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江姐的故事范文1
20世纪60年代，我上小学三年级的时候，学校里组织我们去参观一个苦难展览，我们在老师的引领下放声大哭。为了能让老师看到我的表现，我舍不得擦去脸上的泪水。我看到有几位同学悄悄地将唾沫抹到脸上冒充泪水。我还看到在一片真哭假哭的同学之间，有一位同学，脸上没有一滴泪，嘴巴里没有一点声音，也没有用手掩面。他睁着大眼看着我们，眼睛里流露出惊讶或者是困惑的神情。事后，我向老师报告了这位同学的行为。为此，学校给了这位同学一个警告处分。多年之后，当我因自己的告密向老师忏悔时，老师说，那天来找他说这件事的，有十几个同学。这位同学十几年前就已去世，每当想起他，我就深感歉疚。这件事让我悟到一个道理，那就是：当众人都哭时，应该允许有的人不哭。当哭成为一种表演时，更应该允许有的人不哭。
我再讲一个故事：三十多年前，我还在部队工作。有一天晚上，我在办公室看书，有一位老长官推门进来，看了一眼我对面的位置，自言自语道：“噢，没有人？”我随即站起来，高声说：“难道我不是人吗？”那位老长官被我顶得面红耳赤，尴尬而退。为此事，我洋洋得意了许久，以为自己是个英勇的斗士，但事过多年后，我却为此深感内疚。
请允许我讲最后一个故事，这是许多年前我爷爷讲给我听过的：有八个外出打工的泥瓦匠，为避一场暴风雨，躲进了一座破庙。外边的雷声一阵紧似一阵，一个个的火球，在庙门外滚来滚去，空中似乎还有吱吱的龙叫声。众人都胆战心惊，面如土色。有一个人说：“我们八个人中，必定一个人干过伤天害理的坏事，谁干过坏事，就自己走出庙接受惩罚吧，免得让好人受到牵连。”自然没有人愿意出去。又有人提议道：“既然大家都不想出去，那我们就将自己的草帽往外抛吧，谁的草帽被刮出庙门，就说明谁干了坏事，那就请他出去接受惩罚。”于是大家就将自己的草帽往庙门外抛，七个人的草帽被刮回了庙内，只有一个人的草帽被卷了出去。大家就催这个人出去受罚，他自然不愿出去，众人便将他抬起来扔出了庙门。故事的结局我估计大家都猜到了——那个人刚被扔出庙门，那座破庙轰然坍塌。
我是一个讲故事的人。
【阅读提示】
苦难、人性、爱、理解与宽容，是莫言演讲的关键词，他用这种方式与世界普世价值对接。能够宽容彼此价值差异的人，是建立在人性的基础之上的。莫言最后讲的三个小故事寓意深远，一针见血、入木三分地刻画了某种不良的社会生态。用独特的讲故事的方式来透视社会疾病和劣根性，非心怀对国家民族大爱者不能为之、无能为之。下面综合网络上许多专家和网友的解读，以飨读者：
1. 要允许有的人不哭
☉ 允许有的人不哭，不止是说你有不合作的自由，更是说我也有不反体制的自由。要允许我不对某些事情表态，别逼着我站队，不要非拿我跟索尔仁尼琴相比。
☉ 社会中伪道德的盛行，会殃及淳朴正直的人；社会要允许多样化的价值观念和个人生活方式。要提高社会的包容性。如果一个国家民族，什么事情都只有一种声音，那是非常荒唐和危险的，历史上不缺乏这样的祸患和教训。社会生态和自然生态一样，需要保持多样性，那样才是百花齐放的美好生态环境。
2. 同一件事，年轻时觉得英勇，现在却深感内疚
☉ 人都需要尊重，不尊重别人，强加于人、一厢情愿，不会有真价值。那些看起来洋洋得意的斗士其实是在争取一些光耀的虚荣。
☉ 过分的自尊也是一种对他人的伤害。
☉ 有些现在认为自己正确的人喜欢逞口舌之快，但分不清勇敢和鲁莽的区别，将来会后悔。
