基因突变范例6篇

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基因突变范文1

一、教材分析

1、在教材中的地位

本节是必修二第五章第一节的内容，通过前面各章的学习对于基因是什么，基因在哪里，基因是如何起作用的相关知识已经有了整体的认识。那么基因在代代相传中会不会变化？怎么变化？发生的变化会对生物的生存产生什么影响？本节从遗传物质变化的角度出发分析基因突变和基因重组对生物的影响，以及在生物进化过程中所起的作用，同时，也是学习第六章《从杂交育种到基因工程育种》和第七章《现代生物进化理论》的基础。

2、重、难点分析

重点：基因突变的实例；基因突变及基因重组的概念；基因突变的原因；基因突变特点及意义；基因重组的类型及意义。

难点：基因突变的概念；基因突变的结果形成原基因的等位基因；基因突变的特点；交叉互换。

3、教学目标

（1）知识目标。通过对镰刀型贫血症病因的分析认识基因突变的概念并分析基因突变的几种类型；不同器官发生基因突变的遗传情况；举例基因突变的原因和特点；识记基因突变的意义；举例说明基因重组的概念，类型；说出基因重组的意义。（2）能力目标。通过实例分析入手培养学生分析归纳总结能力；设置问题让学生分组讨论，培养学生合作探究能力。（3）情感态度与价值观。列举基因突变引起的遗传病实例让学生更加珍爱生命，远离不健康的生活方式。

4、教W方法

通过实例分析入手，设置问题情境引导学生探究，再归纳总结概念，从现象到概念，这种教学更符合学生的认知规律；通过联想和类比推理让学生得出基因突变的类型；基因突变的原因部分通过癌变的具体实例归纳哪些因素引起基因突变，让学生在兴趣中掌握了抽象的概念；通过讨论的形式引导学生掌握基因突变和基因重组的意义，最后通过比较法掌握基因突变和基因重组的区别。

5、教具准备

多媒体课件

6、课时安排：1课时

二、教学过程

导课：简单复习下变异的概念，举例：一美女单眼皮，国字脸，去了韩国一趟变成双眼皮瓜子脸，她的这种改变从生物学角度来说就属于变异，问，如果该美女结婚了，她的双眼皮瓜子脸能遗传吗？学生答：不能。教师追问：什么样的变异才能遗传给下一代呢？学生答：遗传物质改变引起的变异才能遗传给子代。教师和学生一起归纳变异的类型：可遗传变异，遗传物质改变引起的变异，有三种来源，基因突变、基因重组、染色体变异；不可遗传变异，由环境变化引起的，遗传物质没有改变，所以不能遗传给下一代。本节课学习可遗传变异的两大来源，基因突变和基因重组。

基因突变

1、基因突变的实例――镰刀型细胞贫血症

学生阅读课本的有关内容，注意以下几个问题： （1）镰刀型细胞贫血症的症状？（细胞呈镰刀状，容易破裂，使人患溶血性贫血，严重时会导致死亡。）（2）镰刀型细胞贫血症的直接病因？（血红蛋白结构异常）科学家为什么先从蛋白质入手？（蛋白质是生命活动的直接体现者）（3）异常血红蛋白与正常血红蛋白相比氨基酸序列有什么不同？（一个氨基酸被替换）（4）氨基酸被替换的根本原因是什么？

学生回答每一个问题后播放括号内的内容，然后再展示第四个问题，引导学生回顾基因表达过程让学生认识到蛋白质的氨基酸序列取决于DNA中的碱基序列，所以，血红蛋白氨基酸被替换应该是DNA中的碱基序列改变的结果。多媒体展示图片和学生一起通过图片分析镰刀型细胞贫血症的原因：

DNA中的一个碱基对被替换信使RNA碱基对改变蛋白质中氨基酸改变蛋白质改变性状改变

教师阐述：像这种氨基酸DNA中碱基对的改变引起基因结构的改变就是基因突变。碱基对改变的类型，除了替换外，还有增添和缺失。

问：这种改变能否遗传？能的话怎样遗传？（能，通过DNA复制后，经减数分裂形成生殖细胞遗传给后代，无性繁殖的生物还可以通过体细胞遗传。）

2、基因突变的诱因

学生阅读课本后，请一个同学回答引起基因突变的原因，不完整的教师补充，通过多媒体展示：物理因素、化学因素和生物因素

3、基因突变的特点

学生阅读课本后和学生一起归纳：普遍性、随机性、不定向性、低频率性、多害少利性。

4、基因突变的意义

教师问：基因突变能产生新的基因，新的基因所控制产生的新性状对生物的生存产生什么影响？突变是多害少利的，什么个体更容易在自然选择中生存下来？

（基因突变产生新的基因，进而出现新的性状，而这种性状对生物的生存大多数是有害的少数是有利的，只有那些适应环境的有利变异个体才能在自然选择中生存下来）

基因突变能产生新的基因，是生物变异的根本来源，为生物进化提供可选择的原材料。

基因重组

请学生阅读基因重组部分内容，并思考以下问题：

1、基因重组的概念？（生物体在有性生殖过程中，控制不同性状的基因发生重新组合的过程。）哪些生物能发生基因重组？（有性生殖的生物）有没有产生新的基因？（没有，原有基因发生重新组合形成新的基因型出现新的表现型。）

