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上皮细胞范文1
首先：鳞状上皮细胞，是上皮细胞组织的一种，鳞状上皮又分成单层上皮和复层上皮：单层上皮包括单层扁平(鳞状)上皮、单层立方上皮、单层柱状上皮(有的有纤毛)、假复层柱状上皮(有的有纤毛);复层上皮包括复层扁平(鳞状)上皮、移行上皮。
其次：鳞状上皮细胞偏高通过服用消炎类药物的方式来进行治疗，比如罗红霉素片还有洁尔阴洗液等来进行清晰。
最后：在发现鳞状上皮细胞偏高后，还可以采用早发现、早手术治疗的办法，术后采用放化疗，配合中草药进行调理有利于提高生存质量。
（来源：文章屋网 ）
上皮细胞范文2
摘要
目的研究高糖诱导人肾近曲小管上皮细胞凋亡及其调控机制。方法以人肾近曲小管上皮细胞株HK2为研究对象，随机分为对照组、高糖组、甘露醇组。MTT、流式细胞术观察细胞的增殖和凋亡状况；ELISA法检测细胞内Caspase的活性；Westernblot法分析B淋巴细胞瘤2（Bcl2）及Caspase家族蛋白的表达变化。结果与对照组比较，高糖组能抑制HK2细胞的体外增殖，下调抑制凋亡作用的蛋白Bcl2表达，上调促凋亡作用的蛋白Bax、Bak表达（P＜005）；流式细胞术显示HK2细胞周期有明显的变化，且随葡萄糖浓度的升高中期凋亡和末期凋亡所占的比例明显上升（P＜001），并且Caspase酶原降解及活性表达也呈上升趋势（P＜001）。结论高糖能抑制HK2细胞体外增殖并诱导其凋亡，其机制可能是通过Bcl2及Caspase家族调控HK2细胞的凋亡。
关键词
高糖；HK2；凋亡；表达
细胞凋亡是生理性过程，不同于细胞坏死；凋亡细胞能产生吞噬和清除碎片的凋亡小体，避免周围环境中细胞损害，维持内环境稳定［1］。糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）发病机制复杂，DN早期，肾脏通过细胞凋亡等应急反应来清除过度增殖的内皮细胞，维持内环境稳定；DN晚期，随着肾功能障碍，内环境稳态破坏，细胞凋亡过度，致使肾损害也加剧［2－3］。了解和干预肾小管内皮细胞凋亡有助于延缓DN进展。该研究采用体外培养人肾近曲小管上皮细胞株HK2细胞，分析高糖坏境下HK2细胞的增殖和凋亡状况、B淋巴细胞瘤2（Bcelllymphoma2，Bcl2）及Caspase家族蛋白表达的变化，并进一步探讨这些作用可能的分子调控机制。
1材料与方法
1．1材料低糖（55mmol／L）DMEM（美国Gibico公司）；Dglucose、医用甘露醇（北京国药集团公司）；Gibco原装小牛血清（北京索莱宝科技有限公司）；HK2由中国科学技术大学生命科学院赠送，液氮保存；AnnexinVFITC（安徽碧云天生物试剂公司）；一抗actin、Caspase3、Caspase9、Bcl2、Bax、Bak、Caspase7（美国SantaCruz公司）；MTT（美国Sigma公司）；二抗（美国Pierce公司）。
1．2方法
1．2．1细胞培养和分组液氮取出HK2细胞，37℃水浴解冻，迅速接种于含10％小牛血清低糖DMEM（葡萄糖浓度55mmol／L），37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中。胰酶消化传代，备用。分组：对照组（葡萄糖浓度为55mmol／L）、高糖组（葡萄糖浓度分别为25、40mmol／L）和甘露醇组（葡萄糖浓度55mmol／L＋甘露醇浓度分别为195、345mmol／L）。
1．2．2MTT法检测细胞增殖取生长旺盛的HK2细胞，胰酶消化，按121分组，MTT实验严格按照前期报道［4］操作，实验重复3次。
1．2．3AnnexinVFITC分析细胞凋亡取对数期生长的HK2细胞，胰酶消化传代，制成细胞悬液，取合适的量平均接种于6孔板，次日按121分组，37℃刺激48h，各组胰酶消化制成约1×106个／ml细胞悬液。400μlAnnexinV结合液重悬，加入5μlAnnexinVFITC染色液，2～8℃避光孵育15min。4℃冷冻离心5min（10000r／min），去除上清液，再用400μlAnnexinV结合液重悬，10μl／孔PI染色液，震动器轻轻混匀；锡箔纸包裹置冰上孵育5min，然后上机检测。
