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有气质的句子范文1
2、瀑布一般的长发，淡雅的连衣裙，标准的瓜子脸，聪明的杏仁眼，那稳重端庄的气质，再调皮的人见了你都会小心翼翼。
3、考虑到你，有理想，有远见，且智慧过人，宇宙超级天才，人见人爱，花见花开，车见车爆胎，所以只好提前祝你三八节快乐。
4、没有德性的美貌，是转瞬即逝的；可是因为在你的美貌之中，有一颗美好的灵魂，所以你的美貌是永存的。
5、好女人是山，端庄大方，好女人是水，柔情绵绵，好女人是书，满腔智慧，好女人是港，安全可靠。
6、青翠的柳丝，怎能比及你的秀发；碧绿涟漪，怎能比及你的眸子；有时，我凝视床头你那张玉照，简直觉得整个世界都永远沉浸在明媚的春光之中。
7、三八三八女人如花，国家给假，咱不回家，姐妹扎堆，咿里哇啦，逛逛商场，染染头发，所有消费，爷们刷卡，妇女解放就一天啊！
8、尽管你身材纤弱娇小，说话柔声细气，然而却很有力量，这是一种真正的精神美！
9、世界上最美的是你的脸庞，世界上最温暖的是你的胸膛，世界上最有力的是你的臂膀，世界上最纯洁的是你的心肠。
有气质的句子范文2
2、不安于小成，然后足以成大器；不诱于小利，然后可以立远功。
3、只要你愿意走，总会有路，人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
4、看淡拥有，不刻意追求某些东西，落叶归根，那些属于你的，总会回来。
5、不必仰望别人，自己亦是风景。
6、每个圣人都有过去，每个罪人都有未来。
7、这世上，最不缺的就是玻璃心。
8、失败比成功更具有吸引力。
9、多一些努力吧，少点功夫矫情。
有气质的句子范文3
论文关键词：知识交流 知识管理 咨询企业 知识商品化; 知识型企业; 知识经济时代; 隐性知识 激励员工 组织结构 企业内部
一、知识型企业的特征
为了实现知识型企业的目标，首先我们必须了解什么是知识型企业，在知识型企业中必须解决好如何对知识经济的基础一一知识进行管理，如何对知识的生产者和持有者一一企业员工进行管理，如何对知识的交流和使用场所一一企业组织进行管理等几个关键问题。
(一)知识型企业的知识管理
工业社会中的重要资源是资本，而知识社会中的主要资源是知识。知识已成为社会经济发展的关键，成为企业获取巨大经济效益的主要手段。进入知识经济时代的企业处在信息化、知识化的社会环境中，面临急剧增长的知识和信息，因此，必须高度重视对知识资源开发、利用的管理。通过开发、交流和利用知识，为企业创造更多的价值，这是企业知识管理的根本目的。
在知识管理中，如果从企业对知识的管理范围看，它涉及到知识的内部管理和外部管理。知识的内部管理包含知识在企业内部的生成、交流、积累和应用四个环节。企业知识的内部管理应该能够营造一个有利于员工生成、交流、验证知识的宽松环境；建立一个企业内部信息网，便于员工进行知识交流；制定各种激励政策鼓励员工进行知识交流；利用各种知识数据库、专利数据库存放知识、积累知识；放松对员工在知识应用方面的控制，鼓励员工在企业内部进行个人创业，促进知识的应用。知识的外部管理目的是通过在企业之间的交流、合作等对知识进行有效的管理，使企业积累更多知识，获得更大的收益。
知识的外部管理应该能够使企业可以有效地和其它企业进行知识交流、知识共享，有效地与其他专门的知识外部供应商进行合作，与企业竞争者共享知识共同开拓和培育市场。
从知识管理所涉及到的管理过程来看，可以将知识管理分成知识生成管理、知识交流管理、知识积累管理和知识应用管理。知识的应用是知识管理的目的，知识交流是生成新知识的必要手段，知识的更新是企业创新的动力，知识的积累是企业发展的基础。企业的知识生成管理的目的在于，促进企业员工不断学习知识、交流知识，通过不断更新、补充知识，使员工能够不断超越自我，激活员工和企业的创新能力给企业带来新的活力。
知识只有通过互相交流才能得到发展，也只有通过使用才能从知识中派生出新知识。知识的交流越广效果越好，只有使知识被更多的人共享，才能使知识的拥有者获得更大的收益。将分散在各个员工头脑中的零星知识资源整合成强有力的知识力量，是知识积累和应用管理的目的通过对知识积累和应用管理使企业能够更好地运用企业人才资源的集体智慧，提高对市场的应变能力和创新能力，通过知识积累管理和知识应用管理激励员工将自己的知识融入集体知识中，形成知识创新能力和企业的核心竞争力，当企业的核心竞争力和员工的知识优势结合在一起时，就可以使企业能够对外部市场需求作出快速反应，明智地运用内部资源、正确地预测市场的发展方向和变化，使企业永远立于不败之地。
