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蚂蚁与大象范文1
就是这个“静悄悄”的网站的域名，却引起了一场轩然大波，成了叶文龙和美国通用电气公司（GE）争夺的目标。一边是普通的个体工商经营户，一边是世界五百强企业，实力的悬殊显而易见，因此这场域名争夺战被戏称为“蚂蚁斗大象”。
稀里糊涂上擂台
2006年，叶文龙进入宁波一家照明公司做销售。学软件出身的他深知网络的威力，于是决定建个网站。注册域名的时候，为了配合宁波这家公司名字中的“通用电器”，他根据“通用电器”的译名General Electrics的缩写，加上“照明”的意思，就组合成了gelighting。他申请注册时发现gelighting.省略”。2006年12月20日，叶文龙在中国互联网中心成功注册gelighting.省略，只花了80块钱。
不久，叶文龙创办了“宁波市江东大港丰虎电子经营部”，继续销售照明电器，并使用自己一手创办的gelighting.省略网站。“网站开通后，生意相当红火。”不过好景不长，2007年9月，叶文龙接到很多要求退货的电话，指责他销售的产品存在质量问题。他觉得莫名其妙。
“这个产品不是我出售的，为什么会找到我？”“产品上印有你们的网址，还说不是你们的产品？现在有了质量问题，想推脱责任吧？”打电话的人不依不饶，强烈要求换货。
紧接着，工商部门也找上门来。叶文龙这才留意到，那些被投诉的产品都是出自美国通用电气公司，产品包装上赫然印着他的网站域名gelighting.省略。
原来，“省略”是GE公司经营照明器械的一个域名，和宁波大港经营部域名“省略”仅相差两个字母。就是“.省略交给GE公司，并补偿叶文龙150万元人民币；而叶文龙提议让他做GE公司产品的区域销售，同时由他来负责维护这个网站。但是双方都没有接受对方的提议。
当时对方的一句话让叶文龙感到非常气愤――我们的网站绝对不可能让你用的。“这怎么成了他们的网站？明明是我注册的！”
由于谈判未果，2008 年4 月9 日，GE公司向中国国际经济贸易仲裁委员会域名争议解决中心（简称域名争议解决中心）提交了投诉书，请求裁决将“gelighting.省略”域名转移给自己。
在这份厚达50页的投诉书中，有40多页都是在讲GE公司悠久的历史和世界范围内的影响力。从飞机发动机、发电设备、金融服务、医疗造影、电视节目到工业塑料等等，美国通用电气公司的产品种类繁多，是世界上最大的多元化服务性公司，多年来销售收入一直位于世界第一。而在旁人看来，叶文龙那成立还不到两年的大港经营部，无论从目前的规模、实力还是影响力来说，都无法和GE公司相提并论。叶文龙能否保住自己的域名？
“GE”=“gelighting”？
首先，GE公司称去年3月份已在我国国家商标局注册了“GE”商标，取得了该注册商标的所有权，同时也早已注册、使用了“gelighting.省略”域名又回到叶文龙手中。
开始反击讨说法
不过，保卫战才刚结束，叶文龙又打响了反击战。原来在应诉过程中，叶文龙发现，GE公司在其部分灯具等产品的外包装以及产品外表上，已经公然印上自己经营部的域名。
“既然仲裁域名是我的，还在包装上印域名就是损害了我的权益。赔偿损失不是最重要的，关键是要讨个说法。”2008年8月底，他正式向北京市朝阳区人民法院GE公司及北京一家经销商，要求两被告停止侵权，不再使用相关域名，赔偿经济损失，并且公开赔礼道歉。
蚂蚁与大象范文2
【摘要】 【目的】观察针刺对抑郁模型大鼠海马脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)表达的影响，探讨针刺的抗抑郁机制。【方法】选用SD大鼠随机分为正常组、模型组、针刺组、西药组，应用孤养和长期不可预见的慢性应激刺激复制抑郁大鼠模型，同时西药组按2 mg·kg-1·d-1剂量给予氟西汀灌胃，针刺组予以针刺百会、心俞、肝俞穴，每天1次，共21 d。采用免疫组化方法检测各组大鼠海马BDNF和NGF蛋白表达的情况。【结果】与正常组比较，模型组BDNF和NGF阳性细胞数量显著减少(P
【关键词】 抑郁症/针灸疗法;海马/病理学;神经营养因子;神经生长因子;疾病模型，动物;大鼠
研究表明，抑郁症的发病机制及治疗可能涉及神经元可塑性的假说，神经元可塑性失调可导致抑郁症[1]。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)与脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor，BDNF)是神经因子家族的两个成员，在神经系统的生长发育中有重要作用，对神经元的可塑性及其形成和生存起着重要的调节作用[2]。本研究采用孤养和长期不可预见的慢性应激刺激复制抑郁大鼠模型，观察针刺对模型大鼠海马神经元BDNF和NGF表达的影响，现报道如下。
1材料与方法
11实验动物和分组SPF级成年SD大鼠，体质量220～290 g，雌雄各半。由广州中医药大学动物中心提供，实验动物合格证编号：2007A017。首先采用Openfield法[3]作行为学评分，选择得分相近的32只大鼠，适应性喂养7 d后，随机分为正常组、模型组、氟西汀组(西药组)、针刺组，每组8只。正常组每笼饲养4只，雌雄分开。用普通大鼠饲料喂养，饮用自来水，室温控制在20℃～25℃，湿度60%～80%。实验在广州中医药大学动物实验中心进行(合格证编号：0007047)。
12试剂与仪器BDNF、NGF免疫组化试剂盒购自中山生物试剂有限公司广州分公司。33’二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)显色剂，兔抗NGF和BDNF多克隆抗体：一抗(工作浓度为1∶100)、二抗、三抗，40 g/L多聚甲醛，磷酸盐缓冲液(PBS)均购自武汉博士德生物有限公司。CX21BIMSET生物显微镜(OLYMPUS公司生产)，图像分析仪(北京航空航天大学24版本)。
13动物模型的复制按照参考文献方法[3]进行抑郁症模型大鼠的复制。模型组、针刺组、西药组每笼饲养1只，各组分别接受21 d各种不同的应激刺激，包括断水24 h;断食24 h;夹尾1 min;4℃冰水游泳5 min;摇晃：1次/s，5 min;昼夜颠倒;电击足底，电压50 mV，每5 s刺激1次，间歇5 s，共刺激10次。每天随机选择1种刺激，每种刺激平均使用3次，共21 d。
14治疗方法给予大鼠各种不可预知的应激刺激同时，西药组按照2 mg·kg-1·d-1剂量给予盐酸氟西汀(美国礼来公司)，将药物溶于生理盐水中灌胃，每天1次。针刺组每天应激刺激前1 h进行治疗，根据《实验针灸学》[4]大鼠穴位定位方法取穴，选取百会、心俞、肝俞。穴位常规消毒，选用华佗牌025 mm×13 mm针灸针进行针刺。百会向尾部斜刺，进针深度约为2 mm，心俞、肝俞(左右两侧穴位交替使用，每次取单侧)斜刺5 mm，每穴均匀捻转刺激30 s，留针15 min。每天1次，共21次。
