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基因治疗范文1
基因治疗(GeneTherapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，而达到治疗目的。1991年美国实施了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案，科学家W.FrenchAnderson等将含有正常ADA（AdenosineDeaminase，腺苷脱氨酶）基因的逆转录病毒转入一个4岁患有ADA-SCID（SevereCombinedImmunodeficiency，严重复合免疫缺陷综合征）的女孩的白细胞内，并用白细胞介素Ⅱ(IL-2)刺激其增殖，经10天左右再经静泳输入到此患儿体内。大约1－2月治疗一次。8个月后，患儿体内ADA水平达到正常值的25％，两年后基本恢复正常，未见明显副作用。此后又进行第2例治疗并获得类似的效果[1-2]。
这是基因治疗史上的里程碑，迅速引起了全球基因治疗的研究热潮。然而，基因治疗的发展并不是一帆风顺的。1999年，美国一名年仅18岁的青年JesseGelsinger因患鸟氨酸转氨甲酰酶不足症（一种遗传性疾病）在美国宾夕法尼亚大学人类基因治疗中心接受基因治疗时不幸死亡，这一事件震惊了当时的科技界。基因治疗一度跌入低谷，各国对基因治疗临床试验的资助大幅减少[3]。基因治疗在争议中不断地前进，最近几年已取得不俗进展，重新成为各国研究的热点。RNAi（RNAinterference,RNA干扰）是基因治疗的又一亮点，其在神经性、遗传性、病毒性等疾病中的治疗研究已经展开[4]。2009年，针对X-连锁型肾上腺脑白质营养不良症(X-linkedAdrenoleukodystrophy，X-ALD)的基因治疗初见成效，并被《Science》评为年度十大科学发现之一[5]。正如《Science》评论指出：在饱受科学界质疑以及制药业遗忘多年后，近几年基因治疗在应对严重遗传性疾病方面取得了重大突破，再次优雅的回归[6-7]。在我国，基因治疗也有一定发展。1991年，复旦大学薛京伦教授研究小组进行了国内首例基因治疗临床试验。
2003年，人类首例商业化基因治疗产品“重组Ad-p53腺病毒注射液”在深圳诞生。目前，我国已在在遗传病、肿瘤、神经系统疾病及细胞因子基因治疗的临床前研究取得了一定成绩[7]。基因治疗按靶细胞类型分为生殖细胞(Germ-lineCell)基因治疗和体细胞(SomaticCell)基因治疗。广义的生殖细胞基因治疗以、卵子和早期胚胎细胞作为治疗对象。由于生殖细胞基因治疗涉及一系列伦理学问题，如人权问题、阻碍人类多样性的问题以及基因歧视等，生殖细胞基因治疗仍属[8]。体细胞基因治疗是当前基因治疗研究的主流，但是仍处于临床试验阶段，存在较高的风险性和不稳定性。基因治疗由于自身技术的高度复杂和难以控制，同时涉及一定的社会伦理学问题，应用于临床医学必然会引起相关的法律问题。
二、基因治疗在临床医学应用中的法律问题
（一）隐私权
基因(Gene)是指携带有遗传信息的DNA序列，是控制性状的基本遗传单位。基因有两个特点，一是能忠实地复制自己，以保持生物的基本特征；二是基因能够“突变”，突变绝大多数会导致疾病，另外一小部分是非致病突变。非致病突变给自然选择带来了原始材料，使生物可以在自然选择中被选择出最适合自然的个体。基因与人类的健康密切相关。基因的特点决定了基因具有特殊的地位①，基因治疗过程中必然涉及到患者基因的隐私权保护。一是基因隐私保密权。保护个人隐私的隐蔽性、不公开性是使个人隐私保持其受法律保护状态的前提。基因信息不仅与个人密切相关，而且与个人的后代相关。因而,个人享有对其基因信息进行保密,不为他人所知的权利。[9]二是基因隐私的知晓权。获取基因进行基因研究必须向基因的所有者进行告知，让基因所有者知情，使其知道自己的基因作何用途。[10]三是基因隐私利用权。是指自然人依法对自己的基因信息进行积极利用,以满足自己精神、物质等方面需要的权利。[9]四是基因隐私支配权。这是基因隐私权的核心内容。任何单位或个人未经基因提供者本人的同意或授权，不得随意公开、使用或处置基因提供者的基因信息。[10]如利用基因信息进行相关科研等活动时，必须征得提供者的同意。五是基因隐私维护权。是指自然人对于自己的基因隐私所享有的维护其不可侵犯性,在受到非法侵害时可以寻求司法救济的权利。[9]例如，非经基因提供者的同意，将其基因信息进行商业活动时，基因提供者有权依靠法律得到相关赔偿。
（二）知情同意书的签订
任何医疗活动都会存在风险，为保护医患双方的权益，大部分临床医疗活动均要签订相关知情同意书，并受法律保护。基因治疗应用到临床医学，签订知情同意书同样至关重要。我国1994年颁布的《医疗机构管理条例实施细则》第六十二条和八十八条以及2002年颁布的《医疗事故处理条例》第十一条规定，患者在医疗过程中对自己的病情、诊断、治疗享有知情权。医方施行手术、特殊检查或特殊治疗时，必须征得患者同意。概言之，患者知情同意权包括了解权、被告知权、选择权、拒绝权和同意权，但不宜告知患者的（仍应告知其家属）除外。特殊检查、治疗系指该检查、治疗具有一定危险性，或因患者本质特殊、病情危急可能产生不良后果，或系临床试验性，或收费较多。基因治疗治疗显然属于上述法律规定中的特殊检查和治疗范畴。基因治疗不同于传统的医疗活动，其高科技、高要求及高风险等特点必然决定此类知情同意书的特殊性。受试者有权利要求被告知基因治疗实施单位及人员的资格以及经验、风险效益比、其他可替代的保守治疗途径、保密问题、受伤害时的赔偿等等。实施单位还必须有一份针对使用的基因产品的专业医师的指示说明，包括依实验所知的产品药性、毒性和治疗效果等。[11]考虑到基因治疗的复杂和难以理解性，一般人不是很容易透彻理解，应当成立相关部门，如基因治疗专家咨询委员会等，帮助患者及家属真正了解基因治疗及知情同意书的内容，真正维护患者及其家属的利益。
（三）治疗方案的规范
基因治疗现在还大多仍处于临床试验阶段，还不是一种成熟和稳定的治疗技术，存在较多不宜克服的难题，其中最为突出的是：
1.效率问题
基因治疗的时效比较短暂。基因治疗成功的前提是导入治疗性DNA的靶细胞能发挥功能，并且能够在体内长时间存活并且性能稳定。然而，导入的外源性的DN段会导致许多细胞快速分化从而很大程度上可能基因治疗的持续性。患者必须经过多轮治疗，如前所述的第一例成功的基因治疗病例中，1-2月就要进行一次，每次费用大概两万多美元，代价相当昂贵。[1-2]此外，任何外物进入人体组织后，人体的免疫系统就会被激发产生免疫应答以防御入侵者，而这种免疫应答在某种程度上也会降低基因治疗的效果。
2.安全性问题
病毒是大多数基因治疗研究中选择的载体，会对病人带来许多潜在危险，比如其毒性、免疫和炎症反应以及基因控制和定位的问题。基因治疗的安全性是目前基因治疗争论最为激烈的问题，比较著名的是前文提到的那位18岁美国病人死于基因治疗。患者死亡的主要原因是基因治疗对象选择有误及用药剂量过大，尽管病毒载体进入细胞后是随机整合至宿主细胞染色体的，但其仍具有潜在的插入突变可能性。[12]基因治疗属于高端的新医疗技术，存在相当高的风险。由于技术的限制性以及可能涉及相关的社会伦理问题，基因治疗在实施时必须遵循一定规范，必须由相关部门进行管制和监督。1993年，我国卫生部颁布了《人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点》，将人的体细胞治疗及基因治疗的临床研究纳入《药品管理法》的法制化管理。2003年，我国药监局又颁布了《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》，较为详细地规定了基因治疗研究的技术标准和操作规范。
三、我国临床基因治疗的立法思考
（一）国外基因治疗的立法经验
1.美国
1976年，美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth,NIH)成立了重组DNA咨询委员会(RAC)并制定世界上第一个实验室基因工程应用法规《重组DNA分子实验室准则》，首开了政府对生物技术发展进行控制的先例。随后，在基因治疗进入临床研究前的1985年，美国NIH制订了针对体细胞基因治疗的指导准则《人类体细胞基因治疗的设计和呈批考虑要点》，是这一领域里第一个系统的成文规章。[13]美国对基因治疗临床试验的监督由健康和人类服务部的食品与药品管理局和人体研究保护办公室两个法定机构负责。所有从事人体研究的研究者，无论是来自学术机构还是工业界，都必须遵循上述机构的监督管理[14]。