☉ 在的社会，社会上层或者领导阶层，有许多把底层人物不当人看的人，很难想象这样目中无人的人会为广大的人民大众谋福利，他们只会把大众作为忽视、鱼肉和玩弄的对象。那个顶嘴的士兵就是一个真正的“斗士”的象征。之所以顶嘴后又要道歉，是因为这不是有意针对个人，而是针对现象。这种道歉，应该是莫言对可能因为他的小说及获奖前后言论受到一定刺激，而耿耿于怀的一批人的礼节性的道歉，我怀疑这道歉并不是发自内心的，因为本来就不需要道歉，要道歉的是那个“老长官”。
3. 七个自作聪明的泥瓦匠反而倒霉
☉ 替罪羊和牺牲拯救不了你，谁都不可能天真纯洁得一塌糊涂。故事不必解读，一说就俗。
☉ 每个人做好自己就行，不要推别人出去接受考验，结果吃亏的是起哄的人。
江姐的故事范文2
关键词：坝基固结灌浆；帷幕灌浆；施工技术；实例分析 文献标识码：A
中图分类号：TV543 文章编号：1009-2374（2015）21-0129-02 DOI：10.13535/ki.11-4406/n.2015.21.064
水利中的坝基固结灌浆和帷幕灌浆施工技术对水利运行来说尤为重要，表现出了多种优点，最大程度上可以抵御洪涝灾害的发生，与此同时还可以在很大程度上改善下游的航运环境，可以利用它进行发电，为我国的发电节约更多能源。水利坝基固结灌浆和帷幕灌浆的工程有比较大的规模，施工技术也呈现出多样化，需要根据不同的施工环境对施工方法进行具体的选择。在施工过程中应对坝基质量进行必要的分级，可以更好地对施工进行处理。为了更好地对坝基固结灌浆施工技术进行分析，可以结合实际施工工程来进行必要的研究，这样能够更好地促进施工技术得到提高。
1 工程基本情况
水利工程的建设对我国来说意义重大，它肩负着人们最基本的生活用水问题，以辽宁沈阳水利工程为例，流域面积在100km2，主沟道长约25km左右，有良好的植被体系；坝基形式是土坝，河底高程为1042.7m。
2 坝基固结灌浆施工技术及技术要求
2.1 施工设备以及施工工艺
该水库受到辽沈地区环境的影响，坝基固结灌浆的施工方法主要采用的是自上而下孔内循环分段式灌浆。根据河床的上下游河段进行施工，随着施工的进度，大坝中的碾压高度随之升高，在进行灌浆施工中，必须严格控制固结灌浆孔，固结灌浆孔应达到5m。在对其进行灌注时需要按照序孔的顺利进行灌注。灌浆施工设备包括了液压钻孔、气囊式灌浆塞和3SNS型灌浆泵，在进行压水的过程中采用的设备是LJ―Ⅲ型灌浆自动记录仪，它会自动对压水情况进行记录。
2.2 固结灌浆相关的技术要求
（1）该工程中，坝基固结灌浆施工所用的水泥是普通硅酸盐水泥，所使用的粉煤灰是二级产品。（2）在施工的过程中，最大程度上使浆液的压力达到标准压力，如果在注入的过程中出现较大的注入率，应及时对其进行分级升压方法，达到最大压力之前应对灌浆压力进行合理确定。（3）在进行灌浆时，需要把握好水和浆的比例，很多情况下水和浆的比例应控制在0.6∶1，在灌注时如果出现大量吸浆的情况，应根据不同的情况进行变桨，在保证水和浆的比例达到0.6∶1的前提下注浆量大于300L，或者注入1h后注入率没有发生变化，可以把水和浆的比例调整到0.5∶1。（4）如果灌浆压力保持不变，注入率小于1.0L/min时，可以继续灌注30分钟结束。
3 水库坝基帷幕灌浆施工技术
3.1 钻孔技巧
坝基帷幕灌浆中的钻孔技术在坝基施工中非常重要，孔径应≤91mm，终孔孔径应>56mm，帷幕灌浆在进行钻孔时需要钻孔测斜，并采用专用的测量仪对其进行必要的测量，每5～10m进行一次测量，对孔斜的要求不是很高，但是也要符合一定的规范要求。
3.2 抬动观测技巧
在进行灌浆之前，需要进行地面抬动变形观测，观测的开始工作就是钻孔冲洗，直到灌浆结束为止，专业人员需要对整个灌浆进行必要的观测，观测频率比较高，
一般每隔10min需要观测一次，并且做好观测记录。
3.3 冲洗技巧
