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初步验收范文1
女友小A原本是个乖乖女，她对婚姻的设想简单而美好，那就是，勤勤恳恳持家，安安稳稳过日子，不求大富大贵，但求相亲相爱白头偕老。然而，一脚踏进婚姻的殿堂，她就发现以上设想纯属虚构。男人有大男子主义，家务一点都不干，一有时间就坐在电脑前边打游戏边扯淡，吃饭时还会翻着白眼抱怨菜做得太咸粥煮得不烂，对此，小A顽强地忍着。男人玩心不改，动不动就老夫聊发少年狂，撇下老婆去跟一帮狐朋狗友胡吃海喝，对此，小A依旧顽强地忍着。但是，当男人一而再再而三地跟公司的女同事眉来眼去勾勾搭搭时，像“小强”一样顽强的小A终于忍无可忍了。
新仇旧怨纠结到一起，给小A的发飙注入了山呼海啸的力量，一番河东狮吼之后，她扬起手，左右开弓，在男人帅呆的脸上留下了十个清晰的指印。小A本以为这两记耳光会给他们的感情画上句号，但出乎她意料的是，被打之后的男人不仅没有因为自尊心受伤而跟她分道扬镳，反而舌头磨短了半寸给她道歉，说自己过去狼心狗肺不知道珍惜她，但以后一定会洗心革面痛改前非。接着男人就开始了实际行动，他不再跟狐朋狗友们鬼混，不再跟花花草草们瞎扯，而且还笨手笨脚地学着做家务，其诚意天地可鉴。男人的改邪归正让小A彻底明白，这年头，做淑女不如做烈女，做怨妇不如做悍妇。
不错，好男人不是天生的，而是一个或者几个女人打造出来的。打造，打造，你不打，他就不可造。很多时候，一记耳光胜过千言万语。给他点颜色瞧瞧，他才能知道你是开染坊的。古语说，严师出高徒，这话套用在夫妻关系上就是：严妻出好丈夫。为什么那些千依百顺的女人动辄就被男人无情踢掉，而那些张牙舞爪的女人却能出人意料地获取一份天长地久的婚姻，原因就在这里。
这并不是说男人都有受虐倾向，但是他们的生物本性决定了他们贪玩，懒惰，好色，喜新厌旧。即便他们真的爱一个女人，也难免管不住自己那蠢蠢欲动的身体和跃跃欲试的心。为了帮助他们立地成佛，女人们需要晓之以理，动之以情，但是当男人不为情所动时，动之以粗也是必要的。灰太狼先生之所以能建立起勤劳顾家、用情专一的好男人形象，不是因为他天生人格闪亮，那是红太狼太太举着平底锅张牙舞爪一路追杀的结果。
想拥有一个好男人？江湖流传的《打造好男人之终极秘笈》是这样写的：看他小样的不顺眼一声吼，该出手时就出手，该扁他时就扁他，可以把他打成熊猫眼，但坚决不能惯他的熊猫脾气。假以时日，男人必然收敛心性，德智体美劳全面发展，于是乎，一个好男人诞生了。
初步验收范文2
关 键 词： 国民收入分配矩阵；收入分配；收入转移法；支出转移法
中图分类号： F047 文献标识码：A 文章编号：1006-3544（2013）05-0048-03
世界上第一个严格意义的社会核算矩阵是由Richard Stone教授和他的研究团队在20世纪60年代为英国建立的社会核算矩阵（Social Accounting Matrix，SAM） [1] 。在我国，李宝瑜引入了矩阵形式表示国民收入流量 [2-3] ，刘扬称国民收入流量矩阵为国民收入分配矩阵 [4] 。 在上述文献的基础上，本文对国民收入分配矩阵中的平衡关系，部门收入支出的计算方法及部门间收入分配转移的方法等进行了初步研究。
一、 国民收入分配矩阵的编制方法和原理 [3]
（一）国民收入分配矩阵的一般形式
国民收入分配矩阵的一般形式见表1。
（二）国民收入分配矩阵表中的符号表示
国民收入分配矩阵中所有的字母均为矩阵。W为部门（n个）间的收入流量矩阵；U为各部门在各分配项目（m个）上的收入矩阵；Y为增加值列向量；G为总收入列向量；S为各部门在分配项目（m个）上的支出矩阵；Z为可支配收入列向量；F为各项（m个）收入合计数列向量。AT表示矩阵A的转置矩阵 [5] ，即，若A=（aij）n×m，则AT=（aji）m×n。U=（uij）n×m，其中uij表示第i部门在第j项目上的收入；S=（sij）m×n，其中sij表示第j部门在第i项目上的支出。Y=（y1，y2，…，yn）T，其中yi表示第i部门的增加值；G=（g1，g2，…，gn）T，其中gi表示第i部门的总收入；Z=（z1，z2，…，zn）T，其中zi表示第i部门的可支配收入；F=（f1，f2，…，fm）T，其中fj表示第j项收入的 从W矩阵的数据可以看出，非金融企业部门的收入主要来自部门内部（5728亿）、 金融机构部门（4679亿）和国外部门（3406亿），非金融企业部门的支出主要流向住户部门（71 803亿）、政府部门（51 911亿）。
参考文献：
[1]王其文，李善同. 社会核算矩阵原理、方法和应用[M]. 北京：清华大学出版社，2008.