2.英国
1989年，英国政府成立基因疗法伦理委员会，作为临床治疗的审批和监督机构。1993年成立基因治疗咨询委员会，对基因治疗临床方案的可接受性进行审查和管理，协调与其他相关机构的关系。[13]
3.奥地利
奥地利基因治疗的管理要遵循基因技术法的有关规定。体细胞基因治疗只能在被批准的医院里由特定的医疗小组进行，并要得到相关政府机构和伦理委员会的同意。[14]
4.德国
德国1984年由司法部和科研部召集医生、生物学家、哲学家、法学家、宗教代表组成了一个基因分析和基因治疗的研究小组，为政府的立法提供咨询报告，并基于报告提出了一系列相关的法律法规。[13]德国1990年制定世界上第一部“基因技术法”，分七部分四十二节。[14]
（二）我国临床基因治疗的立法建议
基因治疗对个体及人类生命的影响程度远远超过了传统医疗技术，其风险也是目前的医疗经验知识无法掌控的。同时，基因治疗还可能引发不少社会伦理问题。这些问题的解决离不开法律的支持。就本人观点而言，我国临床基因治疗的立法至少应包括以下内容：
1.治疗范畴的立法
首先要确定临床基因治疗的范畴，何种基因治疗可以在人体内进行等基本问题。最为典型的是生殖细胞基因治疗，它涉及平等问题和其他个人侵害问题，如优生主义、基因歧视等，各国对其一般都持反对态度。[8]就我国目前而言，可以通过法律规定临床医学基因治疗的基本范畴，同时规定设立相关伦理委员会进行协助管制。
2.治疗方案审核的立法
除了涉及相应的社会伦理问题，基因治疗还存在高风险且费用昂贵，如何权衡“受益/风险”的比例也相当重要。我国可以指定或成立相关机构或部门，进行临床基因治疗方案的严格审核。
3.规范化治疗方面的立法
临床基因治疗，从方案的选择、实施到最后的疗效评估等，都应严格按照一套规范化的程序进行。美国的基因治疗临床研究伦理审查已制度化。美国食品和药物管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)生物制品评估和研究中心(CBER)负责对基因治疗、细胞治疗的安全性和有效性的评价。美国国立卫生研究院下设的生物技术活动办公室(OBA)执行对基因治疗研究的监管。人体研究保护办公室侧重于对受试者的保护，而所有涉及人类受试者的临床试验都要接受地方伦理委员会审查。英国参与基因治疗监管和审查相关的政府部门包括医学和医疗产品管理局(MHPRA)、转基因作物(GMOs)科学咨询委员会、基因治疗咨询委员会(GTAC)、地方伦理委员会。[7]就我国而言，关于临床基因治疗规范化方面的立法，至少考虑以下几方面内容：首先，临床基因治疗资格的审查机制。基因治疗资格的获得必须通过严格审查，包括相关的治疗设施及人员配备是否达到必需的标准。其次，获得资格后的施行人必须严格按照标准的基因治疗方案进行治疗。现在可参照的是《人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点》以及《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》这两份文件，之后可随着基因治疗的日趋成熟作相应修改补充或专门立法规定。[15]再者，应当成立或指定相关部门对临床基因治疗规范化的实施进行不间断的监督和管制，及时发现并处理基因治疗过程中的问题。同时，还应追踪患者的治疗效果，作相应的评估分析。最后，应当建立基因治疗数据库。数据库的数据应准确详实，并配有相应的对照、评估以及传播信息的保护机制。[14]
4.侵权方面的立法
基因治疗的技术高难度性以及涉及相关社会伦理学问题等特点使得它在临床医学操作过程中更易发生医患矛盾。我国2010年7月开始施行的《侵权责任法》专设第七章规定医疗损害责任相关问题。基因治疗应用于临床医学，同样将涉及相关的侵权问题。一是隐私权。由于基因治疗的特殊性，基因治疗过程中患者的隐私权保护尤为重要。《侵权责任法》第六十二条是患者的隐私权保护相关规定，临床基因治疗在这方面的立法可参照此法并结合自身特点作相应补充。二是知情同意书的签订。除了《侵权责任法》第五十五条关于患者知情权的相关规定外，基因治疗作为一种特殊治疗，其知情同意书中还应详细阐述基因治疗实施单位和个人的资格及经历、基因治疗的详细过程及疗效、可能产生的各种风险、治疗费用等内容。由于基因治疗的复杂和难以理解性，还应指定或成立相关部门，如基因治疗专家咨询委员会等，帮助患者及家属真正了解基因治疗和知情同意书的内容再做出是否签订的决定，真正维护患者及其家属的利益。临床基因治疗在这方面的法律规定应该进行全面的考量。三是规范化治疗。《侵权责任法》第五十八条第一款规定，违反法律、行政法规、规章以及其他有关诊疗规范的规定导致患者有损害，推定医疗机构有过错。基因治疗作为一种高难度、高风险的治疗方案，施行规范化的保守治疗将更加安全，因此应该制定相应的法规进行管制。
5.对治疗方法本身保护的立法
基因治疗自身能否依法得到保护，尤其是能否通过被授予专利权得到保护，一直是全球争论的焦点。基于人道主义的考虑以及疾病治疗方法因人而异缺乏重复性的考虑，大多数国家对疾病治疗方法不予以专利保护。基因治疗属于疾病治疗的方法，所以目前大多数国家都同样不予以专利保护。[16]《欧洲专利公约》(EuropeanPatentConvention,EPC)对授予专利的要求是新颖性、实用性以及创造性，其中第52(4)条指出，通过外科手术等治疗和诊断人类或动物疾病的方法不符合其工业化实用性的要求，不应被授予专利。基因治疗作为一种疾病治疗方法，在欧洲同样不被授予专利保护。此外，其真正目的还在于保护公共利益，使公众避免花费昂贵的医疗服务费用。然而，并不是所有基因治疗相关的发明都被EPC排斥在专利保护范围之外。EPC为用于基因治疗方法的产品，特别是物质或其化学成分提供专利权保护，这些产品的新颖性可参照EPC第54(5)条规定确定。即使这些物质或化学成分以前就被人知晓，但只要作为一种治疗、手术或者诊断的方法第一次被发现，仍然可以被授予专利。[16]例如，在ADA-SCID基因治疗中，导入含有缺陷基因正确拷贝数的病毒颗粒到体内的治疗方法并不能被授予专利，但治疗过程中用的这种遗传学已发生改变的病毒可以被授予专利，这个病毒将被授予治疗ADA-SCID医学使用的专利保护，即使它之前已被授予别的非医学使用专利保护。专利法对于技术发展的推动作用不容小觑，生物技术也不例外。作为这个领域的领先者，美国和欧盟都不否认这个观点。根据美国专利法的规定，疾病治疗的方法包括基因治疗，是可以被授予专利保护的。这样势必促进本土对基因治疗的深入研究，最终在这一领域处于垄断地位。关于这一点，对基因治疗专利化保护限制的欧盟也已日益意识到来自美国的竞争压力，并且意识到自身的法律规定已经限制了本土在这一领域的发展，现已采取相关措施逐渐扩大对基因治疗的保护范围。我国专利法第二十五条明确规定，对“疾病的诊断和治疗方法”不授予专利权。因此，我国对基因治疗本身不应给予专利保护。然而，用于基因治疗的药物或器械等产品，则应该按照现行《专利法实施细则》等法律授予专利保护，以维护发明者的利益和刺激我国基因治疗的研究，从而促进我国基因治疗技术水平的发展。
基因治疗范文2
关键词：RNA干扰；小干扰RNA；基因沉默；肿瘤
中图分类号：Q522文献标识码：A文章编号：1672-979X(2009)01-0054-04
RNA Interference and Tumor Gene Therapy
JU Ji-yu, LI Zai-lian
(Department of Immunology, Weifang Medical University; Key Laboratory of Immunology in Universities of Shandong, Weifang 261042, China)
Abstract：RNA interference is a mechanism for controlling normal gene expression, which has been employed as a potential technology for a wide range of disorders such as tumors, infectious diseases and metabolic disorders. This paper reviews the discovery, mechanism of RNA interference and its application in tumor diagnosis and prevention, as well as some challenges.