2、基因重组的类型有几种？（两种，四分体时期，四分体中的菲姐妹染色单

体发生交叉互换，引起染色单体上的非等位基因重新组合；减数第一次分裂后期非等位基因随着非同源染色体的自由组合发生重组。）

3、基因重组发生的时期？（减数分裂形成配子过程。）

比较项目

4、基因重组的意义？

基因突变范文2

【关键词】：毛竹；遗传结构 ；基因突变

【引言】：

经济社会的发展，促进了物质文明的需要，毛竹的生态价值，长作为景观竹，翠绿的颜色让人心旷神怡，对于改善区域内的环境也有很大的作用。被移栽与多个国家，毛竹的生态性和经济价值被发掘，毛竹的遗传结构受到品种之间的冲击，毛竹的基因发生了变异。保持毛竹品种，受到社会各界广泛的重视。

1、毛竹的遗传结构

我国的毛竹栽种面积广泛，主料的产量、工业利用的规模和水平遥遥领先于其他的国家，毛竹作为我国高生态价值和高经济价值的禾本科竹亚科植物，得到了国家的相关部门的重视，采用科学的手段对毛竹进行相对应的研究，了解毛竹的遗传结构，从而保护毛竹品种的多样性。毛竹的遗传结构和区域分布有重要的关系，不同地区的毛竹的遗传结构不同，甚至就是同一区域的毛竹因为其的群落不一样，内部的基因结构也不相同。毛竹的遗传结构基本上是固定，但不排除环境因素还有自身导致的病变。

毛竹的经济价值还和她快速的生长和约60年左右开花等非常独特的生物特点引起我国生物学家、科学家的重视。毛竹主要是群落生长的特征，整个毛竹的群落的遗传特征大体相同，但是由于人们过度的追求经济利益，破坏原有的毛竹群落的遗传，这个需要相关部门引起重视，避免出现部分毛竹品种灭绝。

2、引起毛竹基因突变的原因

基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象（gene mutation）。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因虽然十分稳定，能在细胞分裂时精确地复制自己，但这种稳定性是相对的。在一定的条件下基因也可以从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因。

引起毛竹基因变异的原因主要分为两种，一种是基因突变，另外一种是外部环境的改变导致。这两种基因的突变，对于毛竹的生长有利也有弊。

毛竹的生长环境对于毛竹的基因构造有着重要的作用，毛竹作为中国的经济价值和生态价值并重的植物，它的基因的突变引起了生物学家、遗传学家、科学家等相关研究部门的重视。主要有两个原因导致毛竹基因的突变：

2.1 毛竹受外界原因影响，发生基因突变

因为毛竹具有较高的经济价值和生态价值，人们大量的移栽毛竹，毛竹为了适应生长环境，内部的基因结构发生变化。人们大规模的移栽毛竹，破坏了毛竹的竹群的完整性，毛竹因为要适应环境而发生基因突变。外界的原因导致毛竹遗传结构的改变，质变到量变的积累过程，持续的周期长，但是也是毛竹遗传结构变化细微的地方，应该引起人们的重视，避免毛竹品种出现一致化，破坏毛竹品种的多样性。

2.2 毛竹群落之间的病变

毛竹的群落因为病虫灾害，或者是环境的变化，毛竹为了生存发生，基因的突变。对于毛竹群落出现病变的情况，应该引起相关部门的重视，对此应该给出合理的方案，避免这类情况的发生。

防治毛竹群落的病虫灾害，根据划定的毛竹区域的不同，害虫的不同，使用不同的农药进行防治。

3、如何避免毛竹的基因突变

毛竹作为重要的经济物种，引起的生物价值受到人们的重视，避免毛竹基因的突变，怕影响毛竹的经济价值。避免毛竹基因突变，就应该从导致它基因突变的方面入手。

3.1 划定区域繁殖

研究毛竹遗传的多样性和分布格局为避免毛竹的基因突变有重要的意义，毛竹因为其生物特性，有性生殖率低，开花的周期长以及开花期不确定等综合性因素，毛竹的基因的突变需要时间。毛竹作为中国乃至全世界重要的的经济性作物被广泛的栽培，毛竹的生命力强，但随着人工的栽植的强度增大，毛竹的多样性正在减少，为了防止毛竹的群落过于单一化，应该划定区域繁殖。

3.2分类对待毛竹的基因突变

区域的划定，是避免了毛竹基因的突变，了解区域内毛竹的品种，能够利于对毛竹原有品种的保护，比如湖南怀化、贵州黎平和广东仁化等地区属于遗传变异较丰富的居群，应给予重视和优先保护，防止深度破坏该物种；对于特有基因丰富度高的居群，如四川兴文，以及分布在各个群体的特异种质要加大力度进行异地保存和利用。