[2]李宝瑜. 国民收入流量表与模型研究[J]. 统计研究，1996（2）：16-19.
[3]李宝瑜. 中国国民收入流量表研究[J]. 统计研究，2001（6）：14-18.
初步验收范文3
关键词：资产处置；工作思路；调研；改进
随着农行完成逾8000亿元不良贷款剥离及注资,农行的不良贷款率大幅下降,信贷资产质量显著改善,为农行的成功上市铺平了道路。农行剥离的不良资产处置方式不同于其他三家国有银行,以前的银行,包括中行、工行、建行,都是最后不良贷款交由四家资产管理公司来进行处置。农行这次的不良贷款,是由财政部和农业银行建立共管帐户,财政部委托农行成立专门的资产处置机构进行清收。对于农行而言,加快财政部委托不良资产的处置,既是对国家、对社会的责任,也是拓展收入来源,加速自身发展的需要。
一、资产处置工作面临的形势和挑战
当前,农行资产处置工作面临着严峻的形势和挑战,在深入分析不良资产处置工作任务的同时,我们应该看到既有有利因素,也有不利因素。
有利方面:一是我国实施积极的财政政策和适度宽松的货币政策,加大投资,扩大内需,有利于企业提高经济效益;二是有利于制定和实施整体的不良资产解决方案,提高各类不良资产处置效率;三是有利于通过整合当地多方面信息资源,以及在金融、财务、司法等领域的资源和其它各种社会关系资源,依托专业清收队伍,以专业技能和操作手段,提高了资产处置的力度;四是有利于集约经营管理,节约清收费用和人力资源。
不利方面:一是宏观经济面临的国内外环境将更加趋紧,尤其是我国经济内生性变化带来的周期性调整压力可能会明显大于往年,经济进一步向下调整的压力已经显现,出口增长压力较大,消费增长趋于放缓,劳动力成本增加,企业赢利能力明显下降,客户现金流趋紧,不利于贷款清收;二是我国信用体系尚不完善,不良资产剥离后,客户心态会发生变化,存在逃废债倾向;三是地方政府出于维护社会稳定、利益分配等原因,不同程度的存在地方保护主义;四是虽然近年来执法环境有所改善,但执行难问题仍没有从根本上解决,尤其政策性放款如供销系统、公共事业单位执行难的问题仍然存在。
二、资产处置工作存在的主要问题
一是委托资产质量低下,清收难度大。损失类贷款占比较高,经过多年的清收,并且采取了多种措施,包括依法清收等等,剥离的不良贷款的清收难度很大。
二是地方政府保护。近年来,由于企业转制等诸多原因,导致职工上访事件增多,地方政府为保持稳定要求有关部门在处理企业资产时要做好稳定工作,结果造成在执行企业资产时难度很大,执行不下去。
三是存在逃废债现象。由于农行股改不良资产剥离,经过媒体等报道,目前,贷款客户的心态发生了变化,存在拖、赖债等现象,所以在清收过程中要比剥离前付出更大的精力,采取更强更有力的措施。
四是剥离的个人客户笔数较多,金额较小,分布区域广,管理和清收难度较大,缺乏更为有效的清收措施。
五是贷款正常维护都会产生一定的成本和费用,而预期的收益具有较大的不确定性。如何在成本和效益之间权衡,也是一项难以抉择的现实选择。
三、资产处置的主要工作目标和重点
随着股份制改革的整体推进,我行的资产重组和财务重组目标已经实现,目前正稳步推进IPO融资上市,业务经营方式将发生重大变化。为此,结合总行制定的3510战略目标,将“风险控制”理念贯穿于资产处置全过程,充分考虑风险与收益平衡,致力于提高自身风险管理能力,确定我行总体工作目标:即最大限度收回不良资产,降低处置成本,提高处置效率,实现处置收益最大化。