Key words：RNA interference; small interfering RNA; gene silencing; tumor
基因治疗是一种特异性的治疗方法，可用在疾病早期。基因治疗一般是通过一定的技术把遗传物质转入细胞并永久改变细胞表型，例如通过替换变异的肿瘤抑制基因（如p53）、抑制基因转录、引入能编码治疗物质（如scFv）的新基因或者使特定的靶基因沉默（如反义技术）等。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是控制基因表达的特异有效方法。近年RNAi已成为研究根据基因功能合理设计药物的重要工具。本文现简要介绍RNAi的发展史和近来在肿瘤基因治疗中的应用。
1RNAi的发现及作用特点
1.1概述
RNAi是指小分子双链RNA抑制同源序列基因的表达，是生物进化过程中保留下来的机制。像反义技术一样，RNAi可以特异的抑制基因的表达。RNAi最早在秀丽新小杆线虫（C. elegans）中发现可以抵御外来基因的入侵。此后陆续在昆虫、植物、真菌和脊椎动物中也发现了该机制。
1.2干扰RNA的分类及作用特点
目前，已知具有功能作用的小分子干扰RNA主要包括小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）和Piwi-interacting RNA（piRNA）3类。
1.2.1siRNA的发现及作用机制1993年学者们发现秀丽新小杆线虫中微小RNA和反义互补RNA抑制基因的表达。1995年Guo等[1]用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫中par-1基因表达时发现，正义RNA和反义RNA均能阻抑基因功能表达，且两者的作用是相互独立的，机制也各不相同。1998年Fire等[2]首次发现双链RNA（dsRNA）能够特异性地抑制秀丽新小杆线虫的纹状肌细胞unc-22基因表达，dsRNA引起的基因沉默效应要比单用反义RNA或正义RNA强十几倍。注入秀丽新小杆线虫的性腺后，在其第一子代中也诱导出了同样基因的抑制现象，表明RNAi有可遗传性。此现象称为RNAi。因为RNAi作用发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默（PTGS）。1999年Hamilton等[3]在植物基因沉默研究中首次发现，21~25 核苷酸（nt）的dsRNA出现对转基因导致基因沉默十分重要，同时指出RNAi作用是由部分纯化的核酸酶中所含siRNA介导的。2000年首次在果蝇中发现，通过核糖核酸酶可将长的dsRNA处理为21～23 nt的短片段[4]。2001年，首次报道了哺乳动物细胞中也有RNAi。2002年证明了用短的发夹结构RNA（shRNA）在哺乳动物细胞中可以诱导特异性的基因沉默[5]。2003年首次用RNAi技术对模型动物进行了治疗研究[6]。
哺乳动物体内RNAi的作用机制与植物及果蝇等RNAi的机制相似，体外研究证实，RNAi是一个ATP依赖性的过程。首先，dsRNA通过细胞膜进入细胞，在胞质内的Dicer（一种序列特异性的核酸内切酶，属RNA酶家族III成员）的作用下，分解成21～22 nt；3’端带有2～3个末端突出碱基的dsRNA分子，这种小的dsRNA分子称为siRNA[7]。siRNA与Agonaute2等蛋白酶结合，形成由RNA介导的沉默复合物（RNA-induced silenceing complex，RISC）。RISC大约500 kb，在ATP供能的条件下，RISC可以把其携带的双链siRNA分子变成单链siRNA。含单链siRNA的RISC有活性，可与目的mRNA结合，导致其断裂、降解，从而导致目的基因沉默[8]。
1.2.2miRNA的发现和作用特点miRNA是一种内源性的非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA），由大约2l～23 nt组成单链RNA分子。miRNAs广泛存在于植物、线虫和人类细胞中，可能是一类进化上保守的、在生命中起重要调控作用的分子[9]。它们能有效地抑制相关蛋白质的合成，导致靶mRNA降解，或者以其他形式的调节机制抑制靶基因表达，产生基因沉默。Lin-4和Let-7是最早在秀丽新小杆线虫中发现的能时序性地调控胚胎后期发育的基因，这些基因编码一类长度约21 nt的小分子短暂RNA（small temporal RNA，stRNA）[10] 。后来，又相继在线虫、果蝇、HeLa细胞、拟南芥和水稻等许多真核模式生物和细胞中找到了几百个相似的小分子RNA，将其统称为miRNA，Lin-4和Let-7基因编码的stRNA则认为是miRNA的代表[11]。
与siRNA一样，miRNA也可以引发RNAi现象。在miRNA生成过程中，编码miRNA的基因首先转录产生几百至几千核苷酸的初级产物（pri-miRNA），在核内被核酸内切酶Drosha酶切割成约70 nt的发夹状前体（pre-miRNA）。pre-miRNA在Ran-GTP和转运蛋白Exportin-5的协同作用下转运出细胞核，经Dicer酶切割成约22 nt的成熟miRNA。成熟miRNA可通过两种机制调控靶基因表达：一种是和siRNA一样，与靶mRNA结合，促进其降解；另一种是结合到靶mRNA的3＇UTR部位抑制其翻译。如果miRNA与靶序列互补配对高则可能切割mRNA，配对低的可能只是抑制[12]。
1.2.3piRNA的发现2006年由4个独立的研究小组[13，14]在小鼠实验中分离得到一种能与piwi蛋白相互作用的小分子RNA，称为piRNA，由30 nt组成。piwi基因为Argonaute基因家族成员之一，科学家们推测，这类小分子RNA可能与动物体的发育和维持功能相关。实验结果表明，每个精母细胞或完整的细胞中大约含有100万个piRNA[13]。同时，经过克隆也观察到大量26～31 nt的小分子RNA。根据RNA的长度大小，piRNA可分为2种：第1种长29～31 nt，可以和MIWI蛋白连接；第2种长26～28 nt，可以率先与MILI蛋白结合。在成年小鼠体内，第1种比第2种含量高。但由于某些piRNA探针可以检测出30 nt和26 nt区带，所以2种piRNA均可形成相同的分化过程。利用cDNA末端快速扩增技术确定它们的5’端相同，而3’端相差2 nt。这2种piRNA是否发挥不同的作用有待进一步研究。
2在肿瘤学中的应用
最初RNAi在肿瘤学的应用主要是针对突变的肿瘤基因、增生、转位和病毒基因，阐明其功能以及和其它基因之间的相互联系。应用RNAi技术探索各种基因的功能及相互作用为筛选新的药物靶基因提供了便利。RNAi已用来加强现存药物如伊马替尼（imatinib）和雷帕霉素的作用，这是通过沉默抗性相关基因实现的[15]。当用siRNA抑制Prkdc基因（与DNA修复有关的基因）后，人成纤维细胞对射线的敏感性明显增强[16]。抗凋亡基因survivin被认为是诊断和治疗肿瘤的一个很有价值的基因，是RNAi治疗的候选基因[17]。融合癌基因BCR/ABL在人白血病细胞系中成功地被人工合成的siRNA抑制，不但减少了相应基因蛋白的表达，而且诱导靶细胞发生凋亡[18]。用RNAi方法抑制融合基因ALM1/MTG8可增强细胞因子驱动的淋巴母细胞在骨髓中分化。有趣的是，癌基因转录被抑制可以长达5 d。相似的情况是，用RNAi方法抑制培养的EWS/Fil肉瘤细胞癌基因表达可以使细胞生长减慢长达3周[19]。现在已有多种基因用于RNAi治疗肿瘤的研究，如bcl-2、fas、k-ras、myc、p53等。这一方法的前景依赖于siRNA或shRNA能否使癌基因转录沉默并带来相应的生物学效应[20]。
3RNAi所面临的问题