不同的区域采用不同的保护措施，避免毛竹品种的量变引起质变的情况发生，区域的划定利于毛竹品种的多样性。

3.3 对毛竹的品种进行保护

避免出现毛竹杂交的情况，对于毛竹的品种进行了解，避免出现劣等毛竹品种杂交，出现更为劣质的毛竹品种出现。

结语

毛竹的栽种历史悠久，品种多，对于现有的品种的保护，能够利于毛竹生产资源的单一性，基因纯正的保证。保护毛竹的品种，对于后续的毛竹研究，具有重要的意义。

相关部门应该建立相关的毛竹保护区域，避免人工干涉过多，野生的毛竹资源缺少，毛竹的生物多样性减少，不利于后期毛竹品种的改良。

【参考文献】：

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[5]沈晓婷. 毛竹小尺度遗传多样性及取样策略的初步研究[D].南京林业大学，2012.

[6]刘向敏. 毛竹MLE转座子转座活性的鉴定与分析[D].浙江农林大学，2012.

基因突变范文3

【关键词】  乳腺癌;肿瘤易感基因;基因突变

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【摘要】  目的 研究河北省家族性乳腺癌患者一级亲属brca基因突变情况。方法 采用聚合酶链反应单链构象多态性分析(polymerase chain reactionsingle strand conformation polymorphism, pcrsscp)和基因测序技术对国内外报告中常见的4个brca1/brca2突变热点区域(brca1：外显子2、11、20;brca2:外显子11)进行检测。结果 在12个家族性乳腺癌家系46例一级亲属中，发现1个brca2基因突变位点(5329inst)和1个核苷酸多态性位点(287 g>c)。结论 家族性乳腺癌家系中健康一级亲属突变基因和核苷酸多态性位点携带者存在较大的乳腺癌发病风险。

【关键词】  乳腺癌;肿瘤易感基因;基因突变

近年来研究表明，乳腺癌易感基因brca(breast cancer susceptibility gene，brca)在家族性乳腺癌发生的过程中起到重要作用，突变基因可以常染色体显性遗传方式传给子代[1]，目前研究最多的是brca1和brca2基因。本实验采用聚合酶链反应单链构象多态性分析(polymerase chain reactionsingle strand conformation polymorphism, pcrsscp)和基因测序技术，对河北省12个独立家族性乳腺癌家系中患者的健康一级亲属进行brca1和brca2基因突变检测，以探讨家族性乳腺癌患者健康一级亲属brca基因的突变位点及携带情况，为乳腺癌的预防和早期干预提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象均为女性，平均年龄42.3岁。 入选标准：家族中2个及2个以上一级或二级亲属患乳腺癌，选取同意入组的12个独立家族性乳腺癌家系中乳腺癌患者健康一级亲属46例样本作为研究对象。

1.2 标本采集和dna提取 经研究对象知情同意后，采集每位研究个体外周静脉血5 ml，经枸橼酸钠抗凝，置4c冰箱保存，并于采血后1周内用高盐沉淀法提取基因组dna。

1.3 pcrsscp 分析 brca1基因有24个外显子，brca2基因有27个外显子，本实验对国内外报告中常见的4个brca1/brca2突变热点区域(brca1：外显子2、11、20;brca2外显子11)进行了检测。

1.4 数据分析 采用dna starmagalign分析软件进行序列比较，所有核酸序列位置编码参考美国国家生物技术信息中心网站(ncbi, ncbi.nlm. nih.gov)genbank上野生型cdna序列：brca1(u14680.1)和brca2 (u43746.1)[2];采用ncbi上blast2应用程序进行核苷酸翻译为蛋白质的比较，确定该核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)是否引起氨基酸编码改变;对发现的snp在乳腺癌信息中心网站 (breast cancer information core， nhgri.nih.gov /intramuralresearch /labtransfer/bic)进行比较，以确定新发现的突变位点是否为新的突变点。

2 结果

46例研究样本中，于brca2基因发现了1个突变位点(5329inst)，且分布于第11外显子上，其核苷酸序列在5 329位插入t，为移码突变，导致终止密码子形成，产生截断蛋白。该基因携带者24岁，健康一级亲属，其母亲和两个姨妈分别于49、43和47岁确诊为乳腺癌，其中一个姨妈为隐性乳腺癌患者。另外，于brca1基因发现了一个核苷酸多肽位点(287g>c)，分布于第2外显子，携带者为另一家系中的健康一级亲属，其母亲、姨妈和表姐分别于49岁、56岁、35岁诊断为乳腺癌。上述两个家系中乳腺癌患者均为3例。

3 讨论

brca1和brca2是与家族性乳腺癌发病密切相关的两个基因[3，4]。研究认为，两基因突变可以导致家族性、早发性、双侧性乳腺癌的发生[5]。

目前国内外关于家族性乳腺癌患者brca1和brca2基因突变的研究较多，但其一级健康亲属brca1和brca2突变情况罕有报道。该研究应用pcrsscp技术对12个独立河北汉族乳腺癌家系中乳腺癌患者46例健康一级亲属，进行了国内外报告中常见的4个brca1和brca2突变热点区域(brca1：外显子2、11、20;brca2：外显子11)进行检测，发现1例致病性突变：5 329inst分布于brca2基因第11外显子上，为移码突变，其核苷酸序列在5 329位插入t，导致终止密码子形成，产生截断蛋白，上述突变点在国内首次被发现。研究还发现brca1基因外显子2 存在1个snp位点(287g>c)，经过比对，上述snp位点亦为首次发现。

