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香囊暗解范文1
[关键词] 氨基葡萄糖；兔；膝关节；细胞凋亡；实验研究
[中图分类号] R684.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）05（c）-0010-04
口服硫酸氨基葡萄糖治疗膝关节骨关节炎（osteoarthritis of the knee，简称膝OA）在我国较为普遍，欧洲风湿病协会和国际骨关节炎研究协会治疗膝关节骨性关节炎亦推荐应用硫酸氨基葡萄糖[1-2]，然而也有国外学者认为“很少有证据表明，氨基葡萄糖能促进关节软骨功能恢复”[3]。为观察其作用效果，本试验通过膝OA动物模型实验，从细胞组织形态学探讨硫酸氨基葡萄糖胶囊对兔膝关节软骨细胞凋亡的影响，进而初步评价硫酸氨基葡萄糖胶囊在膝OA防治中可能发挥的作用，为临床治疗提供参考和理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
6月龄雌性新西兰兔30只，体重2.5～3.0 kg，由广西中医药大学实验动物中心提供[实验动物使用许可证SYXK（桂）2003-0001]。
1.1.2 实验仪器
脱水机（ASP300S型，德国Leica公司）；包埋机（EG1160型，德国Leica公司）；光学显微镜（CX31型，日本OLYMPUS公司）；切片机（RM2235型，德国Leica公司）；漂片、烤片机（CS-Ⅲ型，孝感亚鹏公司）；图文分析系统（HMIAS-2000型，武汉千屏医学影像技术有限责任公司）。
1.1.3 实验药品
硫酸氨基葡萄糖胶囊，规格每粒0.314 g（浙江海正药业股份有限公司，国药准字H20041316），TUNEL试剂盒（美国罗氏公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组
随机分为硫酸氨基葡萄糖胶囊（简称药物组）、模型对照组（简称对照组）、正常组共三组，每组10只动物。
1.2.2 造模
药物组、对照组共20只兔均使用1%戊巴比妥钠3 mL/kg，兔耳缘静脉注射，参照改良Huith法的造模方法，于无菌条件下切断兔右膝内侧副韧带、前后交叉韧带及切除内侧半月板，缝合伤口，无菌敷料复盖，术后连用3 d青霉素钠（每天5万U/kg）、链霉素（每天10万U/kg）。术后1周始躯赶兔子每天行走2次，共30 min，连续4周。
1.2.3 给药
根据Meeh-Rubner公式计算，药物组给予硫酸氨基葡萄糖胶囊每只0.628 g/d，用生理盐水配成30 mL液体灌喂，连用8周；对照组和正常组每日30 mL生理盐水灌喂，连用8周。所有动物单笼饲养，饲养至4周时药物组、对照组各有1只兔子死亡，正常组有3只兔子死亡，予以剔除。造模后12周末分别处死所有动物。
1.2.4 取材
所有动物于造模后12周末取材。耳缘静脉空气栓塞处死，解剖右膝关节，肉眼观察关节软骨组织大体变化，后使用咬骨钳、手术刀取内侧胫骨平台软骨组织放入4%多聚甲醛中备检。
1.2.5 指标检测
1.2.5.1 HE染色 右膝内侧胫骨平台4%多聚甲醛固定，脱钙，脱水，石蜡包埋，连续切片（厚度3 μm），苏木精-伊红染色，封片，光镜下观察软骨形态变化。
1.2.5.2 原位末端标记法检测软骨细胞凋亡率 切片常规脱腊至水，用蛋白酶K室温孵育30 min，PBS洗2次，滴加50 μL的TUNEL反应混合液，在湿盒中37℃孵育60 min（为防止蒸发和保证TUNEL反应混合物均匀分布，在孵育过程中加盖盖玻片），PBS冲洗3次。擦干样品周围水分，加入50 μL转化剂POD，在湿盒中37℃孵育30 min（为防止蒸发和保证转化剂POD（辣根过氧化物酶）均匀分布，在孵育过程中加盖玻片）。PBS冲洗3次，加入100 μL DAB底物溶液，室温孵育10 min，PBS冲洗3次，封片。在光学显微镜下观察，以细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性细胞（即凋亡细胞）。每个标本选择细胞分布较均匀的高倍视野10张片计数，分别计数阳性细胞；软骨细胞凋亡率（%）=阳性细胞数/总细胞数×100%。
