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高效液相色谱仪范文1
中图分类号：TS206.2 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）21-0088-01
引言
高效液相色谱仪（HPLC）的灵敏度高、分辨率高、色谱柱支持反复利用、运行效率高、速度快、流出组收集难度低，是当前我国实验室内使用范围较广的一种分析型仪器。如今，在大气环境分析、无机分析、生物医药研究、食品检测等领域，高效液相色谱仪都得到了应用。
安捷伦高效液相色谱仪的出现，使HPLC的压力上限得到了提升，四元泵、等度泵、二元泵系统的压力上限均可达到600bar，其最高流速多达5mL/min。其中，四元泵系统与等度泵系统的压力上限在达到200 bar时，其流速为10mL/min，检测速率为80 Hz，灵敏度为原先的十倍，大大提高了安捷伦的通用性，促使安捷伦的分离速度上升了一个台阶。
1 安捷伦高效液相色谱仪的环境要求
为了保持仪器的正常运行，延长仪器的使用寿命，环境必须保持干净、电压稳定、远离水源。我们应避免在温度和湿度的急剧变化，一般温度保持在1530℃，湿度30% - 80%。高效液相色谱法是最常用的有机溶剂，如甲醇，有挥发性并且有毒性，并应配备通风设备。
2 安捷伦高效液相色谱仪的开机维护
首先，检查检测过程中用到的色谱柱与流动相的准确性，紧接着将仪器的稳压电源打开，然后打开柱箱与输液泵，待色谱柱的最大保护柱压设置好后开始排气，保证流路过程中没有气泡产生。若有气泡存在，气泡内的氧气会对仪器组件发生氧化作用，导致机器的性能指标受到影响。其次，在控制流速的过程中，应遵循由慢到快的过程，如此可对色谱柱起到更佳的保护效果。再者，要认真观察柱压和流速是否可以合理与平稳地增加，等到流速已达到所需值且柱压处于稳定状态后，促使检测器工作，如此即可有助于检测器的使用寿命增加。
3 高压输液泵的维护
整个液相系统能否通畅、压力是否稳定、流量是否准确主要取决于输液泵。若压力的跳动幅度大、流量的精准度不高，会导致基线的变幅增大，噪音扩大，最终使检验最终结果与实际出现偏离。为此，要采用HPLC级别的流动相，运用0.45μm滤膜进行过滤。①流动相使用前须脱气，避免给在线脱气机太大的压力。定期更换流动相，避免水溶液滋生藻类或微生物。②要注意更换滤芯，在排气泡的时候，水相以5 ml/min的流速，压力超过10 bar就要更换滤芯。③配制10%异丙醇溶液，清洗柱塞清洗附件。调节其打开周期，让泵里充满异丙醇溶液，防止盐析出。④清洗更换溶剂人口过滤头，如果是玻璃材质的，不能用超声清洗，只能用30%的硝酸溶液浸泡，定期更换。
4 色谱柱的柱前柱后维护
色谱柱属于消耗品，所以购置到的色谱柱的厂家与仪器的厂家不同的情况很普遍。实际上，不同厂家的管线接头也许会和柱头之间存在偏差的可能。因此，在购置色谱柱的过程中，要谨慎行事，严格依据仪器接头购置柱头与其相符的色谱柱。
使用流动相前千万注意，流动相与色谱柱内的保存溶剂和系统内存留溶剂的混溶性，避免形成乳化小液滴，从而毁坏柱子。可以使用异丙醇作为过渡溶剂，实验室应配备有色谱纯的异丙醇作为过渡溶剂，或用于清洗备件。在使用中应当注意，过滤是非常重要的环节，有效过滤才能够有效保护色谱柱、仪器。为了避免这种情况，不能使用已经存放日期过长的蒸馏水及磷酸盐溶液，如果条件许可的话，可以采用“在溶液中加入0.0001-0.001M的叠氮化钠”的方法来处理解决。也可以在溶剂瓶内溶剂的上方不断地吹入比较稳定的氩气从而实现隔绝空气的目的。另外，切忌将溶剂瓶放置于光线强烈的环境下，否则会使溶液本身的效用丧失。同时，为了减轻阳光对容积瓶的影响，应尽可能地运用琥珀色的溶剂瓶进行防治。当然，也可采取把保护柱安装于色谱柱之前的方式，以防色谱柱受到污染。此外，要定期用水对全部通道进行冲洗，确保阀口上的盐沉淀被及时清除。
鉴于在日常分析检测过程中的对象大部分是复杂的混合物，但色谱柱的内腔容积与填料相当小，考虑到色谱柱的使用时间有限，因此通常会在柱前应用保护柱，通过0.45μm的滤膜后才能使用样品，并定期更换保护柱芯。待样品做好后，清洗干净流路与柱子，确保其清洁度达到要求。为节省光源，增加灯的使用年限，应关闭检测器开关，然后选取5%的甲醇与95%的水对流路内的盐进行冲洗，紧接着用5%的水与95%的甲醇继续进行冲洗，待其使整个系统达到充盈状态。色谱柱首先选择50%的乙睛水将残留物清除，然后用纯乙睛充满整个柱子。
5 期间核查
试剂：山梨酸标准溶液；
检测条件：色柱：Hypersil ODS， 5 EA.m， 4.6 mm×150 mm；流速：1.0 mL/min；