1．2．4Caspase蛋白酶原活性检测原理：依据ELISA抗原抗体结合的原理，细胞内活性的Caspase7、Caspase3、Caspase9能在体外与相应的酶结合，催化底物显色反应，通过吸光度（opticaldensity，OD）值OD405来间接反应Caspase7、Caspase3、Caspase9的活性。取对数期生长的HK2细胞，按123步骤操作，分组后置于培养箱连续刺激2d，胰酶消化，冷冻离心5min（10000r／min），按照ELISA法操作，依次加入酶、底物、酶标仪检测，实验重复3次。
1．2．5Westernblot法检测提取总蛋白：按121分组批量培养，刺激48h后，弃去原液并用PBS洗去残留液体，置冰上，每瓶加裂解液150μl充分裂解，细胞刮子收集细胞，低温冷冻离心5min（10000r／min），上清液置于－80℃备用，BCA测定蛋白浓度，每组加入浓缩蛋白上样缓冲液，水浴煮沸，分装备用，置于－20℃保存。配制125％SDSPAGE，微量加样针上样，先用40～50V电泳浓缩胶，100V电泳分离胶，100mA冰浴转膜，伊利脱脂牛奶封闭，PBS洗膜，置于一抗为Bcl2（1∶400），Caspase7（1∶1000），Bak（1∶1000），Bax（1∶300），Caspase3（1∶2000），Caspase9（1∶800），actin（1∶1000），4℃过夜。相应二抗分别为山羊抗小鼠（1∶1500），山羊抗鼠（1∶1500），山羊抗兔（1∶1000），山羊抗鼠（1∶1000），山羊抗鼠（1∶1000），山羊抗兔（1∶1000），山羊抗小鼠（1∶4000），37℃孵育2h，PBS洗膜3次，暗室内胶片显影、定影，重复实验3次。结果进行统计学分析。Westernblot条带的灰度值用ImagePro45分析软件测定。
1．3统计学处理采用SPSS190软件进行统计学单因素方差分析，数据用珋x±s表示。组间计量资料用方差分析。
2结果
2．1高糖对HK2细胞的体外增殖的影响MTT结果采用单因素方差分析进行主体间效应检测，显示差异有统计学意义（F＝11204，P＜001）。组间两两比较显示，与对照组比较，高糖组（25、40mmol／L）的OD值依次降低，且糖浓度为40mmol／L抑制率达266％（P＜005，P＜001）；而甘露醇组与对照组比较，差异无统计学意义，表明体外高糖能抑制HK2细胞的体外增殖，与高晶体渗透压无关。见表1。
2．2高糖对HK2细胞凋亡的影响结果采用单因素方差分析进行主体间效应检测，差异有统计学意义（F＝8254，P＜001）。组间两两比较显示：与对照组（99％）比较，高糖组（图1B、1C）中期凋亡与末期凋亡所占的比例明显升高，并且末期凋亡所占的比例随着葡萄糖浓度的升高而升高；从图1D、1E中可以观察到甘露醇对细胞的凋亡影响不明显。提示高糖能诱导HK2细胞凋亡，与高晶体渗透压无关。见图1、表2。
2．3高糖对Caspase蛋白酶原活性的影响单因素方差分析显示高糖能够增强Caspase7、Caspase3、Caspase9活性（F＝7143、5581、7432，P＜001）。组间两两比较显示：与对照组比较，高糖组Caspase7、Caspase3、Caspase9活性呈上升趋势，但甘露醇组活性没有明显变化。见图2。
2．4高糖对Bcl2及Caspase蛋白酶原家族蛋白表达的影响单因素方差分析显示高糖上调Bak、bax、cleavedCaspase9、cleavedCaspase3、cleavedCaspase7蛋白表达（F＝2741、4754、3722、41772547，P＜001）；下调Bcl2蛋白表达（F＝3314）。组间两两比较显示：与对照组比较，Bcl2家族Bcl2蛋白表达量有所下降，Bak、Bax蛋白表达量显著上升，且Bax／Bcl2的比值也呈上升趋势。另外剪切后的Caspase蛋白酶原家族cleavedCaspase9、cleavedCaspase3、cleavedCaspase7蛋白表达明显增加，见图3。
3讨论