(二)知识型企业的人才资源管理
人在知识经济时代具有特殊的重要性，因为知识的开发、更新和应用都需要人来完成。从员工在知识型企业中的重要性来看，并不是因为他们掌握了某些秘密知识，而是因为他们具有不断创新和创造新的知识的能力，他们可以在没有先例可循的情况下在实践中不断丰富、支配和应用创新知识。员工的创新和创造能力是一种特殊资源，企业应该针对其在知识开发中的独特性，实行有效的、有针对性的人才资源管理。
为了实现对人才资源的有效管理，企业通常将企业内部的人才资源按照其对知识的生成、交流、应用所起的不同作用分成五类：1、知识生产者或构思者。他们能够通过对市场、产品、知识的分析，提出新产品、新工艺、新服务的构思，即对知识商品化的可能性进行构思。2、知识商品化的倡导者。他们能够确认新知识或新构思，能够提出并推动新产品、新工艺、新技术和新服务的实现。3、知识商品化的领导者。他们有能力策划、协调在知识商品化过程中涉及的各项具体活动及人员，以顺利完成知识的商品化。4、知识分析者。他们主要完成对影响企业内外环境的信息和知识的收集、整理、分析和传播，促进知识的交流和更新。5．幕后保护人。能够指导前四种关键人物中的缺乏经验者，在幕后保护、支持知识的创新、应用，给遇到挫折的前四种关键人物以支持，甚至不惜提供“非法”的计划外经费支持员工在企业内部个人创业。知识犁氽、¨，的人才资源管理重点是放在这五类关键人才上的。
知识型企业对人才资源所拥有的隐性知识往往采取各种方法促使其自觉地奉献给企业，为大多数员工共享，使员工的隐性知识转化为企业的强大生产力。企业除了利用内部计算机信息网络，为员工的知识共享提供方便外，还鼓励员工积极奉献自己所具有的创新知识，让奉献出隐性知识的员工觉得，奉献出自己所具有的知识要比让知识永远滞留在自己的头脑中好得多。其主要措施有：日某员工所提出的创新知识得到其他员工的响应或被知识商品化倡导者所确认，他就有权组织一些员工实现其设想，并从中获得相应的报酬和奖励。如果该员工缺乏组织才能，企业就应提供有影响的管理人员予以帮助，或者由其他具有管理才能的知识商品化领导者组织开发，但是首先提出这种创新知识或构思的员工，或在创新开发中提供关键知识帮助的员工都有权从这种开发活动的收益中获得一定的报酬，以此来激励员工积极奉献自己头脑中的隐性知识。
对员工的知识应用激励不仅发生在员工成功应用知识之时，更应该在员工进行知识应用、知识创新遭到失败时给予宽容，鼓励员工在创新中不怕失败。只有管理人员对失败的高度容忍，员工的知识才可能从失败中更新、完美。员工在知识创新中是否怕失败，在很大的程度上取决于管理人员对失败的容忍程度。当然，管理人员宽容态度必须有赖于企业内部或外部的风险基金支持，有风险基金支持的管理人员才可能允许知识创新的失败，否则一次知识创新失败就可能使企业陷入不能自拔的困境。
二、知识型企业的组织结构管理
知识是否能够在企业内得到有效的应用，其中的个重要条件就是员工必须能够顺利地进行知识交流。员工间的知识交流不仅要在具有相同知识结构的人员之间进行更重要的是要和具有不同知识结构的人员进行交流。这样才能从不同的知识结构和知识领域内获得灵感和启迪，并且在应用知识进行创新开发时能够直接得到不同知识结构人员的帮助，以弥补自己的不足。因此，知识经济时代的组织结构必须有助于知识的交流和应用，而目前国内企业所采用的金字塔型组织结构却严重地禁锢了不同部门具有不同知识结构的员工之间的接触和交流，妨碍了知识的更新和应用。因此，这种组织结构在国外知识型企业中已被淘汰，而代之以一种新型组织结构。这种组织结构具有这样一些特点：
1、有利于员工的相互影响、沟通和知识共享。这种沟通不仅仅发生在企业内部员工之间、部门之间而且还应该发生在企业与外部客户、供应商、同行之间。这样不仅可以使员工了解其他员工在做什么自己是否能够提供帮助，是否对自己的研究工作有启发，而且还能使企业了解同行在做什么，同行是否走在了自己的前面，客户需要什么，本企业是否能够满足客户的要求等。
2、有利于企业的知识更新的深化。组织结构的设置应该使企业各部门之间能够交流各自所拥有的知识，能够使外界的最新知识迅速地传人企业，并能迅速被企业员工所知晓，使企业和员工所拥有的知识在知识的内外交流和合作开发中得到更新和深化。
