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细胞自噬范文1
人体内部有一种叫做“自体吞噬”的内置系统，这一过程控制着细胞的生死。细胞自噬是机体一种重要的防御和保护机制，可以清除受损和失去功能的细胞、细胞器，为细胞的重建、再生和修复提供必须原料，实现细胞的循环利用。如果违反这一系统规定的“程序”，人体就会生病，包括神经退化和癌症。
该研究由英国牛津的路德维格癌症研究所分所王奕华和陆新领导的研究小组完成。他们研究了成纤维细胞的生命周期（成纤维细胞是动物体内最普通的结缔组织），发现有一种叫做ASPP2的肿瘤抑制剂可作为分子开关，向一种普通癌症基因——RAS致癌基因发号施令，指示RAS致癌基因丧失功能或走向衰老。ASPP2蛋白含量减少时，会增加RAS致癌基因诱导的自体吞噬行为，从而遏制细胞走向衰老。如果没有ASPP2，细胞会不受控制地持续增生，由此激发肿瘤生长。
科学家已知ASPP2在遏制肿瘤发展方面起着重要作用。缺少这种蛋白或该蛋白出现故障的小鼠就容易患上肿瘤。当肿瘤患者体内ASPP2水平很低时，其预后情况不乐观，如大型B—细胞淋巴瘤。在高转移性乳腺肿瘤中，也能看到ASPP2表达减少。但迄今为止，研究人员不清楚这是为什么。
“我们在具有RAS致癌基因的癌症中发现，ASPP2会和一种蛋白质复合物相互作用，由此导致了细胞出现自体吞噬。”王奕华说，“当ASPP2表达减少或不再表达时，就意味着细胞处于危急时刻。此时它的停止按钮已被破坏，能像癌细胞那样不受控制地增生。”
细胞自噬范文2
[关键词] 肝癌细胞HepG2；SN50；自噬；NF-κB；微管相关蛋白LC3
[中图分类号] R329 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）07（a）-0035-03
Effect of NF-κB on autophagy formation of human hepatoma cell
HAO Gaopeng WANG Shiming DONG Xiushan REN Ning FAN Yue LU Yudong
Department of General Surgery, the Affiliated First Clinical Medical School of Shanxi Medical University, Shanxi Province, Taiyuan 030001, China
[Abstract] Objective To research the effect of NF-κB on autophagy formation of Human Hepatoma Cell HepG2. Methods The human hepatoma cell HepG2 was cultured in vitro and divided into SN50 group and control group, MTT assay was used to test the cell growth dynamically. Western blot analysis was performed to assess the expression of LC3-Ⅱ. The autophagy was observed using fluorescent microscope by monodansylcadaverin (MDC) staining. Results The inhibition ratio of HepG2 cells were (20.45±3.70)%, (31.94±4.20)% and (36.44±4.60)% after treatment of SN50 for 24, 48 and 72 h, the difference was statistically significant than before (P < 0.05). The expression of LC3-II had upregulation and fluorescent staining revealed the activity of autophagy. Conclusion Blocking of NF-κB can significantly inhibit the proliferation of HepG2 cells in a certain period of time, and the effect may associated with increased cell autophagy.
[Key words] Human hepatoma cells HepG2; SN50; Autophagy; NF-κB; Microtubule-associated protein LC3
迄今的研究显示NF-κB在多种原发肿瘤中高表达，在恶性肿瘤的发生发展过程中起着非常重要的作用[1]。NF-κB通过调节多种基因的转录从而影响肿瘤细胞的增值、凋亡以及肿瘤的发生等过程；而SN50作为NF-κB的特异性抑制剂[2]，已被广泛用于该通路的研究以及以NF-κB为靶点的疾病治疗[3]。笔者基于已有的知识和研究成果，研究肝癌细胞的自噬活性以及通过使用SN50初步探讨了NF-κB信号通路对肝癌细胞自噬活性的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
HepG2细胞由山西医科大学寄生虫实验室提供，高糖DMEM培养基购自Neuronbc公司，胎牛血清为北京元亨金马生物技术开发有限公司产品，胰蛋白酶和MTT购自美国Solarbio公司，SN50购自美国Sigma公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自碧云天试剂公司，微管相关蛋白Ⅰ轻链子（LC3）一抗购自BOSTER公司。
1.2 细胞培养
将HepG2细胞置于37℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养，每3天传代1次，细胞贴壁达到70%时，以体积分数0.25%胰酶消化，使瓶底细胞都浸入溶液中，倒置镜下观察细胞，在贴壁的细胞逐渐变圆后，但是在尚未漂起时加入5 mL培养液终止消化，用吸管吹打贴壁细胞，然后分到另外的两个培养瓶中，加入新鲜培养基后置于37℃、体积分数5%CO2的培养箱中继续培养，取对数生长期细胞进行实验。
细胞自噬范文3
[关键词]口腔扁平苔藓；恶性转化；程序性细胞死亡；细胞自噬
[中图分类号]R 781.5＋9[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.03.036
Research progress on the role of autophagy in the malignant transformation of oral lichen planusChang Zhen1, Li Ronglin1, Li Chunyang2.（1. Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, Hospital of Stomatology, Guanghua School of Stomatology, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510055, China; 2. Dept. of Stomatology, The Fifth Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University, Zhuhai 519000, China）
[Abstract]Oral lichen planus（OLP）is a common inflammatory disease of oral mucosa, which is easy to recurrent and has malignant tendency. The precise etiology and pathogenesis about OLP is unknown. Autophagy is a highly conserved phenomenon in eukaryotic cells, as one type of programmed cell death, which plays an important role in the maintenance of inter-cellular environment homeostasis. At present, there is no report about the rela－tionship between autophagy and the development and malignant transformation of OLP. In this article, the correla－tion between autophagy and OLP has been discussed.