DN是糖尿病重要并发症之一，其基本病理特征主要表现为肾小球细胞外基质聚集与降解紊乱，导致肾小球病态增生、基底膜增厚和动脉硬化等，这些改变严重影响肾小管的营养供应，诱发上皮细胞程序性凋亡，从而导致肾间质纤维化［5］。国外相关报道［6］证实终末期肾病肾小球损伤多数从肾小球上皮细胞（足细胞）损伤开始；在糖尿病的早期，长期处于高糖环境下的细胞微环境发生改变，导致肾小球超过滤、诱发氧化应激、糖化终产物堆积、蛋白激酶C的激活、多元醇化、转化生长因子的过表达和炎症等，这些因素致使肾小管基底膜增厚，养分供应受阻，引起肾小管上皮细胞萎缩，导致肾衰竭。因此干预肾小管上皮细胞凋亡，维持上皮细胞活性，能有效的减缓肾脏的衰竭［5］。体内长期高血糖容易导致上皮、内皮细胞损伤和功能障碍，从而诱发多种疾病，如2型糖尿病等；因此，控制血糖，并通过调节细胞增殖和凋亡修复损伤的细胞有重要的临床意义［7－8］。本研究模拟体内高糖环境，选取稳定性较好的人肾近曲小管上皮细胞株HK2进行体外培养。作为维持近曲小管功能的上皮细胞，HK2细胞的功能障碍在DN的发生发展中扮演着重要角色。实验表明高糖刺激48h后HK2细胞的增殖抑制，且出现细胞凋亡现象。
上皮细胞范文3
【中图分类号】d919．2；q75
【文献标识码】b
【文章编号】1007—9297(20__)o1—0048—02
荧光标记str分型技术在法医物证检验中已经得到广泛应
用，但在实际工作中，含有微量人体脱落上皮细胞的特殊载体在
很多情况下被忽略，关于皮肤脱落上皮细胞的dna检验比较
少。本文作者结合案例，对一些特殊载体上的脱落上皮细胞成
功地进行了str检验分型，并就检验中的相关问题进行讨论，旨
在进一步提高办案人员对此类检材应用价值的注意。
案例资料
【案例1】20__年1月在某旅社内，犯罪嫌疑人王某将徐某
(女，27岁)掐颈致死，后用打火机烧灼电视机电线再用手拉成多
节，欲用于捆绑。鉴定人员在现场采用纱线两步擦拭法转移电
视机电线上的上皮细胞，用chelex一100法提取上皮细胞dna，
microcon一100纯化柱处理，用ampfistr。profiler plus ”系统复
合扩增试剂盒进行str位点的复合扩增，扩增产物经abi 310
型基因。
表1 案例1有关检材str结果
分析仪荧光检测分型，结果显示在现场电视机电线上检出
混合dna谱带。通过与死者徐某及嫌疑人的dna分型结果一
起比对，发现现场电视机电线上检出混合的dna谱带可由死者
徐某和犯罪嫌疑人王某的dna谱带混合形成，见表1。由此推
断，嫌疑人来过现场，并使用过该电线的可能性极大，为下一步
针对性的审讯提供了强有力的支持，并最终迫使犯罪嫌疑人交
待了杀人过程。
【案例2】20__年1月，李某(女，23岁)在某美容店被杀。
经勘查及调查访问后，现场发现的一双黑色棉皮手套确定为犯
罪分子作案后留下。因为是冬天，考虑到戴棉手套后会有较多
手汗浸人手套的内层。把手套的内层翻转过来，将出汗较多的
手掌及手指对应位置的棉布各剪一块置小烧杯中，加人蒸馏水
浸泡过夜，离心收集浓缩沉淀物，镜检见有核上皮细胞，用与案
例1相同的方法提取dna 进行检测，结果检出一男性dna 谱
带。与抓获的犯罪嫌疑人的dna分型结果进行比对，结果见表
2。经统计学计算，偶合率为2．3×10 。。在证据面前，犯罪分
子交代了犯罪事实。
讨 论
人体皮肤脱落上皮细胞多为角质上皮细胞，细胞核多已退
化，因而一般情况下接触物品时留下的上皮细胞多为角化细胞，
使得进行核dna str分型难度极大。但在有些情况下，如出
汗、和物品有摩擦时，会留下较多的有核上皮细胞，使得对这些
皮肤脱落上皮细胞的str检测成为可能。
表2 案例2有关检材str结果
对于这些附有微量脱落上皮细胞的载体，关键是尽可能收
法律与医学杂志20__年第11卷(第1期)
集上皮细胞，提取时可以根据载体种类采用沾水棉线反复擦拭
后浸泡或直接浸泡载体等方法使上皮细胞完全解离到浸泡液
中，并采用高速离心收集含有上皮细胞的沉淀物。提取dna
时，向沉淀物加入50 1 chelex一100和2 1 10mg／ml蛋白酶k，
5cc消化2小时以上，以保证上皮细胞的充分消化裂解，消化后
经microcon一100纯化柱纯化浓缩后，用ampfistr~(r)profiler