流动相：甲醇、乙酸钱溶液（（ 0.02 mol/L ） （ 5：95，VIV）；
检测器：二极管阵列检测器，紫外检测器，波长230 nm。
6 评定结果
6.1 技术要求
①通过六次测量后，得到的定性测量重复性误差，RSD定性为1.5%。②定量测量重复性误差（6次测量）RSD定量为3.0%。③回收率（6次测量浓度的平均值与标准液浓度）大约处在90%至110%的范围内。
6.2 液相色谱仪期间核查记录表
选择以浓度值是20μg/mL的山梨酸为标准物，进样量是10μL，波长是230 nm，甲醇为其流动相：乙酸钱溶液（0.02 mol/L）（5：95，V/V），流量是1mL/min，下表1为液相色谱仪期间核查记录表。
6.3 核查结论
通过对仪器设备的使用期间的验证，以满足实验工作的要求，保证实验结果的准确性，试验检定的有效期内可以继续使用。
7 安捷伦高效液相色谱仪关机维护
做完实验后，需立马清洗色谱柱，确保色谱柱干净。首先，要关闭检测器的开关，以节省光源，延长仪器灯的使用时间。同时，将检测器和色谱柱的连接程序全部切断，从而避免对检测池形成不利影响。运用流动相对流路进行长达半个多小时的冲洗，紧接着用15%的甲醇水洗大约10min，再用纯甲醇冲大概30min，运用纯化水对外流路等处进行冲洗。输液泵的流速减至0时，才可将稳压器与泵关闭。若把柱子彻底地浸泡在有机相中放置的话，可以有效防止纯有机相封存反相色谱柱。
参考文献：
[1]王媚.高效液相色谱仪的日常维护及常见故障[J].现代妇女（下旬），2014，11：494.
[2]胡大方，王海波. 高效液相色谱仪期间核查方法研究[J].中国兽药杂志，2005，11：18-19.
高效液相色谱仪范文2
关键词：高效液相色谱仪自动进样器校准方法；不确定评定；测量方法
一、高效液相色谱仪自动进样器校准方法
1.高效液相色谱仪自动进样器校准方法的引进条件
众所周知，测量始终是分析某物质不可避开的方法，并且也是确定物质各项指标是否合格，以及各成分，还有个成分之间如何发生反应以及之后的各项指标的重要方法，但是单一的测量方法存在着很多的不足之处，而在测量之中任何一点小的纰漏都有可能造成最后的巨大损失，所以在现实的严峻条件之下，为了更好更全面地发挥测量的效果和应有的准确度，引进了高效液相色谱仪自动进样器校准方法。在此之前，国际标准化组织（ISO）曾于1993了《测量不确定度表示指南》，这样的标准曾是国际上用于测评物品的最低准则，而高效液相色谱仪自动进样器校准方法也是在严格依据指南上的说明来进行创造发明的方法，也正是因为这样的标准使得高效液相色谱仪自动进样器校准方法在起点之处的效果就高于普通的校准方法。此外，国家质量技术监督局也曾于1999年批准颁布过JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》。而这之中德CNAL/AC01∶2005《检测和校准实验室认可准则》（等同于ISO/IEC17025∶2005）中5.4.6对有关不确定测量的相关方法进行了明确的规定，包括对实验室中应有的用于测量的设备配套设施，还有在测量之中应该遵循的程序守则。也正是因为这种测量效果的有效性和权威性，在基本的测量方法被普及之后，各大报告中均要求在最后提交的时候附上关于高效液相色谱仪自动进样器校准方法及不确定评定的评价结果，举一个明显的例子，在参加能力验证和比对中，就要求附上不确定评定的最后结果。
2.高效液相色谱仪自动进样器校准方法的具体操作原理
高效液相色谱仪自动进样器校准方法一般采用的方法，是根据液体的最小浓度来进行差量检测，而根据国家的的对于液体的最新研究显示，液体中的浓度的测量时液体中最敏感的地方，其敏感度超过了所有的其他指标，是能够准确得出测量结果的标杆，也因此成为了测量的最重要的指标之一。在测量中，利用高效液相色谱仪自动进样器校准方法来进行基本的测量，然后再通过对测量的结果进行分析合成，就能得到初步的结果。试验条件之下对液体的最小浓度的检测，在达到了一个极点之后，整体上就会成为一个饱和的状态，在这种饱和状态之下的液体很难检测出所想要的数据和效果，所以在液体到达饱和状态之前就必须要能够测量出有效地的结果，这就对测量的时间效应有了严格的要求，而高效液相色谱仪自动进样器的优势之一就是其对时间的把握度能够高于普通的仪器，这样不仅能够节省相应的时间，也能够在保证试验效果的同时，尽量避免对检测物品的浪费，（因为一旦物品至于空气之下，则会很开与空气产生化学反应，在这样的化学反应之下，不仅是液体的纯度会发生变化，需要检测到的液体的相关数据也会因为化学反应产生质的变化，这样便会导致最后的测量结果出现差错）