15检测指标和方法
151取材方法各组大鼠在治疗21 d结束后，全部断头取脑，剥离全脑，于冰浴下迅速分离出海马，40 g/L多聚甲醛固定6 h，再依次浸入200、300 g/L的蔗糖PBS(pH 72)中，直至组织块下降到底部，恒冷冰冻切片机连续冠状切片，取海马与齿状回互包平面，片厚40 μm，直接置于01 mmol/L PBS液中，4℃冰箱保存。
152BDNF、NGF免疫组织化学染色载玻片经防脱片剂PolyLysine处理，体积分数3%H2O2室温作用10 min以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次。热修复抗原：将切片浸入001mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 60)， 微波炉加热至沸腾后断电，间隔5～10 min，反复1～2次。冷却后PBS(pH 72～76)洗涤2次，加50 mg/L的牛血清白蛋白(BSA)封闭液，室温20 min。甩去多余液体，不洗，滴加1∶100稀释的一抗(抗BDNF、NGF)，37℃放置1 h。PBS洗涤2 min×3次，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃、20 min。PBS洗涤2min×3次，滴加链霉亲和素—生物素—过氧化物酶连结法(SABC)试剂，37℃、20 min。PBS洗涤5 min×4次，使用DAB显色试剂显色。取1 mL蒸馏水，加入试剂盒中ABC试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5～30 min之间。蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染。脱水，透明，封片，显微镜观察。每组各取1张切片贴在载玻片上，通过比较吸光度(D)半定量分析BDNF和NGF的表达量。每张随机取2个视野，在10×40光镜下用图像分析仪进行分析。
16统计学方法采用SPSS 120软件分析数据，用单因素方差分析：方差齐时采用LSD法(最小显著差异法);方差不齐时采用Dunnett T3法。
2结果
正常组大鼠海马结构中，BDNF阳性细胞表达很强，广泛分布于海马的锥体细胞和齿状回的颗粒细胞层，细胞排列密集，着色深，有的有较长的突起。与正常组比较，模型组BDNF阳性细胞数量明显减少，且多数细胞呈空泡状，胞浆着色较浅。针刺组、西药组BDNF阳性细胞数显著增加(与模型组比较，P005)。结果见表1、图1(见彩图页第615页)。
正常组大鼠海马神经元中可见较多的NGF免疫反应阳性颗粒，呈浅棕色。与正常组比较，模型组大鼠海马神经元NGF 阳性细胞数显著减少(P
【摘要】 【目的】观察针刺对抑郁模型大鼠海马脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)表达的影响，探讨针刺的抗抑郁机制。【方法】选用SD大鼠随机分为正常组、模型组、针刺组、西药组，应用孤养和长期不可预见的慢性应激刺激复制抑郁大鼠模型，同时西药组按2 mg·kg-1·d-1剂量给予氟西汀灌胃，针刺组予以针刺百会、心俞、肝俞穴，每天1次，共21 d。采用免疫组化方法检测各组大鼠海马BDNF和NGF蛋白表达的情况。【结果】与正常组比较，模型组BDNF和NGF阳性细胞数量显著减少(P
【关键词】 抑郁症/针灸疗法;海马/病理学;神经营养因子;神经生长因子;疾病模型，动物;大鼠
研究表明，抑郁症的发病机制及治疗可能涉及神经元可塑性的假说，神经元可塑性失调可导致抑郁症[1]。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)与脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor，BDNF)是神经因子家族的两个成员，在神经系统的生长发育中有重要作用，对神经元的可塑性及其形成和生存起着重要的调节作用[2]。本研究采用孤养和长期不可预见的慢性应激刺激复制抑郁大鼠模型，观察针刺对模型大鼠海马神经元BDNF和NGF表达的影响，现报道如下。
1材料与方法
11实验动物和分组SPF级成年SD大鼠，体质量220～290 g，雌雄各半。由广州中医药大学动物中心提供，实验动物合格证编号：2007A017。首先采用Openfield法[3]作行为学评分，选择得分相近的32只大鼠，适应性喂养7 d后，随机分为正常组、模型组、氟西汀组(西药组)、针刺组，每组8只。正常组每笼饲养4只，雌雄分开。用普通大鼠饲料喂养，饮用自来水，室温控制在20℃～25℃，湿度60%～80%。实验在广州中医药大学动物实验中心进行(合格证编号：0007047)。
12试剂与仪器BDNF、NGF免疫组化试剂盒购自中山生物试剂有限公司广州分公司。33’二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)显色剂，兔抗NGF和BDNF多克隆抗体：一抗(工作浓度为1∶100)、二抗、三抗，40 g/L多聚甲醛，磷酸盐缓冲液(PBS)均购自武汉博士德生物有限公司。CX21BIMSET生物显微镜(OLYMPUS公司生产)，图像分析仪(北京航空航天大学24版本)。
13动物模型的复制按照参考文献方法[3]进行抑郁症模型大鼠的复制。模型组、针刺组、西药组每笼饲养1只，各组分别接受21 d各种不同的应激刺激，包括断水24 h;断食24 h;夹尾1 min;4℃冰水游泳5 min;摇晃：1次/s，5 min;昼夜颠倒;电击足底，电压50 mV，每5 s刺激1次，间歇5 s，共刺激10次。每天随机选择1种刺激，每种刺激平均使用3次，共21 d。
14治疗方法给予大鼠各种不可预知的应激刺激同时，西药组按照2 mg·kg-1·d-1剂量给予盐酸氟西汀(美国礼来公司)，将药物溶于生理盐水中灌胃，每天1次。针刺组每天应激刺激前1 h进行治疗，根据《实验针灸学》[4]大鼠穴位定位方法取穴，选取百会、心俞、肝俞。穴位常规消毒，选用华佗牌025 mm×13 mm针灸针进行针刺。百会向尾部斜刺，进针深度约为2 mm，心俞、肝俞(左右两侧穴位交替使用，每次取单侧)斜刺5 mm，每穴均匀捻转刺激30 s，留针15 min。每天1次，共21次。
15检测指标和方法
151取材方法各组大鼠在治疗21 d结束后，全部断头取脑，剥离全脑，于冰浴下迅速分离出海马，40 g/L多聚甲醛固定6 h，再依次浸入200、300 g/L的蔗糖PBS(pH 72)中，直至组织块下降到底部，恒冷冰冻切片机连续冠状切片，取海马与齿状回互包平面，片厚40 μm，直接置于01 mmol/L PBS液中，4℃冰箱保存。