plusⅲ系统复合扩增及灵敏度较高的abi 310型基因分析仪检
测，往往可以得到较理想的dna谱带。必要时可以经过两次纯
化柱纯化浓缩，这样可以进一步减少抑制剂对扩增的影响，又能
得到足够用于扩增的dna量。
· 49 ·
参考文献
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l996：293～ 294
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上皮细胞范文4
【摘要】 目的：检测人膀胱上皮细胞(T24细胞)是否表达双功能氧化酶(Duox1、Duox2)，并观察炎症细胞因子及佛波酯(PMA)对基因表达水平的影响。方法：体外培养人膀胱上皮(T24)细胞，经佛波酯(PMA)、炎症细胞因子(TNFα及IFNγ)刺激后提取细胞总RNA，采用半定量RTPCR方法观察细胞Duox1，Duox2 mRNA表达水平。结果：Duox1，Duox2 mRNA在T24细胞中组成性表达，在佛波酯(PMA)、TNFα及IFNγ作用下，Duox2基因表达水平明显增加，而Duox1基因表达水平无明显变化。结论：双功能氧化酶Duox1和Duox2基因在膀胱上皮细胞表达，并受炎症刺激的影响，其在膀胱上皮细胞中的生理功能值得深入研究。
【关键词】 膀胱上皮细胞;双功能氧化酶;基因表达
吞噬细胞NADPH氧化酶被激活后，细胞发生呼吸爆发，产生大量活性氧(ROS)，成为细胞杀灭微生物的重要成分。2000年以后，在非吞噬细胞发现了NADPH氧化酶的同源物家族，被命名为NOX(NADPH oxidase)家族。人类NOX家族共有7个成员，即NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox2[1-3]。NOX家族广泛表达于机体的组织器官，其生物学功能成为研究的热点。双功能氧化酶(Duox1和Duox2)最初在甲状腺中发现，它们除了具有NOX的C端结构域外，还有一个N端过氧化物酶样胞外域，故称为双功能氧化酶。近年来，呼吸道、胰腺、腮腺、前列腺及肠胃道上皮等部位陆续发现Duox基因表达。泌尿道上皮是否表达Duox目前未见文献报道，本实验利用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)的方法，观察膀胱上皮细胞中是否存在Duox表达，并初步探讨基因的表达调控因素。
1 材料与方法
1.1 材料 人膀胱上皮细胞株(T24)为本实验室保存，RPMI1640为GIBCO产品，新生小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司，佛波酯(PMA)购自sigma公司，细胞因子(TNFα、IFNγ)为PeproTech公司产品，Trizol试剂购自Invitrogen 公司，逆转试剂盒购自MBI公司，Taq mix DNA聚合酶，DL2000 DNA Marker为天根生物技术有限公司产品，PCR引物由Invitrogen 公司合成。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及刺激 T24细胞采用含有10%新生小牛血清的1640培养基(无抗生素)常规培养和传代。实验前在每个细胞培养皿(60×15mm)中接种30万个T24细胞，37℃ 5%CO2孵箱培养24h。加入PMA(浓度为5nM)或细胞因子(TNFα 20 ng·ml-1+IFNγ 20 ng·ml-1)，分别在刺激后的12、24h收集细胞抽提RNA。实验同时设无刺激的空白对照组。
1.2.2 PCR引物设计 根据GenBank 的序列，用Prime5.0软件分别设计Duox1(登录号AF213465)，Duox2 (登录号AF267981)，βactin (登录号BC016045)的引物。
表1 PCR引物序列