在对钻孔进行灌浆之前，需要对孔壁利用水流进行冲洗，等到清净之后延长10min的水流，彻底对孔壁进行冲洗。裂缝的冲洗采用的是灌浆压力水，如果水压大于110MPa时，应及时把压力调整到110MPa。
3.4 压水试验技巧
孔壁和裂缝冲洗完毕之后，需要进行必要的压水试验，水的压力需要保持在灌浆压力的80%，如果压力值大于1.00MPa时，应及时把其调整到1.00MPa。
3.5 灌浆技巧
灌浆有很高的要求，在很多情况下对水灰的比例有严格控制，主要有几个比例范围：2∶1、5∶1、0.60∶1，这些都进行了标准化，灌浆可以运用由稀到浓的方法来调整。
4 帷幕灌浆的施工质量管理
4.1 各次序孔透水率分析
坝基帷幕灌浆工程中的段次数量和钻孔数量分别为693和93，q是灌注前压水试验成果透水率。
4.2 检查孔压水成果
坝基帷幕灌浆分部工程灌浆孔数量是99，检查孔压水77段，有11个孔的布置是工程师全面负责。透水率的最大值和最小值都在标准范围之内。
5 结语
通过对某水利机构进行分析可以看出，坝基固结灌浆和帷幕灌浆在水利工程中占据着非常重要的位置，坝基固结灌浆方式能够在很大程度上降低施工量，与此同时对混凝土钢筋切割的工作量进行最大程度上的降低。在施工过程中，随着施工的顺利进行，设备搬迁的次数大大降低，不会带来由于设备的搬迁而出现环境污染的情况，能够很好地预防水管的断裂情况。
参考文献
[1] 罗红琦，邢芳.燕山水库固结灌浆和帷幕灌浆的质量控制[J].安徽建筑，2011，（5）.
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江姐的故事范文3
大国的建立并不是一朝一夕建立起来的，它必将经历时间、政治、文明乃至整个历史的考验，或崛起于经济的变革、或崛起于律法的审试、或崛起于战火的洗礼、或崛起于科学的考教、抑或思潮的涌动、大道的铸就;但无疑从世界天堑被打破的那一天起，所有国家便不得不停止那些自我演绎的的故事，开始主动或被迫地相互的审视、交流、碰撞。那些拥有着强大凝聚力的国家出现了，他们推动着世界向着“既定”的剧情走去，演绎着伟大的史诗，把握机会，凝聚更为强大的力量衍变为世界性强国。
大国，是一个不单单以领土为衡量标准的词汇，更是对其国家地位和世界影响力的一种肯定。任何单一的、单调的因素都不足以支撑一个大国、强国。单纯物质层面的丰富是苍白的，其不仅要有规模、能力，更应该形成一种吸引力、内部凝聚力。也就是说一个大国外部的崛起，源于内部制度、体系的健全，是其内部力量的外延。而这种内部力量往往取决于思想文化的影响力。不妨来看，莎士比亚、牛顿、亚当斯密的名字共同镌刻在了英国崛起的道路上;法国的先贤祠内安葬着伏尔泰、雨果、居里夫妇等一系列代表引领法国文化的伟人。文化可以打破人们思想的束缚，从而碰撞出全新的火花，推动社会的行进。
除此以外，制度的创新，也足以奠定大国的地位。近五百年来，只有三个国家先后建立起世界霸主地位——荷兰、英国、美国。他们先后建立、确定、完善、创新、改良着世界市场经济的模式。而随之而来的便是为了保障经济而实行的政治制度——内阁制、议会制，长久的保障了国家的长治久安，保证了国家、社会的稳定，促进了经济的发展。
任何一个国家想要崛起、走向强盛和现代化都不能刻意模仿其他国家所走过的道路，其必须从万千条途径之中发现并坚持一条适合自己的道路，并不懈践行。打开视野，向发达国家学习，无疑是后发国家走向强盛国家的开端。正如俄罗斯、德国、日本，他们选择凭借国家推动社会经济建设、实现工业化、现代化的发展目标。这些国家凭借刚刚重建后国家和政府的强大影响力，塑造社会形态，与英美等凭借社会推动国家自下而上发展的模式完全不同。