152BDNF、NGF免疫组织化学染色载玻片经防脱片剂PolyLysine处理，体积分数3%H2O2室温作用10 min以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次。热修复抗原：将切片浸入001mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 60)， 微波炉加热至沸腾后断电，间隔5～10 min，反复1～2次。冷却后PBS(pH 72～76)洗涤2次，加50 mg/L的牛血清白蛋白(BSA)封闭液，室温20 min。甩去多余液体，不洗，滴加1∶100稀释的一抗(抗BDNF、NGF)，37℃放置1 h。PBS洗涤2 min×3次，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃、20 min。PBS洗涤2min×3次，滴加链霉亲和素—生物素—过氧化物酶连结法(SABC)试剂，37℃、20 min。PBS洗涤5 min×4次，使用DAB显色试剂显色。取1 mL蒸馏水，加入试剂盒中ABC试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5～30 min之间。蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染。脱水，透明，封片，显微镜观察。每组各取1张切片贴在载玻片上，通过比较吸光度(D)半定量分析BDNF和NGF的表达量。每张随机取2个视野，在10×40光镜下用图像分析仪进行分析。
16统计学方法采用SPSS 120软件分析数据，用单因素方差分析：方差齐时采用LSD法(最小显著差异法);方差不齐时采用Dunnett T3法。
2结果
正常组大鼠海马结构中，BDNF阳性细胞表达很强，广泛分布于海马的锥体细胞和齿状回的颗粒细胞层，细胞排列密集，着色深，有的有较长的突起。与正常组比较，模型组BDNF阳性细胞数量明显减少，且多数细胞呈空泡状，胞浆着色较浅。针刺组、西药组BDNF阳性细胞数显著增加(与模型组比较，P005)。结果见表1、图1(见彩图页第615页)。
正常组大鼠海马神经元中可见较多的NGF免疫反应阳性颗粒，呈浅棕色。与正常组比较，模型组大鼠海马神经元NGF 阳性细胞数显著减少(P
3讨论
海马是边缘系统重要组成部分，参与情绪、学习、记忆、行为、免疫等调节，它的损伤在各种应激所致疾患中起关键作用。应激所致的海马树突结构重建、神经元形成的减少和细胞生存能力的下降为抑郁症患者海马损害提供了细胞学基础[5]。NGF和BDNF是神经生长因子家族的两个成员，其作用比较广泛，胚胎发育期对神经系统的发育、分化、成熟以及突触的形成不可缺少，成年期对神经功能的调节和神经系统的可塑性具有重要作用[6]。成熟的神经元对刺激具有调节其结构和功能的能力，称为可塑性。BDNF可能是作为这种结构可塑性的分子媒介。有人认为，NGF可调节神经元的结构，BDNF可调节神经元的活性，其机制可能是改变了胆碱能神经元的功能，进而调节了海马神经元的可塑性[7]。
研究表明，海马是成年大鼠神经生长因子含量最高的部位，各种应激造成海马神经元损害时，NGF和BDNF也会发生变化。如束缚应激可以使大鼠齿状回的NGF降低到正常的36%，BDNF也会同时降低[8]。心理及物理应激能下降海马BDNF mRNA水平，提示与应激相关的抑郁症与海马BDNF有密切关系。本实验也发现：正常组大鼠海马结构中，BDNF阳性细胞表达较强，广泛分布于海马的锥体细胞和齿状回的颗粒细胞层，细胞排列密集，着色深，有的有较长的突起。而模型组BDNF阳性细胞数量显著减少，且多数细胞呈空泡状，胞浆着色较浅。正常组大鼠海马神经元中可见较多的NGF免疫反应阳性颗粒，呈浅棕色，而模型组NGF 阳性细胞数显著减少(P
本实验结果还显示：在给予针刺及氟西汀干预后，BDNF和NGF 阳性细胞数均较模型组显著增加。针刺可以促进BDNF和NGF 表达，从而对海马神经元的可塑性进行调节，这可能是针刺抗抑郁的分子机制之一。
抑郁症属中医的“郁病”， 主要病机为肝郁气滞、心脾两虚和肝肾阴虚。其病位在脑，涉及肝、心等，故选择百会、肝俞、心俞穴。百会属督脉，督脉是人体诸阳经脉之总汇，对整个经脉系统有统帅作用，其主干行于脊里，向上行至项后风府进入脑内，上循巅顶，故督脉与脑、脊髓关系相当密切，历代医家素有“病变在脑，首取督脉”之说。百会为手足三阳经与督脉及足厥阴肝经之会，位居头之巅顶，犹天之极星居北，为百脉聚会之处，是调补中气、疏通脑络、健脑宁神之要穴。心俞、肝俞为背俞穴，属足太阳膀胱经，其主干从头顶入里络于脑，故和脑的关系极为密切，两穴除了调理心脾、疏肝理气之外，还可健脑安神，是治疗神志病的要穴，三穴共奏解郁调神的功效。
参考文献
[1]Duman R S， Malberg J， Thome J. Neural plasticity to stress and antidepressant treatment[J]. Biol Psychiatry， 1999， 46(9):1181.
[2] Kata L C， Lo D C. Neurotrophins and synaptic plasticity[J]. Annu Rev Neurosci， 1999， 22(2): 295.
[3]Willner P， Towell A， Sampson D， et al. Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress and its restoration by a tricyclic antidepressant[J]. Psychopharmacology， 1987，93(3):358.
[4] 李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2003:329.
[5] Dequervain D J， Roozendaa I B， McGaugh J L. Stress and glucocorticoids impair retrieval of long term spatial memory[J]. Nature，1998，394(12):787.
[6] Arimatsu Y， Miyamoto M. Survivalpromoting effect of NGF on in vitro septohippocampal neurons with cholinergic and GABAergic phenotypes[J]. Brain Res Dev Brain Res， 1991， 58(2)：189.