基因上游引物下游引物片段长度(bp)Duox15'cgacattgagactgagttga 3'5'ctggaatgacgttaccttct3'106Duox25'aacctaagcagctcacaact3'5'cagagagcaatgatggtgat3'109βactin5'cgggaaatcgtgcgtgac3'5'tggaaggtggacagcgagg3'4431.2.3 总RNA提取 按Trizol试剂说明操作。贴壁T24细胞直接用Trizol试剂裂解，提取的总RNA用异丙醇沉淀，溶于经过DEPC处理的水中，紫外分光光度计检测其含量及纯度。
1.2.4 逆转录反应 在0.5 ml的Eppendorf 管中加入 RNasin 0.5μl，Oligo (dt) 1μl，总RNA 1μl，MgCl2 4μl，10(buffer缓冲液2μl，逆转录酶1μl，用DEPC处理过的水补足至总体积20μl ，混匀，42℃反应40min，95℃ 5 min 终止反应，冰浴冷却5min，-70℃保存。
1.2.5 PCR扩增Taqmix酶12.5μl，cDNA2μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，加水补足总体积25μl。Duox反应程序：94℃ 10min，94℃ 45s，53℃ 45s，72℃ 1min，40个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。βactin反应程序：94℃ 3min，94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 1min， 27个循环，72℃ 5min，4℃保存。
1.2.6 PCR产物的鉴定 取5μlPCR产物，加1μl 6×lodding buffer，以1×TAE电泳缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上电泳约60min，BioRad凝胶图像分析仪拍照，Quantity One分析软件对PCR扩增产物的特异性条带进行灰度扫描，以βactin产物作校正分析，计算目的基因与内参照βactin灰度比。
1.3 统计学处理 利用SPSS软件13.0对数据进行统计学处理。
2 结果
2.1 总RNA的鉴定
实验提取的细胞总RNA用紫外分光光度计检测OD260/OD280比值在1.79-1.90之间，表明所提RNA的纯度较高，蛋白质和DNA污染少。从凝胶电泳上可以清晰看到28sRNA和18sRNA两条带(图1)，其亮度之比约为2∶1，5sRNA带不明显，表明RNA没有降解。
2.2 RTPCR扩增结果
PCR扩增结果显示Duox1，Duox2在T24细胞中有组成性表达(Constructive expression)。佛波酯(PMA)刺激后，Duox1基因表达无明显改变，而Duox2基因表达增加，并以细胞刺激后12h表达量最高，与未刺激对照细胞相比增加4.5倍(P
3 讨论
吞噬细胞(中性粒细胞、单核/巨噬细胞)杀菌机理研究揭示，通过细胞呼吸爆发产生大量超氧阴离子和活性氧(ROS)，是吞噬细胞重要的杀菌方式。NADPH氧化酶(NADPH oxidase)是吞噬细胞呼吸爆发的关键酶，该酶在吞噬细胞特异表达。基因突变而使NADPH氧化酶活性丧失的病人很容易感染细菌和真菌，这种疾病称为慢性肉芽肿病(Chronic granulomatous disease，CGD)。2000年以来，通过基因同源检索，发现人的基因组中另外还有6个基因编码的蛋白分子与NADPH氧化酶结构和活性相似，因此具有NADPH氧化酶活性的分子被重新分类，分别称为NOX15(NOX是NADPH oxidase 的简称)以及Duox1和Duox2。在吞噬细胞特异表达的NADPH氧化酶现在称为NOX2，而其他NOX分子广泛表达于机体的上皮细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞[4-6]。