[Key words]oral lichen planus；malignant transformation；programmed cell death；autophagy
自噬作用是真核细胞生物中普遍存在的生物现象，通过溶酶体途径清除损伤的细胞器、长寿命的蛋白质以及胞质成分，维持细胞内环境的稳态[1]。在固有免疫以及获得性免疫反应中起一定的作用，自噬作用的功能障碍可以导致多种疾病的发生，包括肿瘤、神经变性、心血管疾病、感染性疾病等[2]。口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是一种以T细胞介导的免疫反应为特征的慢性炎症反应，伴有持续性的T细胞的积聚和表皮细胞的损伤[3]，为口腔黏膜角化异常性疾病。1997年，世界卫生组织已将OLP归在癌前状态的范畴，OLP能增加患癌症的风险[4]，其发病及恶变机制与多因素有关，具体机制尚不清楚。
1概述
细胞通过调节其蛋白和细胞器等的合成与降解之间的平衡来维持细胞内环境的稳态。在真核细胞生物中，有两种有效的蛋白降解系统：一是蛋白酶体系统，可以选择性地降解短寿命的蛋白质；另一种是溶酶体系统，降解长寿命的蛋白质和细胞器[5]。在真核细胞中，90%以上的为长寿命蛋白，根据被降解的大分子物质，细胞器等底物进入溶酶体的途径，可将细胞自噬分为3种类型：巨自噬、微自噬、分子伴侣介导的自噬（chaper－one-mediated autophagy，CMA）[5-6]。通常所讲的细胞自噬作用指的是巨自噬，指大分子物质和细胞器等被来自于内质网或高尔基体的双层膜结构包绕形成自噬吞噬体；自噬吞噬体被转运到溶酶体与溶酶体融合，形成自噬溶酶体并降解其内的成分，其代谢的产物参与再循环，维持细胞内环境的稳态。因此，可以将细胞自噬的发生分为3个阶段：初始自噬体双层膜形成，自噬体双层膜延长与自噬吞噬体形成，自噬溶酶体形成与降解。
2细胞自噬的调控
许多细胞因子、蛋白质和自噬相关基因atg参与细胞自噬的调控，形成复杂的调控网络，在细胞自噬作用发生的过程中发挥重要作用。
2.1雷帕霉素靶蛋白信号通路
哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇-3-激酶相关激酶（phosphatidylinositol-3-kinase-related kinase，PIKK）蛋白家族，以mTORC1和mTORC2两种形式的复合物存在，在调节细胞生长、增殖、调控细胞周期等多方面发挥重要作用[7]。研究发现，mTORC1在细胞自噬过程中期起主要作用。在哺乳动物细胞自噬发生的初始阶段，ULK1：Atg13：FIP200为定位在自噬体双层膜上的稳定复合物，为mTOR调控细胞自噬的下游信号通路。在采用饥饿或雷帕霉素治疗的情况下，mTORC1与ULK1分离抑制mTOR的活性，ULK1自磷酸化而活化，同时磷酸化Atg13和FIP200进而诱发细胞自噬[8]。该结果与在酵母中的研究结果不同，在酵母中抑制mTOR的活性，使Atg1与Atg13和Atg17的亲和力增，进而诱发自噬。
2.2磷脂酰肌醇-3-激酶途径
初始的自噬体膜的形成与成核化依赖于ClassⅢ磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide-3-kinase，PI3K）复合物Beclin1：hVps34：Atg14L的参与，该复合物的活化受到一些正性和负性的调节因子的参与。hVps34可以产生磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol-3-phosphate，PtdIns3P），在自噬吞噬体的形成过程中发挥重要作用。膜泡蛋白1（vacuole membrane protein 1，VMP1）、Beclin1调节的细胞自噬的活化分子，髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）等作为正性的调节因子；而Bcl-2家族蛋白作为负性的调节因子通过与Beclin1：hVps34：Atg14L复合物的相互作用控制PtdIns3P的产生，调节细胞自噬过程[9]。在自噬体膜延长过程中，Beclin1：hVps34：Atg14L复合物和其他Atg蛋白可以募集Atg12-Atg5：Atg16L多聚体以及微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3）的类脂质形式，这对于自噬吞噬体的形成来说是必需的[2]。在这个过程中存在两个泛素化的结合系统，Atg12-Atg5复合物和MAP1LC3。Atg12被Atg7（E1泛素活化酶的同源物）活化，然后通过Atg10（E2泛素结合酶的同源物）与Atg5结合；MAP1LC3在Atg4B的作用下裂解，在Atg7、Atg3、Atg12-Atg5：Atg16L的作用下与磷脂双分子层的组成成分磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）结合，参与自噬吞噬体膜的延长以及自噬吞噬体的形成。在自噬吞噬体的成熟过程中，Beclin1：hVps34：UVRAG：Rubicon复合物可以下调自噬吞噬体和内吞体向溶酶体的转运，而Beclin1：hVps34：UVRAG复合物可以加快转运过程并促进自噬吞噬体的成熟[10]。因此，Beclin1：hVps34复合物通过调节自噬吞噬体的形成与成熟过程来调节细胞自噬。