RNAi用于临床肿瘤治疗要解决两个问题，首先如何把有效的干扰RNA带到肿瘤细胞内，对特异性靶基因产生特异性的抑制作用；其次，如何避免RNAi带来的副作用。
3.1载体问题
以前的研究表明，血流中的siRNA或DNA很难通过细胞膜屏障和逃避内体溶酶体的降解作用[21]。为了提高siRNA的运载效率，学者们发展了很多病毒和非病毒运载体系，大大提高了运载siRNA的效率。如基于逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒的运载系统在体内外均实现了RNAi介导的基因沉默[22]。腺病毒由于基因在细胞内表达短暂，应用受到很大限制。逆转录病毒由于其复制过程中要经过DNA中间体过程，能把前病毒整合到宿主细胞基因组上，从而实现稳定表达。用表达siRNA的逆转录病毒加上一些调控元件可实现组织特异性基因沉默[23]。然而，逆转录病毒基因治疗的主要问题是插入变异的问题。腺相关病毒载体可以实现外源基因宿主基因组的定点整合，也可以实现外源基因的稳定表达，但纯化仍然是需要突破的一道障碍[24]。除了病毒载体以外，非病毒载体也用于肿瘤的基因治疗。如阳离子脂质体或聚乙醇胺均用作siRNA运载体。这些载体均已用作体内siRNA实验并在静脉给药或鼻内给药后实现了目的基因沉默。但是，这些载体在体内均表现出毒性和激发机体免疫应答的能力[25]。因此，需要改进这些载体和进一步寻找更加安全的载体。另外一种值得注意的载体是壳聚糖。壳聚糖是一种阳离子多糖，已广泛用于药物的运载，特别是DNA介导的基因治疗药物的运载。壳聚糖的胺带有正电荷，可与核酸上的磷酸形成聚合电解质络合物。而且，这种质子化的胺还有利于复合物与细胞膜结合并被内吞入细胞。现已证明，壳聚糖/siRNA微粒可在体内外介导基因沉默。而且，已证明壳聚糖是生物相容的、非致炎、非毒、可降解的材料。因此，壳聚糖/siRNA运载系统可能具有良好的发展前景[22]。
3.2脱靶效应
如果考虑将siRNA作为治疗药物，须考虑它的序列特异性和评估它的脱靶效应的危险性。例如，必需保证只有目的基因mRNA被降解而其它必需基因不受影响。siRNA产生脱靶效应主要基于以下3个方面：（1）由于shRNA和siRNA均含有dsRNA序列，因此它们可能会诱发机体的天然免疫应答，如干扰素应答。（2）转染或表达的siRNA可能会产生一些非特异性效应。（3）尽管设计的siRNA与目的基因互补，但也可能和非靶基因mRNA互补[26]。
研究表明，dsRNA的长度大于30 bp可以导致非特异性抑制基因表达，大部分是由于激活了dsRNA依赖性的蛋白激酶PRK和随后的磷酸化以及灭活eIF2a 所引起。RNA的长度（siRNA或shRNA）与此有关，即使11 bp的siRN段也可诱导微弱的干扰素应答。有些措施可以减轻干扰素应答，如减少转染siRNA的量，也可通过检测干扰素应答基因如寡腺苷合酶-1的方式预防干扰素应答发生[27]。除了干扰素应答外，另一个脱靶效应就是由于外源siRNA的导入使细胞内RNAi机制饱和，从而抑制内源性RNAi（miRNA）发挥作用，产生非特异性的毒性反应。这就要求在进行外源siRNA转染时尽可能减少外源siRNA的用量[27]。最近用基因芯片进行的研究表明，用RNAi方法抑制慢性髓性白血病细胞中BCR-ABL融合蛋白表达可启动细胞内其它沉默的癌基因、抗凋亡基因和细胞因子的表达[28]。因此，RNAi技术在真正应用到临床之前，需要更加严格的评估。
4展望
把RNAi技术从研究工具转变为治疗手段所遇到的主要问题是载体系统。我们需要更加特异、有效的运载系统，如可以特异性肿瘤靶向的载体或者带有肿瘤细胞特异性启动子的载体系统。由于RNAi主要与细胞胞浆成分作用，这是优于其它基因治疗方法之处。尽管摄取效率和稳定性是建立RNAi治疗方法所遇到的主要问题，但这一领域的飞速发展表明，也许在几年之后，我们就能找到较好的解决办法。
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基因治疗范文3
论文关键词：基因治疗,移植静脉,再狭窄
随着医疗水平的发展，像静脉移植等手术方法治疗包括冠状动脉在内的血管狭窄等疾病给病人生活带来新的希望，但术后通畅率逐年下降又给病人带来新的忧虑。目前对预防移植静脉再狭窄主要手段有放射、药物、物理治疗，虽然有一定成效，但效果还是不佳，随着生物科学技术的发展，人们将希望寄托于基因治疗。下面将对基因治疗中目的基因和载体的选择进展进行综述。
1.目的基因的种类静脉桥再狭窄主要机制就是内皮细胞的损伤；血栓形成；平滑肌细胞的迁移和增殖。这为我们目的基因的选择提供依据。
1.1促进内皮细胞修复的基因。
1.1.1内皮型一氧化氮合酶(eNOS)一氧化氮（NO）是体内重要的生物信使分子和效应分子，它具有抑制vsmc增殖、迁移，抑制血小板聚集等功能。而eNOS是NO合成的关键酶，通过将eNOS基因局部转移，是防止移植血管狭窄的有效手段。王晓明等通过给静脉桥转染带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒，再旁路移植到动脉后得出其加速内皮细胞再生、抑制血栓形成，进而抑制内膜增生。
1.1.2血管内皮生长因子(VEGF)VEGF能高效的刺激内皮细胞的增殖，使损伤的内皮尽快得到修复，也可以间接抑制血管平滑肌细胞迁移和增殖。VEGF165是最主要的异构体，是其生物学作用的主要形式，也是目前的基因治疗中主要选用的异构体。有研究表明通过腺病毒介导的VEGF过度表达可以使球囊损伤的动脉内皮细胞再生，抑制血管内膜增殖。
1.1.3肝细胞生长因子(HGF):HGF是一种间质细胞衍生的多功能细胞因子，能刺激血管内皮细胞分裂和增殖,促进血管内皮细胞损伤的修复，但不引起VSMC的增殖。有研究表明转染HGF基因可增强球囊损伤后血管内皮组细胞的功能，有效抑制损伤血管的狭窄。
1.2抗血栓形成的基因。
1.2.1组织因子途径抑制物(TFPI)TFPI是相对稳定的糖蛋白，是广谱的Kunitz类型丝氨酸蛋白酶抑制物，其具有很强的抗凝作用。有研究表明通过腺病毒介导TFPI基因局部转染可以显著抑制PICA术后血栓形成和内膜增厚，主要是通过促进血管平滑肌细胞（VSMC）凋亡而抑制血管的狭窄的。
1.2.2组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)t-PA纤溶酶原激活剂主要物质之一，主要有血管内皮细胞合成。其主要功能就是裂解纤溶酶原肽键，形成具有活性的纤溶酶。Ross报道t-PA减少能使经皮冠状动脉成形术(PTcA)后血管狭窄,可见t-PA在预防血管狭窄中起到比较重要的作用。t-PA不仅能预防血管狭窄，有项研究也表明tPA基因逆转录病毒载体直接注入介入手术后再狭窄动物模型的血管壁可以减轻狭窄面积，甚至能达到30%。
1.3抑制VSMC增殖迁移的基因。
自体移植静脉再狭窄的主要病理特征为内膜显著增厚。增厚内膜主要是由血管平滑肌细胞增殖、迁移等因素形成，其中有很多调节步骤参与当中。这为我们抑制VSMC增殖、迁移提供许多候选基因。单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）是一种能使无活性的核昔类似物轻甲基无环鸟苷转化为磷酸化的细胞毒性形式，诱导DNA链合成中止引起细胞死亡。实验研究表明HSV-tk基因能抑制新生内膜形成、降低内膜面积与中膜面积的比值(I：M)。FAS是一种凋亡受体，在VSMC中表达较多，当FAS配体在血管壁上表达也可以降低新生内膜的形成。抗细胞迁移金属基质蛋白酶(MMPs)基因在VSMC的迁移中有十分重要的作用,组织型金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)及其同家族成员都有显著减低I:M比例.