活性氧(ROS)参与了许多重要生命活动，比如信号转导、细胞凋亡、炎症反应、免疫防御、组织损伤等，因此细胞(特别是非吞噬细胞)产生活性氧的分子基础受人关注。双功能氧化酶(Duox1、Duox2)是NADPH氧化酶(NOX)家族的两个重要成员，最早发现它们在甲状腺中高表达，研究表明Duox2基因突变将使甲状腺激素合成减少，而Duox1在甲状腺中表达的生物学意义尚有待明确。近年来研究显示Duox1、Duox2在呼吸道、肠道上皮细胞也有很高的表达，并把它们与这些粘膜部位的免疫防御功能相联系，气管上皮细胞Duox2产生的过氧化氢在乳过氧化物酶及硫氰酸盐存在的情况下生成具有抗菌活性的次硫氰酸盐，可能是呼吸道上皮的一种抗菌机制[7-8]。
双功能氧化酶(Duox1、Duox2)是否在泌尿道粘膜上皮表达目前未见报道。本实验通过RTPCR检测表明在膀胱上皮细胞T24中Duox1、Duox2有组成性表达，并且佛波酯(PMA)以及炎症细胞因子(TNFα和IFNγ)作用均能刺激细胞Duox2的表达，但两种刺激因素并不能改变Duox1的表达，这与呼吸道上皮细胞双功能氧化酶表达调控研究比较相似，Duox2表达受IFNγ刺激，而Duox1表达受IL4和IL13刺激[9]。本实验证实了膀胱上皮细胞表达双功能氧化酶，因此它们在泌尿道粘膜的生物学功能值得研究。而炎症刺激增加Duox2基因表达，提示双功能氧化酶可能参与膀胱粘膜免疫防御过程，为膀胱粘膜抗感染机制研究提供了新的线索。
参考文献
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上皮细胞范文5
[关键词]糖基化终产物;fractalkine;糖尿病肾病
[中图分类号]R587.2
[文献标识码]B
[文章编号]1006-1959(2009)11-0015-02
糖尿病肾病(DN)是糖尿病严重的微血管并发症之一,是导致终末期肾脏疾病最常见的原因。近期研究证实,糖尿病肾损伤不仅是肾小球的硬化,同时也发生在肾小管。许多研究显示糖基化终末产物(AGEs)形成与堆积是DN的主要发病机制之一[1]。近年来发现,细胞因子尤其趋化因子和糖尿病肾病的病理变化及临床表现密切相关。fractalkine(FKN) 是目前发现的趋化因子CX3C家族的唯一成员,它是否在AGEs致DN肾小管间质病变的发病机制中发挥重要作用,值得深入研究和探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂:新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所产品)、DMEM培养基(Gibco产品) 、Trizol总RNA提取试剂盒(TaKaRa产品)、RT-PCR试剂盒RevertAidTM First Stand cDNA Synthesis Kit MBI(Fermentas)产品、DNA Marker D2000(2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100bp)购自天为时代公司、FKN mRNA及β-actin mRNA引物委托上海生物工程公司合成。
1.1.2 AGE-BSA的制备:在PH 7.4的PBS溶液里加入BSA和不同量的葡萄糖,使BSA的终浓度为5.0 g/L,葡萄糖的终浓度为50 mmol/L,过滤除菌,PH 7.4 PBS溶液透析除去未结合的葡萄糖。对照组BSA中不含葡萄糖,其余条件一致。荧光光谱扫描分析鉴定AGE-BSA。
1.1.3 TEC的培养:首先将冻存的人肾小管上皮细胞(TEC)复苏,将细胞悬液移入培养瓶内,加适量培养液进行培养。
1.2 方法
1.2.1 实验分组及干预:实验设AGE组、对照组。将处于对数生长期的细胞按1∶3移入6孔板中,待细胞生长至80%～90%融合时,换用无血清的DMEM同步化饥饿24h后进行干预:①分别加入不同浓度(50、100、200、400 mg/L)的AGE-BSA对TEC干预24h;②加入200 mg/L 的AGE-BSA对TEC分别干预0、12、24、48h。用不含葡萄糖BSA和无血清培养基DMEM作为对照。