蚂蚁与大象范文3
Changes of nNOS positive neurons in hippocampus and memory consolidation after paradoxical sleep deprivation in rats
【Abstract】 AIM: To study the changes of memory processes and consolidation during paradoxical sleep in rats and to observe the alteration of neuronal nitric oxide synthase immunoreactivity (nNOSIR) neurons in hippocampus after paradoxical sleep deprivation. METHODS: Aradoxical sleep deprivation was performed using the "lower pot technique" The control groups (CC)， tank control groups（TC） and paradoxical sleep deprivation groups（PSD） were tested in Morris Water Maze. At the end of the experiment， the animals were sacrificed under chloral hydrate anesthesia (0.4 g/kg) by intraaortic perfusion of a fixative solution. Coronal sections were cut at 25 μm thickness on a freezing microtome and up to five series of adjacent sections were collected for nNOS immunohistochemical processing using streptavidinbiotinperoxidase complex technique (SABC technique). RESULTS: The memory consolidation in PSD 24 h， PSD 48 h and PSD 72 h rats declined significantly compared with that in TC 24， 48， 72 h as well as CC 24， 48， 72 h rats (P
【Keywords】 sleep; learning & memory; hippocampus;rat; nNOS
【摘要】 目的: 揭示记忆是否在异相睡眠中得到加强和巩固，取消异相睡眠是否导致记忆维持能力下降及其下降的机制. 神经元性一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase， nNOS）是否参与记忆中枢海马结构调节，剥夺异相睡眠（paradoxical sleep deprivation，PSD)是否改变它们在海马的表达. 方法: ①采用小平台法建立PSD大鼠动物模型. 应用Morris水迷宫测试系统检测大鼠空间参考记忆获得及维持的变化; ②海马的nNOS免疫组化研究：PSD 24，48和72 h后，立即取脑、固定、行冰冻切片（片厚25 μm）、SABC法免疫组化染色、光镜下进行观察分析、摄像. 结果：①PSD可造成大鼠空间参考记忆维持能力的损伤； ②PSD组大鼠海马中nNOS免疫反应阳性细胞在CA1，CA2，CA3，CA4及锥体细胞层、颗粒层、齿状回稀疏，数目较相应的大平台组（tank control groups， TC group）、正常饲养组（control groups， CC group）明显减少(P
【关键词】 睡眠；记忆；海马；大鼠； 神经元性一氧化氮合酶
0引言
近年来人们对睡眠和学习记忆之间的关系进行了广泛的研究，尤其是异相睡眠与学习记忆的关系是近年来神经科学研究的热点问题. 以往大量研究集中在异相睡眠与记忆获得的机制上，而异相睡眠与记忆维持的关系所见报道不多. 我们通过Morris水迷宫建立空间记忆获得模型，用小平台技术（flower pot technique）建立异相睡眠剥夺（paradoxical sleep deprivation，PSD)模型［1］. 应用空间记忆获得后PSD的方法，观察PSD后大鼠的记忆维持能力的改变，及其神经元性一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase， nNOS)在学习记忆中枢海马表达的变化. 旨在探讨异相睡眠与记忆维持的关系及其可能机制.
1材料和方法
1.1材料
健康雄性Wistar大鼠45只，体质量（308±20）g ，由甘肃省医学科学院提供. 连续学习训练4 d结束后，立即用随机数字表法将所有大鼠随机分为3组(24 h组， 48 h组和72 h组)，每组15只. 每组再分为：PSD组，大平台（tank control groups， TC）组；正常饲养组（control groups， CC group）. 每小组5只. nNOS多克隆抗体（Ab1参考效价1∶200），SABC试剂盒，DAB显色试剂盒，PBS缓冲液等均购自武汉博士德公司.
1.2方法
1.2.1Morris水迷宫空间记忆动物模型的建立①水迷宫的组成：一直径为150 cm的圆形水池，直径10 cm、高15 cm的平台，以及水迷宫测试系统. 为了增强迷宫与大鼠的色彩对比，水池内壁及平台均漆成黑色. 实验时，平台隐藏在水下（低于水面2 cm），水温保持在（20±2）℃. 水迷宫测试系统购自北京Genheart公司，由数码摄录机、A/D转换卡及与其相连的计算机、相关软件等组成; ②PSD箱的制作：大小30 cm×30 cm×30 cm ，中央放置一直径为6.5 cm，高8 cm的平台. 剥夺箱内注有水，水面低于平台2 cm，水温保持在（20±2）℃左右. 大鼠可以在平台上自由摄取食物和水，但当进入异相睡眠时，由于骨骼肌的松弛使大鼠掉入水中而惊醒，造成PSD. TC组与PSD组的环境相同，只是平台直径为20 cm. CC组饲养在干燥鼠笼内； ③水迷宫空间学习记忆的训练：训练开始前，大鼠单个饲养以适应实验室环境1 wk. 每日逐一给予适当抓摸以消除其恐惧感. 训练在每日8:00～13:00间进行. 预先将迷宫任意分为4个象限. 平台放入上述4个象限中随机选择的1个象限中（在训练的4 d中位置一直保持不变），测量水温和水面距平台的高度达到实验要求后，于池边任意取一入水点，大鼠面向池壁入水，计算机自动跟踪计时. 允许在120 s内找到平台，找到后在平台上保持15 s. 若在120 s内找不到，则将大鼠引导到平台上并保持15 s. 每只大鼠在同一入水点连续训练2次，以第1次训练（trial 1）成绩衡量空间记忆的获得水平，第2次（trial 2）成绩衡量空间工作记忆水平. 全部动物按照上述方法完成第1个入水点的训练后继续进行第2、第3及第4个入水点的训练. 每次训练结束后擦干大鼠身体，放入各自的鼠笼内并适当给予保暖. 连续4 d训练期间，迷宫周围的参照物（包括灯光、周围的器物等）必须保持不变. 其中所有的PSD组、CC组及TC组在4 d训练结束后立即分别放入睡眠剥夺箱、大平台水箱和普通鼠笼，室温控制在（22±2）℃，避免噪音，保持24 h光暗周期，每日7:00～19:00开灯照明. 24，48和72 h后，分别将24， 48和72 h组大鼠再次任意选取两个入水点，每个点连续两次寻找平台，其结果用来衡量记忆的变化. 此时水下平台所处的位置与训练时相同.
1.2.2主要观察指标①大鼠在迷宫中的游泳轨迹（track）；②潜伏期（latency， L），大鼠从入水到找到平台的时间；③距离(distance， D)，大鼠从入水到找到平台的游泳距离；④速度(velocity， V)；⑤平台所在象限轨迹（时间）的分布(percentage of track or time in correct quarter， PQ)；⑥记忆得分(memory score， MS).
1.2.3nNOS免疫组化取脑连续冠状冰冻切片（LEICA RM2135），片厚25 μm，切片入0.1 mol/L PBS液中，隔5取1捞片，4℃冰箱保存备用. 共4套分别采用SABC（streptavidinBiotinperoxidaseComplex）法进行nNOS的免疫组化染色. nNOS阳性细胞胞质呈棕黄色. 每片随机选取5个高倍视野，记数阳性细胞数.
统计学处理：所有数据以x±s表示，连续4 d各点第1， 2次探索距离、记忆得分采用重复测量方差分析，其余数据采用单因素方差分析，均数两两比较行LSDt检验，方差不齐各组间的比较采用非参数检验，P
2结果
2.1大鼠Morris水迷宫空间学习记忆能力的测试随着训练次数的增加，大鼠空间学习记忆能力逐渐增强，连续4 d各点第1，2次探索距离、记忆得分有差异（Tab 1）；PSD 24，48和72 h后各入水点搜索平台的结果也有差异（Tab 2）.表1连续4 d各点第1，2次探索距离、记忆得分的结果（略）表2剥夺异相睡眠24，48和72 h后探索距离、记忆得分的结果（略）
2.2海马的nNOS免疫组化nNOS阳性细胞均为神经元，胞质和突起浓染，大部分集中于锥体细胞层和颗粒细胞层内或边缘，胞体多为锥形或梭形 . PSD组大鼠海马各亚区及齿状回阳性细胞分布稀疏，数目较TC和CC组明显减少(P
3讨论
Morris水迷宫是英国心理学家Morris于20世纪80年代初设计并应用于学习记忆脑机制的研究［2］. 此后，该迷宫系统被广泛运用在神经生物学领域的基础和应用研究中，实验动物主要是大鼠［2］.