成为一个大国，或许是人类发展史上一个永远的难题，是一个有着无穷多解法的永恒之谜。但只有那些在不同时期根据自己的国情和时代的需要，做出正确战略判断的国家，才能获得历史的青睐。历史总是率先选择第一时间适合其规则并拥有那个时期核心竞争力的国家来充当世界的主角。回顾当下，二战结束70多年后的今天，而今活跃的强国依然是当年的那些大国，他们率先完成了现代化早已领先于时代，向着未来的更深处去探求人类的命运。
当然，自从大航海的航道把地球割为两半的时候有些事就已经注定。这个世界有时像黑白照片那般残酷的鲜明，大国崛起所依靠的恰是对殖民地的扩张、划分、掠夺。那里的人民享受着与殖民国完全不同待遇，他们所失去的绝不仅仅是土地和丰富的资源，更是国家的尊严、民族的独立与平等，被迫的接受着外来者残酷的强制性改变——颠覆性的动荡。这些影响有些直到今天还牢牢根植于那片土地。
或许比起大国的崛起，其维系过程中所爆发的矛盾和问题远比解决的办法要多得多。他们面临着保持和扩大利益的烦恼。“第一大国”总是想建立起最符合其利益的世界秩序而与新崛起的大国发生冲突和矛盾，这时大国间的战争似乎成为了解决这一矛盾的必由之路，唯一手段，用于打破重建世界秩序。
江姐的故事范文4
关键词：大坝；坝后无盖重固结灌浆技术；注意要点
前言
随着我国经济建设的快速发展，国家对于水利建设的重视程度也越来越强，各种类型的水利工程纷纷上马，同时随着科技的发展使得大量的先进技术被应用于大坝的施工中，从而使得大坝施工的技术与可靠性都大大加强，文章将在分析大坝施工技术的基础上对大坝坝后无盖重固结灌浆技术进行介绍。
1 大坝施工中的灌浆技术工艺分析
在大坝的施工过程中，为确保其可靠性以及防渗要求，多使用灌浆工艺对大坝进行加固，从而使得大坝工程的可靠性与施工质量有进一步的提升。由于水利工程会在各种不同的地质条件下进行施工，因此需要对灌浆施工工艺进行一定的调整以适应各种不同类型的地质条件下施工，从而使得大坝施工的可靠性与质量得到进一步的提升。在大坝施工的过程中，采用灌浆技术主要是通过在大坝坝体上进行钻孔后使用高压泵将水泥浆液压入到岩石结构中，从而使得水利工程施工中的基础岩石更为稳固与紧密。随着科技的发展，传统的大坝灌浆施工工艺也得到了改良，灌浆施工更为简单高效。而大坝坝后无盖重固结灌浆技术则主要应用于大坝坝体基岩结构的加固，大坝坝体基岩的整体性和均质性有着极大的提高，为下一步的水利工程施工创造良好的施工条件。大坝坝后无盖重固结灌浆技术是在传统灌浆施工工艺的基础上发展起来的，其主要目标是对大坝坝体的基岩结构进行灌浆加固，使大坝坝体具有一个良好的基础。在水利过程的施工过程中会面临着各种复杂的地质条件，甚至于一些施工地点的地质结构疏松、防渗抗漏问题较为严重，所以，通过采用大坝坝后无盖重固结灌浆技术将水泥浆液注入到大坝的基岩中以加强其结构的稳定性和防渗抗漏的能力。
2 大坝坝后无盖重固结灌浆技术与有盖固结灌浆技术对比
为了增强混凝土固结灌浆的效果，通常固结灌浆应当尽可能地在浇筑了一定厚度的混凝土后进行施工，即进行有盖重固结灌浆，使用有盖固结灌浆对于提高混凝土与基烟的紧合度有着重要的意义。其中有盖重混凝土的厚度一般控制在1.5-3m之间，且当浇筑后的盖重混凝土的凝固强度达到所要求的一半以后即可进行钻孔灌浆施工，是现今在水利工程大坝基岩施工中使用较为广泛的一种技术。但是有盖重固结灌浆需要占用混凝土浇筑施工部位，会使得混凝土浇筑的工期压后，尤其是在边坡坝块，为确保施工质量需要多次进行混凝土的浇筑，限制碾压混凝土按照6m厚升层浇筑，而后进行有盖重固结混凝土施工，待到边坡基础固结灌浆完毕并完成压水试验后在进行上一层的碾压混凝土施工，从而使得施工速度较慢，会坏死的混凝土块层面长期暴露在空气中，对于一些气候变化较快的地区会对混凝土块的性能造成严重的影响。为解决这一问题采用无盖重结混凝土灌浆技术进行施工，其施工是在建基面开挖完成后，先在其上浇筑厚度为30cm左右的找平混凝土，其主要目标是嵌堵基岩面裂缝，而后则可进行灌浆施工，同时对于找平混凝土的施工较为灵活可以快速完成，从而给大坝施工带来方便。