管理目标:全面落实风险管理责任体系。不良资产抓降、监测、控制有机结合,实行客户、风险管理、资产处置等部门的一体化管理,形成各司其职,各负其责的良好工作氛围。加快资产处置工作职能转变,打破传统的工作模式,将风险管控关口前移,变以往的事后补救式被动管理为事前、事中风险隐患的预防。
人员目标:建立一支高素质的资产处置专业队伍。实行精细化管理,选聘责任心强、专业素质高的员工专职负责委托资产处置工作,同时配备懂经营、会管理、理念新,道德水准高的管理人员。
经营目标:实际剥离的委托不良贷款,在充分尽职调查核查的基础上,形成真实可信的估值结果。通过尽职调查和估值,为不良资产处置提供定价依据,研究个案处理办法,制订全年乃至今后三年的处置计划和工作方案,并组织实施。
当前资产处置工作重点:
1.制定处置工作实施细则。认真研究即将出台的委托资产处置相关制度、办法,结合我行委托资产实际状况,在授权范围内进行必要的细化,研究探索委托资产处置的有效模式。
2.落实处置工作责任制。委托资产实行分户到人,双人管户原则,明确主要责任人,负责分管客户的资产处置方案制定、具体实施和债权的日常维护。
3.了解掌握客户资产现状。认真开展尽职调查,形成全面的债务分类和回收可行性分析报告。深入了解与债务关联的可执行资产状况,对委托处置客户进行分类排队,确定潜力客户、一般客户、无效客户,分别采取不同的处置手段,使资产处置方式、方法更接近于实际,实现资产处置收益最大化。
4.确定处置清收工作重点。处置工作优先放在处置周期时间短,见效快的项目上。一是对受国家宏观经济政策限制企业采取坚决措施,防止金融危机、经济衰退对上述企业造成冲击,导致资产迅速减值,资产质量进一步恶化。二是借股改之机存在逃废债侥幸心理的客户。三是产权制度变革、借款主体资格变更,特别是政策性破产企业,避免企业变更或破产造成债权的终结。
5.加大处置工作力度。分别采取依法清收、领导包大户、责任清收、减免表外利息等有效方式,集中人力、法律、费用等有效资源,确保清收工作取得实效。
四、资产处置采取的主要工作措施
1.明确部门职责分工。结合剥离后的工作,明确部门人员职责和各单位的管理责任,树立大风险管理观念,实现业务部门风险管理关口前移,从业务风险产生的源头上进行有效控制。
2.完善考核奖惩机制。完善资产处置考核约束措施,制定不良资产监测考核细则,强化监测职能,严格考核。
3.发挥协同作战的整体优势。充分发挥原经营行的人员优势和信息优势,协调原经营行与委托资产处置经营部的协同工作,对已落实还款计划的委托资产还款情况进行监督。同时,对悬空债权承债协议进行落实,使其有实质性的进展。
4.加强资产风险防范。强化监管、强化检查,提高制度的约束力。以人为本,加强人生观价值观教育,提高制度执行的自觉性。加大监管及时发现风险隐患,实行客户寻访双人及登记汇报制,收贷收息客户到行,内外勤分离;抵债资产收取审查、审议审批程序化;处置项目审查审批制,通过市场寻价、合理评估,处置损失认定适当,严格处置方式,坚持公平的市场运作,确定拍卖保留底价,对中介机构实行公开或邀请招标,协议处置实行“阳光”操作。对我行的实物资产权属情况进行重新确认,特别是防止抵债资产产权过户风险和看管风险,杜绝接收后资产因管理造成的人为减值。
5.注重贷款时效维护。加强贷款诉讼时效管理,使我行的到期未到期债权始终置于司法保护之下。及时向债务人或担保人发催收通知书、律师函等形式延续诉讼时效保全债权;密切重点行业产权制度变更,争取最大限度获得破产债权的清算额度,避免企业破产成为我行债权的终结日。