我们参考Youngblood等［3］的设计方法，用每个入水点的第一次训练成绩来衡量空间参考记忆的获得和保持水平，用第二次训练成绩来衡量空间工作记A: TC; B: PSD 24 h; C: PSD 48 h; D: PSD 72 h.
忆的水平. 大鼠的每个入水点第一次探索时，由于时间和空间的改变，不能与上一次探索之间形成顺序性关系，大鼠只能依照环境的参照来确定水下平台的位置. 其记忆属性为参考记忆. 大鼠的每个入水点第二次探索时，与第一次探索在空间和时间上都存在连续性，大鼠可以根据刚刚获得的信息找到水下平台，其记忆属性为工作记忆.
实验结果发现，全部大鼠通过训练后建立了不同程度的空间记忆. 从PSD组大鼠在同一时段其第一次探索游泳潜伏期、距离均大于其相应的TC组和CC组，记忆得分（MS）小于TC，CC组大鼠，其差异有显著性（P
nNOS调节中枢神经系统中的NO的释放，长时程增强（long term potentiation， LTP)的表达与NO的产生呈现正相关［4］. Vincent等［5］在研究中发现，NO可以调节Ach的释放，NO释放增多，Ach分泌也增多. 应用NOS抑制剂灌注脑组织可以使Ach基础释放量减少40%，而Ach与学习记忆及睡眠的周期密切相关. 另外，NO还参与突触重塑的调节，NO的减少可使突触重塑能力下降. LTP是神经可塑性和突触传递的一种表现形式，被认为是学习记忆的细胞学基础. 而突触重塑是LTP的基础［4，6］.
实验中发现，PSD后PSD组与TC，CC组相比较，PSD组大鼠海马中nNOS阳性神经元表达稀少，数量明显低于TC和CC组. 因而可以推测：PSD可以造成海马nNOS的表达减少，从而导致NO的产生减少，这可能是导致PSD造成大鼠空间学习记忆能力下降的原因之一.
参考文献
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蚂蚁与大象范文4
【关键词】 抑郁症；黄芩苷；神经营养素-3
【中图分类号】R2855 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）20-0013-03
抑郁症是一种常见的精神性疾病。传统的抑郁症以及抗抑郁药物研究多集中于单胺类神经递质领域。近年来，越来越多的研究支持了抑郁症的神经营养因子假说。神经营养因子是一类主要由星形胶质细胞产生的蛋白质分子，为神经元的生长、存活和功能完整性提供必须的支持作用。已有大量研究发现抑郁症患者血清神经营养素（Neurotrophins， NT）-3水平显著高于正常人[1]，提示NT-3可能参与了抑郁症的发病过程，但两者关系研究还较少。
在前期研究中，笔者采用连续注射皮质酮的方法建立了小鼠抑郁模型，并给予黄芩苷治疗，发现黄芩苷可显著逆转皮质酮小鼠的抑郁样行为，并上调海马中脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor，BDNF）的表达水平[2]，提示黄芩苷的抗抑郁作用可能与增强神经元营养与再生有关，但黄芩苷对NT-3的表达是否有影响尚不清楚。因此，本文主要研究了黄芩苷对小鼠海马内NT-3表达水平的影响，期望以此解释黄芩苷的神经保护以及抗抑郁机制。
1 材料与方法
11 药品 黄芩苷（981%）购自南京泽朗医药科技有限公司，生产批号为ZL111024；皮质酮购自美国Sigma公司，生产批号为B130537；盐酸氟西汀购自常州四药制药有限公司，生产批号为20100623No144。
12 动物 雄性ICR小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，18～22g。实验开始前动物预先适应环境一周，可自由进食和饮水。环境温度为（22±1）℃，每天12h光照（8：00-20：00）。动物实验遵循河南中医学院实验动物伦理委员会规定进行。
13 动物模型 适应1周后，所有小鼠随机分为5组（每组10只）：正常组、皮质酮模型组、黄芩苷组（剂量分别为10、20mg/kg）、阳性对照氟西汀组（剂量为20mg/kg）。除正常组外，其他组每天皮下注射皮质酮（40mg/kg），连续21d。黄芩苷和氟西汀混悬于生理盐水中，于注射皮质酮前30min灌胃给药，剂量为10ml/kg。
14 糖水实验 末次给药24h后，进行糖水实验。所有小鼠均提前断水断粮24 h，每只小鼠置于单独的笼子中，分别给予1瓶1%的蔗糖水和一瓶自来水，两个瓶子随机放置，24h后收取瓶子，量取小鼠的蔗糖水和自来水的摄入量，通过以下公式来计算糖水偏爱百分比：糖水偏爱百分比=糖水摄入量/（糖水摄入量+水摄入量）×100%。
15 强迫游泳实验 糖水实验24h后进行强迫游泳实验。将小鼠放在一个垂直玻璃缸内（直径15cm，高30cm），玻璃缸内水深10cm，温度为24±1℃。每只小鼠游泳6min，用摄像机进行录像，记录每只小鼠的最后4min内的不动时间。
16 组织获取 强迫游泳实验24h后，摘眼球采血并脱颈椎处死小鼠，快速分离海马组织，立即放入液氮中冷冻，随后转移至-80℃冰箱保存待测。
17 qPCR 冰冻的海马组织中加入10倍体积Trizol试剂匀浆后，加入氯仿剧烈震荡15s，静置5min 后于12000g离心15min，取上层相加入等量异丙醇混匀，静置10min 后于12000g 离心10min，弃上清。白色沉淀中加入1mL 75%乙醇洗涤，7500g 离心5min后弃上清，沉淀风干5min，加入40 μL DEPC水溶解，紫外分析仪测定OD260和OD280后等量稀释模板RNA。采用M-MLV反转录试剂盒合成cDNA。采用qPCR试剂盒（染料法），加入相应引物后进行qPCR扩增，采用2-ΔΔCT法分析结果。引物序列：NT-3：上游引物5’-GCGAGACTGAATGA CCGAACT-3’；下游引物：5’- GCCACGGAGATAAGCAAGAAA-3’。内参β-actin：上游引物：5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’；下游引物：5’- TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。
18 统计学分析 采用SPSS200进行统计分析，数据以平均值加减标准差（x[TX-*3]±s）表示，单因素方差分析比较组间差异，P
2 结果
21 黄芩苷对小鼠抑郁样行为的影响 如图1和图2所示，与正常组相比，模型组小鼠糖水偏爱百分比显著下降（P
22 黄芩苷对海马中NT-3水平的影响 如图3所示，与正常组相比，模型组小鼠海马中NT-3的mRNA表达水平显著增高（P
3 讨论
自抑郁症的“神经营养因子假说”提出以来，有关抑郁症的研究逐渐进入了神经营养因子领域。该假说认为，抑郁症患者脑内神经营养因子功能的不足导致神经元突触可塑性受损，进而导致大脑功能紊乱和抑郁症的发生[3]。目前发现的神经营养因子主要有神经生长因子（Nerve growth factor，NGF）、BDNF、NT-3和NT-4等。其中BDNF是神经营养因子中含量最多的，也是研究最充分的。多种抗抑郁药物可以通过增加脑内BDNF含量，促进神经元的存活，并提高突触可塑性而发挥抗抑郁作用[4-5]。笔者在前期研究中发现了黄芩苷可上调海马BDNF的表达发挥抗抑郁作用。其他众多的研究，也发现了黄芩苷具有良好的神经保护效应，这提示黄芩苷的抗抑郁作用可能涉及调节神经营养因子以及对神经元的保护作用。