1.3 统计学方法
采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大体观察
2.1.1 药物组
关节面光滑，软骨透明，有光泽，未见明显缺损及新生物。切面见软骨厚度正常或稍增厚。
2.1.2 对照组
关节面粗糙，凹凸不平，软骨面颜色灰黄，无正常透明度及光泽，可见明显缺损及骨赘形成。切面见软骨变薄明显。
2.1.2 正常组
关节软骨表面光滑完整，呈乳白色或淡蓝色，半透明状。
2.2 组织病理学观察
2.2.1 药物组
大部分动物软骨表面光滑平整，局部可见小裂隙，四层结构基本清晰。部分动物软骨层增厚，表、中层细胞增多，排列稍紊乱。潮线清晰完整（图1a）。
2.2.2 对照组
软骨表面不光滑，可见深达辐射层的糜烂及缺损，周围软骨见簇状增生，局灶骨赘形成。四层结构紊乱。软骨层厚度不均，大部分软骨层明显变薄，软骨细胞减少。潮线扭曲紊乱（图1b）。
2.2.3 正常组
关节软骨各层次明确，其中表层软骨细胞呈类圆形，排列近似水平状，分布较均匀；中间层（移行层与辐射层）软骨细胞为圆形，呈散在、无序排列，有聚集现象；钙化层软骨细胞呈柱状排列，细胞较少，未见软骨细胞簇集，潮线完整（图1c）。
2.3 兔软骨组织细胞凋亡情况
动物膝关节软骨细胞凋亡见图2，凋亡率见表1。结果显示，药物组细胞凋亡率比正常组高，比对照组低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。
3 讨论
目前对膝OA的病因尚未完全明了，大多数OA的发病缺乏已知病因，但一般认为该病的始发部位在软骨[4]。软骨组织的损伤启动并影响着膝OA发生、发展的整个病程。有学者[5-6]认为骨关节病炎发病与滑膜、软骨细胞的凋亡有关。细胞凋亡即程序性细胞死亡，通常认为导致细胞凋亡的程序在机体内、外因素作用下被启动，导致细胞凋亡的发生。正常软骨细胞的凋亡参与细胞数量的调节，在软骨发育和关节区的稳态调节中发挥重要的作用，但过度凋亡则是病理的和有害的。已有研究发现软骨细胞的过度凋亡与软骨组织损伤有密切关系[7-9]。本实验通过右膝内侧副韧带、前后交叉韧带及切除内侧半月板造成膝关节内环境损伤，建立并观察软骨细胞凋亡模型。
硫酸氨基葡萄糖治疗膝关节骨关节炎一直存在争议，欧洲风湿病协会和国际骨关节炎研究协会治疗膝关节骨性关节炎推荐应用硫酸氨基葡萄糖[1-2]，然在2009年一项综述认为“很少有证据表明，氨基葡萄糖能促进关节软骨功能恢复”[3]。一些学者做了相关的基础研究，认定硫酸氨基葡萄糖有一定的疗效，并且在欧洲得到肯定。硫酸氨基葡萄糖作用机制研究如下：①硫酸氨基葡萄糖能控制软骨葡萄糖胺聚糖和蛋白多糖合成的速度，从而促进蛋白多糖的生物合成，保护与修补软骨基质和恢复受损的软骨细胞；②硫酸氨基葡萄糖可以调节胶原酶[10]和磷脂酶A2的活性，减少损伤细胞的内毒性因子释放，还可以通过减少降解、促进合成而恢复葡萄糖胺聚糖的代谢失衡；③硫酸氨基葡萄糖能抑制促炎症细胞因子表达，减少关节的破坏和炎性反应。硫酸氨基葡萄糖作用是否对膝关节软骨细胞凋亡产生影响，目前尚缺乏类似的基础研究。
本组实验的对照组在宏观的解剖形态和组织病理学观察发现膝关节软骨受损严重，同时从过微观显微镜下观测软骨细胞软骨细胞凋亡率达到（30.50±4.72）%，光镜显示软骨组织损伤明显。而药物组细胞凋亡率较对照组明显要低，两者差异有高度统计学意义（均P < 0.01），光镜显示软骨组织损伤较轻。本实验证实硫酸氨基葡萄糖与膝关节软骨凋亡有关，可减轻兔膝关节软骨组织的损伤及软骨细胞的凋亡，其具体的作用机制尚需要进一步深入研究。结合目前的临床使用与一些基础研究文献[11-13]提示，硫酸氨基葡萄糖治疗膝OA效果确切，值得临床医生重视。
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