除此之外，最新发表的欧洲《质量控制文件》中也提供了具体的供高效液相色谱仪自动进样器校准方法如何操作和具体的流程做出了详细的解释和说明。在参考控制文件之中，提出了通过高效液相色谱仪自动进样器校准方法在进行测量的时候，应该对被检测的液体的体积，残体，密度等进行具体的测量，而在测量之后还应该进行至少5次以上的重复测量，在这样的测量结束之后，建立相关的体积误差，残液留样的数据分析对比，并且通过重复性检测建立复式校准方法，最后保证经评定之后的效果进样体积误差的相对扩展不确定度为1.8%。通过具体的标准对检测结果进行限定，不仅能够提高检测的效率，还能减少成本的使用你，是一个利益双得的两全之法，同时这样的检测结果标准规定也是为之后的高效液相色谱仪自动进样器的校准进行其他类似的校准时准去的依据保证和方法经验的提供。
二、高效液相色谱仪自动进样器校准方法及不确定度评定的具体效果演示说明
1.测量果冻中环己基氨基磺酸钠中对高效液相色谱仪自动进样器校准方法及不确定度评定的使用
环已基氨基磺酸钠俗称甜蜜素，是一种人工合成的无营养性食品甜味剂。因长期存在甜蜜素是否具致癌性的争议，英国、美国、欧盟、加拿大等国家和地区的食品中甜蜜素的添加均规定了允许的含量，日本则不允许使用。近年来，我国也将甜蜜素列入为限制使用的食品添加剂。它的基本性质效果是能够在水中微溶，但是在甲醇、乙醇、氯仿或二氯甲烷等强酸性物质中几乎不溶。适当的使用中环己基氨基磺酸钠可以达到对产品增味的效果，但是一旦使用过量，就可能会造成严重的急性过敏反应，或者是严重的腹泻，更甚者甚至会威胁人的生命安全，虽然现代医疗技术已经找到相应的方法能够及时处理这样的情况，但是如果一旦事情发生的太过于迅速或者用量过大，就很难能够避免意外情况的发生，因此，对环己基氨基磺酸钠应该在果冻中使用多少何其的具体效果和可能出现的情况进行测量就有了战略性的意义。
2.测定果冻中环己基氨基磺酸钠中使用的具体参数
检测中所需要的化学数据建立在基本的数学模型之上，而使用到的基本公式就是
CX = × ×100% （1）
式中：CX――供试品的含量；
AR――对照品的峰面积
AX――供试品的峰面积
WR――对照品浓度（g）
WX――供试品浓度（g）
这个基本的公式适用于计算产品中检测出的结果时的对具体的产品数据进行分析的时候使用，是在检测之后需要用到的工具。
检测之前需要用到的工具包括电子天平，特定的试管若干，同时还应该注意的是对室内温度的控制，一般在二十五摄氏度左右，同时控制液体在液箱中的流速大概为1.0ml/min ，在做好了基本的设施准备之后，应该注意的就是在实验过程中进行数据的准确计量。在实验中会用到的数据一般有：波长，样品和对照样品的量度，样品和对照样品的浓度，两种样品的平均峰面，对照样品的实际浓度和在掺水之后的产品变量的浓度，供应品的含量，其中对对照品纯度的控制要在：99.5%以内 ；对样品中含水量的控制要在：4.9%以内。在计算之后，除了基本的检查核算以确保测量的结果无误，还应该进行合成标准不确定度的计算，一般来说这样的计算主要是为了计算重度，举一个简单的例子，在各项条件符合标准的状况下，合成标准不确定度的计算结果应该是类似于下面的结果：
uc（Cx）=
= =0.021
uc（CX）=100.41%×0.021=2.1%
最后，在计算结果的基础上扩展不确定度计算，在进行完最后一步之后，按照标准流程提交报告。
参考文献：
[1]王冠杰，季士委，田利，曹守春，邹健，杨洋.高效液相色谱仪自动进样器校准方法及不确定度评定[J].化学分析计量，2013，05：69-71.
高效液相色谱仪范文3
【关键词】 仔花感冒胶囊；对乙酰氨基酚；高效液相色谱法
Abstract：Objective To establish a method for the determination of Paracetamol in Zihua Ganmao Capsule. Method Samples were separated on a Kromasil-C18 column with the mobile phase of methanol- water (35∶65)， and the detection wavelength was set at 249 nm. Result The calibration curves were linear in the range of 0.165～0.99 μg (r＝0.999 9) for Paracetamol. The average recovery was 98.41% and RSD＝ 0.64% (n＝6). Conclusion The method is accurate and repeatable， and can be used for the quality control of Zihua Ganmao Capsule.