除了BDNF，NT-3也是一种重要的神经营养因子，在神经系统中广泛分布[6]。与BDNF不同的是，BDNF在抑郁症动物脑内的含量显著减少，表明神经元缺乏足够的营养支持而受到损伤，但NT-3在抑郁症动物脑内却大量增加，尤其在海马内，表明这是动物机体应对神经损伤的一种有效补偿措施，NT-3的增加有利于神经元的存活和功能修复[7-8]。NT-3通过Trk受体活化诱导突触结构和功能的改变，对损伤的突触进行修复，促进神经元分化并诱导轴突生长[9]。在临床抑郁症患者中，也发现了血清NT-3含量显著高于正常人[10]。本研究中发现在皮质酮处理组的小鼠海马内NT-3的mRNA表达水平显著增高，表明长期的皮质酮注射导致海马神经元受到损伤，NT-3代偿性的大量表达促进神经元的修复。黄芩苷组小鼠海马的NT-3表达显著下降，提示黄芩苷通过发挥神经保护作用，对损伤的神经突触作出一定的功能修复，从而恢复了NT-3的正常表达，这可能是黄芩苷抗抑郁机制之一。
参考文献
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蚂蚁与大象范文5
【摘要】
目的 研究LY294002靶向抑制PI3K/Akt信号通路对线粒体激活因子（Smac）基因的表达及胃癌细胞凋亡的影响。 方法 将PI3K/Akt信号通路的靶向抑制剂LY294002加入胃癌细胞株SGC7901，四甲基偶氮唑蓝法测定细胞增殖，DNA ladder检测细胞凋亡，原位细胞凋亡检测技术检测细胞凋亡，流式细胞仪检测细胞周期，免疫组织化学检测Smac的表达。 结果 LY294002致细胞存活率下降，且与时间、浓度呈正相关。在DNA电泳图上，对照组呈规则的基因组断裂条带，其亮度与药物作用时间呈正相关。流式细胞结果显示LY2940002处理后在细胞周期G1期前出现明显的凋亡峰，作用12 h时，细胞凋亡达58.7%。Smac在胃癌细胞中仅在胞质中呈阴性或弱阳性表达；LY294002作用后，细胞质中出现棕黄色颗粒状浓染。 结论 PI3K/Akt信号通路、Smac基因与胃癌细胞的凋亡关系密切。
【关键词】 1磷脂酰肌醇子激酶； 线粒体蛋白质类； 胃肿瘤； 肿瘤细胞， 培养的； 细胞凋亡
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均较高，其异常的细胞凋亡和增殖在胃癌的形成和进展中具有重要意义。近年研究发现，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)的线粒体激活因子(second mitochondriaderived activator of caspases，Smac)是一种从线粒体内释放到细胞质中的重要凋亡调节蛋白，能增加Caspase3活性，促进细胞凋亡[1]。笔者拟通过LY294002靶向抑制胃癌细胞SGC7901来探讨PI3K/Akt信号通路、Smac基因与胃癌细胞的凋亡关系。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 胃癌细胞系SGC7901由本实验室传代培养，含10%小牛血清(美国SIGMA公司)的RPMI 1640培养基，在37 ℃培养箱中培养，2～3 d更换培养基1次
1.1.2 实验试剂 Smac多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；PI3K抑制剂LY294002（美国Promega公司）；流式细胞仪（Coulter，Epicus ELITE，ESP，美国)。
1.2 方法
1.2.1 LY294002溶液的配置 按照配制说明书先将 LY294002干粉5 mg充分溶解于二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液325 μL中，配制成50 mmol/L的LY294002溶液，移入-20 ℃冰箱储存，用前稀释成所需的浓度。
1.2.2 四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞生长活性 选择对数生长期细胞，接种于96孔培养板，另设不加细胞的培养液为对照组。实验组分别给予终浓度为10，30，50 μmol/L的LY294002（DMSO≤0.05%），对照组加入同等浓度的DMSO，每孔设3个复孔。再培养4，8，12 h，每孔分别加入5 g/L的MTT 10 μL。加DMSO 100 μL，振荡。用酶标仪在波长490 nm处测每孔光吸收值（D），重复3次。计算：
细胞存活率（%）=D试验组/D对照组×100%。
根据MTT结果选择出干预浓度和时间。
1.2.3 DNA Ladder检测 收集各组细胞，用PBS重悬，加入细胞裂解液(1%NP40，20 mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris)400 μL，反应10 min，离心收集上清，加入十二烷基硫酸钠(SDS)至1%浓度，加入RNA酶在56 ℃作用1 h，加入蛋白酶K 37 ℃处理过夜，乙醇沉淀DNA，TE溶解DNA，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并拍照。
1.2.4 原位细胞凋亡检测技术（TUNEL）检测细胞凋亡 将细胞接种在放有盖玻片的6孔板内，取对数生长期细胞。待细胞长满后，给予终浓度为10，30，50 μmol/L的LY294002（DMSO≤0.05%），分别培养4，8，12 h后，取出盖玻片，用4%多聚甲醛溶液固定，并与阻断剂室温孵育30 min。PBS洗片，与通透液在冰浴中孵育2 min。滴加TUNEL反应混合溶液50 μL，在湿盒中37 ℃孵育。加入转化剂(POD)50 μL，在37 ℃湿盒中孵育30 min。加入DAB底物溶液50～100 μL，封片，在光镜下分析结果：
细胞凋亡指数=凋亡细胞数倒置显微镜计数200个细胞
1.2.5 流式细胞仪检测 调整待测细胞的密度。设置对照组及观察组。收集细胞，70％冷乙醇固定24 h，10 μg/mL RNaseA 37 ℃温育30 min后，加碘化丙啶(PI)使其终浓度达20 μg/mL，暗处作用＞0.5 h。
1.2.6 胃癌细胞SGC7901 Smac表达的检测 将细胞接种在放有盖玻片的6孔板内，当盖玻片面上的细胞长至70%～80%融合时，加入终浓度为50 μmol/L的LY294002，不加药物作为对照组，培养4，8，12 h，小心取出长有细胞的盖玻片，4 ℃冷丙醇固定，按试剂说明行SP法免疫组织化学染色，用PBS代替一抗作为阴性对照片。采用Gatalica等的半定量积分法计算[5]。
1.3 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS 11.5统计软件，2组间各指标均数的比较采用t检验，多组间指标的比较均采用单因素方差分析（OneWay ANOVA）、LSDt和SNKq检验。计数资料比较采用卡方检验。P
2 结果
2.1 MTT法检测胃癌细胞增殖 随着不同浓度LY294002作用时间延长，细胞的存活率呈逐渐下降趋势(P
表1 四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞存活率（略）
Tab 1 Cell viability of SGC7901 cells after exposure of LY294002(10～50 μmol/L) for 4，8，12 h
同一浓度LY294002干预不同时间相比较，#：P
2.2 胃癌细胞凋亡结果
2.2.1 DNA Ladder结果 对照组呈规则的基因组断裂条带，50 μmol/L的LY294002作用4，8，12 h后，均可见180～200 bp的梯型条带，其亮度与药物作用时间呈正相关。随着LY294002作用浓度增加，胃癌细胞凋亡增加（图1）。
2.2.2 TUNEL检测结果 50 μmol/L LY294002作用4，8，12 h，细胞的凋亡指数上升，且在同一时间点上，随着干预浓度增加，细胞凋亡指数升高；在同一浓度点上，随着作用时间延长，细胞凋亡指数升高（表2，图2）。
M：maker；1：对照组；24：LY294002作用4，8，12 h.
