颜色变浅。条带经灰度值分析，AChE/β-actin灰度比值结果如图3B所示，对照组、LPS 12 h、LPS 24 h灰度比值分别为（1.05 ± 0.02），（1.37 ± 0.01），（0.65 ± 0.05） ，P
2.4 肺泡巨噬细胞上清液中AChE活性的变化
LPS（1 μg/mL）LPS刺激NR8383后12 h、24 h，通过乙酰胆碱酯酶T-CHE测试盒对细胞上清液AChE活性进行测定，结果显示，对照组AChE活性为（2.64 ± 0.85 ）U/mL，LPS刺激后12 h AChE活性为（6.14 ± 1.13 ）U/mL （P
3 讨论
LPS是革兰氏阴性菌外壁的主要成分，它可以通过作用肺内巨噬细胞表面Toll样受体4（Toll-like receptor 4， TLR4），依次磷酸化一系列蛋白激酶，最终活化核转录因子-κB（nuclear factor kappa B， NF-κB），引起多种炎症因子如TNF-α基因转录，启动炎症反应，导致脓毒症肺损伤，甚至急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome， ARDS）发生[4-6]。本研究结果显示LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞后TNF-α大量释放，表明成功诱导肺泡巨噬细胞炎症反应模型。碱能抗炎通路是一条神经免疫调节通路，由传出迷走神经、神经递质ACh和α7nAChR组成，炎症反应时迷走神经释放的ACh与巨噬细胞上α7nAChR 结合，通过细胞内信号通路转导，阻碍NF-κB的活化，抑制促炎因子释放，从而减轻炎症反应[7]。在内毒素血症、脓毒症休克、缺血-再灌注损伤等均有研究表明胆碱能抗炎通路发挥着重要的作用[8-9]。Sun等[10]研究发现在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞和小鼠中，胆碱能激动剂尼古丁通过上调miR-124的表达水平，降低白细胞介素-6（interleukin-6， IL-6）等炎症因子的表达。AChE是一种特异性水解ACh的酶，它不仅存在于神经元细胞中，也存在于免疫细胞上，其中巨噬细胞表达最丰富[11]。炎症反应时巨噬细胞分泌的AChE将迅速水解ACh，阻碍ACh的抗炎作用，因此AChE成为调控炎症反应的新靶点。研究表明使用胆碱酯酶抑制剂可减轻脓毒症动物炎症反应，如胆碱酯酶抑制剂加兰他敏可通过抑制中枢AChE活性，降低LPS动物模型的血清TNF-α和IL-6水平及提高生存率[12]。另外有研究发现血清胆碱酯酶可能参与了老年人全身炎症反应综合征的发生和发展过程，并且对该类患者的预后有一定的预测作用[13]。但胆碱能抗炎通路在ARDS中的调控作用及机制尚不确定。
本研究中，通过检测对照组AChE mRNA、蛋白的表达及AChE活性均证实AChE在大鼠肺泡巨噬细胞中存在表达。更为重要的是，本研究观察到LPS刺激肺泡巨噬细胞后12 h，AChE mRNA、蛋白及活性均较对照组升高，这说明LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应能引起AChE的表达增加，提示其可能参与肺泡巨噬细胞炎症反应的调控；刺激后24 h，AChE mRNA仍处于高表达水平，但AChE蛋白及活性均低于对照组，这与de Oliveira等[14]对人急性白血病单核细胞细胞株（the human acute leukaemia monocytyc cell line， THP-1）的研究结果一致，提示在肺泡巨噬细胞炎症反应中可能存在AChE转录后水平的调控。
转录后调控通常是由成熟mRNA的5’或3’ 端非翻译区（untranslated region， UTR）与相应蛋白或microRNA等相互作用，介导mRNA的出核转运、翻译起始及降解等过程，从而调节基因的表达。近来有研究[15-16]对小鼠和人初级巨噬细胞的研究发现AChE是miR-132的靶基因，miR-132能靶向作用AChE mRNA的3’UTR，抑制AChE蛋白翻译表达，加强胆碱能抗炎通路作用从而使炎症消退。笔者的前期研究表明LPS刺激肺泡巨噬细胞能引起miR-132表达上调。因此笔者推测肺泡巨噬细胞中AChE转录后水平的调控可能与miR-132有关，但仍有待今后进一步实验证实。
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巨噬细胞范文6
关键词：巨噬细胞：Exosomes；透射电镜；超速离心
中图分类号：Q28
文献标识码：A
文章编号：1007-7847（2014）04-0283-03
Johnstone等研究网织红细胞发育时，发现网织红细胞成熟过程中会分泌出一种囊泡状物质，于是分离纯化了该物质并命名为Exosomes。目前研究认为Exosomes由细胞内多泡体（muiti-vesicular body， MVB）与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种直径约30～100nm的膜性囊泡，这些小囊泡具有呈递生物相关抗原与免疫治疗作用的特性。