Key words：Zihua Ganmao Capsule；Paracetamol；HPLC
仔花感冒胶囊由狗仔花、柴胡、藁本、防风、黄芩以及马来酸氯苯那敏、对乙酰氨基酚等制成，具有清热解毒、祛风止痛的功效，用于风热感冒所见发烧头痛、肢体不适。对乙酰氨基酚为其中的主要西药成分之一，原质量标准中用紫外分光光度法[1]测定对乙酰氨基酚的含量，重现性差、阴性干扰严重、误差较大。为了更好地控制该药的质量，笔者采用高效液相色谱法测定对乙酰氨基酚的含量，方法简便、结果准确、重复性好，可以较好地控制该产品的质量。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪：日本岛津LC-10AD泵，SPD-10AV紫外检测器，C-R7Ae数据处理机；超声波清洗器[必能信超声(上海)有限公司]。对乙酰氨基酚(中国药品生物制品检定所提供，批号10018-200408，供含量测定用)；仔花感冒胶囊(广西玉林制药有限责任公司提供，批号635002、635003、635004、735001、735002)。甲醇为色谱纯，其他为分析纯、水为去离子水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Kromasil-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(35∶65)，流速：0.5 mL/min，柱温：30 ℃，检测波长：249 nm，进样量10 μL。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取在105 ℃干燥至恒重的对乙酰氨基酚适量，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备
取本品20粒的内容物，精密称定，研细，混匀，取约0.3 g，精密称定。加甲醇35 mL，超声处理(功率500 w，频率50 kHz) 20 min，放冷，滤过，滤液置50 mL量瓶中，用少量甲醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取1 mL置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
2.4 线性关系考察
精密称取在105 ℃干燥至恒重的对乙酰氨基酚适量，加甲醇制成每1 mL含0.165 mg的溶液作为对照品溶液。精密吸取对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，各精密吸取10 μL，分别注入液相色谱仪，依本法测定。以测得峰面积为纵坐标，对照品进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，求得线性回归方程：Y＝3 450 864X－9 698，r＝0.999 9(n＝6)，表明对乙酰氨基酚进样量在0.165～0.99 μg范围内呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
取同一份供试品溶液，依本法，按上述色谱条件测定，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，重复进样6次，对乙酰氨基酚峰面积的RSD＝0.55%，结果表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验
吸取供试品溶液10 μL，于0、1、4、8、12、24 h，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，结果对乙酰氨基酚峰面积RSD＝1.6%，说明供试品溶液在24 h内稳定。
2.7 重复性试验
取同一批号(批号635003)的仔花感冒胶囊样品5份，按供试品溶液制备项下操作，制备5份供试品溶液，按上述色谱条件测定，分别吸取10 μL注入液相色谱仪，测得对乙酰氨基酚的平均含量为0.306 8 g/g(n＝5，RSD＝1.50%)。
2.8 加样回收率试验
精密称取已知含量的仔花感冒胶囊(对乙酰氨基酚含量为0.321 5 g/g)6份，分别准确加入对乙酰氨基酚对照品溶液(98.5 mg/mL)各1 mL，按供试品溶液制备项下操作，制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定，分别吸取10 μL注入液相色谱仪。结果见表1。表1 加样回收率试验结果（略）
2.9 样品测定
精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，根据对照品峰面积，计算出样品溶液中对乙酰氨基酚的含量(见表2)。表2 样品测定结果(略)
2.10 专属性考察
对乙酰氨基酚对照品和仔花感冒胶囊在相同保留时间处有吸收峰，而阴性样品在此处无吸收峰。色谱图见图1。
3 讨论
由于仔花感冒胶囊样品中对乙酰氨基酚含量较大，为了尽量减少误差，提高方法的准确性，通过紫外扫描，对乙酰氨基酚在249 nm有处最大吸收，故选择249 nm为检测波长。
根据文献报道，曾用过流动相、检测波长：①甲醇-水(15∶85)，冰醋酸调pH至4.5，波长243 nm[2]；②以甲醇-0.025 mol KH2PO4(15∶85)用磷酸调节至pH 3.0，检测波长为295 nm[3]，结果以本试验所用的流动相较佳，对乙酰氨基酚保留时间约为7.6 min，整个分析时间10 min。
在提取条件的选定过程中，我们曾采用过索氏提取法、热回流法、超声提取法，结果三者之间提取出的对乙酰氨基酚含量没有显著差异，但由于索氏提取法和热回流法费时间较长，不利于生产过程的控制，超声20 min提取所测定的对乙酰氨基酚含量最高。因此，选择了比较简便、且效率较高的超声提取法。
【参考文献】
[1] 广西壮族自治区卫生厅.广西药品标准[S].1988.217.
[2] 容颖慈，李瑞明，卢秉忠，等.HPLC测定感冒灵颗粒中对乙酰氨基酚含量[J].广东药学，2003，13(2)：23－24.