3 大坝坝后无盖重固结灌浆施工的施工工艺
在进行大坝坝后无盖重固结灌浆施工的过程中首先需要对施工地点的地质情况进行分析，并制定出合理的施工工艺。同时做好前期的施工准备工作，对岸坡坝段部分基础固结灌浆施工时需要按照坝段分块进行施工，对于坝基部分进行施工时需要按照平台分块进行施工，固结灌浆施工按照分序加密的原则来对坝体进行施工，首先需要进行表层的钻灌，而后再进行以下各段的钻灌。
3.1 大坝坝后无盖重固结灌浆技术中的钻孔
在进行大坝坝后无盖重固结灌浆施工时首先需要进行钻孔，钻孔采用潜孔钻机，钻孔直径要大于60mm，采用自上而下的钻孔方式，其中钻孔严格按分序加密的原则进行，在钻孔的过程中对钻孔进行冲洗，对于裂隙的冲洗压力控制为灌浆压力的八成，从而将钻孔中所含有的岩渣、碎屑等清洗干净，避免对后续的灌浆作业造成影响。
3.2 大坝坝后无盖重固结灌浆技术中的灌浆
完成了对于大坝的钻孔后，需要进行灌浆，其中灌浆采用的是“自上而下”的循环式灌浆方式，灌浆时采用的是单孔灌注，而当发生串孔且设备能够满足设备所需要的要求时可以采用并联灌注的方式进行灌浆，且一次灌注的孔不得超过3个孔，灌浆时采用的是分段灌浆的方式，坝后坡固结灌浆孔的深度分别为10m和12m两种，可以对灌浆孔采用分3段灌浆，10m时可以分为1、4、5m三段而12m可以分为1、5、6三段。灌浆时对于压力的控制需要注意：灌浆时需要尽快将水泥浆液的压力提升至设计压力，而对于一些孔径较大且注入速率较快的孔段需要采用分级升压的方式来将灌浆压力提升至设计压力，将压力按照0.05MPa进行分级并在每一压力级上保持15分钟以上确保水泥浆液能均匀的渗入到基岩中。
对于灌浆浆液水灰比的配比需要按照实验设计进行，灌浆所采用的水泥浆液为425号普通硅酸盐水泥配比的水泥砂浆，对于砂石的细度选用的是通过80m方孔筛筛余量控制在5%以内，对于所使用的建材需要定期对其进行质量检测以控制其达到要求，同时对于水泥砂浆的制造顺序为配浆-高速搅拌-普通搅拌后得出所需要的浆液。灌浆封孔采用的是全孔灌浆法的方式对其进行封孔，待到灌浆完毕后，首先使用导管将钻孔内的全部浆液置换成水灰比为0.5：1的浓浆，待到置换完成后使用灌浆塞对钻孔进行封塞，而后继续使用浓浆进行纯压式灌浆封孔，待到封孔时所采用的压力需要达到1.0MPa，并持续保持此压力30分钟以上，完成了对于钻孔的灌浆后，使用抬动观测孔、声波测试孔等要求按照固结灌浆孔的封孔方法进行处理。
4 灌浆过程中出现问题的处理
当灌浆过程中出现冒浆问题时，可以采用对地表冒浆地点进行封堵，如封堵作用不大还可以采用降压、浓浆、限流等方式来进行处理。当灌浆时出现串浆问题时，如果串浆孔之间满足灌浆的条件，可以采用并联灌浆的方式进行处理，并对两个孔的灌浆压力分别予以控制，防止压力剧烈变动对其的影响，同时需要将并联的孔数控制在三个以内。当灌浆过程中设备出现问题而引起灌浆中断时，需要尽快恢复灌浆作业，如中断时间较长需要采用浓度较低的浆液进行灌注并在过程中逐渐恢复以前的压力。同时对于灌浆时出现耗浆问题时需要停止灌浆作业，并对项目的地质状况进行提高勘查，对于存在的地下洞井、裂缝等问题需要及时封堵后再继续进行灌浆。
5 结束语
大坝坝后无盖重固结灌浆技术是一种新型灌浆技术，相对于有盖固结灌浆技术，施工简单工期较短，具有很高的实用意义，文章在分析其工作原理的基础上对施工作业中需要注意的问题进行了分析介绍。
参考文献
[1]郑永新.水电站堰坝工程的施工浅析[J].科技资讯，2011，17.