1.4联合基因治疗
由于预防移植静脉狭窄干预靶点太多,而谁是关键基因尚未确定,又加上单一靶点效果并不理想,于是有人联合多个基因进行干预,证明比单一基因干预更有效。Gunn等用C-myb的反义核酸得出能抑制猪经皮冠状动脉成形术后的内膜增生.VanBelle等在兔股动脉上给予VEGF165质粒可以加速内皮化,减少附壁血栓和新生内膜形成。张铁民等实验显示,反义寡核苷酸与VEGF联合应用较两者单用更能显著预防再狭窄。
2.载体的种类为了获得一个好的临床治疗效果，载体的选择是重要的一步。载体就是将目的基因导入特殊部位的工具，通常分为病毒载体和非病毒载体，它们各有自己的优缺点。
2.1病毒载体的种类
2.1.1腺病毒载体腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒，目前的腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础。腺病毒主要优点有转染细胞广泛、携带的DNA量大、感染效率高、重组病毒滴度高、不整合到宿主细胞、理化性质稳定等。以腺病毒介导的基因治疗预防血管狭窄的研究层出不穷。体内转基因表达时间短暂、病毒基因表达的产物引起的毒性反应限制腺病毒这个载体的应用。正因如此，对腺病毒载体的改进正在进行，如经RGD-4C整合素靶向多肽改良后的腺病毒在静脉桥中有更好的转染能力
2.1.2腺相关病毒载体（rAAV）rAAV源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一。
通用的AAV载体都是基于血清型2，即AAV2。因为rAAV感染效率低、制备成本高且只能包装小于4.7kb的基因序列而在基因治疗中受到限制。
2.1.3慢病毒载体慢病毒载体（LVs）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系。LVs具有免疫原性低、整合到细胞上长期表达、可感染非分裂期与分裂期细胞等优点.已有研究表明慢病毒载体应用于球囊损伤致血管狭窄研究的可行性。但慢病毒仍具有潜在的产生复制型慢病毒（RCL）和致癌的风险，相关的研究还是有待加强。
2.2非病毒载体非病毒载体是通过哺乳细胞摄取和细胞间转运大分子物质的机制来把目的基因转入靶器官。虽然非病毒载体具有安全、易得、无免疫源性等优点，但是他们基本上转染效率不高，因此早期在基因治疗研究中没有太高的地位。随着技术的进步，非病毒载体在基因治疗载体选择上占有一定份额，尤其表现在纳米粒子、超声微泡载体上。
2.2.1超声微泡载体：它的作用原理是通过超声的物理效应使细胞膜上产生可逆的小孔，借助此孔外源性物质进入细胞内。Taniyama等通过超声微泡载体将p53的cDNA转入球囊损伤大鼠颈动脉，得出血管内膜和中膜面积的比值显著降低。虽然超声微泡靶向释放技术的靶向性及无创性的优点已达到大部分实验的认可，但其转染效率不高仍是需要大力研究的。
2.2.2纳米粒子：它是现在研究比较热门一种非病毒载体，主要是可以使被包裹的目的基因免受水解酶的降解，将目的基因运载到血管平滑肌上，达到治疗疾病的目的。胡新华等通过纳米粒子介导的反义雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因抑制移植静脉内膜增生得出纳米粒子在血管狭窄治疗中是可行的。现在用的纳米粒子主要是PLGA，它有很好的组织相容性，产物没有任何毒性。
3.总结和展望
这些年来尽管科研及医务工作者在移植静脉获取技术、药物防治、应用血管外支架和放射治疗等方面做了大量的工作并在预防移植静脉再狭窄上取得一定成效，但是总体效果还是不理想。移植后的静脉因为内皮细胞损伤、炎性细胞浸润、平滑肌细胞迁移增殖、细胞外基质增加等一系列病理改变导致移植静脉再狭窄。随着分子生物学技术的发展，安全、高效的载体出现、多基因联合等综合治疗必将能有效预防血管再狭窄。
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基因治疗范文4
用于传递药物的磁性纳米粒子直径通常为5-20nm，这些晶体一般是铁的，最常见的是磁铁或磁赤铁。有几种方法合成这些晶体，最常用的是共沉淀Fe（III）和Fe（II）。磁性纳米粒子与被传递的基因和药物混合封装以促进细胞吸收。用于磁性纳米技术的有聚合物、病毒和非病毒，此外，还有形成这些复合物的输水相互作用和静电作用。由于要靶向体内，被处理的纳米复合物通过静脉注射、动脉注射或腹腔内注射，用一个外部磁场（通常用一个小的稀土磁体）附近的目标区域以创造一个局部磁场。随着药物在血液中流动，磁场对带药的磁性纳米粒子产生作用，驱动它们分布到目标组织中。与其它传递方法相比，磁性纳米粒子对药物的传递有许多优势，它显示出了外部磁场的反应，相对安全，用途更广。磁性纳米粒子被批准应用于临床作为磁共振成像的造影剂已有十多年了，因此，是一种能根据病人安全性来被更好理解的纳米技术。此外，磁性纳米粒子与现有药物具有广泛的兼容性，能被用于有效传递各种各样的治疗药物。
2使用磁性纳米粒子的体内基因靶向传递
磁性靶向传递技术是1978年被首次提出来的,这种方法类似于药物传递，对治疗基因的传递有着巨大的潜力，尽管该技术的应用必须适应核酸分子的大小和电荷数。有趣的是，磁性传递为解决当前基因治疗中的有效传递问题提供了很大的可能性。例如，将磁性纳米粒子与基因载体混合，治疗基因通过外部磁场被选择性地输送到肿瘤部位，增加了治疗基因的浓度，同时也减少了治疗基因在身体其它部位的停留。
2.1局部给药系统临床试验中肿瘤靶向给药一直是在肿瘤内或肿瘤附近注射给药，磁转染在肿瘤局部给药中有两个可能的优势：第一、它能增加注射部位细胞对药物的吸收和滞留；Bhattarai等人通过直接在空肠和气管内注射的方法向体内传递经过修饰的腺病毒载体表达结合了磁性纳米粒子的LacZ基因，发现在磁性组中的肺部和空肠内β-半乳糖苷酶的活性明显高于对照组。这表明在外部磁场下基因的滞留和表达都有所增强。虽然这种方法可能不适用于非侵入性肿瘤的治疗，但也显示了磁转染有提高注射基因在肿瘤内的滞留效果的可能。在局部传递中磁转染的另一个优势就是对肿瘤的穿透性。目前的传递方法不能有效的将治疗基因传递到肿瘤块的所有区域，尤其是低氧中心，部分是由于许多肿瘤内部有复杂的脉管系统。另外，这被认为是一个进步，考虑到耐药性的问题。已证明磁转染粒子的局部传递能增加靶组织内的基因积累和基因对肿瘤内较小动脉的穿透力。Krotz等人采用靶向提睾肌的股动脉注射带有荧光标记的寡聚脱氧核苷酸后发现磁性组的荧光强度增加，此外，在较小动脉内有很强的荧光。较小动脉内的荧光增强显示磁靶向能增加基因和药物的组织渗透性，说明了这种方法可能会增加经血液传递给肿瘤组织的基因和药物的渗透力。