3、有利于企业集中资源完成知识的商品化。企业拥有知识的最终目的在于使知识商品化，使企业获得更大的市场效益。因此，企业的组织结构应该有利于企业调动资源，集中力量完成知识的商品化，有助于协调知识商品化过程中的研究、设计、制造、营销等各种活动。
4、有利于企业掌握对环境的适应能力。能够通过对外界环境的“适应纠正一一再适应”过程使企业充满活力，以有助于提高组织的工作效率，能够迅速地对外部市场的不确定性、多变性作出迅速、灵敏的反应。
5、有助于增强企业员工的团队合作精神。应该注意的是，这个团队不仅包含企业内部人员，还应包含企业的供应商和忠实的客户。这样才能使知识产品按照市场需要设计，按照资源最优化配置来生产。要组建个充满合作精神的团队，需要员工、客户和供应商拥有共同的语言、价值观和企业文化。
6、有利于知识商品化过程中关键角色的明确和确认，使其顺利地发挥各自应有的作用。由于知识经济中资本要素与知识要素的重要性发生了变化，知识的增值能力远远超过资本的增值能力。因此，在企业组织结构中的知识结构就应该替代资本的权力结构。在组织权力结构设置中，应该注意让知识渊博、判断能力强的五种关键人物参与更多的企业战略决策。
知识型企业的组织管理体制还应该是一种宽松的、民主的管理体制，企业的发展出路在于企业管理体制的建设，企业需要高水平的领导，正确的战略指导，优良的产品服务和实用的、创新的知识和技术。而要达到这一点，就应将企业的管理模式从严格的控制转向宽松的管理，在完善的管理体系和机制下使每一员工均有余地和动力在企业战略的指导下充分发挥自己的能动性和创造性。
目前知识型企业所采取的组织结构大多是围绕产品项目开发而形成的项目网络组织结构。在这种组织结构中，每一个项目小组都拥有来自不同知识领域的员工，这些员工为开发某一项目而聚集在一起进行知识的交流和应用。一旦项目完成，就为开发新的项目而重组，员工在项目开发过程中不断地聚集、分散、再聚集，从而使员工和企业的知识在这种组织的形成、消亡、再形成的过程中得到不断的交流和更新。
综上所述，知识型企业的管理是一种高度和谐、亲善、融洽的管理，其管理对象是知识，管理重点是人才，管理基础是组织结构，在管理中强调企业和员工的自我组织、自我调节功能，使企业成为一个密切合作的团体，能够在知识经济时代协调一致地、有序高效地运转。
三、中国国有投资咨询企业在知识经济下的机遇和挑战
随着改革开放的深人，中国国有投资咨询企业必须顺应时代的变革，逐步将自身改造成为知识型企业。国有投资咨询企业要实现知识型企业的转变首先是观念的转变，然后是体制的转变，最后才能实现知识型企业的整体转变，国有投资咨询企业必须对自己进行准确的定位才能走向正确的变革之路。
从国有投资咨询企业的内部看，由于企业的体制是派生于国家具备项目审批和相关管理权限的主管部门，天然地享受着国有资本的垄断红利，自然缺乏自我否定、自我创新的源动力。从人力资源体制看，由于国有企业的人力资源管理采用自上而下的管理体制，员工几乎是终身聘用制，使得员工自然产生唯上而不唯业、唯稳而不唯新的人才垢病，让员工将更多的心思放在如何搞好领导关系和如何求稳不犯错误的不良状态，而不是把精力集中在知识交流和知识创新上。从管理机制上采用传统的行政管制加工业企业的管理手段，管理者哟专制权利和自上而下的命令、指示，严重压抑了员工的创造力和交流环境，知识的更新和传播自然被压制到最小程度，以现有的体制模式要实现知识型企业的转变可见困难何其之多。
但是世界的主流是知识型经济模式，而中国也正在经历一个产业行政体制改革和升级结构调整的转变期，改革和调整意味着部分垄断行业将因为行政管辖的弱化而失去垄断地位，一个开放的咨询市场体系需要的不是按部就班、人云亦云的咨询服务企业，而是需要那种具备深厚知识沉淀和知识创新的咨询企业，如果国有投资咨询企业继续沿袭现有的模式面对挑战，有可能会被国外咨询业巨头挤出市场。
机遇和挑战并存是千古不变的真理，不进则退是历史赋予我们的历史使命，国有投资咨询企业的变革既要反对言而不行的形式主义，也要反对盲目冒进的机会主义，这个变革过程是个缓慢的螺旋形上升过程，是一个需要五年甚至更长的时间才能实现的战略目标二从战略角度看，企业战略目标的达成必须准确地进行战略细分，并且针对外部大环境和自身小环境对变更的进度和程度进行有效地控制。
有气质的句子范文4
关键词：不具有商业实质；存货换入；投资换入；会计处理