1.2.2 半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测FKN mRNA表达:按Trizol总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,取2μg为模板逆转录。应用RT-PCR试剂盒进行FKN及β-actin的cDNA第一链合成,总反应体积25μl。取2μl cDNA进行PCR扩增,以1.7%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,用自动凝胶图像分析仪扫描凝胶图谱,用LabImage分析软件对DNA条带进行密度扫描分析,以特意扩增产物条带光密度值与内参照条带光密度值之比值作半定量分析。
1.3 统计学处理:计量数据以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS13.0统计软件分析数据,采用one-way ANOVA进行显著性检验,组间比较采用S-N-K检验,P
2 结果
2.1 不同浓度的AGE-BSA对TEC FKN mRNA表达的影响 :TEC在DMEM组和BSA组有少量FKN mRNA表达,FKN/β-actin mRNA光密度比值分别是:DMEM 0.675±0.039,BSA 0.761±0.078。50、100、200、400 mg/L的AGE-BSA干预后,各组细胞光密度比值分别是:0.880±0.082,0.904±0.060,0.991±0.152,1.125±0.174,FKN mRNA表达随AGE-BSA浓度增高而增高(P
2.2 AGE-BSA干预TEC不同时间对FKN mRNA表达的影响:用浓度为200 mg/L的AGE-BSA干预TEC 0、12、24、48h,各组的FKN/β-actin mRNA光密度比值分别是:BSA 0.628±0.065,0h 0.595±0.060,12h 0.676±0.058,24h 0.784±0.056,48h 0.982±0.287(P
图1的DNA电泳图①Marker;②DMEM;③BSA(200mg/L);④AGE-BSA (50mg/L);⑤AGE-BSA (100mg/L);⑥AGE-BSA (200mg/L);⑦AGE-BSA (400mg/L)
图2的DNA电泳图①Marker;②BSA;③AGE-BSA干预0h;④AGE-BSA干预12h;⑤AGE-BSA干预24h;⑥AGE-BSA 干预48h
3 讨论
DN的发病机制非常复杂,目前尚未明确。长期以来,人们把研究和治疗重点放在肾小球损害上,但研究显示肾小管的损害在DN的发生、发展中同样重要,糖尿病患者尿白蛋白排泄率在正常范围时,就已经存在肾小管损害。肾小管间质病变程度是反映肾功能下降严重程度和判断预后最重要的指标,故对其机制的研究可以为临床防治DN有重要意义。其中高血糖引起蛋白质非酶糖基化导致的糖基化终末产物和一些炎性趋化因子在其中的相互作用及致病机制正逐渐被认识。
AGEs是由葡萄糖或其他还原糖与蛋白质的游离氨基端经一系列脱水、环化、氧化及重排等反应后形成的不可逆产物,大量研究结果显示,AGEs参与DN发生机制[2]。而炎症反应是DN发生发展中的重要环节之一[3]。在DN状态下由于存在的高糖和血流动力学障碍,引起肾脏固有细胞的损伤,释放前炎症介质,白细胞迁移至损伤部位,释放更多的趋化因子[4],刺激肾系膜细胞分泌胶原纤维、层粘连蛋白、纤连蛋白导致肾小球硬化。肾小管上皮细胞则分泌免疫介质、细胞因子,使肾脏间质单核/巨噬细胞聚集,导致肾间质纤维化[5]。既往研究已证实AGE-BSA干预肾系膜细胞后趋化因子家族中CC亚族MCP-1、RANTES表达增加[6],本实验进一步研究AGEs对肾小管上皮细胞CX3C亚族的趋化因子-FKN mRNA的表达影响,从而了解糖尿病肾小管间质病变可能机制。
上皮细胞范文6
目的：观察各种乳腺疾病患者肌上皮细胞(mecs)中单克隆抗体标志物p63的表达及意义。方法:选择近期在我院接受女性乳腺手术存档石蜡标本135 例(良性病变 53例,原位癌 27例，浸润性癌36例,正常乳腺组织19例)，进行s-p法免疫组化染色，标记 p63。结果:p63在正常乳腺组、良性病变组及原位癌组中mecs阳性表达率分别为94.74%、96.23%和59.26%，在浸润癌组表达仅为2.78%。结论:p63标记乳腺肌上皮细胞具有较高的敏感性和特异性，有助于对乳腺病变的确诊。
【关键词】 乳腺疾病 肌上皮细胞 p63 免疫组化染色