2.3其他调节通路
在细胞自噬发生的过程中，除了经典的调控通路之外，有一些自噬吞噬体的形成并不依赖于Atg12-Atg5形成，Rab9蛋白定位在内吞体膜上；另外，有些自噬吞噬体的形成不依赖于Beclin1：hVps34复合物的形成，而是仅仅依赖于Atg5和Atg7的参与，但这两种途径均需要ULK的参与[2]。另外还有许多核因子参与细胞自噬的调控，如乏氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）-1、核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）、肿瘤抑制因子p53等。Zhao等[11]的研究表明，乙酰化的叉头转录因子（forkhead box O transcription factor，FoxO）-1与Atg7结合可以引发自噬作用，抑制肿瘤的形成。此过程不依赖于核转录的途径，不受mTOR信号通路的调节，揭示了胞质中FoxO-1的新功能———诱导细胞自噬作用所必须的。
3细胞自噬与OLP
OLP是病因不明的慢性炎症性口腔黏膜疾病，目前尚无特效的治疗药物且容易复发[11-12]。反复的或持续性的慢性炎症会导致DNA的损伤，刺激组织修复的增生，产生大量的炎症性细胞因子和生长因子，进而增加人体组织器官对癌症的易感性，诱导癌症的发生[13]。1997年世界卫生组织已将OLP归在癌前状态的范畴，OLP能增加罹患癌症的风险[4]。Lodi等[14]经回顾性研究发现，OLP的恶变率为0%~5.3%。在大部分的研究中，OLP的恶变率不超过1%。一般说来，糜烂型和萎缩型OLP更易发生恶变[15-16]。
3.1自噬与凋亡
细胞死亡的方式有2种形式：程序性细胞死亡和坏死。很长一段时间，程序性细胞死亡都是指细胞的凋亡，而超微结构的资料提示还存在另一种形式的程序性细胞死亡———细胞自噬[17]。细胞自噬与凋亡均是程序性细胞死亡的方式，它们之间可能存在着一定的联系。抑癌基因p53是凋亡诱导因子，可以调节细胞的生存、死亡和代谢。在细胞压力存在的情况下，可以导致p53的活化使其积聚在细胞核内，积聚的p53可以反式激活损伤调节自噬调控基因（damage regulate autophagy modulator，DRAM）、肿瘤抑制因子p53诱导的糖酵解和凋亡的调控因子（TP53-induced glycolysis and apotosis regulator，TIGAR）；TIGAR通过调节糖酵解的途径及间接调节细胞活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的水平抑制自噬，减少饥饿状态下细胞的死亡；DRAM通过刺激自噬吞噬体的积聚来促进自噬的发生[2]，阻断DRAM可以抑制p53介导的自噬泡的聚集进而减少凋亡的发生。有学者[18]认为，DRAM在介导自噬的同时可促进凋亡。另外，在氧化应激、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等刺激下，线粒体肿胀，释放细胞色素C（cytochrome C，cytC）等促凋亡的细胞因子，此时细胞启动自噬作用隔离并清除受损线粒体，抑制细胞凋亡的发生，提高细胞对低氧的耐受力，进而对细胞起到保护作用。李国东等[19]研究表明，抑制自噬可以提高细胞对凋亡信号的敏感性。Inbal等[20]研究认为，自噬与凋亡在细胞死亡的过程中同时存在，哺乳动物细胞中凋亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPk）和DAPk相关蛋白激酶（DAPk-related protein kinase，DRP）-1能够同时调控自噬性细胞死亡和具有凋亡特征的膜泡。自噬与凋亡之间存在着密切关系，两者之间可相互影响，但具体的机制尚不清楚。
以往的研究表明，固有层淋巴细胞浸润带中的主要细胞为CD8+T细胞，可以通过以下3种途径诱导角质细胞的凋亡：1）CD8+T细胞分泌的TNF-α与角质细胞表面表达的TNF-α受体结合诱导角质细胞的凋亡；2）CD8+T细胞表面的凋亡蛋白配体CD95L与角质细胞表面的凋亡蛋白CD95结合诱导细胞凋亡；3）CD8+T细胞分泌颗粒蛋白酶B经过有穿孔蛋白诱导的角质细胞膜上的孔隙进入角质细胞内，诱导角质细胞的凋亡[16]。此外，还有CD4+T细胞、肥大细胞等分泌白细胞介素（interleukin，IL）-2，、干扰素（interferon，IFN）-γ、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）等致炎因子，引起角质细胞以及基底膜的损伤。