在该研究中，brca1基因核苷酸多态性位点和brca2基因突变位点携带者分别属于两个无任何血缘关系的家系，且两个家系中均相继发生3个乳腺癌。因此，作者认为：上述核苷酸多态性位点和突变基因携带者存在很大的乳腺癌发病风险，应该引起重视，密切随访或尽早进行手术或药物干预。

【参考文献】

  　1 ripperger t, gadzicki d, meindl a, et al. breast cancer susceptibility: current knowledge and implications for genetic counselling. eur j hum genet，2009，17:722731.

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3 dunnen jt, antonarakis se. mutation nomenclature extensions and suggestions to describe complexmutations: a discussion. hum mutat, 2000, 15:712.

4 tada t, kasumi f. characteristics of familial breast cancer. nippon riusho,2000,58:14051408.

基因突变范文4

Correlation of p53 gene mutation and p16 gene deletion with hepatocellular carcinoma

【Abstract】AIM: To detect the probability of p53 gene mutation and p16 gene deletion in the plasma of the patients with hepatocellular carcinoma (HCC) and to explore its correlation with onset and development of HCC and its clinical significance. METHODS: PCR was used to amplify p53 gene exon 58 and the immunohistochemistry (SPp16) was employed to determine the deletion of p16 gene. The difference between the patients with or without liver metastasis was analysed in gene mutation and deletion. RESULTS: Of 33 cases of HLL 17(51.55%)， showed the mutation of p53; the mutation rate in metastasis group(n=18) was higher than that in nonmetastasis group(n=15). CONCLUSION: There is a correlation between HCC and p53 gene mutation and p16 gene deletion .The mutation rate may have the reference value in diagnosis and prognosis prediction of HCC.

【Keywords】 genes p53; genes p16; carcinoma， hepatocelluar

【摘要】 目的： 检测肝癌患者血浆中p53基因突变和细胞核中p16基因缺失的机率，研究与疾病发生、发展的相关性并探讨其意义. 方法： 实验采用聚合酶联链式反应（PCR）扩增p53基因外显子5~8和免疫组织化学方法SPp16，对其突变和缺失进行分析. 结合临床患者有无肝组织以外转移来对比差异性. 结果： 33例肝癌患者中，有17例结果显示血浆循环核酸p53基因突变；有转移病灶组18例的突变率高于无转移病灶组15例. 结论： 血浆p53基因突变和p16基因缺失与肝癌的发生、与疾病的轻重及病灶转移有相关性，突变机率在临床鉴别诊断和治疗预后中有参考价值.

【关键词】 基因，p53；基因，p16；癌，肝细胞

0引言

在各类疾病中，肝癌以恶性程度高、治疗效果差、病灶易转移和给患者带来极大身心损害而排在前列［1］. 检测血浆中p53和细胞核中p16基因突变机率，对治疗效果判定、康复干预都有参考和使用价值［2］，对肝癌的发生和发展的危险因素评估、早期预防提供实验方法学.

1材料和方法

1.1材料收集病例35例，患者均经腹部B超、CT或MRI影像学诊断，CEA， AFP多项肿瘤标志物蛋白检测. 有胸腹水患者21例抽取样本进行组织细胞学，4例肝穿刺活检病理学诊断. 21例术后证实为肝癌，12例失去手术机会，2例因病情恶化死亡. 本组研究实为33例，肝癌无转移15例，肝癌合并肺、胃、肠、脑等部位转移癌18例. 男性27例，女性6例，年龄27~69（中位年龄48.27岁）. 自静脉采血分离血浆，不受时间、饮食和治疗影响. 31例正常对照为献血员血浆，男性20例，女性11例，年龄25~55岁（中位年龄42.93岁）.

1.2方法PCR扩增仪使用美国PE公司智能型热循环仪，引物设计参照序列如下［3］：p53基因外显子5，扩增第5个显子（P56.1和P5.2）序列上游引物顺序5′TTC CTC CTG CAG TAC C3′， 214 bp，上游引物顺序3′GCC CCA GCT GCT CAC CAT3′；p53基因外显子6，扩增第6个显子（P6.1和P6.2）序列上游引物顺序5′CAC TGA TTG CTC TTA GGT CT3′， 144 bp，上游引物顺序5′AGT TGC AAA CCA GAC CTC AGG3′；p53基因外显子7，扩增第7个显子（P7.1和P7.2）序列上游引物顺序5′TCT CCT AGG TTG GCT CTG AC3′， 133 bp，上游引物顺序5′CAA GTG GCT CCT GAC CTG GA3′；p53基因外显子8，扩增第8个显子（P8.1和P8.2）序列上游引物顺序5′CCT ATC CTG AGT ACT GGT AA3′， 166 bp，上游引物顺序3′GTC CTC CTT GCT TAC CTC G3′.