江姐的故事范文5
2、故事是真实。小说是在这些真实故事的基础上加工而成的。小说是艺术加工的产物，它的人物、地点等应是虚构的，不一定有一个确定的答案。但是也可以大抵推一下。
3、书中所说的城市是虚构的。原西：平凡的世界讲的是陕西的故事，原西是虚构出来的。书中出现了“原西的婆姨原东的汉”。而大家都知道原话是“米脂的婆姨绥德的汉”，依次推出：原西是米脂，原东是绥德。但是也有人提出异议，这个，只有作者有发言权。
4、黄原：书中写道：延河与南川河在中心交汇，宝塔山、清凉山、凤凰山三山相映，东关、南关尽在眼底，应该就是延安。铜城：孙少平挖媒的地方铜城，便是陕西煤城铜川市，这应该没有什么疑问。
江姐的故事范文6
[关键词] 骨折；降钙素基因相关肽；基因重组；质粒转染；愈合
[中图分类号] R68 [文献标识码] C [文章编号] 1673-7210（2013）09（b）-0164-03
骨折是骨科临床中最为常见的疾病，特别是随着交通事故的频发，骨折患者的数量也呈逐年上升的趋势。目前，骨折的治疗方式主要包括切开复位和闭合复位，但无论哪种方式都存在延迟愈合甚至不愈合的可能，给患者的身心造成极大的痛苦。针对这一问题，国内外学者先后采用了机械固定、骨移植、电刺激、骨诱导等多种方法进行治疗[1-3]，虽然取得了一定的进展，但均不能完全解决骨折不愈合的难题。本研究采用与骨代谢密切相关的降钙素基因相关肽（CGRP）转染入骨折断端，观察其对骨折动物模型的愈合作用，在基因水平为促进骨折的愈合提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
36只SD大鼠，平均体重（200±10）g ，由中国农科院哈尔滨兽医研究所提供，许可证号：SYXK（黑）2006-032；pcDNA3.1-CGRP质粒（Invitrogen，美国），E.coli. DH5α（哈尔滨医科大学附属第四医院实验室提供），CGRP引物、dNTP（TAKARA，日本），Hind Ⅲ、BamHⅠ（博士德公司，中国武汉），兔抗大鼠CGRP单克隆抗体、生物素二抗、AP二抗（博士德公司，中国武汉）。
1.2 实验方法
1.2.1 pcDNA3.1-CGRP质粒的转化 应用CaCl2溶液将E.coli. DH5α制备成感受态E.coli. DH5α，加入到50 mL离心管中，向离心管中加入5 μL pcDNA3.1-CGRP质粒，冰浴30 min，42℃热休克90 s，再冰浴2 min。向管中加入SOC培养基800 μL，37℃培养45 min，使恢复大肠杆菌的正常生长状态并且表达抗生素的抗性基因。将菌液涂于含有50 μg/mL氨苄青霉素的SOB平板上进行抗性筛选。
1.2.2 CGRP的PCR及酶切鉴定 待菌落长出后，挑选饱满菌落对CGRP行PCR检测，向体系内加入5×PCR Buffer 4 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各1 μL（表1），Taq DNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O定容至20 μL。95℃变性60 s，60℃复性60 s，72℃延伸60 s，30个循环后，72℃延伸5 min，4℃保温。对产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。对于PCR鉴定阳性菌落，扩增提取质粒后，加入10×K Buffer 2 μL，Hind Ⅲ 1 μL，BamHⅠ1 μL，质粒-PCR混合物15 μL，ddH2O定容至20 μL，37℃反应8 h后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。
表1 聚合酶链反应引物列表