不具有商业实质的非货币性资产交换，应当以换出资产的账面价值和应支付的相关税费作为换入资产的成本，不确认权益。企业发生的不具有商业实质的非货币性资产交换涉及不同的非货币性资产，其具体会计处理也各不相同。下面主要分析存货换入其他资产、投资换入其他资产的会计方法。
一、以存货换入其他资产
1.以存货换入投资
企业以存货换入投资且不涉及补价的。应当以换出存货的账面价值和应支付的相关税费作为换入投资的成本，借记“长期股权投资”、“持有至到期投资”等科目，按换出存货计提的跌价准备，借记“存货跌价准备”科目，按换出存货的账面余额，贷记“库存商品”、“原材料”等科目，按换出存货的增值税销项税额，贷记“应交税费——应交增值税（销项税额）”科目，接应支付的其他相关税费，贷记“银行存款”、“应交税费”等科目。
2.以存货投入固定资产
企业以存货换入固定资产且不涉及补价的，应当以换出存货的账面价值和应支付的相关税费作为换入固定资产的成本，借记“固定资产”科目，按换出存货计提的跌价淮备，借记“存货跌价准备”科目，按换出存货的账面余额，贷记“库存商品”、“原材料”等科目，按换以存货的增值税销项税额，贷记“应交税货——应交增值税（消项税额）”科目。按应支付的其他相关税费，贷记“银行存款”、“应交税费”等科目。
3.以存货换入无形资产
企业以存货换入无形资产量不涉及补价的，应当以换出存货的账面价值和应支付的相关税费作为换入无形资产的成本。支付补价的，企业应当以换出存货的账面价值和应支付的相关税费以及补价作为换入无形资产的成本。收到补价的，企业应当以换出存货的账而价值和应支付的相关税费减去补价作为换入无形资产的成本。
二、以投资换入其他资产
1.以投资换入存货
企业以长期股权投资换入存货且不涉及补价的，应当以换出投资的账面价值和应支付的相关税费，减去可抵扣的增值税进项税额，借记“原材料”、“库存商品”等科目，可抵扣的增值税进项税额，借记“应交税费——应交增值税（进项税额）”科目，按换出投资计提的减值准备，借记“长期股权投资减值准备”、“持有至到期投资减值准备”等科目，按换出投资的账面余额，贷记“长期股权投资”、“持有至到期投资”等科目，贷记“银行存款”、“应交税费”等科目。
支付补价的，企业应当以换出投资的账面价值和应支付的相关税费以及补价减去可抵扣的增值税进项税额，借记“原材料”、“库存商品”等科目，按可抵扣的增值税进项税额，借记“应交税费——一应交增值税（进项税额）”科目，按换出投资计提的减值准备，借记“长期股权投资减值准备”、“持有至到期投资减值准备”等科目，按换出投资的账面余额，贷记“长期股权投资”、“持有至到期投资”等科目，按应支付的其他相关税费和支付的补价，贷记“银行存款”、“应交税费”等科目。
收到补价的，企业应当以换出投资的账面价值和应支付的相关税费，减去可抵扣的增值税进行税额和补价，借记“原材料”、“库存商品”等科目，按可抵扣的增值税进项税额，借记“应交税费一应交增值税（进项税额）”科目，按收到的补价，借记“银行存款”科目，按换出投资计提的减值难备，借记“长期股权投资减值准备”、“持有至到期投资减值设备”等科目，按换出投资的账面余额.贷记“长期股权投资”、“持有至到期投资”等科目，按应支付的其他相关税费，贷记“银行存款”、“应交税费”等科目。
2.以投资换入固定资产
企业以投资换入固定资产且不涉及补价的，应当以换出投资的账面价值和应支付的相关税费作为换入固定资产的成本，借记“固定资产“科目，按换出投资计提的减值准备，借记“长期股权投资减值准备”、“持有至到期投资减值准备”等科目，按换出投资的账面余额，贷记“长期股权投资”、“持有至到期投资”等科目，按应支付的其他相关税费，贷记“银行存款”、“应交税费”等科目。
支付补价的，企业应当以换出投资的账面价值和应支付的相关税费以及补价作为换入固定资产的成本，借记“固定资产”科目，按换出投资计提的减值准备，借记“长期股权投资减值准备”、“持有至到期投资减值准备”等科目，按换出投资的账面余额，贷记“长期股权投资”、“持有至到期投资”等科目，按应支付的其他相关税费和补价，贷记“银行存款”、“应交税费”等科目。
收到补价的，企业应当以换出投资的账面价值和应支付的相关税费减去补价作为换入固定资产的成本，借记“固定资产”科目，按收到的补价，借记“银行存款”科目，按换出投资计提的减值准备，借记“长期股权投资减值淮备”、“持有至到期投资减值准备”等科目，按换出投资的账面余额，贷记“长期股权投资”、“持有至到期投资”等科目 。