3.2细胞自噬与OLP共有的细胞调控因子
3.2.1NF-κBNF-κB在炎症、免疫以及癌症的发生发展过程中起着重要的作用[21]，同时也参与了细胞自噬。Copetti等[22]研究表明，在人类和鼠编码Beclin1基因的启动子上有保守的NF-κB的结合位点；同时观察到NF-κB的二聚体p65/RelA能够上调细胞自噬基因Atg6的同源物Beclin1的表达，进而诱导细胞自噬的发生。Santoro等[23]研究发现，在OLP病损组织基底层以及基底层以上的角质形成细胞中可观察到NF-κB呈阳性表达，而在正常组织切片中没有NF-κB的表达；并且表皮细胞表达的NF-κB与固有层淋巴细胞浸润带中细胞毒性T细胞的数量有关，这表明NF-κB的活化可能是炎症持续的原因。Rhodus等[3]研究发现，NF-κB依赖的细胞因子TNF-α、IL-1、IL-8、IL-6在OLP组织滤出液中的含量明显高于对照组，辅助T细胞（T helper cell，Th）1/Th2下降，Th2在OLP中占优势。也有学者研究认为，Th1在OLP中占优势，目前仍存在争议，但可以肯定的是，Th1/Th2的平衡在OLP的发病中起重要的作用。NF-κB在OLP的发病机制中起重要作用，在细胞自噬的过程中也有NF-κB的参与，由此推测，OLP中的细胞损伤可能与NF-κB所诱发的细胞自噬有关。
3.2.2HIF-1HIF-1细胞核内的转录因子可以在组织细胞乏氧的情况下调节许多基因的转录[24]。Bellot等[25]研究表明，乏氧诱导细胞自噬的发生由HIF-1通过诱导促凋亡蛋白B细胞淋巴瘤因子2/腺病毒干扰蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19-kDa interacting protein 3，BNIP3）和B细胞淋巴瘤因子2/腺病毒干扰蛋白3类（Bcl-2/adenovirus EIB 19-kDa-interacting protein 3-like，BNIP3L）的表达而介导的。BNIP3和BNIP3L通过阻断Bcl-2与Beclin1的相互作用，在诱导细胞自噬的发生中起到重要作用。HIF-1也可能间接调节Beclin1与Atg5的表达，虽然有研究[26]报道，培养的软骨细胞中HIF-1的沉默与Beclin1的表达下降有关。Ding等[27]研究结果显示，OLP的病损组织处于乏氧状态，HIF-1α的水平升高而其靶基因蛋白RTP801的表达降低，提示这两者在OLP的发病中起一定作用，使得细胞对乏氧的适应能力下降，凋亡蛋白表达异常，基底细胞液化变性。
3.3细胞自噬和OLP均与免疫反应有关
细胞自噬在维持细胞内环境的稳态中起重要作用，同时还参与细胞的固有免疫和获得性免疫反应。胞质或胞核的抗原通过自噬的途径转运到主要组织相容性复合体Ⅱ（major histocompatibility complexⅡ，MHCⅡ），然后呈递给CD4+T细胞；自噬还参与肿瘤抗原的交叉呈递至MHCⅠ以及
CD8+T细胞的活化[28]。Pua等[29]研究发现，在Atg5-/-
的小鼠中，T细胞的自发性死亡明显增加，而且在受到T细胞抗原受体（T cell antigen receptor，TCR）的刺激后并不增殖。研究结果证明了Atg5对于活化的CD4+T细胞与CD8+T细胞的增殖是必需的，同时暗示了细胞自噬在促进T细胞的存活与增殖方面起到重要的作用。另外有研究表明，在感染人类免疫缺陷病毒-1的细胞表面表达的包膜糖蛋白，可以通过细胞自噬作用和Beclin1的积聚诱发未感染的CD4+T死亡；此外，细胞自噬在因细胞因子缺乏引起的Th2细胞死亡中起到一定的作用，它可以抑制获得性反应，诱发T细胞死亡。由此可推断，细胞自噬在免疫反应中起双重作用[17]。
在OLP中，细胞免疫起了重要作用。角质细胞表面表达的MHC-Ⅰ可与一种或多种抗原结合活化CD8+T细胞；同时，朗格汉斯细胞或一些角质细胞表面表达的MHC-Ⅱ呈递抗原活化CD4+T细胞[30]。活化了的CD8+T细胞分泌的TNF-α可引起角质细胞的凋亡，同时可刺激上皮下血管丛的内皮细胞高表达内皮细胞白细胞黏附分子Ⅰ（endothelial leukocyte adhesion moleculeⅠ，ELAM-Ⅰ）、细胞间黏附分子Ⅰ（intercellular adhesion moleculeⅠ，ICAM-Ⅰ）、血管内皮细胞黏附分子Ⅰ（vascuolar cell adhesion moleculeⅠ，VCAM-Ⅰ）等黏附分子，参与炎症反应[31]。在这种情况下，由角质细胞与朗格汉斯细胞表面表达的MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类分子呈递抗原引发T细胞的活化，进而引发抗原特异性的细胞免疫反应，MHC-Ⅰ刺激CD8+T细胞分泌TNF-α，同时MHC-Ⅱ激活CD4+T细胞并分泌IL-2、IL-12、INF-γ等引起角质细胞持续性的损害[30，32]。