高效液相色谱仪范文4
【关键词】 益气降糖胶囊；葛根素；高效液相色谱法
Abstract:Objective To establish an HPLC method for analyzing the content of puerarin in Yiqijiangtang capsule.Methods Samples were analyzed on an LUNA ODS C18 column（5 m，4.6 mm 200 mm）by using methanol 0.5％HAc（19∶81） as mobile phase. The flow rate was 1.0 ml/min and the detecting wavelength 250 nm.Results The linear range of puerarin was 0.0535-0.535 μg(r＝0.9998). The average recovery was 96.32％（RSD=0.63％）. Conclusion The method is reliable， accurate and specific. It can be used for the quality control of Yiqijiangtang capsule.
Key words:Yiqijiangtang capsule；puerarin；HPLC
益气降糖胶囊由黄芪、天花粉、葛根、山药、茯苓、泽泻、山茱萸等二十几味中药组成，具有滋阴清热、益气生津、敛气固精的功效，适用于糖尿病及糖尿病引起的全身综合征［1］。制剂处方中主药葛根的有效成分为葛根素、黄豆苷、黄豆苷元等黄酮类成分，其中葛根素的含量最高。为了有效控制该药品的质量，根据新药审评有关规定，本文建立了测定益气降糖胶囊中葛根素含量的高效液相色谱法，结果分离度好、重现性好、灵敏度高，可作为控制益气降糖胶囊质量的方法。
1 仪器与试药
仪器：Agilent1100高效液相色谱仪（SPD10AVP紫外检测器；N2000数据处理系统）；超纯水器（Mililpore）；DL360A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）。
试药：葛根素对照品（供含量测定用，中国药品生物制品检定所提供，批号：110756200305 ）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯；D101大孔吸附树脂（安徽蚌阜天星树脂有限公司）；中性氧化铝（100～200目，青岛海洋化工厂）；益气降糖胶囊样品（批号061205，061208，061211）以及阴性样品（自制）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为DiamonsilTM十八烷基键合硅胶柱(200 mm×4.6mm， 5 μm)；柱温为35 ℃；流动相为甲醇0.5％醋酸（体积比17∶83），流速1.0 mL/min；检测波长为250 nm；进样量为10 μL。理论塔板数以葛根素计不得小于5 000， 葛根素与其他峰的分离度应良好。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取葛根素对照品13.37 mg，置10 mL量瓶中，加体积分数为30％的乙醇溶解并定容，即得质量浓度为1.337 mg/mL的对照液，摇匀。精密吸取上述对照液1 mL置10 mL量瓶中，用体积分数为30％的乙醇稀释至刻度，即得质量浓度为133.7 μg/mL的对照品母液。精密吸取上述对照品母液2 mL置10 mL量瓶中，用体积分数为30％的乙醇稀释至刻度，即得质量浓度为26.74 μg/mL的对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 取本品内容物1 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精确加入体积分数为30％的乙醇20 mL，称重，超声提取（功率250 W，频率33 kHz）40 min，放冷，再次称重（用体积分数为30％的乙醇补足减失的重量），离心，倾出上清液，过滤得滤液。精确吸取该滤液10 mL，水浴蒸干溶剂，残渣加水15 mL使溶解，通过已处理好的D101大孔吸附树脂柱（1.5 cm×8 cm，顶端加入5 g中性氧化铝，树脂层与氧化铝层用脱脂棉隔开），先以水150 mL洗脱，再以体积分数为50％的乙醇150 mL洗脱。收集乙醇洗脱液，水浴蒸干溶剂，残渣加体积分数为30％的乙醇溶解并定容于5 mL量瓶中，摇匀，以微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
2.2.3 阴性样品溶液的制备 按处方工艺取各味药材（缺葛根）制成空白样品，并按“2.2.2”项下制备阴性样品溶液。
2.3 测定方法
分别吸取对照品溶液和供试品溶液、阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定。实验结果表明：阴性样品溶液在与对照品相应的保留时间处，无色谱峰出现，表明方中其余各药味对葛根素色谱峰测定无干扰。结果见图1。
2.4 线性关系考察