2.2全身给药系统全身给药系统是研发新的传递技术的最终目标，因为它能被广泛的应用于各种临床适应症，也方便治疗。此外，小鼠的人类肿瘤移植模型提供了一种在活体内测试靶向给药以及在外部控制磁转染的简单方法。尽管人类移植肿瘤能提供宝贵的信息，便于深入了解全身给药系统的效果，但是这些模型可能大大低估了在病人体内靶向给药的复杂性。迄今，已被验证的磁转染作为活体内癌症治疗最有前途的应用是在人类肿瘤移植的小鼠模型中。用磁性纳米粒子-脂质体复合物传递荧光素酶质粒，Namiki等人发现外部有磁铁并经过纳米粒子处理的动物组有很强的荧光素酶活性，传递相同剂量基因的其他的对照组却没有明显的表达。这个结果在肿瘤组织匀浆中的二次试验得到证实，那个实验是用siRNA干扰磁性组中的EGF受体，而在非磁性组中没用siRNA。与有外部磁铁靶向的控制组相比，对照组中肿瘤块EGF受体的siRNA传递减少了50%。还有一项研究也显示了不同的纳米复合物组分与疗效之间的差异。相比于之前使用的磁性复合物，新配方在非目标器官中siRNA的积累量减少10倍，提出增加配方的选择性可以提高对器官的靶向性。这可能是由于新配方的尺寸较小的缘故。总之，这些结果都是磁转染具有明确疗效强有力的证据，除了用传递报告基因来证实外。单核细胞由于其具有与肿瘤细胞天然的亲和力，也被用来作为癌症治疗的基因载体。一种方法是先将单核细胞在体外转染，再经过血液注射将治疗基因传递到肿瘤组织。这种方法虽然避免了非内源性载体引起的组织毒性，但问题一直是没有靶向足够数目的肿瘤细胞。Muthana等人最新的研究检查了传递磁性纳米粒子基因的单核细胞在肿瘤组织中的生长能力。作者发现磁性组中16.9±4.2%的肿瘤细胞表达GFP，而在非磁性组中肿瘤细胞GFP的表达大量增加，增量超过4.9±3.5%。没有数据显示这是否会导致单核细胞在肝脏中的减少，这项研究也没有显示任何治疗效果，它传递的是一个标志基因，它证明了磁性纳米粒子能被用于改善细胞作为基因载体的功能。
3小结与展望
基因治疗范文5
1基因治疗的途径和常用载体
基因治疗技术，一种新的治疗策略在口腔再生医学领域中的应用发展迅速。基因治疗通常采用两种途径，体外间接基因治疗(ex vivo)和体内直接基因治疗(in vivo) [3,6]。无论间接还是直接基因转移都需要借助载体才能将外源基因转入靶细胞内。目前载体系统主要分为病毒和非病毒两种[3]，常用的病毒载体有腺病毒（AV），腺相关病毒（AAV），逆转录病毒（RV，包括慢病毒载体），单纯疱疹病毒（HSV），杂合病毒等[7-9]。非病毒性载体有裸DNA、脂质体与脂质体复合物、纳米颗粒等[3]。
2基因治疗在口腔再生医学中的应用
2.1 颌面骨组织再生：用于治疗颌骨缺损的靶基因很多，作用机制和环节不尽相同，目前的研究主要集中于骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)基因。Park等[10]应用脂质体和腺病毒载体分别将BMP-2基因导入大鼠骨髓基质细胞(BMSC，bone marrow stromal cells)，比较了两种载体的体外、体内成骨能力。体外实验结果显示腺病毒组的转染效率是脂质体组的两倍。当将基因修饰细胞复合明胶海绵植入大鼠下颌骨的骨缺损区，BMP-2可以在体内表达2 周以上，促进了下颌骨骨缺损的修复，其中腺病毒组4周后骨缺损几乎完全愈合，而脂质体组相对新骨形成速度较慢，6周后骨缺损基本愈合，阴性对照组8周时仍未见骨愈合。Zhao等[11]用腺病毒介导的BMP-2转染BMSC细胞，结合磷酸三钙支架材料可以修复下颌骨的缺损，获得矿化密度较高的新生骨。Chang等[12]应用腺病毒载体携带BMP-2，体外修饰BMSC，并植入小型猪的上颌骨缺损区，实验组的骨缺损在3个月后完全修复，组织学观察显示新生骨为成熟的编织骨且钙化良好。近期，Ke等[8]应用安全性较好的AAV病毒载体介导BMP-2体外修饰BMSC，并将其植入兔子的上颌骨缺损，颌骨缺损的修复能力显著提高。Ashinoff等[13]研究通过腺病毒介导的BMP-2 对大鼠下颌骨牵张成骨的影响。实验结果表明，实验组在牵张成骨部位新骨形成量显著增加。
BMP基因治疗在促进颌骨组织再生中的应用非常广泛，近来也有一些研究报道了其他治疗基因的应用，例如碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor， bFGF），音波刺猬因子（sonic hedgehog，SHH）等。Jiang等[14]将腺病毒介导的bFGF基因修饰的骨髓基质干细胞移植入兔子下颌骨牵张成骨区域，可以有效地促进更多的新骨形成。Edward等[15]将逆转录病毒介导的Shh修饰的三种细胞(牙龈纤维细胞、间充质干细胞、脂肪来源细胞)复合I型胶原植入兔的颅骨缺损处，6周后通过X线片、组织学观察，骨组织缺损区域几乎完全修复，同时机体没有出现任何不良反应。
颌骨的生长调控需要多因子的协同作用，多个治疗基因的联合应用也取得了一定进展。Koh等[16]的研究证实通过基因治疗的同时表达两种成骨因子BMP2和BMP7，表现出了更强的骨组织再生能力。通过X线片，Micro CT和组织学切片进行检测，4周后 BMP2和BMP7的联合基因转染组，其成骨能力显著高于单个基因转染组，表现为颅骨缺损区域几乎完全修复，甚至个别缺损区的成骨量更致密，显著高于阴性对照组。另外，将促血管生成因子与成骨因子联合应用，可以更好地协同促进颌骨组织再生。Peng等[17]的研究表明单独应用VEGF并不能促进骨的再生，但是将VEGF和BMP4基因共同修饰MDSC，并与明胶海绵共同植入小鼠的颅骨缺损区域后，血管新生和新骨形成能力显著增强。
2.2 颞下颌关节组织再生：颞下颌关节的组织工程需要促进功能性骨和软骨组织再生，并需要建立适当的骨-软骨交界区。 Schek等[18-19]将分化的猪软骨细胞和Ad.BMP7基因修饰的人牙龈纤维细胞复合到生物支架中，并将复合物移植到免疫缺陷小鼠的皮下，4周后构建了一种骨-软骨组织，包括血管化骨，成熟的软骨以及清晰的矿化界面。另一项研究进展是将基因直接导入下颌髁突，1999年，Kuboki等[20]用腺病毒载体携带B-半乳糖苷酶基因直接体内法注射到豚鼠颞下颌关节上腔，4周后发现，关节软骨表面和滑膜均有B-半乳糖苷酶的稳定表达，从而证明了腺病毒介导基因治疗颞下颌关节疾病的可行性。Rabie等[21] 用AAV病毒载体介导了治疗基因VEGF感染了大鼠的髁突组织，体内试验证明VEGF的表达增强，促进了下颌髁突的软骨内成骨进程。Li等[22]用AAV病毒载体携带Vastatin基因，局部注射到颞下颌关节后区，进一步证明转基因不仅表达在髁突软骨，而且在关节盘和关节窝都有持续的表达。这些研究为生理性骨-软骨结构的构建以及TMJ局部基因治疗的应用前景提供了实验依据。