参考文献：
有气质的句子范文5
各区、县劳动局、财政局、税务局，市财政各分局，各企业主管局、总公司：
北京市财政局、税务局、劳动局印发《关于主要副食品零售价格变动给职工适当补贴的发放办法》的通知（即京财预〔1988〕504号文）等下发后，一些单位反映，我市发给企业职工的主要副食品零售价格补贴是否作为计提统筹退休基金的工资总额基数问题，需要有关问题作出统一的规定，以便于企业执行。为不影响企业统筹退休基金的提取，保证全市企业职工退休基金统筹工作的顺利进行，现将有关问题通知如下：
1.凡参加我市企业职工退休基金统筹的国营企业，区、县、局、总公司属集体所有制企业，在计提统筹退休基金时，要将主要副食品价格补贴计入工资总额作为提取统筹退休基金的基数。但原定财务列支渠道不变。
2.主要副食品价格补贴发放后，未将此项补贴作为计提统筹退休基金基数的，应从1988年5月起进行补缴。
3.以前有关规定与本通知精神不相符的，一律以本通知规定为准。
有气质的句子范文6
关键词：白及胶/微米三七膏 NF-κB信号通路 脂多糖 糖尿病足溃疡
Study on Effect of Hyacinth Bletilla/Micron Pseudo-ginseng Salve Drug-containing Serum on LPS-induced Inflammatory Injury Model of Macrophages by NF-κB Pathway
XIE Yu ZHANG Kang ZHANG Jin-mei
Department of General Surgery, Shaanxi University of Chinese Medicine;
Abstract：Objective To explore the effect of Hyacinth Bletilla/Micron Pseudo-ginseng salve drugcontaining serum on LPS-induced inflammatory injury model of macrophages by NF-κB pathway. Methods The RAW 264. 7 cells at logarithmic growth stage are processed with lipopolysaccharide(LPS) at different concentrations( 5, 10, 15, 20, 25 μg/m L). Its proliferation rate is detected by CCK-8 method. The optimal LPS concentration is determined and the RAW264.7 model of inflammatory injury is established. The cells are divided into normal control group, LPS group and Bletilla/Micron Pseudo-ginseng drug-containing serum + LPS group with different concentration gradient(50, 100, 150, 200, 250, 300 μL/m L). The OD value of each group is detected by CCK-8 method to determine the optimal concentration of drug-containing serum. The cells are divided into normal control group, blank serum group, drug-containing serum group, LPS group, LPS + blank serum group and LPS + drug-containing serum group. The protein expression levels of NF-κB p65/p-IκBα in cytoplasm and nuclear are determined