分别精密吸取质量浓度为0.267 4 mg/mL的对照品溶液0.2、0.4、0.8、1、1.4、1.8、2 mL于10 mL量瓶中，用体积分数为30％的乙醇稀释至刻度，即得不同质量浓度的对照品溶液，分别精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪中，测定峰面积，以峰面积（A）为纵坐标，相应的进样质量（m）为横坐标，绘制标准曲线，葛根素回归方程为A=4.8×106 m+0.75×103，r＝0.999 8，表明葛根素在0.053 5～0.535 μg质量范围内与峰面积呈良好线性关系。
2.5 精密度试验
取质量浓度为26.74 μg/mL的葛根素对照液10 μL，重复进样6次，测得峰面积RSD为0.26％，表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验
取同一批供试品（批号：061205）溶液，分别0、2、4、6、8、10、12 h进样，按上述色谱条件测定，计算葛根素含量，求得RSD为0.68％，表明样品中的葛根素在12 h内测定结果稳定。
2.7 重复性试验
取同一批号益气降糖胶囊样品（批号061205）6份，按“2.2.2”制备溶液，进行测定，测得葛根素的平均含量为0.0288%，RSD为2.72％（n＝6）。
2．8 回收率试验
取同一批号（批号061205）已知含量的益气降糖胶囊样品6份，每份约0.5 g，精密称定，置20 mL量瓶中，分别加入质量浓度为133.7 μg/mL的葛根素对照品溶液1 mL及适量体积分数为30％的乙醇，按“2.2.2”项方法操作，测定含量，并计算回收率。结果见表1。
转贴于 2.9 样品含量测定
分别取益气降糖胶囊样品3批（批号061205，061208，061211），按“2.2.2”制备供试品溶液，进样测定，结果测得葛根素含量分别为0.285、0.270、0.272 mg/g。 表1 回收率试验结果
3 讨 论
3.1 本制剂药味较多，制剂成品中葛根素的含量低，且测定干扰大，因此样品的前处理尤为关键。在样品溶液制备过程中，参考文献［2-5］，考虑采用体积分数为30％的乙醇或甲醇超声提取的方法，由于甲醇提取液HPLC图中的干扰组分多，葛根素无法达到基线分离，故采用体积分数为30％的乙醇提取并进一步精制浓缩。参考文献［6］，将体积分数为30％的乙醇提取液采用大孔吸附树脂纯化，对树脂种类、洗脱剂等进行了研究，最终确定采用D101大孔树脂作为吸附剂，依次用水及体积分数为50％的乙醇洗脱，达到了浓缩精制的目的。
3.2 试验过程中发现，单独使用大孔吸附树脂纯化所得的洗脱液中固体物较多，难以用少量的溶剂溶解定容。在大孔树脂柱上加适量中性氧化铝预先吸附上样液后，效果较为理想。氧化铝可以吸收大量杂质，但不影响葛根素的回收率，说明葛根素没有被中性氧化铝吸附。
3.3 考察了甲醇0.1％磷酸（体积比26∶74）、乙腈水（体积比15∶85）、甲醇水（体积比20∶80）、甲醇0.5％醋酸（体积比19∶81）等流动相，以甲醇0.5％醋酸（体积比19∶81）的保留时间较为适宜，且分离度良好，其余几种条件葛根素保留时间短，分离度差。另外，对样品超声处理时间进行了考察，结果表明样品超声时间30 min以上，被测组分含量不再增加，说明超声时间30 min以上即可，故将样品处理的超声时间定为40 min。
参考文献
［1］ 李茜.李书义治疗糖尿病的经验［J］.中国中医药杂志，2004，2（5）：283-284. ［2］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.北京：化学工业出版社，2005.
［3］ 曹雪慧，刘晶晶.反相高效液相色谱法测定颈通颗粒中葛根素的含量［J］.时珍国医国药，2007，18（4）：881-882.
［4］ 梁军，郭卫东，高睿.冠脉宁软胶囊中葛根素含量测定［J］.辽宁中医杂志，2006，33（12）：1619-1620.
高效液相色谱仪范文5
关键词：高效液相色谱法 脱氢乙酸 食品检测
脱氢乙酸具有较强抑制细菌、霉菌及酵母菌发酵的作用，尤其对霉菌的抑制作用最强，是一种高效的防霉、防腐剂。其还具有脂溶性强、热稳定性高的特点，在摄氏120℃的杀菌温度下仍保持杀菌能力不变。国外曾广泛使用于食品、药品中，我国自上世纪70年代中其开始用于食品防腐，曾用于果汁、酱菜、腐乳、干酪、人造奶油、乳酸菌饮料、月饼、果酱等食品。脱氢乙酸的缺点是毒性较强，目前我国允许在腐乳、酱菜、果蔬汁、肉类制品、糕点、月饼、焙烤馅料中作为防腐剂使用，最大使用量0.5克/公斤。脱氢乙酸的国标检测方法为气相色谱法，样品经过有机溶剂的萃取、净化、浓缩等步骤的复杂处理，并且脱氢乙酸在气相色谱条件下色谱峰出现拖尾现象，使定性、定量影响较大。据报道利用高效液相色谱法食品中脱氢乙酸，采用纯水、乙醇-水、碱性水对样品进行超声萃取处理，萃取液经过滤后上机检测。作者在试验中发现，利用脱氢乙酸难溶于水而易溶于甲醇、乙醇、乙腈等有机溶剂的特性，样品均浆后酸化处理，用乙腈提取，经微孔过滤后用高效液相色谱进行定性、定量测定，方法的灵敏度、准确度和回收率高，精密度良好，重现性好，前处理简便快捷，更能满足样品分析要求。
一、材料与方法
（一）仪器