除此之外，在慢性炎症反应中还存在非特异性的机制，肥大细胞脱颗粒和巨噬细胞的活化，可以释放细胞因子TNF、糜蛋白酶等，可以诱导黏附分子的表达，有利于淋巴细胞的黏附和迁移；同时糜蛋白酶能直接或间接地引起基底膜的降解[15]。此外，有研究[33]表明，Th17可以分泌IL-17等细胞因子，介导炎症反应，与一些自身免疫性疾病的发病有关。戴耀晖等[34]在应用全基因组核苷酸芯片技术分析了OLP病损组织的基因表达谱后发现，IL-17 mRNA显著上调，提示IL-17可能参与了OLP的发病过程。除细胞免疫外，Lukac等[35]研究结果显示，糜烂型OLP患者的血清抗桥粒核心蛋白1和桥粒核心蛋白3的抗体浓度与正常组相比明显升高，提示体液免疫在OLP的发病机制可能起到一定的作用。目前对于OLP的发病机制还没有统一的定论，尚需深入的研究。
以往的研究表明细胞自噬、OLP均与细胞凋亡有关；细胞自噬作用与免疫反应有关，细胞免疫的异常与OLP的发病有关；此外，细胞自噬与OLP的发病过程中有共同的细胞因子的参与。在OLP病损中存在角质细胞的凋亡，基底细胞的液化变性，而OLP中是否存在细胞自噬现象以及这些损伤细胞是否与自噬作用的异常有关，还需要进一步的研究。细胞自噬作用是一把双刃剑，以往有研究表明细胞自噬作用可以提高肿瘤细胞的适应性，通过降解自身成分为肿瘤细胞提供能量，促进肿瘤的形成与生长；另外有研究[36]表明，细胞自噬可以发挥重要的抑制肿瘤形成的作用。它在OLP的发病和恶变过程中是否起作用以及起何种作用尚有待于进一步的研究。
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细胞自噬范文4
关键词：天力克注射液；肝癌；端粒酶
中图分类号：R735.7 文献标识码：A 文章编号：1673-2197(2008)06-014-04
肝癌为世界第五大常见恶性肿瘤，我国发病率和死亡率均占癌症中的第二位，占全球肝癌病例的50%以上[1]。本试验旨在研究复方虫草制剂-天力克注射液对人肝癌细胞的作用机制。
1 材料和方法
1.1 试剂与方法
人肝癌细胞株HepG-2为兰大基础医学院病理实验室保存；天力克原液(批号：200212292)由甘肃东佳源研究所提供；5-氟尿嘧啶(南通精华制药有限公司，批号：050308)；超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司，型号为SW-CJ-2FD。CO2孵箱：日本SANYO；荧光电动倒置显微镜：OlympusIX81；透射电镜JEOL-1230；流式细胞仪：CoulTER Epics XL；PCR仪：MJ PTC-220。
1.2 方法与分组
1.2.1 分组
细胞形态、细胞周期及端粒酶的测定分天力克注射液组，5-氟尿嘧啶组(南通精华制药有限公司，批号：050308)及阴性对照组；免疫组化分为天力克注射液组，5-氟尿嘧啶组，阴性对照组和阳性对照组。
1.2.2 细胞培养及细胞形态变化的观察
将冻存的肝癌细胞株HepG-2从-196℃液氮罐取出，细胞常规复苏及传代[2]。取对数生长期HepG-2细胞进行相关实验。透射电镜观察细胞超微结构，依据文献[2]，取对数生长期细胞，用天力克注射液稀释10倍作用48h，对照组不加药物，5-氟尿嘧啶组调整终浓度为250μg/mL作用48h后。透射电镜观察结果并拍照。荧光显微镜观察细胞核变化，用碧云天生物科技有限公司Hoechst 33258染色试剂盒，按说明书操作，置荧光显微镜下观察，可检测到呈蓝色的浓缩细胞核。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期、细胞膜改变及bcl-2的变化
用含10%胎牛血清的1640完全培养液培养至对数生长期，用终浓度为稀释10倍的天力克注射液作用于肝癌细胞，阴性对照组不加药物，5-氟尿嘧啶组调整终浓度为250μg/mL，继续培养48h，固定后分3份。一组加入RNaseA(终浓度为20mg/L)及PI染液(终浓度50mg/L)，摇匀后室温避光静置1h，经尼龙网过滤，置Coulter EpicsXL型流式细胞仪计数，测定细胞周期中不同时相的细胞数及各期细胞DNA含量并计算凋亡细胞所占比例；另一份按说明书，加100μl A液(破膜液)，室温孵育15min，离心(1000rpm)5min，弃取上清液，用PBS液洗涤，离心(1000rpm)5min，弃取上清液，加入B液(固定液)，同时加入bcl-2-FITC荧光染料，室温孵育15min，离心(1000rpm)5min，弃取上清液，加入400μlPBS液，上流式细胞仪检测bcl-2变化；另外一份离心沉淀(1000rps)5min，PBS清洗2次，将细胞悬浮于200μl结合缓冲液，加入10μlAnnexin-V-FITC(20μg/ml)避光室温反应15min，再加入5μlPI(50μg/mL)染色5min，加入300μl结合缓冲液，立即置Coulter EpicsXL型流式细胞仪检测，获得由四个象限组成的细胞直方图(cytogram)，每个象限的细胞数目就是在检测细胞总数所在点的组分。左下象限代表正常细胞(An-PI-)，右下象限代表早期凋亡细胞(An+PI-)，右上象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞(An+PI+)，左上象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞(An-PI+)。