by Western blotting. Results The optimal concentration of LPS is 10 μg/m L. The optimum concentration of drugcontaining serum is 250 μL/m L. Compared with the normal control group, the protein expression levels of NF-κB p65 in cytoplasm are significantly decreased in LPS group. The protein expression levels of NF-κB p65 in nuclear and p-IκBα in cytoplasm are significantly increased in LPS group(P < 0. 01).Compared with the LPS group, the protein levels of NF-κB p65 in nuclear are significantly increased, NF-κB p65 in nuclear and p-IκBα in cytoplasm are significantly decreased in LPS + containing serum group(P <0.01). Conclusion Bletilla/Micron Pseudo-ginseng drug-containing serum inhibits NF-κB p65 entry into the nucleus and IκBα phosphorylation and reduce macrophage secretion of inflammatory cytokines, thereby improving LPS-induced inflammatory reaction by NF-κB signaling pathway.
Keyword：Hyacinth Bletilla/Micron Pseudo-ginseng salve; NF-κB pathway; LPS; diabetic foot ulcer;
脂多糖（LPS）是革兰阴性菌外膜的重要组成成分，被定义为毒力因子和血清型特异免疫原[1-2]。在介导炎症反应的过程中，巨噬细胞起最主要作用，正常时呈静息状态，受刺激后，能分泌出多种炎性介质[3]。因此，利用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞发生炎症反应，并通过药物干预来观察药物对炎症反应的影响，已经成为实验中常用的模型[4]。糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer,DFU）是一种慢性难愈性溃疡，该病发生发展周期较长、治疗费用高、预后效果差，给患者造成了沉重的负担。在DFU创面炎症反应中，巨噬细胞激活核因子（NF）-κB的结合活性，上调多个相关炎性基因表达产生大量炎性因子，如肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL)-1β等。TNF-α可增加线粒体生成，加剧氧化应激，激活IκB激酶（IKK），更进一步刺激NF-κB，使之释放更多炎性因子，形成慢性低度炎症信号的正反馈[5-6]。本课题组前期研究发现白及胶/微米三七膏具有促进DFU慢性溃疡创面肉芽组织修复及抑制炎性细胞因子的功效[7]，但具体机制尚不明确。本研究在此基础上应用白及胶/微米三七膏含药血清作用于LPS诱导的RAW264.7细胞炎症损伤模型，进一步探讨基于NF-κB信号通路白及胶/微米三七膏含药血清改善炎症反应的机制，从而为DFU的防治提供新思路。
1 材料与方法
1.1 细胞
小鼠巨噬细胞RAW264.7，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
1.2 药物