Waters公司的高效液相色谱仪，1525泵，2486检测器，717自动进样器，BREEZ色谱管理软件；Waters C18 5um，4.6 mm X 250 mm色谱柱。旋涡混合器，离心机TGL-10B，MILLI-Q，超纯水机。
（二）试剂
乙腈 色谱纯
乙酸铵 分析纯
氯化钠 分析纯
脱氢乙酸，纯度99.9%（日本生产）
（三）测定方法
1、色谱条件
流动相 乙腈―0.02mol / ml乙酸铵溶液（15+85）
流速 1.0 ml / min
温度 35℃
进样量 10 μl
2、实验方法
实验样品材料用一般市售的果汁、酱菜、腐乳、糕点等食品。果汁样品精确称取5.00 g于50 ml的离心管中；酱菜、腐乳、糕点等食品样品事先均匀，准确称取2.0～3.0 g于50ml的离心管中，加入5mL饱和氯化钠溶液和1ml盐酸溶液（1 ：1），用旋涡混合器混合1分钟，准确加入10mL乙腈，用旋涡混合器混合3分钟，3000转离心15分钟，取上清液经0.45μm过滤器过滤后供液相色谱测定。
3、色谱分析
按1.3.1色谱条件对样液进行分析，采用外标法，以保留时间定性，以峰面积定量，测定样液中脱氢乙酸的浓度（mg/ml）。
二、结果与讨论
（一）检测波长的确定
根据扫描的结果，脱氢乙酸的最大吸收波长在230 nm和297 nm处，230 nm处吸收较强，但基体于扰较多，在波长297NM处基体干扰较少，故选取检测波长297NM。
（二）流动相的选择
流动相为乙腈+水时，脱氢乙酸峰形拖尾，使用0.02 mol / L的乙酸铵代替水作流动相，峰形得到较大的改善。乙腈的比例影响出峰的时间和响应，乙腈的比例低，保留时间长，响应也会低，乙腈比例高时，出峰时间短，响应也较高。试验表明，当0.02 mol / L的乙酸铵―乙腈比例为85：15时效果较好。
（三）提取液的选择
脱氢乙酸难溶于水，易溶于苯、氯仿、乙醚。脱氢乙酸钠则易溶于水，选用水或氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液提取，提取液须净化后方可使用。本方法选用乙腈作提取液，主要考虑到脱氢乙酸能溶液于乙腈，乙腈的水溶性有利于乙腈从酸性的样液中把脱氢乙酸完全溶解，同时乙腈可沉淀蛋白质，与脂肪不溶，离心分离得到干净的提取液。
（四）色谱分离
在1.3.1色谱条件下测定，脱氢乙酸的保留时间为5.775min，峰形及组分分离效果好，色谱图见图1。
图1脱氢乙酸色谱图
（五）标准曲线
以70%乙腈水溶液为溶剂配制浓度0.01～0.1范围内的脱氢乙酸标准使用液，测定结果见表1。以峰面积对脱氢乙酸浓度进行回归分析得回归方程式Y=2.39X×1081.33×105，R= 0.9997，线性良好。在对同一浓度标样连续进样5次，得到脱氢乙酸的峰面积和保留时间的RSD值分别为0.35%和0.24，方法的定性和定量准确度较高。
表1 脱氢乙酸标准系列测定结果
（六）方法的回收率和精密度试验
称取不含脱氢乙酸的腐乳3g样品3份，分别加入0.1mg、0.2mg、0.4mg、0.6mg、1.0mg脱氢乙酸标样，按1.3.2、1.3.3和1.3.4步骤处理测定，经计算，加标回收率为96.2%～99.6%，平均回收率为98.6%。
选择添加有脱氢乙酸的腐乳样品，按按1.3.2、1.3.3和1.3.4步骤对同一样品分别做6次平衡测定，测定结果值分别为0.193、0.196、0.195、0.199、0.196和0.194g/kg，测得标准偏差2.14×103，变异系数RSD值为1.09%。
（七）样品测定
应用本方法对市售产品果汁、酱菜、腐乳、月饼中脱氢乙酸含量量的测定，结果详见表2。
表2 市售样品中脱氢乙酸测定结果
参考文献：
高效液相色谱仪范文6
【摘要】 目的: 采用反相高效液相色谱法测定吸入用异丙托溴铵溶液的含量。方法: 色谱柱为 phenomenexC8 （4.6 mm×250 mm，
5 μm），流动相为乙腈0.25%庚烷磺酸钠溶液（29∶71）用磷酸调pH值至3.2；检测波长为210 nm；流速为1.0 mL/min；进样量20 μL。结果:异丙托溴铵在12.8～256 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.9995，日间、日内RSD均小于1.5%。结论：本方法准确可靠，可用于吸入用异丙托溴铵溶液的质量控制
【关键词】 异丙托溴铵；含量测定；高效液相色谱法
异丙托溴铵是一种具有抗胆碱能特性的四价铵化合物，可竞争性抑制乙酰胆碱对气道平滑肌的收缩作用。通过抑制细胞内cGMP生成，减少cAMP降解，降低细胞内钙离子浓度，使气道平滑肌松弛，肥大细胞释放炎性介质下降，终止气道扩张，呼吸阻力减小。吸入异丙托溴铵后，作用只限于肺部扩张支气管，而不作用于全身，主要采用气雾吸入给药［1］。吸入用异丙托溴铵溶液在临床上应用较广泛，主要采用压缩雾化吸入或超声雾化吸入给药，常用于预防和治疗儿童支气管哮喘。本文考察了异丙托溴铵含量的HPLC测定方法，为制剂的质量控制提供了方法学依据。
1 仪器与材料
LC10ATvp高效液相色谱仪（日本岛津公司）；异丙托溴铵对照品（购自浙江优联医药化工有限公司，经精制后色谱峰为单峰）；吸入用异丙托溴铵溶液（爱全乐）购自德国勃林格殷格翰国际公司（批号638066，规格为含异丙托溴铵2 mL∶500 μg）；庚烷磺酸钠为离子对色谱试剂，纯度≥99％，购自上海亿日化工科技有限公司；乙腈为色谱纯；其它试剂为分析纯。