DNA提取方法为静脉血2.5 mL，EDTAK2抗凝，混匀后3500 r/min离心10 min，分离血浆低温-20℃保存. 操作程序按DNA提取试剂盒（由博华公司提供QLAmp DNA minikit，Germany）说明书进行. PCR扩增循环条件为：95℃ 40 s， 60℃ 30 s， 75℃ 40 s，重复循环32次，70℃ 10 min完成延伸反应. 再经非变性聚丙烯酰胺凝胶SSCP电泳，银染，应用凝胶自动成像系统分析. 阳性（基因突变）条进行基因测序.

免疫组织化学方法采用SP方法，p16单克隆Ab及SP试剂购自成都医药工业总公司. p16蛋白以细胞核染棕兰色为阳性，每张切片中以东西南北中五个高倍镜下视野计数，按100%计算. 判定标准为阳性细胞数≥5%. 阳性对照同批实验对照.

2结果

2.1p53基因突变p53基因突变与转移癌的相关性（表1）和p53基因突变分布有区别（表2）.

表1小细胞肝癌（HCC）p53基因突变与转移癌的关系（略）

表217例肝癌患者血浆p53基因热点区外显子突变的分布（略）

2.2p53基因突变相关性分析正常对照血浆31份，结果均为阴性（未发现泳动变位），33例肝癌患者血浆，有17例结果为阳性（有泳动变位）. 33例肝癌血浆p53基因有突变的17例（17/33， 51.55%），在第8外显子居多（6/17， 35.4%）. 5~8外显子扩增结果表明，HCCp53基因发生突变的机率在临床有转移的HCC中明显高于无转移的HCC（P

转贴于

2.3p16基因缺失p16基因缺失情况见表3. 阳性为细胞核内着棕兰色颗粒，均匀散在分布. 随采样位置，显示无转移癌组织切片>有转移癌组织切片，分别为88.9(16/18)% 和11.1(2/18)%，统计学分析存在显著性差异(χ2=6.095，P

表3p16基因缺失程度与癌组织是否转移的相关性（略）

3讨论

目前已知的抑癌基因有数十种，随着人类基因组计划的进行；其数目不断增加，由于功能效团最终聚到细胞增殖调控机制上来［4］，在人体的各种细胞中都有p53蛋白质，由于含量很低、半衰寿期很短，一般检测方法无法测到. p53有抑制细胞生长的作用［5］. 从以上实验可知：在33个病例中有17例患者HCC的p53基因发生突变，占51.52%. 由于p53基因的突变或缺失导致p53基因功能的改变或丧失，从而不能抑制细胞的生长. 在HCC患者中p53发生突变，抑制细胞生长的作用随之降低，导致癌细胞的快速增长，在同等条件下，发生HCC转移的机率将比p53未发生突变的大，从实验数据显示HCC有转移的占66.6%，HCC无转移的占29.5%. 表明在肝癌患者中HCC p53基因突变与癌转移有一定的相关关系，以上实验从5~8外显子扩增结果表明，HCCp53基因发生突变的机率在临床有转移的HCC中明显高于无转移的HCC（P

p16基因（MTS1，CDR41，CDRN2）是细胞周期调空基因家族中的重要成员［9］，是近年来新发现的抑癌基因，其作用机制为直接抑制. 实验表明，随采样位置显示：无转移癌组织切片＞有转移癌组织切片，分别为88.9(16/18)% 和11.1(2/18)%， 存在显著性差异(P

结论： 核酸（RNA和DNA）的PCR扩增已成为分子生物学研究的重要技术体系，本研究在国内较早将其用于肝癌血浆p53基因突变的检测，同时观察基因p16缺失的情况，不仅从分子水平精确地阐明机制，也为基因诊断和基因治疗提供了实验依据，尽管目前仍存在一定的局限性，尚不能确定特异的对应关系，但无疑是一种前景广阔的发展方向，处于学科前沿.

【参考文献】

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基因突变范文5

【摘要】 目的 探讨CD117阳性的胃肠道间质肿瘤（GIST）ckit基因突变分布及类型。方法 采用免疫组化技术，对10例GIST标本行CD117、CD34、SMA和S100检测，以确诊为GIST；采用PCR技术对CD117阳性的GIST进行ckit基因突变检测；采用直接测序方法对突变ckit基因11、9、13和17号的外显子突变进行序列分析。结果 4例成功提取了肿瘤DNA，其中3例检出了ckit基因突变，均分布于第11号外显子，均为557～558（WK）的缺失性突变；其中2例为纯合子性突变，1例为杂合子性突变。结论 CD117阳性的GIST通常有ckit基因突变，其11号外显子是经典分布热点，变异纯合子和杂合子突变为常见类型。

【关键词】 胃肠道间质肿瘤；DNA突变分析；ckit基因

［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the locus and types of ckit (CD117) mutations in gastrointestinal stromal tumors (GIST).MethodsSpecimens of 10 GIST cases were detected immunohistologically for CD117， CD34， SMA and S100 to confirm the diagnosis of GIST. For CD117positive GIST， the mutation of ckit was detected by PCR， and its exons 11， 9， 13 and 17 analyzed by direct sequencing technique.ResultsDNA was successfully isolated in four cases， in which， mutation of ckit was found in three cases， all the genes detected were at ckit exon 11 with codon 557-558(WK)， homozygous mutation being noted in two cases and heterozygous in one.ConclusionThere is usually ckit gene mutations in CD117positive GIST， the exon 11 being classic “hot spot” of the mutations. The homozygous and heterozygous are their common types.