白及胶/微米三七膏含药血清，陕西省中药资源产业化协同创业中心制作。制备方法：将水体醇沉法提取的白及胶与振动机细胞级超微粉碎机制取的微米三七粉按照1.5︰1、3︰1、6︰1比例放入烧杯，加入蒸馏水，加热并搅拌药液2 h，过滤药液，将药渣再次加热过滤，合并两次过滤液，浓缩至1 g（生药）/m L，即白及胶/微米三七膏。将制备好的白及胶/微米三七膏分组给予大鼠灌胃，连续7 d后自腹主动脉采血，抽取血清。经前期实验证实白及胶/微米三七膏含药血清最佳比例为6︰1，本次选用6︰1浓度的白及胶/微米三七膏含药血清进行实验。
1.3 主要试剂与仪器
脂多糖，美国SigmaAldrich公司；RPMI-1640培养基，美国GIBCO公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒、RIPA裂解液、BCA蛋白定量检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒均购自博士德生物工程有限公司；蛋白Marker、PVDF膜，上海碧云天生物技术有限公司；ECL显影定影试剂，美国Thermo Fisher scientific公司；蛋白提取试剂盒，上海贝博生物科技公司；一抗NF-κB p65、p-IκBα、β-actin、Histone H3、二抗HRP标记山羊抗兔Ig G为沈阳万类生物科技有限公司产品。
1.4 检测建立RAW264.7细胞炎症损伤模型的LPS最佳浓度
将RAW264.7细胞设置为正常对照组及不同浓度（5、10、15、20、25μg/m L）的LPS组，前者加入RPMI-1640基础培养基，后者依次加入不同浓度梯度的LPS溶液，用CCK-8法得到各组光密度（OD）值及细胞增殖率，最终筛选出LPS的最佳浓度。
1.5 检测白及胶/微米三七膏含药血清最佳浓度
取对数生长期的RAW264.7细胞，设置为正常对照组、LPS组（最佳浓度）和不同浓度梯度（50、100、150、200、250、300μL/m L）的白及胶/微米三七膏含药血清+LPS组。在对照组中加入RPMI-1640基础培养基，其他组均加入LPS（最佳浓度）溶液，培养2 h后加入不同浓度梯度的白及胶/微米三七膏含药血清，采用CCK-8法检测各组的OD值，确定白及胶/微米三七膏含药血清的最佳浓度。
1.6 细胞培养
将细胞分为正常对照组、空白血清组、含药血清组、LPS组、LPS+空白血清组和LPS+含药血清组。前3组中加入RPMI-1640基础培养基；后3组中加入LPS（最佳浓度）培养2 h；在含药血清组和LPS+含药血清组中加入最佳浓度的白及胶/微米三七膏含药血清；在空白血清组与LPS+空白血清组中加入空白血清共同干预22 h。培养完成经离心后，按组分装于离心管中。
1.7 Western blotting法检测细胞浆/细胞核NF-κB
p65蛋白水平和细胞浆p-IκBα蛋白水平细胞培养方法和分组同1.5，解冻样品，首先将细胞用RIPA裂解液处理，离心后取上清，根据试剂盒说明提取胞核和胞浆蛋白，制备蛋白质待测液，加入BCA工作液，放于37℃环境中20 min，用酶标仪在波长为562 nm处测其OD值，计算样品蛋白浓度。经过60 V、90 V、120 V电压SDS-PAGE凝胶电泳，在380 mA电流中转膜90 min，再经过封闭1 h、TBST洗膜、一抗、二抗孵育，最终用ECL试剂显影、定影。对实验数据进行统计学分析，观察白及胶/微米三七膏含药血清对细胞浆/细胞核NF-κB p65及细胞浆p-IκBα蛋白表达的影响。
1.8 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间进一步两两比较采用t检验，采用Graph Pad 8.0软件进行数据统计和制图，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 LPS最佳浓度
LPS诱导RAW264.7巨噬细胞24 h后，相比正常对照组，5、15、20及25μg/m L的LPS溶液对诱导RAW264.7细胞影响较明显，差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组OD值为1.072±0.102,10μg/m L的LPS溶液对诱导RAW264.7细胞影响最显著，OD值为2.045±0.060，差异有统计学意义(P<0.01)。因此，本次建模选用10μg/m L的LPS溶液作为最佳浓度。见表1。
表1 LPS作用对巨噬细胞增殖的影响
2.2 白及胶/微米三七膏含药血清最佳浓度