2 含量测定
2.1 色谱条件
参照文献［24］，选定试验条件为：C8色谱柱（phenomenexC8 5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相为乙腈0.25%庚烷磺酸钠溶液（29∶71）用磷酸调pH至3.2；检测波长为210 nm；流速为1.0 mL/min；进样量20 μL。
2.2 对照品贮备液的制备
精密称取在五氧化二磷干燥器中减压干燥24 h的异丙托溴铵对照品12.80 mg，精密称定，置10.0 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1.28 mg/mL的异丙托溴铵对照品液，备用。
2.3 供试品溶液的制备
取本品15瓶，合并内容物，混匀，精密量取10 mL，置50 mL量瓶中，加0.001 mol/L盐酸溶液甲醇（1∶1）稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
2.4 系统适应性试验
取溴化钾适量，用流动相溶液溶解制成溴化钾溶液。精密吸取溴化钾溶液、“2.2”、“2.3”项下溶液适量，分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。由图1可知，与异丙托溴铵对照品比较，供试品异丙托溴铵色谱峰分离良好，符合高效液相色谱法的要求，且溴离子不影响本品含量测定。异丙托溴铵的出峰时间约在22 min。
2.5 最低检测限和最低定量限
取异丙托溴铵对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成供试液，按上述色谱条件取10 μL进样。经试验，当进样浓度为0.3 μg/mL时，信噪比为3∶1，即最低检测限为0.3 μg/mL×10 μL=3 ng；当进样浓度为1.1 μg/mL时，信噪比为10∶1，即最低检测限为1.1 μg/mL×10 μL=11 ng。
2.6 线性范围考察
取对照品储备液，分别精密吸取0.1、0.2、0.4、0.8、2.0 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得浓度依次为12.8、25.6、51.2、102.4、256 μg/mL的系列标准溶液。照上述色谱条件，进样20 μL，以样品浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程为：A=5900.864C+16415，r=0.9995，线性范围为12.8～
256 μg/mL。
2.7 精密度试验
分别取12.8、51.2、2560 μg/mL三种浓度的对照品溶液，于1 d内分别进样5次及5 d内分别进样5次，分别计算日内、日间RSD。结果见表1。表1 精密度试验结果（略）
2.8 样品溶液稳定性试验
取批号为638066的样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在12 h内每隔3 h进样测定1次，测得RSD为1.30%，表明在12 h内样品溶液稳定性较好。
2.9 重复性试验
取批号为638066的样品，按“2.3”项下方法平行制备5份供试品溶液，分别进样，测得RSD为1.03%，表明该法重复性较好。
2.10 回收率试验
取异丙托溴铵对照品约16 mg、20 mg和24 mg各三份，精密称定，按处方比例加入空白辅料适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定含量，计算回收率，结果见表2。表2 回收率试验结果（略）
2.11 样品含量测定
取批号为638066样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定，样品含量测定结果为98.8%。
3 讨论
异丙托溴铵为溴化季铵盐，在溶液状态下，其溴以离子形式存在［3］，在210 nm处有一定紫外吸收。为验证该测定方法溴离子的存在不影响异丙托溴铵的含量测定，故选定溴化钾进行了试验。试验表明，采用该测定方法，溴离子不干扰异丙托溴铵的含量测定。流动相采用等度洗脱系统，用二极管阵列检测器测定异丙托溴铵对照品的峰纯度大于99.8%，表明主峰为单一峰，在210～400 nm波长扫描，未漏检杂质峰。异丙托溴铵浓度在12.8～256.0 μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。
本方法灵敏度高，方法准确，重复性好，且操作简单，可用于吸入用异丙托溴铵溶液的质量控制。
参考文献
［1］付笑飞. 异丙托溴铵的药理基础及临床应用现状［J］.中华医学杂志， 2005， 29(02): 139140.
［2］Peter JS， Robert WT， Cynthia SG， et al. The separation of ipratropium bromide and its related compounds ［J］. J of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 1998，17: 841849.