巨噬细胞是目前功能最强的抗原呈递细胞，能刺激初始型T细胞增殖，激发机体免疫应答。巨噬细胞分泌的Exosomes主要表达MHC分子、共刺激分子及特异性抗原肽，并能将抗原刺激信号运送到抗原递呈细胞（antigen-presenting cells，APC）或T淋巴细胞从而诱导特异性免疫应答，发挥重要的免疫调节作用。近些年来Exosomes在免疫调节、肿瘤治疗、疫苗开发等方面的作用已经引起科研人员的极大关注并已经展开了许多基础与临床研究。
但由于Exosomes直径一般在30～100nm内，很难从细胞上清中分离及获得纯度较高的Exo-somes。本文主要利用低温超速离心方法收集巨噬细胞分泌的Exosomes，并对其形态学与生物学特性进行初步的分析鉴定，为后续实验研究奠定了实验技术基础。
1材料与方法
1.1材料
人单核白血病细胞系THP-1来自武汉大学保藏中心。
1.2试剂及仪器
RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Hy-clone公司，CD80、ICAM-3、HSP-70抗体购自美国Santa Cruz生物技术公司、佛波酯（12-邻-14-烷酰佛波醇-13-乙酸酯，PMA）购自德国默克公司，Cocktail蛋白酶抑制剂购自长沙海扬生物技术公司、蔗糖、磷钨酸均购白南京金斯瑞生物技术公司。
美国Beckman超速离心机；日本日立透射电子显微镜；美国Forma Scientific CO2细胞培养箱；倒置显微镜（Olympas）；中国六一垂直电泳仪。
1.3 细胞培养
THP―l细胞于含10%胎牛血清的RPMl-1640培养基中，37℃，5% CO2饱和湿度环境中培养48h后，0.1mmol/L PMA诱导THP-1细胞24h，使其分化形成巨噬细胞。
1.4Exosomes收集
收集巨噬细胞上清液，4℃，4000r/min，离心20min，保留上清；4℃，10000r/min，离心45min，保留上清；4℃，32000r/min，离心60min，保留沉淀，9%蔗糖溶液200μL、lOOx蛋白酶抑制剂2μL溶解沉淀；4℃，40000r/min，离心45min保留沉淀，9%蔗糖溶液50μL、lOOx蛋白酶抑制剂lμL溶解沉淀，-80℃保存备用。
1.5Exosome透射电镜鉴定
取10μL新鲜Exosomes溶液，3%磷钨酸染色5min，将Exosomes滴于铜网膜，65℃烤干，透射电镜下观察其形态大小并拍照保存分析Exo-somes提纯质量。
1.6Western blot
Bradford方法测定Exosomes蛋白浓度；配制10%SDS-PAGE电泳凝胶，将变性后的蛋白质按50μg的蛋白质总量上样电泳，然后通过电转移法将蛋白质转至PVDF膜上，以免抗人CD80、I―CAM-3、HSP-70抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的二抗进行免疫反应，凝胶成像系统观察拍照。
2结果
2.1佛波酯（PMA）诱导THP-1分化成巨噬细胞
THP-1细胞培养48h后细胞密集度达80%后的生长情况，THP-1细胞经0.1mmol/LPMA诱导24h后，分化形成梭形巨噬细胞（图1），分化形成的类巨噬细胞具很强的吞噬功能。
2.2透射电镜鉴定Exosomes
10μL新鲜Exosomes溶液，与3%磷钨酸2μl染色5min后，Exosomes溶液轻轻滴于铜网膜，65℃烤干，透射电镜下观察Exosomes形态学特征（图2A），并利用NanoSight统计系统分析Exosomes溶液中囊泡直径大小，并绘制曲线（图2B）。
2.3Exosomes膜蛋白表达
CD80、ICAM-3和HSP-70 3种蛋白质在不同细胞来源的Exosomes上均有表达，目前认为这3种蛋白质可以作为Exosomes的特征蛋白质。Western blot研究分析巨噬细胞分泌的Exosomes膜上CD80、ICAM-3、HSP-70的表达（图3）。
3讨论
近年来，越来越多的实验结果证明：树突状细胞和肿瘤细胞产生的Exosomes具有显著的免疫调节功能，可转运肿瘤抗原至抗原提呈细胞，诱导细胞毒性T-淋巴细胞反应，产生和增强抗原特异性免疫应答；Exosomes的非细胞性及其不易被体内环境诱导丧失活性、无繁殖能力、稳定性高、体积小易清除、储藏时间长等优点，使Exosomes有可能成为一种很有潜力的新型无细胞治疗性肿瘤疫苗。目前法国科学家研究的树突状来源的Exosomes肿瘤疫苗已经进入临床I期，并且尚未发现任何副作用。Bard等研究报道，肿瘤来源的Exosomes亦可诱导有效免疫应答，如恶性渗出物（胸水、腹水）中的Exosomes同样含有肿瘤抗原和抗原提呈分子，可以诱导产生抗肿瘤一细胞反应。