图1 DNA Ladder 电泳图（略）
Fig 1 DNA Ladder
表2 TUNEL法检测细胞凋亡指数（略）
Tab 2 Cell apoptotic index of SGC7901 cells after exposure of LY294002(10～50 μmol/L) for 4，8，12 h
不同浓度LY294002干预相同时间相比较，#：P
2.3 胃癌细胞增殖周期改变 同一浓度LY2940002处理SGC7901细胞不同时间，在细胞周期G1期前出现明显的凋亡峰，50 μmol/L LY294002处理8 h时，凋亡细胞就达33.7%；12 h时，凋亡细胞达58.7%（图3）。
2.4 LY294002对Smac蛋白表达的影响 Smac蛋白表达于细胞质内，呈淡黄色或棕黄色分布，在胃癌细胞中仅在胞质中呈阴性或弱阳性表达(χ2=36.246，P
表3 同一浓度LY294002作用不同时间后Smac蛋白表达变化（略）
Tab 3 The expression of protein Smac after exposure of LY294002(10～50 μmol/L) for 4，8，12 h
箭头所指为阳性细胞. A：对照组；B～D：10 μmol/L作用4，8，12，随作用时间延长，阳性细胞粒增加h；E～G：30 μmol/L作用4，8，12 h，阳性细胞粒与作用时间成正比；H～J：50 μmol/L 作用4，8，12 h，作用时间越长，凋亡细胞越多.
图2 TUNEL法检测胃癌细胞凋亡（略）
Fig 2 TUNEL analysis
AP：凋亡细胞；A：对照组；B～D：LY294002 50μmol/L作用4，8，12 h.
图3 流式细胞检测不同浓度LY294002干预SGC7901细胞凋亡（略）
Fig 3 Flow cytometry analysis about apoptosis
箭头所指为阳性细胞. A：4 h；B：8 h；C：12 h，作用时间延长，细胞质着色增加.
图4 LY294002对Smac蛋白表达的影响(×400)（略）
Fig 4 The effect of LY294002 on the expression of protein Smac(×400)
3 讨论
3.1 PI3K/Akt信号通路与肿瘤 细胞通过各种通路所形成的复杂的网络来传递各种增殖和凋亡信号。其中，PI3K/Akt信号通路在多种人类肿瘤中表达失调，调节肿瘤细胞的增殖和凋亡，并与肿瘤的血管形成和侵袭转移也密切相关，因此影响患者的预后，同时也为肿瘤的治疗提供了新的靶点。PI3K/Akt信号通路在胃肠道肿瘤的发生、发展中起关键作用。
3.2 PI3K抑制剂 目前PI3K的抑制剂只有LY294002和Wortmannin，它们是结构明显不同的复合物，工作浓度差异较大。尽管LY294002的工作浓度是Wortmannin的500倍，但由于其在溶液中较Wortmannin稳定性强，因此其作为PI3K的选择性抑制剂更有应用前景，已广泛用于细胞生物学研究[2]。研究表明，LY294002能够竞争性地抑制PI3K亚基中的ATP结合位点，进而抑制胃癌细胞的增殖，但同时它不抑制PKC、PKA、MAPK、EGFR等磷酸激酶的表达[35]。本研究结果显示，LY294002致细胞存活率下降，且与时间、浓度呈正相关，能有效抑制胃癌细胞的增殖，促进胃癌细胞的凋亡，这可能为肿瘤靶向药物的开发提供一条新的思路。
3.3 LY294002、PI3K/Akt信号通路与细胞 研究认为，在PI3K/Akt信号通路中，PI3K通过调节亚基中的SH2区域和受体接触，导致催化亚基的异构性激活。随着PI3K的激活，PIP3和含有PH区域的蛋白结合，导致这些蛋白构像的改变[6]。磷酸化结合的PH区域存在于大多数的蛋白中，它对于活化了的PI3K的转化是很重要的，可促进其下游分子Akt/PKB的磷酸化。随着其第308位上的苏氨酸位点和第473位的丝氨酸位点的磷酸化，可最大限度地激活Akt。活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，进而调节细胞的增殖、凋亡[78]。本研究显示，作为PI3K/Akt信号通路中PI3K的靶向抑制剂，LY294002可导致细胞存活率下降，且与时间、浓度呈正相关，这与上述相关研究结果相符。
3.4 Smac蛋白与胃癌细胞 Smac是近年新发现的一种从线粒体内释放到细胞质中的重要凋亡调节蛋白，是除细胞色素C外被认识的第二种线粒体促凋亡蛋白，能通过增强Caspase3活性，促进细胞凋亡[9]。本研究发现，Smac在细胞质表达与细胞凋亡的程度明显相关，随着凋亡增加，其表达增多，阳性率增强。可见，LY294002作用后，胃癌细胞Smac蛋白表达上调。笔者认为，LY294002作用于胃癌细胞，启动了细胞的凋亡程序，而这可能就包括了Smac蛋白的表达，从而进一步启动凋亡，促进凋亡进程。目前研究表明，Smac蛋白可通过两种途径促进凋亡，即对Caspase3的蛋白水解作用和增强成熟Caspase3的酶催化活性，故笔者推测Smac蛋白可能通过上述作用促进胃癌细胞凋亡，这可能为调控胃癌细胞凋亡提供一个新的途径。
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蚂蚁与大象范文6
【关键词】益气活血化瘀法；肝癌前病变；TGF-β1；Smad4
肝癌细胞的凋亡在肝癌发生发展过程中起重要作用，而TGF-β1、Smad4蛋白酶在肝癌凋亡信号传导中起重要的作用，研究表明TGF-β1、Smad4蛋白酶的激活与肝癌细胞凋亡有密切联系[1-2]。因此，在肝癌的预防及治疗工作中研究TGF-β1、Smad4是十分有必要的。我们综合前期的研究成果认为益气活血化瘀法对肝癌前病变细胞有显著的防治作用，为了探讨该法在肝癌细胞和肝癌相关疾病过程中的作用机理，我们应用二乙基亚硝胺（DEN）方法诱导大鼠肝癌细胞模型，进一步观察该法在肝癌促癌过程中对Smad4、TGF-β1的变化及影响。
1 材料与方法
1.1 药物：中药组成：黄芪、炒白术、丹参、川芎、当归、石见穿、地虫，分别配制成含有生药浓度0.5g/ml 、1.0g/ml的两种中药制剂.