［KEY WORDS］Gastrointestinal stromal tumor; DNA mutationa analysis; ckit gene

胃肠道间质瘤（GIST）是近年来被认识并命名的新实体瘤，CD117（KIT蛋白）是其特异性敏感标志物[1]。GIST具有ckit基因的11号外显子突变，从而导致酪氨酸激酶持续激活[2]。GIST对酪氨酸激酶抑制剂Gleevec治疗敏感[3]。基因诊断和分型为临床深入认识该病提供了重要前提[4]。本文探讨了GIST ckit基因突变分布及类型，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 标本及其来源

收集胶南市人民医院外科收治的10例临床病理诊断为GIST的肿瘤石蜡包埋组织标本，其中男6例，女4例，年龄31～72岁。根据临床病理组织学形态特征将GIST分为：梭形细胞型4例，上皮样细胞型3例和两者混合型3例。肿瘤直径

1.2 免疫组化方法

将40 g/L甲醛溶液固定、石蜡包埋的组织制成4 μm连续切片，以CD117(A4502，1∶200)、CD34(M7165，1∶50)、SMA(M851，1∶100)、S100(Z231，1∶200) 进行免疫组化标记。CD117免疫标记采用Envision两步法；余者均采用SP三步法[5]。

CD117阳性细胞胞膜呈棕黄色；S100阳性细胞胞核和胞质呈棕黄色；CD34、SMA阳性细胞胞质呈棕黄色。

1.3 ckit基因突变检测分析

用Qiagen DNA 试剂盒提取石蜡包埋组织的DNA，行PCR扩增。所有病例均首先进行ckit 第11号外显子的扩增检测，发现有突变者，不再进行其他突变检测；对11号外显子突变无阳性发现者，再进行ckit 9号外显子的扩增检测；无ckit 9号外显子突变者，再进行13 号和17号外显子的扩增。所用引物序列、退火温度和PCR产物片段大小见表1。表1 PCR扩增引物序列、退火温度和产物片段外显子编号引物序列（略）

PCR反应条件为：95 ℃变性2 min；94 ℃ 40 s，退火40 s，72 ℃ 35 s，循环 30～35 次；最后72 ℃延伸5 min。以双蒸水代替模板作为阴性对照。

PCR产物由北京华大中生生物科技发展公司纯化并测序（ABI 3100测序仪）。有突变的病例再行反向测序证实，并与NCBI基因库ckit基因序列进行比对。

2 结果

经免疫组化检测CD117、CD34、SMA和S100，确认10例为CD117阳性GIST病例。

10例石蜡标本中仅4例成功提取了DNA，并进行了PCR扩增和测序。按细胞类型分为上皮样细胞2例，梭形细胞1例，混合型1例。按侵袭危险性分为高度危险性3例，其核分裂象(8～15)/50 HPF；中度危险性1例，其核分裂象(1～2)/50 HPF。该4例中，有3例检出了ckit基因第11号外显子缺失突变，均为累及557～558（WK）的缺失性突变。其中1例CD117（+）、CD34（），第11号外显子缺失突变，缺失片段为TGGAAGG，为杂合子性缺失突变；1例CD117（）、CD34（），第11号外显子缺失突变；1例CD117（）、CD34（），第11号外显子缺失突变。后两者均为纯合子性缺失突变。1例CD117（+）、CD34（），未检测到11、9、13、17号外显子的突变，属野生型序列。其余6例，经反复提取DNA和检测，均失败。

3 讨论

本组10例GIST的组织病理学研究显示，GIST肿瘤细胞主要有3种类型：梭形细胞型、上皮样细胞型和梭形细胞与上皮样细胞混合型，但主要以梭形细胞型为常见。组织学检查表明，GIST肿瘤细胞的核分裂象数目差异很大，而且与肿瘤的大小不相关。光镜高倍视野下GIST肿瘤细胞核分裂象数目与肿瘤大小，均为FLETCHER等[6]对GIST侵袭危险度分级的主要指标，在评估病人预后上有重要意义。

本文研究结果进一步表明，免疫组织化学几项检测指标，特别是CD117和CD34对GIST的诊断是必需的。95％以上GIST表达CD117阳性，70％左右表达CD34阳性。因此，CD117和CD34是GIST病理诊断和鉴别诊断的关键性免疫形态学指标。GIST从组织学上，被认为来源于胃肠道间质中的Cajal细胞和其前身细胞[7]，这两种细胞都显示CD117和CD34阳性表达；SMA和S100则是用于鉴别平滑肌和神经源性肿瘤的免疫学指标。