1.2.4 免疫组化法测定Survivin蛋白及NF-κBp65的表达
依据文献[2]，采用酶标记的链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(简称SP法)，(一抗系SANTA公司产品，免疫组化试剂盒系北京中山金桥公司产品)检测天力克对HepG-2细胞的NF-κBp65及Survivin蛋白的影响。结果判断以细胞质出现棕褐色颗粒为Survivin蛋白阳性染色，NF-κBp65抗体染色阳性细胞为单纯胞核出现棕褐色颗粒或胞核和胞质着色以胞核着色为主。每张图片于高倍视野下随机计数10个视野，计算阳性的细胞数占细胞总数的百分率。
1.2.5 端粒酶活性检测采用TRAP-银染法
用凯基TRAP-银染法端粒酶活性检测试剂盒，操作按试剂盒说明书进行。行细胞端粒酶的提取，PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳，点样后电压改为150mv，电泳1h，银染。结果判定：端粒酶的阳性产物为相隔6个pb条带，最小的条带为40pb。在白光灯箱上用透射照明法对凝胶进行摄影，用电泳分析软件进行分析。
1.3 统计方法
实验数据采用SPSS 10.0统计软件，单因素方差分析法及卡方检验进行统计学分析，单因素方差分析以均值±标准差表示，P
2 结果
2.1 天力克注射液对HepG-2肝癌细胞周期的影响
流式细胞仪PI单染色示天力克注射液作用于HepG-2肝癌细胞48h后，G0/G1期细胞比例下降，S期比例明显增高，G2/M期基本消失，与对照组比较差异有显著性(CP
图1 FCM天力克作用HepG-2细胞48h细胞周期变化
2.2 天力克注射液对HepG-2肝癌细胞膜的影响
流式细胞仪AV/PI双染色显示天力克注射液作用HepG-2 细胞48h后，细胞膜变化率明显增高，与对照组及5-氟尿嘧啶组相比，R×C表卡方检验差异有显著性(P
图2-1 式细胞仪AV/PI染色 天力克作用48h后HepG-2早期凋亡变化
2.3 天力克对HepG-2细胞形态的影响
Hoechst 33258荧光染色检测时，在荧光显微镜下可观察到正常细胞核发蓝色荧光，染色质均匀分布，天力克注射液作用48h后细胞核可见轻度浓缩改变；用5-氟尿嘧啶干预后，细胞核体积变小，染色质致密浓染，或呈颗粒状块或月牙形致密浓染，呈现细胞凋亡改变(见附图3-1、3-2)。
图3-1 荧光显微镜 天力克作用HepG-2细胞48h细胞形态变化×400
图3-2 荧光显微镜HepG-2细胞对照组×400
透射电镜下未用药组细胞膜完整，胞核和细胞器结构清晰；用5-氟尿嘧啶干预后，胞核固缩，核染色质浓缩至核膜下呈新月状或块状；天力克原液作用48h后，细胞质出现大量空泡，细胞核核浆比例减小(见图4-1、4-2)。
图4-1 透射电镜 HepG-2细胞形态对照组×8000
图4-2 透射电镜 天力克作用HepG-2细胞48h6细胞形态变化×6000
2.4 天力克对肝癌HepG-2细胞NF-κBp65及Survivin
蛋白的影响
天力克作用肝癌HepG-2细胞48h时，免疫组化染色示NF-κBp65表达下调，与阳性对照组比较差异有显著性，与5-氟尿嘧啶组比较无显著性差异；Survivin蛋白的表达下调，与阳性对照组比较有显著性差异(P
图5-1 免疫组化天力克作用HepG-2肝癌细胞48hNF-κB p65的变化×400
图5-2 天力克作用HepG-2细胞48hsurvivin蛋白表达×400
2.5 天力克对肝癌细胞bcl-2的影响
对照组的bcl-2表达为59.2%，经天力克作用48小时后，bcl-2的表达为41.0%，下调18.2%，表明天力克可抑制bel-2表达。统计学卡方检验有显著性差异(P>0.01)(见表4，附图6-1)。
图6-1 流式细胞仪 天力克作用HepG-2细胞48h bcl-2 蛋白表达
2.6 天力克注射液对HepG-2肝癌细胞端粒酶活性的
影响 对照组HepG-2肝癌细胞系的端粒酶活性较高，电泳图像分析系统半定量分析，单因素方差分析显示天力克组与5-氟尿嘧啶组、对照组比较差异有显著性(P
图7 TRAP-PCR-银染法测定肝癌细胞端粒酶活性
3 讨论