注：CGRP：降钙素基因相关肽；GAPDH：内参基因；“-”代表无内切酶
1.2.3 pcDNA3.1-CGRP质粒溶液的配制 选取pcDNA3.1-CGRP鉴定为阳性克隆菌株，扩增后应用QIAGEN Plasmid Midi Kit提取质粒，0.22 μm滤器除菌干燥后加入到含20%蔗糖的PBS溶液中，配制成浓度为1.0 g/L的pcDNA3.1-CGRP质粒溶液，同时配制1.0 g/L的单纯pcDNA3.1质粒溶液，-20℃保存待用。
1.2.4 动物的分组及模型制备 36只SD大鼠随机分为A、B、C 3组，每组12只，3.5%水合氯醛（1 mL/100g）腹腔麻醉，右下肢常规备皮消毒后，切开皮肤及皮下组织，分离暴露股骨，于股骨中点处用摆锯将股骨横行锯断，克氏针固定后逐层缝合。术后24、48 h两个时间点，A组每只动物于骨折处经皮注入pcDNA3.1-CGRP质粒溶液1 mL，B组注入单纯pcDNA3.1质粒溶液1 mL，C组注入PBS溶液1 mL作为阴性对照。于术后2、4周检测骨折愈合情况。
1.2.5 骨折端的X线检查 于术后观察大鼠一般状态及切口情况，对每组动物均进行X线检查，记录骨折复位情况。分别在2、4周时每组分别选取6只大鼠，在X线下观察骨折断端骨痂的形成情况，并与术后进行比较。
1.2.6 CGRP的免疫组化检测 术后2、4周两个时间点每组各随机选取6只大鼠，乙醚麻醉后处死，取骨折端周围骨组织、骨膜组织和骨骼肌，4%多聚甲醛固定后，骨组织EDTA脱钙处理。切片脱蜡后，3 % H2O2浸泡20 min，加入兔抗大鼠CGRP单克隆抗体（1∶200），室温过夜；PBS冲洗，加入生物素二抗（1∶400），37 ℃孵育30 min；PBS冲洗后加入新配制DAB显色。以PBS代替一抗作为阴性对照，每个标本随机选取6张切片，每张切片随机选取6个高倍视野，应用Image-ProPlus图像分析系统测定平均光密度值，并进行统计学分析。
1.2.7 CGRP的Western blot检测 术后2、4周两个时间点，取处死动物的骨膜组织，加入1 mL细胞裂解液，冰上裂解5 min，经超声细胞粉碎仪粉碎后，4℃低温离心10 min（12 000 r/min），取上清加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液电泳。转膜封闭后，加入兔抗大鼠CGRP单克隆抗体（1∶200），室温过夜；TBST冲洗后加入AP标记的二抗（1∶400），孵育1 h，加AP显色液显色。应用Image-ProPlus图像分析系统测定平均光密度，并进行统计学分析。
1.3 统计学方法
应用SPSS 18.0采用统计学软件进行数据分析，PCR、免疫组化及Western blot的检测结果的相对值以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CGRP的PCR及酶切鉴定
质粒转化后，对饱满菌落PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，有4个克隆菌落在成像仪下可见大小相同的特异性片段，与CGRP的cDNA相吻合。对这4个克隆菌落提取质粒酶切后进行电泳，在凝胶成像仪下可见两条特异性条带，其大小分别与pcDNA3.1和CGRP相一致。
2.2 骨折端的X线检查
实验动物术后一般状态良好，切口无感染，右下肢跛行。术后行X线检测，各组动物骨折端对位对线良好，横行骨折线清晰可见。术后2周时，A组动物可见明显的骨性骨痂形成，B、C组骨性骨痂不明显；术后4周时，A组动物骨折端均已骨性愈合，骨折线消失，2只动物出现骨髓腔再通，其余四肢尚未再通，B、C组动物可见骨性骨痂形成，骨折线模糊，其中B组1只动物未见骨痂形成。
2.3 CGRP的免疫组化检测