本研究对10例GIST组织进行ckit基因突变检测分析，目的是揭示肿瘤赖以发生的突变基因靶点，寻找在基因水平上的序列异常改变，帮助临床选择恰当治疗方案。但是，其中6例检测失败。分析失败原因，主要是组织标本处理不规范，造成无法有效提取组织DNA。因此，规范GIST的组织处理过程，是必须首先解决的问题。

本组GIST中有3例为ckit基因突变肿瘤，突变位点均位于11号外显子，并表现为纯合子缺失突变和杂合子缺失突变两种类型。ckit基因是一种原癌基因，它的配体是细胞因子，ckit基因被激活后会引起受体的二聚体，并促进酪氨酸磷酸化，启动细胞内的信号传导，产生一系列增殖、分化、凋亡的调节功能。ckit基因11号外显子是酪氨酸激酶抑制剂的靶向位点，因此是Gleevec药物作用的敏感位点。按基因分类诊断，是推荐选择Gleevec靶向治疗药物的适宜对象。而另1例病人的基因突变检测未发现ckit基因9、11、13、17号外显子突变，基因类型为野生型。同时，根据其肿瘤大小和核分裂象分级，属高侵袭危险性GIST者，免疫组织化学检测其CD117和CD34均为阳性，属对靶向治疗药物Gleevec不敏感的GIST肿瘤病人。因此，基因诊断分型是GIST的重要临床指标，为临床治疗提供依据，有重要意义。

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基因突变范文6

1.江苏省中医院急诊外科，江苏南京 210029；2.江苏省中医院病理科，江苏南京 210029

[摘要] 目的 探讨BRAF基因在甲状腺状病变中的突变情况及临床意义。方法 提取石蜡肿瘤组织中DNA，采用直接测序法分析24例甲状腺状癌和30例甲状腺不典型状腺瘤石蜡组织中BRAF基因突变的情况。结合临床资料进一步分析。结果 24例甲状腺状癌，16例发现BRAF基因15外显子第600位密码子A/T杂合（V600E），突变率为66.7%（16/24）。而30例甲状腺不典型腺瘤中未发现V600E病理性突变（0/30）。 结论 BRAF V600E位点突变仅见于甲状腺状癌，具有一定的特异性，可以用于帮助临床甲状腺状增生良恶性的鉴别。

关键词 BRAF；V600E；甲状腺状癌；不典型腺瘤；直接测序法

[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）09（a）－0015-03

[作者简介] 张翼（1979-），男，江苏如皋人，硕士研究生，主治医师，研究方向:肿瘤临床和基础研究。

[通讯作者] 张士虎 （1975-），男，江苏滨海人，博士在读，副主任医师，研究方向:肝、胆、胰、胃肠肿瘤外科。

甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤，主要包括状癌、滤泡状癌、髓样癌和未分化癌，其中甲状腺状癌最常见，约占85％～90％，以女性多发[1]。由于多种因素，导致甲状腺肿瘤的发病率呈现逐年上升趋势。良性甲状腺病变中常出现状病变，当出现不典型增生时易误诊为癌，从而扩大手术范围，给病人造成不必要的伤害，因此对其性质鉴别具有重要临床意义。而肉眼及显微镜下的观察诊断具有一定的主观性，这就需要一个客观的临床检测指标帮助辨别良恶性。目前多项研究[2,3]指出甲状腺状癌和BRAF V600E突变密切相关，此突变在甲状腺其他良恶性肿瘤中突变率非常低，具有一定特异性，而BRAF V600E在甲状腺不典型状腺瘤中的突变情况尚无人报道。为探讨BRAF基因在甲状腺状病变中的突变情况及临床意义，该研究选取2009年11月—2013年3月以来到该院就诊的56例甲状腺状病变的患者，采用直接测序法分析了甲状腺状癌和甲状腺不典型状腺瘤的BRAF基因突变情况，探讨其在鉴别诊断中的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2009年11月—2013年3月江苏省中医院病理科54例甲状腺状病变石蜡标本,男16例,女38例;平均年龄44 19～70岁。其中甲状腺状癌24例（包括微癌6例）, 甲状腺不典型状腺瘤30例。所有组织标本均经病理证实，诊断参考2004年WHO诊断标准[4]。甲状腺状癌患者行单侧及峡部全切加颈部淋巴结清扫, 甲状腺微小状癌患者行单侧及峡部全切加中央区淋巴结清扫，不典型腺瘤行甲状腺次全切除术，所有患者目前均存活。

1.2 研究方法

1.2.1 基因组DNA提取 切取5张10 um厚石蜡白片，脱蜡消化后提取DNA。具体方法见试剂盒说明书（Omega FFPE DNA Kit，USA）。以凝胶电泳系统检测DNA模板的质量。