细胞自我吞噬(autophagy or type II cell death，)是细胞另外一种死亡形式，其特征为即将死亡的细胞浆组分在细胞自噬空泡内降解。其形态特征包括空泡变性、细胞浆组分降解和轻微的染色质浓缩。在体内，细胞出现自噬能被邻近的细胞吞噬[3]。
凋亡：I型程序性死亡，早期细胞支架塌陷而细胞小器官一直存在；自噬：II型细胞程序性死亡，早期细胞小器官降解而细胞支架成分保存。凋亡是以Caspase依赖和核内DNA裂解为特征；而Caspase激活和DNA裂解在自噬细胞死亡过程中发生得非常晚。与坏死比较，凋亡和自噬细胞死亡都以缺乏组织炎症反应为特征[4]。Sophie Pattingre 等[5]实验表明，恶性细胞往往表现出比正常细胞低的自噬活性，且在血清减少或细胞浓度增高时自噬活性仍较低。另有发现，自噬执行蛋白Beclin-1是肿瘤抑制蛋白，原癌基因信号分子(I型磷酸肌醇-3-激酶，Akt，mTOR)抑制自噬，且肿瘤抑制物(PTE-N，p53，DAPk)刺激自噬。而且，一些化疗药物(rapamycin and tamoxifen)是强力自噬诱导剂。自噬作用在肿瘤抑制中可能的机制包括：特异性的细胞小器官和调节细胞生长的长寿蛋白的降解；清除产生活性氧和增加基因毒性的已损坏的细胞器官及非凋亡形式的程序性细胞死亡――自噬性细胞死亡的诱导。体内外实验证实Bcl-2通过结合beclin-1抑制Beclin 1-介导的自噬细胞死亡，下调饥饿诱导的自噬及细胞自噬水平。但有研究表明，细胞自噬是在营养缺乏状态下，细胞通过自噬生成核酸、氨基酸及游离脂肪酸等小分子物质，再循环合成ATP及其他大分子物质，促进细胞增值，如果持续饥饿，细胞会产生II型程序性死亡[5]。本实验显示天力克作用于HepG-2细胞时，形态学检测出现自噬改变，而5-氟尿嘧啶组出现细胞凋亡改变。
天力克注射液是甘肃东佳源医药科研所选用野生黑蚂蚁、沙棘、元胡、术、地龙、冬虫夏草几种中草药，运用高科技手段，精制提炼成可以静脉输注的复方中药注射液。具有止痛、调节免疫及抗肿瘤作用。本实验研究表明，天力克可使肝癌HepG-2细胞膜发生改变，AV/PI染色显示磷脂酰丝氨酸外翻，细胞质空泡变性，胞浆内容物降解，荧光染色显示胞核轻微浓缩，胞核染色均匀，细胞出现自噬表现；使抑制凋亡基因因子Bcl-2及Survivin蛋白表达下调，并引起端粒酶的活性下调，推测其端粒酶活性下调由Bcl-2及Survivin蛋白表达下调引起，而bcl-2表达的下调与NF-κB表达下降有关，bcl-2表达的下调促进细胞自噬。
参考文献：
[1] 芮静安.原发性肝癌的治疗研究新进展[J].Chin J Clini Hepatol，2006，22(4)：244~246.
[2] 司徒镇强，吴军正.细胞培养[M].西安：世界图书出版公司，2004：78~88.
[3] Fink S L，Cookson B T.Apoptosis，Pyroptosis，and Necrosis： Mechanistic Description of Dead and Dying Eukaryotic Cells[J].Infection and Immunity，2005，73(4)：1907~1916.
细胞自噬范文5
实践，不仅是学习，更多的是体验生活，在实践开始之前我就想：这次去实践，我不仅是去学习实践，更重要的是去观察那些已经进入社会生活的人们，不论是老师、销售人员还是老板。虽然他们的称呼不一样，但我相信在他们每一个人的身上都有值得我学习的东西。
这个暑假，对于我来说过的真的很快，不仅和学校一起下乡扶贫，也去了剑桥英语学校和电信公司实践，并且晚上还在南湖公园摆了将近一月的夜市，可以说在将近一个半月的社会实践里自己每天都在扮演着不同的身份，和不同的人打交道，处理着不同的事,这段每天早起晚睡的生活很累，但更多的却是充实和快乐，同时也积累了不少社会经验。
一、 下乡之行
暑期社会实践报告——我在这个夏天成长XX年7月11日至7月12日，我随河北工程技术高等专科学校的下乡队伍来到了保定阜平县老路渠村和东台村进行扶贫。这对于从小在城市中生活的我来说，是一次难得的经历。短短的两天时间，我感受了浓厚的乡村生活气息，丰富了生活经验，也产生了很多感想。
这次下乡我们给老乡们带去了油米、文化宣传墙，给孩子们捐赠了500多本书籍还送出了书包和文具。并且精心的筹划了一台文艺演出。
在乡下的两天里，我发现小路上柿子树，石榴树，核桃树以及西红柿，茄子等应有尽有，使我对大自然倍感新奇。进了农家以后，我发现老乡还养了蜜蜂，猪，鸡，这一切都是城市所缺失的乐趣。听老乡们说村子的年轻人都去城里赚钱一年才回来几次，家里只剩下老人和乳臭未干的孩子，这也让我倍感珍惜和父母亲人在一起的时光。另外我还深切的感受到村里的治安情况相当好，家家民风淳朴，邻里关系和谐，使我毫不夸张感受到了夜不闭户的美好生活。
这两天身体力行的接触老乡，为老乡孩子们服务虽然不简单也很艰苦，但返程时看见老乡和孩子们的脸上洋溢着快乐，我们就觉得能换来他们的快乐再累也值!