术后2周时，A、B、C三组切片均可见CGRP的阳性表达，骨、骨膜、骨骼肌的CGRP平均光密度值见表2。A组的CGRP表达水平均高于B、C组，差异有统计学意义（P < 0.05），说明CGRP基因在A组不同组织均有转染；A组CGRP的表达水平在骨膜组织明显高于骨组织和骨骼肌组织，说明CGRP基因在骨膜组织的转染率较高。术后4周时，A组CGRP表达较2周时明显下降（P < 0.05，图1）；B、C组未见CGRP表达。
表2 术后2周时CGRP的免疫组化光密度值（x±s）
注：与A组比较，*P < 0.05
与术后2周比较，*P < 0.05
图1 术后2、4周时A组CGRP平均光密度值比较
2.4 CGRP的Western blot检测
Western blot检测采用管家基因GAPDH作为内参，电泳条带亮度一致，三组蛋白形成的CGRP条带密度不同。根据公式：CGRP相对量=CGRPF产物电泳条带密度/GAPDH×100%，计算各组蛋白量，结果见表3。A组动物CGRP的表达量在两个时间点较B、C组均明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05），B、C组比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。
表3 三组CGRP蛋白表达相对量比较（x±s）
注：与A组比较，*P < 0.05
3 讨论
骨折是骨科最为常见的疾病之一[4]，多数由意外所致，给患者身心造成极大痛苦，如何提高骨折愈合时间，恢复患者的正常生活是创伤骨科临床中面临的重要问题之一[5]。对于骨折延迟愈合甚至不愈合，许多学者采用不同方法均取得一定疗效[6-8]，但并未能完全解决这一难题。骨折的愈合是较为复杂的病理生理过程，在细胞水平涉及成骨细胞、破骨细胞、巨噬细胞等多种细胞的参与[9]；在分子水平又涉及多种细胞因子、炎症因子的相互作用[10]。其中，由于CGRP参与骨代谢的过程，在骨折的愈合过程中显得尤为重要。
CGRP最早发现于甲状腺髓样癌组织中，主要分布于感觉神经纤维，通过轴浆运输到达神经末梢[11]。骨折发生后，随着骨折的愈合，周围神经逐渐长入骨折断端，其中以CGRP阳性纤维居多[12]。本研究通过基因转染方式，将外源性基因片段导入骨折断端，使其在体内表达。质粒溶液导入体内后转染效率虽然没有病毒溶液高，但由于CGRP在10-8～10-9 mol/L水平即能发挥作用，因此，本实验采用质粒溶液转染，是一种方便快捷的转染方式。A组CGRP在骨、骨膜、骨骼肌组织中的表达水平均明显高于B、C组，说明CGRP在体内转染成功并形成有效的表达。本研究A组CGRP在骨膜中的含量高于骨组织和骨骼肌组织，证明外源性CGRP在骨膜组织中的转染率高，这与内源性CGRP的分布水平相一致，是由于CGRP能够调节成骨细胞的活性，所以分布于骨膜等成骨活跃的区域[13]。术后2周时CGRP在骨膜内的含量明显高于4周时，说明CGRP主要在成骨的早期发挥作用，而在骨痂形成后的塑性期，其作用减弱。术后4周时，A组的CGRP表达仍较B、C组高，说明转染的外源性基因表达较持久。虽然B、C组没有外源性CGRP的转染，但在骨折愈合的早期和晚期仍有CGRP的表达，可见内源性CGRP在骨折周围组织中也有表达，而早期的表达水平高于晚期的动态变化，也说明了内源性CGRP在骨折愈合的过程中发挥一定的作用。CGRP发挥作用的通路可能与蛋白激酶C（PKC）有关[14]，也有研究表明其可能是通过抑制核因子κB活化因子配体（RANKL）对NF-κB的激活作用而起效[15]。本实验不足之处在于未能探究CGRP的具体作用通路及作用位点，尚需进一步研究。
综上所述，降钙素基因相关肽能够加速骨痂形成，提高骨折的愈合效率。
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