2.3 牙周组织再生：牙周病造成牙周支持组织破坏及牙周附着丧失，是导致牙齿缺失的最主要原因。牙周病治疗的目的不仅在于控制炎症，更在于使已经破坏的牙周组织再生以形成新附着。牙周组织再生包括因炎症破坏吸收的硬组织(牙槽骨与牙骨质)和软组织(牙周膜与牙龈)。Jin等[23]将携带血小板衍生生长因子-B（plateletderived growth factor-B，PDGF-B）的腺病毒直接注射于牙周缺损处，结果显示，病毒感染组牙槽骨的修复4倍于对照组，而牙骨质的修复则6倍于对照组，提示应用PDGF- B 基因治疗可以促进牙周的修复潜能。Chang等[24]的进一步研究证实在牙周骨缺损处直接局部注射腺病毒介导的PDGF-B 是安全可靠的，没有发现治疗引起的机体不良反应。尽管2周内在缺损局部可以检测到病毒载体的DNA, 随着时间的推移病毒载体的量逐渐衰减。可见PDGF-B基因转染可有效地促进细胞增殖和缺损的充填，证实了基因转入牙周细胞可以为牙周再生提供一个便捷的途径。
2.4 牙体组织再生：牙再生的研究是口腔再生医学研究中最为活跃的领域。Rutherford等[25]采用了体外间接基因转染方式，将携带BMP-7的腺病毒载体感染培养的成体纤维细胞，然后将修饰后的细胞与胶原复合植入白鼬炎性牙髓组织中，研究发现BMP-7的基因转染促进了修复性牙本质的形成。Nakashima等[26-27]用电穿孔（Electroporation）的方法将分化因子（Gdf1）转染到培养的小鼠牙髓细胞中可以在体外促进其向成牙本质细胞转化。Nakashima等[28]又用超声波的方法转染Gdf1，发现它还可以促进犬的自体牙髓干细胞分化为成牙本质细胞，同时在犬的模型上修复性牙本质的形成增加，其中管状牙本质的再生最为明显。可见，通过转染特异性基因和生长因子进入成体牙细胞，为促进组织工程牙的形态发生提供了新的思路。
3基因治疗的前景展望
成功的基因治疗必须包括选择适当的治疗基因、适当的转导，使其在体内获得安全、持续和可调控的表达。口腔再生医学领域的基因治疗，虽然在动物试验上取得了一些初步经验，但是离真正的临床推广应用还有相当长的一段距离。将来的研究将着眼于以下几个方面：①对于目的基因，仍需进一步明确何种基因或多种基因的联合应用；②选择与构建一个安全、高效、可调控的甚至是具有组织特异性的靶向基因载体仍是基因治疗面临的重要问题；③在基因转导方法上仍需决定最佳基因载体或者靶细胞的数量、最佳转入体内的时机，以及减少不良反应以达到最佳治疗效果。随着现代分子生物技术日趋成熟和基因工程研究的深入，相信这些问题在不远的将来都会得到解决。
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基因治疗范文6
椎间盘退变性疾病(disc degeneration disease，DDD)是一种发病率及致残率极高的疾病，常引起以颈肩腰腿疼痛为主要表现的临床症候群，据资料表明，DDD患者占美国骨科住院人数的1/3以上，目前对DDD的常规治疗方法包括药物治疗、理疗、卧床休息、类固醇注射封闭以及手术治疗等。但是，这些措施仅能够改善疾病的临床症状，并不能从根本上减缓或终止退变的进程。因此，进一步研究椎间盘退变的发生机制，试图从分子水平上对椎间盘退变进行调控，从而对椎间盘退变进行治疗是非常有价值的。以往对DDD发生机制的研究主要集中在椎间盘的生物力学改变、椎间盘的自身免疫因素、炎症反应、细胞凋亡失衡及椎间盘的营养障碍等几方面。近期的研究显示，Sox家族的Sox9基因很可能与椎间盘退变有着密切的关系，现将其相关研究情况作一综述。
1椎间盘退变与胶原改变
椎间盘内含有大量的胶原，其中Ⅰ、Ⅱ型胶原是最主要的胶原，约占总量的80%，其次是Ⅵ型胶原，占10%~20%。在正常情况下，Ⅰ型胶原主要存在于外层纤维环，Ⅱ型胶原则主要分布在髓核和软骨终板。Ⅱ型胶原，在椎间盘中央含量最高，到边缘则逐渐减少，而Ⅰ型胶原则刚好相反。而且胶原在椎间盘内的分布情况并不随年龄的增长而改变。但是，随着椎间盘的退变，胶原的构成情况却发生了变化。在退变的早期，正常类型的胶原在它们的分布范围有增加的趋势，提示在退变早期椎间盘存在一过性修复反应，这一点已经在核中软骨细胞的Ⅱ型胶原mRNA增强表达得到证实［1］。髓核中，Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅵ型胶原含量也有增加，Ⅰ型胶原在纤维环中也呈增加趋势。随退变程度的加重，胶原的性质发生了改变，Ⅰ型胶原开始出现在髓核中，软骨终板丧失了Ⅱ型胶原的表达。Ⅳ型和Ⅹ型胶原也在髓核中出现，胶原成分的改变说明髓核内软骨样细胞表型发生变化，可能失去了软骨特征而出现骨化现象。最后，胶原的翻译后修饰出现非酶糖化或脂质过氧化作用，交联增加。以上种种变化最终导致椎间盘细胞外环境的破坏，椎间盘的弹性和膨胀时的抵抗力减弱，这种改变极难自行修复。
2Sox家族及Sox9基因
1990年，Berta等［2］在人类和小鼠中克隆了决定因子SRY基因，人们发现SRY基因产物含有的一个保守区与一种染色体蛋白HMG-1和HMG-2中的DNA结合基序非常相似。HMG框是一个长约79个氨基酸的DNA结合基序，根据该HMG框的保守性，由此命名了编码一类新的转录因子的基因家族，称为Sox家族，该家族特点为其所编码的蛋白质与HMG框有60%同源性。2000年，Girard等［3］人利用已经克隆的Sox基因全长序列和大量的完整的HMG基序对Sox基因家族的分类进行了详细的研究，他们提出Sox基因家族可以分为A~J十个亚族。同一亚族内不同基因间在HMG基序内的相似性在80%以上；不同亚族间的相似性就低于这个数字。另外，同一亚族中同一Sox基因在脊椎动物中不仅在HMG基序区存在同源性而且在其他区也存在较大的相似民生。在哺乳动物发育过程中，Sox基因在广泛范围内表达。Sox1，Sox2，Sox3，Sox9和Sox11在神经组织中主同水平表达；Sox9在软骨组织中和性腺中表达；Sox2亦在鸡胚胎的晶状体和肠的表皮细胞中表达。