1.2.2 PCR扩增 使用ABI -2700型测序级扩增仪，扩增目的基因片段。反应体系：10×PCR Buffer 2 μL，HotStar Taq DNA Polymerase 0.25 μL(Q IAGEN，USA)，5×Q-Solution 4 μL, dNTP 2 μL,Primer各1 μL,模板DNA 1 μL,去离子水8. 75 μL。95 ℃ 10 min; 94 ℃ 50 s, 57 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min,共循环35次,最后于72 ℃延伸10 min。PCR产物纯化具体方法见试剂盒说明书（AXYPrep PCR Cleanup Kit, USA）。

1.2.3 测序 测序方法[5]：在3100-Avant遗传分析仪进行测序; Data collection软件自动进行数据处理和分析。对于测序中发现有突变的病例,都进行反向测序验证。将测序结果用DNA sequencing analysis5. 1软件分析原始测序数据,获取测序电泳图和序列。将样品序列用AB I SeqScape软件与genebank标准序列进行比对,观察样本基因序列的改变。

1.3 统计方法

数据处理使用spss 13.0软件。计数资料采用χ2检验、Fisher’s确切概率法进行显著性检验。

2 结果

经直接测序法测定，54例样本成功检测了BRAF第15外显子突变情况，突变位点全部位于V600E位点，未发现其他类型突变。24例甲状腺状癌，16例发现BRAF基因15外显子第600位密码子A/T杂合（V600E），突变率为66.7%（16/24）。而30例甲状腺不典型腺瘤样本中未发现V600E位点病理性突变（0/30）,两者差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。研究结果还显示，BRAF V600E突变与性别、年龄、肿瘤大小无关，差异无统计学意义（P>0.05），与组织学类型相关。见表2。

3 讨论

甲状腺状癌组织光镜下多表现为状，细胞核毛玻璃样，可观察到核沟，核内包涵体，间质中含有砂粒体，此为重要的特征。而当由于冰冻处理或者其他原因造成不典型时与腺瘤难以鉴别。免疫组化可以用于鉴别诊断，但是免疫组化操作过程中易出现假阴性或者假阳性，人工判读结果也有一定的主观性，易造成误诊。两者治疗和预后差别很大，需要一个客观的检测指标。

BRAF基因为RAF家族成员，位于7号染色体，是编码B型有丝分裂原激活的蛋白激酶依赖性激酶的激酶。研究显示，BRAF基因第15位外显子上的T1799A点突变（V600E）导致BRAF中的缬氨酸(V)被谷氨酸(E)替代，进而持续激活BRAF激酶，造成MAPK通路持续活化，细胞不断分裂、增殖，进而形成肿瘤[6]。在转基因小鼠中通过BRAF 突变的表达，可诱导出状癌，表明了BRAF基因在状癌起始中的重要作用[7]。Fukushima等[8]检测了100例甲状腺癌的BRAF基因突变情况，发现BRAF基因的突变仅存在甲状腺状癌中，而且仅发现了V600E突变,阳性率为53％(40/76). 多项研究[9-11]显示甲状腺状癌中BRAF基因突变率为29%~87%，而滤泡型腺癌和所有良性病变如单纯性甲状腺肿则无此突变。Zhang[11]等发现在甲状腺细针穿刺标本中71.4%发生BRAF V600E突变，所有BRAF(V600E)阳性的标本甲状腺切除术后都被证实为甲状腺状癌。最近的研究还显示，BRAF（V600E）突变的发生率有地区差异。例如， BRAF V600E突变率在韩国（52％~87％）比其他国家（36％~65％）高[3]。造成这种差异的原因尚不清楚，可能是由于地理因素。一些研究报道了在高碘摄入区BRAF V600E突变率更高，这可能表明碘过量摄入是状癌BRAFV600E突变的一个危险因素[12]。

甲状腺状癌的预后较好，十年生存率超过90%。但是35%的患者在长期随访中有复发[13]。甲状腺状癌的预后与多种因素相关，包括年龄、多灶性、肿瘤最大径、甲状腺外浸润性的生长方式及缺乏肿瘤相关性纤维包膜等。研究显示BRAF V600E突变在经典型甲状腺状癌中确与侵犯表型相关，BRAF V600E影响肿瘤的生长方式，促进浸润转移发生，进而影响甲状腺状癌患者临床预后[14]。这对于甲状腺状癌患者的诊断和治疗具有重要意义。Yong [15]等研究显示73.7％的甲状腺状癌中发现BRAF V600E突变。淋巴结转移，TNM分期，多灶性与BRAF V600E突变并无显著相关。然而，肿瘤大小，甲状腺外侵犯，组织学类型以及并发桥本氏甲状腺炎与BRAF V600E突变有关联。在一项回顾性多中心研究中[16]，BRAF V600E突变的存在增加了甲状腺状癌的死亡率。尽管这种联系并不是独立存在的，但支持了BRAF V600E突变对甲状腺状癌预后和治疗影响的进一步研究。

综上所述，BRAF V600E突变在鉴别甲状腺状癌和甲状腺不典型状腺瘤中具有重要意义，对患者的治疗和预后有指导意义，直接测序法结果准确，价格低廉，适合临床推广使用。

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