肌上皮细胞(myoepithelial cells, mecs)构成乳腺上皮结构的基底细胞层, 在良性病变中, 腺体周围mecs存在, 而在恶性病变出现浸润时mecs消失[1，2]。我科应用免疫组化双标记法检测135 例我院女性乳腺手术存档石蜡标本中的mecs，现报告如下:
1 资料和方法
1.1 资料 收集2005年7月～2008年7月在我院接受女性乳腺手术存档石蜡标本135例, 入选患者术前未经历放疗、化疗。其中，良性病变53例 (增生疾病46例、纤维腺瘤23例、导管内状瘤14例),原位癌27例(小叶原位癌12例、导管内癌15例)，浸润性癌36例(包括浸润性导管癌27例，浸润性小叶癌9例)，正常乳腺组织19例。入选标本病理诊断无异议。
1.2 方法 单克隆抗体p63免疫组化染色采用s-p法,p63抗体及s-p试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司, 实验步骤参照说明书进行。结果判定以细胞核出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。
2 结果
19例正常乳腺组织mecs呈p63阳性表达18例(94.74%)，53例乳腺良性病变中, mecs呈p63阳性表达51例(96.23%), 表现为阳性细胞围绕腺体上皮形成一层大致均匀间隔的点状结构,2例(纤维腺瘤)部分mecs p63表达阴性。27例原位癌p63阳性表达为16例(59.26%)，且表达不尽相同，即在同一病例中癌性导管周围p63阳性的mecs表达也不一致，显示为有完整的肌上皮细胞或有不同程度的缺失，36例浸润癌中仅有1例(2.78%)在癌组织中有小灶状p63阳性表达，且表达模式是胞浆和胞核同时表达。
3 讨论
p63基因是近年来新发现的一种基因，定位于3q27-3q29，由于其结合域与p53基因有高度的同源性，被认为是p53家族的新成员。一些研究[1，2]表明，p63免疫活性表达通常限于肌上皮前驱细胞，因此观察p63表达有助于判定静止乳腺肌上皮前驱细胞，后者对乳腺疾病的临床病理诊断非常有价值。本研究选择近期存档我科的女性乳腺手术石蜡标本标测结果表明，p63在正常乳腺组、良性病变组及原位癌组中mecs阳性表达率分别为94.74%、96.23%和59.26%，在浸润癌组中一般不表达，这说明乳腺mecsp63标记具有较高的敏感性和特异性。国内另一些作者[3]也观察到，乳腺组织单克隆抗体p63标记能准确地显示肌上皮细胞核，而不显示其他细胞成份。在正常乳腺组织腺体及乳腺良性病变腺体周围，显示肌上皮连续性围绕;而在导管原位癌、小叶原位癌癌巢周围，肌上皮数目减少呈间断或不连续环状;而乳腺早期浸润性导管癌和乳腺浸润性癌癌巢周围，可见肌上皮部分消失及肌上皮全部消失。这说明，从正常乳腺腺体、良性腺体到原位癌、早期浸润和浸润性癌性腺体，肌上皮的减少、消失是一逐渐发展的过程。
一般认为，肌上皮细胞对于维持正常乳腺微环境较为重要。国外学者研究表明，乳腺肌上皮细胞能减少乳腺癌细胞的浸润，在控制乳腺的微环境中起着重要作用。其作用机制为，肌上皮细胞能分泌一种抗癌蛋白maspin，后者可以通过对细胞作用来影响肿瘤组织生物学特性，特别是在肌上皮细胞抑制乳腺癌细胞体外浸润能力中扮演角色。这些研究[4]认为，肌上皮细胞的存在是乳腺组织的一个保护因素。
综上所述，p63标记mecs具有较高的敏感性和特异性，可作为乳腺良恶性疾病鉴别诊断的重要参考指标。但p63抗体临床应用也有一些局限性：①少数部分肿瘤细胞可有表达;②由于p63为核阳性，虽然mecs在正常乳腺组织及良性乳腺病变组织中是连续的，但mecs细胞核是分离的。因此，p63在良性乳腺病变组织中不能显示连续的mecs，这虽然对大多数乳腺良恶性病变诊断不会带来困难，但在小管状硬化性腺病和小管癌做鉴别时应谨慎。
【参考文献】
[1] 袁慧敏.乳腺良恶性病变的肌上皮细胞免疫组化检查[j].现代实用医学,2006,18(11)：809-810.
[2] 张艳梅，李莹杰，杜金荣.免疫组化在乳腺良、恶性疾病鉴别诊断中的意义[j].哈尔滨医科大学学报，2008，42(5)：492-493.