Sox9基因是Sox基因家族成员之一，1994年，Zanaria等［4］克隆了Sox9基因，发现它与SRY的HMG框区域的同源性大于60%，基因定位于染色体17q24Ⅱ~25Ⅰ区段内，在男性的发育中与SRY基因相同，作为转录因子而调控其下游基因的表达。SRY基因并不是直接调节的发育而是通过Sox9共同作用才发生作用。Foster等［5］将从三个独立文库中分离得到的cDNA克隆序列组装出Sox9的复合转录单位，其长度为3934 bp，Sox9基因具有一个开放阅读框架（ORF），该框架能够编码509个氨基酸，其中104~182位的79个氨基酸残基编码HMG盒，与SRY基因的HMG盒编码序列同源性高达71%；除此之外，在其所编码的Sox9蛋白C端约1/3处有一富含脯氨酸、谷氨酰胺和丝氨酸的区域，该区域类似于某些转达录因子的反式激活域（transactivation/transcription activation domain，TA域），这一非酸性区域在进化上相当保守，很可能Sox9蛋白因含有HMG盒样DNA结合基序及该TA域而具有转录因子活性。
3Sox9基因与椎间盘退变
椎间盘的退变与其内部的细胞外基质的改变有密切的联系。椎间盘的细胞外基质主要由抵抗张力的胶原和抵抗压力的蛋白多糖共同组成，而细胞外基质的稳定是椎间盘结构和功能的基础。因此椎间盘内胶原变化，包括胶原的成分和构象改变必将影响椎间盘的生物学性质，并且更易造成椎间盘退变［6、7］。Nerlich［8］和Ahsan等［9］的研究发现，随着年龄的增加，椎间盘髓核中胶原的类型发生变化，最初为Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ型胶原的增加，随后为Ⅱ型胶原的丧失；椎间盘内蛋白聚糖含量逐渐下降，呈聚集状态的蛋白聚糖下降尤为明显，非聚集蛋白聚糖比例相对增加，这种变化在髓核更为显著。同时，伴随蛋白聚糖的下降，含水量明显降低。Oegema等［10］发现，间盘退变后，椎间盘细胞产生的基质金属蛋白酶（matrix metallporoteinases，MMPs）增多，抑制了基质合成。其它的研究结果还显示［11］，椎间盘的退变过程是由于细胞因子的减少和致炎因子的增多，导致MMPs活性增加，椎间盘软骨样细胞分泌蛋白聚糖和Ⅰ、Ⅱ型胶原能力下降、降解加速。进而使椎间盘软骨样细胞赖以生存的细胞外环境被破坏，髓核内水分丧失，不能维持椎间盘内应有的张力，加剧细胞退变，并且这种改变很难自行修复。有资料显示Sox9、Ⅱ型胶原、aggrecan是最主要的三种软骨细胞因子［12~14］，并且Sox9被当作Ⅱ型胶原mRNA转录中的正向操纵了［15~17］；Sive等［18］用原位杂交方法分析了正常与退变椎间盘内Sox9、Ⅱ型胶原和蛋白多糖三种软骨因子的表达状况，发现在退变的椎间盘的髓核与纤维环中Sox9与Ⅱ型胶原mRNA的表达明显降低。通过免疫定位分析方法发现椎间盘纤维环组织中Sox9的表达水平与年龄呈反比［19］。Paul等［20］在体外实验中发现Sox9腺病毒载体能够增加细胞内Sox9与Ⅱ型胶原的表达。同时在纤维环穿刺法制备的兔椎间盘退变的病理模型中注射重组腺病毒载体，发现注射Sox9腺病毒的椎间盘与注射病毒对照组相比仍能维持更好的软骨细胞表型。有学者更进一步的对不同时期椎间盘（包括新生儿椎间盘，正常椎间盘，退变各个时期椎间盘）应用RT-PCR、Westernblot和免疫组化方法检测髓核中Sox9、Ⅱ型胶原基因的表达，并分析两者的相关性，发现Sox9 mRNA在椎间盘髓核细胞中的表达从新生儿到严重的椎间盘退变的病人逐渐降低，且它在人的椎间盘退变过程中也有表达，从新生儿到严重退变的椎间盘细胞中，Ⅱ型胶原下降的幅度与Sox9降低的幅度基本一致，这表明椎间盘退变的发生一定与Sox9的表达降低有关系，Sox9在正向调控Ⅱ型胶原的合成方面发挥了重要的作用。另外，1993年，Tommerup等［21］通过对染色体易位断裂点定位作图，提出17号染色体短民Sox9如果发生突变，就可以导致躯干发育异常（campomelic dysplasia，CD）。CD是一种罕见的可致死先天性软骨骼发育异常综合征（国外报道发病率为05~1/10万），其典型病状是先天弓形和长骨扭曲，常合并四肢骨骼异常如先天性脊柱裂、多趾畸形和软骨形成障碍，患者常因呼吸衰竭而死于出生后的第一个月内，因为疾病的严重程度不一，极少数病人能活到成年。Lefebrve等［22］亦推测在CD患者中Sox9基因活性的降低将抑制Ⅱ型胶原的产生而导致严重的骨骼发育障碍。昆士兰大学的Wright等认为小鼠中的一种“短尾突变”实际上代表一种潜在的CD模式，Sox9是“短尾”鼠中有缺陷的基因，虽然不表现性反转，但这些小鼠应当也还有一系列其它骨骼发育上的异常。目前可引起椎间盘退变的各种因素恰恰也是可以诱发Sox9基因突变的因素，因此我们有理由怀疑，在椎间盘退变过程中，很可能也象“短尾突变”或“CD”一样，存在Sox9基因的突变。或者即使没有Sox9基因编码序列上的突变，也可能存在调控方面的缺陷。这些都十分值得我们进行更深入的研究探索。
4Sox9对Ⅱ型胶原的调控机制
虽然，当前已经确认Sox9是Ⅱ型胶原合成过程中的一个重要的转录因子，且其在软骨的发育、成熟过程中对Ⅱ型胶原的正向调控作用已十分明确，但其中确切的调控机制是什么呢？亦即Sox9是通过什么机制正向调控二型胶原蛋白表达呢？Lefebvre V等［22］在研究中发现，Ⅱ型胶原基因（Co12al）的内含子Ⅰ中一个最小的DNA元件引起了转基因小鼠中软骨特异性细胞的表达，并发现该元件在瞬时细胞转染实验中也是一个软骨细胞特异性的强增强子。Co12al的表达与软骨细胞中所表达的高水平Sox9 RNA和Sox9蛋白密切相关，实验证实这个最小的Co12al增强子是Sox9作用的靶序列，Sox9直接结合到这个最小的Co12al增强子的一段序列上并将该软骨细胞增强子激活，共转染实验中发现，在非软骨细胞中，Sox9也是作为一个有效地增强子激活剂而发挥作用。Lefebvre V设计出该增强子的突变体，使其不能与Sox9相结合，结果发现软骨细胞中增强子的活性消失，共转染的非软骨细胞中由Sox9引起的增强子的激活亦受到抑制。Lefebvre V将Sox9蛋白截短，去除其反式激活域（transactivation domain，TA域）部分但保留其与DNA结合能力，发现与全长的Sox9蛋白相比，增强子的活性受到了明显的抑制。以上试验结果强烈的表明Sox9参与了软骨细胞中Co12al的细胞特异性激活作用以及Ⅱ型胶原合成的调控，且其调控机制是通过Sox9蛋白的DNA结合域与Co12al增强子直接结合而发挥作用，而Sox家族的其他成员对该增强子并无激活作用。除了与DNA直接结合，Sox9是否还通过其他的方式（如信号通路等）调控Ⅱ型胶原的表达呢？目前并无相关报道。
总之，椎间盘退变的基因治疗正处于早期的实验阶段，对Sox9基因在椎间盘退变中作用和机制的研究亦刚刚展开。随着分子生物学技术的发展和对椎间盘退变的生物学机理研究的不断深入，相信Sox9基因终将广泛应用到椎间盘退变的临床治疗中。
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