1.2 动物：清洁级雄性Wistar大鼠共80只，大鼠体重80克～100克，大鼠由长春高新医学动物研究中心提供.实验动物大随机分空白组、模型组、中药低剂量组和中药高剂量组4组。
1.3试剂与设备：TGF-β1、Smad4试剂盒购买于南京建成试剂有限责任公司；二乙基亚硝胺由Sigma公司生产；加样枪德国生产；德国离心机CR21型；日本MDF-V50V型超低温冰箱；玻璃匀浆器；分光光度仪，美国生产。
1.4 实验方法：在第1周将正常组大鼠腹腔注射生理盐水100mg/kg，将模型组、中药组大鼠腹腔注射DEN造模，剂量为100mg/kg.从第2周开始，中药组大鼠和模型组大鼠按每周70mg/kg DEN的水溶液剂量，连续灌胃20周.造模成功后，中药低剂量组给予每日生药含量0.5g/ml的中药汤剂按10ml/kg灌胃，每日进行1次；中药高剂量组按1.0g/m标准进行，每日1次；正常组和模型组大鼠给予10ml/kg生理盐水每日1次灌胃，共20周.4组分别于喂养第4、第12、第20周时，各组分别取5只大鼠杀死后取肝脏组织，第20周时将其余大鼠全部杀死后剖取肝脏.并在肝脏左叶的取相同的部位取材，除去血液后拭干，并按2g：2ml的比例加如入冰盐水，用玻璃匀浆器在冰浴中制作成匀浆.在离心机离心20分钟后取离心上清液封存，置于低温冰箱保存备用.
1.5 统计分析：各组数据以（均数±标准差）表示，应用SPSS15.0统计软件计学处理.检验方法用方差分析，组间的比较采用LSD法检验和q（SNK法）
2 结果
3 电镜下病理改变
正常组：细胞多成圆形或核圆，可见1至2个核仁，在肝脏细胞浆内见有线粒体、糖原颗粒结构、粗面内质网结构.
模型组：可见细胞排列紊乱，肝脏细胞核形不规整，线粒体、滑面内质网增多，大部分线粒体嵴显示不清，粗面内质网明显扩张，出现次级溶酶体增多.
中药低剂量组：可见镜下肝脏细胞排列不规则，细胞膜不规整，肝细胞核缩小，细胞核形态不规整，见少量线粒体膜性结构融合，粗面内质网结构可见轻度扩张，肝脏胞浆内见少量次级溶酶体.
中药高剂量组：可见镜下肝脏细胞排列不规整，肝脏核膜有皱缩，线粒体大小形态未见明显改变，线粒体嵴显示欠清，滑面内质网少部分增生.
4 光镜下病理改变
空白组：各个时期的大鼠肝脏细胞形态基本正常，细胞排列基本完整，肝小梁、肝血窦排列基本正常。
模型组：4周时出现部分肝脏细胞变性、坏死、甚至空泡样改变；12周时，肝脏细胞纤维化出现。肝脏局限性增生结节形成，数量逐渐增多。部分肝脏出现核异质变性；20周时，增生结节呈逐渐增大，结节内肝脏细胞异型性出现，部分表现为核异质变性，异性细胞结发展，癌变细胞于结节中出现。
低剂量组：4周时，未见细胞空泡样变性；12周时，异常增生节形成，部分纤维化改变出现。20周时，病变相当于模型组第12周的改变，未见明显的肝脏癌变细胞。
高剂量组：第4周时，与低剂量组基本相同；12周时，肝脏细胞异常增生结节明显形成，少部分大鼠出现部分纤维化改变，但程度较轻。20周时，肝细胞改变与模型组第12周相近，但程度仍较轻。
5 讨论
研究发现，Smad4为TGF-β1信号传递蛋白，两者在恶性肿瘤中的表达密切相关，Smad4是TGF-β1的信号从胞质传导到细胞核内的中介分子，在TGF-β1诱导基因表达调控和随后的生长抑制中是必不可少的关键转录因子[3]。TGFβ1/Smads信号转导通路的改变在许多肿瘤的发生和发展中起着非常重要的作用，TGFβ1/Smads信号转导通路通过调节基因转录，使细胞生长抑制、分化或凋亡，这一通路中的任一环节异常都会导致细胞生长分化失去控制。
实验结果表示，益气活血化瘀法在大鼠肝癌的形成过程中能明显上调肝脏TGF-β1的表达水平和下调肝脏Smad4的表达水平，对TGF-β1、Smad4的作用具有一定的剂量依赖性。因此我们分析，益气活血化瘀法可能通过上调TGF-β1和下调Smad4水平来抑制大鼠肝癌细胞的形成水平来抑制大鼠肝癌的形成。通过光镜、电镜组织病理改变，提示益气活血化瘀法对肝癌前病变组织有明显的修复作用。
参考文献：
[1] He Y，Yang F，Wang F，et al. The upregulation of expressedproteins in HepG2 cells transfected by the recombinant plas-mid-containing HBx gene[J]. Scand J Immunol， 2007， 65（3）：249-256.
[2] Migita K， Miyazoe S， Maeda Y， et al. Cytokine gene poly-morphisms in Japanese patients with hepatitis B virus infec-tion--association between TGF-beta1 polymorphisms and hep-atocellular carcinoma[J]. J Hepatol，2005， 42（4）： 505-510.