不同浓度梯度的白及胶/微米三七膏含药血清的OD值均高于正常对照组，且低于LPS组。在白及胶/微米三七膏含药血清干预LPS诱导的炎症模型24 h后，100、150、200、300μL/m L的白及胶/微米三七膏含药血清抑制LPS诱导的炎症模型较为明显，差异有统计学意义（P<0.05）。正常对照组OD值为1.111±0.113。250μL/m L白及胶/微米三七膏含药血清对LPS诱导的炎症模型抑制最显著（P<0.01),OD值为1.300±0.016。因此，选择250μL/m L的白及胶/微米三七膏含药血清作为本研究含药血清组的最佳浓度。见表2。
2.3 白及胶/微米三七膏对细胞浆和细胞核NF-κB p65蛋白表达量的影响
含药血清组、空白血清组与正常对照组细胞浆NF-κB p65蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。LPS组相比正常对照组显著降低，LPS+含药血清组相比LPS组显著增高，差异有统计学意义（P<0.01）。见图1。含药血清组、空白血清组与正常对照组细胞核NF-κB p65蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。LPS组相比正常对照组显著增高，LPS+含药血清组相比LPS组显著降低，差异均有统计学意义（P<0.01）。见图2。
表2 白及胶/微米三七膏对巨噬细胞炎症模型的影响
图1 白及胶/微米三七膏对细胞浆NF-κB p65蛋白表达的影响
图2 白及胶/微米三七膏对细胞核NF-κB p65蛋白表达的影响
2.4 白及胶/微米三七膏对细胞浆p-IκBα蛋白表达的影响
含药血清组、空白血清组与正常对照组差异无统计学意义（P>0.05）。LPS组相比正常对照组显著增高，LPS+含药血清组相比LPS组显著降低，差异均有统计学意义（P<0.01）。见图3。
图3 白及胶/微米三七膏对细胞浆p-IκBα蛋白表达的影响
3 讨论
DFU是糖尿病患者中晚期严重的慢性并发症之一[8]，目前有关DFU的现代医学治疗方法尚未有新的突破，课题组研制的“白及胶/微米三七膏”作为院内制剂，用于临床诊疗，效果满意。白及可止血消肿，生肌敛疮，消炎止痛[9]。白及胶是从白及块茎中提炼出的，主要成分为葡萄糖和甘露糖，并通过糖苷键聚合而成的水溶性多糖，是一种天然高分子材料，可作为安全有效的生物医学材料[10]。三七有化瘀生新、止血定痛的作用，三七超微粉碎后可以破坏植物细胞的细胞壁，有利于其有效成分三七总皂苷(PNS)溶出[11-12]，杨煜等[13]通过实验证实PNS能增加凝血的时间，降低血小板、红细胞的聚集和黏附，使血液黏稠度降低，起到活血化瘀的作用。它还能明显减轻因缓激肽、5-羟色氨等物质引起的毛细血管通透性增加，并通过抑制肥大细胞释放的组织胺等活性物质减少渗出，降低早期血管通透性，故而起到抗炎作用[14]。
NF-κB通路是炎症反应中的经典通路，NF-κB与起抑制作用的蛋白I-κB相结合，在细胞浆中呈无活性状态存在[15]。I-κB的亚型种类繁多，其中I-κBα抑制NF-κB的作用最强，故I-κBα可作为考察指标。当受到外在因子刺激时，IKK被激活，I-κBα在IKK的催化下被磷酸化，致使NF-κB二聚体与I-κBα分离，游离状态的NF-κB p65转位到细胞核后，作用于核内相应的炎性基因，促使靶基因进行转录和表达，引发炎症反应[16]。本研究成功建立LPS诱导巨噬细胞增殖、分泌炎性因子的模型，并在此基础上进行不同方式的干预。结果显示，加入白及胶/微米三七膏含药血清后炎症反应得到了明显的改善。含药血清组细胞浆NF-κB p65蛋白表达量显著增高，细胞核NF-κB p65和细胞浆p-IκBα蛋白表达量显著降低。推测白及胶/微米三七膏含药血清通过NF-κB通路抑制NF-κB p65进入细胞核，下调I-κBα的磷酸化，从而减少巨噬细胞分泌炎性因子来改善LPS诱导的炎症反应。
综上所述，白及胶/微米三七膏含药血清对LPS诱导的细胞炎症损伤模型具有显著的改善作用，这也为防治DFU提供新的理论依据和思路，但由于创面炎症机制复杂，且白及、三七药理作用广泛，其治疗DFU的具体作用机制是否存在多通路及多靶点目前尚不明确，值得进一步探究。
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