二、 在剑桥学校的日子
为了拓展自身的知识面，扩大与社会的接触面，增加个人在社会竞争中的经验，锻炼和提高自己的能力，以便在以后毕业后能真正真正走入社会，能够适应国内外的经济形势的变化，并且能够在生活和工作中很好地处理各方面的问题，7月13日我来到了姑姑开的剑桥少儿英语学校里帮忙，开始了我这个假期的第一份“工作”。
暑期社会实践报告——我在这个夏天成长我主要负责学生的签到和订餐工作，协助老师管理学生。在那里工作很开心，是因为工作的时候，老师都对我们几个助教很好，有时候会买点零食给我们吃，大家在一起聊天，到处充满着欢声笑语。而且我们也和学生、家长们相处的不错，都说我认真起来还真像个不折不扣的老师，连孩子们都亲切的叫我孔叔叔。
当老师的这段日子虽然没有教过课，但能体会到每一位老师为了孩子的辛勤付出和每一位家长对孩子那颗真挚的心。
三、 沧州电信之行
在经过将近一个月的剑桥实践后，经人介绍我又来到了沧州电信运东分公司，为了做些与专业有关的工作便和领导协调，我被安排在维护分部监控维护班，实践内容就是了解维护监控机房的职责和本地电信网络的现状，通过学习了解，我知道了监控机房岗位的职责和重要性，对运东分公司的网络现状和组成有了基本的了解，通过对设备现场参观，了解了设备大致的工作状况和每种设备在电信网中的作用;通过学习，了解了测试软件的使用方法和主要测试指标;了解了机房室内分布的原理和状况及很多新的知识，也长了见识，从人员到设备大致了解了电信公司的后端的情况。
这段日子的经历我也更深刻的体会到我们学的都是理论知识，与实际有着不小的差距。这次实践活动就是为了让自己了解从学校到社会的阶段是需要转型的，让我们做好充分的心理准备，从理论到实践也不是说说这么简单的一件事。
四、 摆摊的夜生活
很小的时候我就有了生意梦，梦想着以后会成为老板有自己的店面，而如今有了暑假充分的时间，我当然不会让它白白溜走，于是利用起每天下班后晚上的空闲时间我便在南湖夜市摆起了地摊卖可以自己动手画的石膏娃娃，
在摆摊的这段时间内，我想是我一个暑假里最让我成长的一段实践了，为了进货我穿街走户的去货比三家，每天晚上摆摊的时间看着各种各样的人和事，这些都是在学校里无法感受到的，在学校和公司里也许有老师和领导分配说今天做些什么，明天做些什么，但在这里，不会有人会告诉你这些，你必须要知道做什么，要自己去做，而且要尽自已的努力做到最好。在学校，只有学习的氛围，毕竟学校是学习的场所，每一个学生都在为取得更高的成绩而努力。无论是学习还是工作，都存在着竞争，在竞争中就要不断学习别人先进的地方，也要不断学习别人怎样做人，以提高自已的能力!记得老师曾经说过大学是一个小社会，但我总觉得校园里总少不了那份纯真，那份真诚，尽管是大学高校，学生还终归保持着学生的身份。接触那些刚刚毕业的学长学姐，他们总是对我说要好好珍惜在学校的时间。在这次实践中，我感受很深的一点是，在学校，理论的学习很多，而且是多方面的，几乎是面面俱到;而在实际工作中，可能会遇到书本上根本没学到的，又可能是书本上的知识一点都用不上的情况。
五、 漫长的未来
回想这次社会实践活动，我学到了很多，从我接触的不同的角色身上都学到了很多不同的社会经验和待人接物的方法，而这些在学校里是学不到的。
在社会上要善于与别人沟通是需要长期的练习。以前没有工作的机会，使我与别人对话时不会应变，会使谈话时有冷场，这是很尴尬的。人在社会中都会融入社会这个团体中，人与人之间合力去做事，使其做事的过程中更加融洽，事半功倍。别人给你的意见，你要听取、耐心、虚心地接受。
细胞自噬范文6
现对实习报告整理如下：
9月11日上午：实习动员
负责老师着重向我们介绍了这次专业实习的目的、内容、方式、时间安排以及一些实习要求等。
专业实习目的
专业实习是本科教学计划中非常重要的实践教学环节，其目的是使学生了解和掌握生产知识，印证、巩固和丰富已学过的专业基础课内容。使学生了解电子产品的现代化生产方式和先进的工艺过程，对工业生产有一个感性认识，并得到电子产品工艺、组装和调试方面的训练，掌握一定的生产技能。在实践中提高分析问题和解决问题的能力，为后续专业课程的学习打下基础。培养学生理论联系实际，热爱专业、奋发向上、致力于祖国现代化建设的思想。
专业实习内容
为了达到上述实习目的，实习主要内容应包括：
1．了解实习单位的生产过程和生产组织管理情况。
2．分析和掌握某一通信业务的工作原理、发展和未来的前景。
3．掌握使用电气设备进行各分机和整机调试的技术和方法。
4．学会所用电气设备、电信业务的操作方法和基本工作原理。
专业实习方式
1．组织参观
组织学生到通信公司或有关车间进行专业性的参观，以了解电信业的现代业务和未来的发展方向，重点了解实习单位的工作过程和生产组织管理情况和先进通信方式、先进装配和调试技术。
2．听取报告
在生产实习开始时，由实习单位指派人员向学生介绍单位情况及进行安全保密教育。为了保证和提高实习质量，在实习期间还可请实习单位有关人员作技术报告，介绍：
①各个主要设备的作用、工作方式、工作原理；
②各设备间的相互联系以及一些主意事项；
③目前所用设备所存在的问题和一些简单的应急方案；
④目前电信技术的发展，以及未来的方向；
⑤工作组织及管理方面的经验及问题。
3．车间实习