6.加大以下几种委托资产的清收力度:借款人有还款能力但拒不还款的赖债行为或各种恶意逃废债行为的;借款人虽无还款能力,但有可变现资产暂未变现的;借款人虽无还款能力,但保证人有能力和有资产的。
7.加大诉讼执行力度,充分利用法律手段对委托资产进行处置清收。组建诉讼案件管理团队,实现对本行委托不良资产诉讼案件的集约化、规范化管理。对已涉诉的客户进行梳理,区别已胜诉在执行、已胜诉未执行、已尚未判决等情况,加强与县区两级法院的沟通,尽量加快判决及执行速度,尽早处置,取得清收效果。对债权债务关系明晰、诉讼时效有效、借款人确有可执行财产的不良资产项目,收集相关资料,制定项目处置预案,在充分论证效益评估的基础上,确有必要诉讼的,果断诉讼,力争做到快立、快审、快结和快执行。强化诉讼时效管理,明确时效管理责任,建立诉讼时效台帐,采取各种催收措施保证诉讼时效的连续,维护我行的权益。
8.对政府干预形成的或有公务员参预形成的委托资产采取向借款人单位发函、公开曝光等措施,借助社会舆论的压力促使其还贷。
9.加强与政府部门沟通、协商,积极探索国有企业老陈欠贷款的解决途径,使不良资产处置收益最大化。
五、对资产处置工作的建议
一是建议出台有针对性的清收政策,根据借款人的还贷能力和贷款方式出台包括减免息、打折、打包、拍卖债权等清收政策。
二是建议出台减免税费等优惠措施,使资产处置效率高、收益大。
三是建议各级财政部门密切配合资产处置工作,对财政担保的不良贷款由财政部门合理安排资金偿还不良贷款,同时对其他政府或企业贷款财政部门也可协调清收工作。
四是建议在严防道德风险的基础上,进一步出台加快处置抵债资产措施,对于抵债手续存在瑕疵、自然贬值速度较快(厂房、车辆、原材料等),不再深挖历史责任和现实责任,最大程度地减少这部分资产损失。
参考文献:
初步验收范文4
作品众多
但也是“拖稿女王”
在诸多的青春作家中，落落的作品绝对不算少，小说、散文集、摄影集，同时还是杂志《文艺风象》的主编，这样的工作状态让不少不了解落落的人都会误以为她是个工作狂，但落落说，自己并不属于勤奋型，甚至因为强大的拖沓症，被同事们冠以“拖稿女王”的称号。
“《剩者为王》对于我来说是一本特别难写的书。剩女这个题材写得我很难受，这是我第一次用第一人称来写，投射了太多自己在书里面，还包括身边的朋友、父母，太过的掏心掏肺，让我经常难以从书中抽离。”落落说，因为总是纠结到底是应该投入还是抽离，所以前期四个月她一个字都没写出来，情绪上也出现了抵触。“我的稿子就一拖再拖，后来公司实在忍无可忍，我才拼命说服自己跨过这个障碍。”落落笑说，因为要赶稿，而且觉得在家里实在写不出来，为了逼迫自己，后来她直接搬到了公司。“我觉得可能我家的写作风水不好，不适于写作。但是公司的风水挺好，在公司写作很顺，所以我就带着被子、牙刷等生活用品驻扎公司，刷牙洗脸全在公司厕所搞定。从9月底到10月底，有将近一个月的时间宅在公司。”
如今书已经出了，再回想当初写作时纠结的情感投入问题，落落说，她实在是一个不适合写虚构故事的人，“我的创作一定要源于真实，因为写虚构的东西，我心里总没有底，而如果是以真实为基础的故事，我就会特别有感觉。”落落还说，为了写好“剩女”，她还去相了几次亲，“就当是去取材了。”
不当编剧，不出镜
2010年落落推出了《剩者为王》第一部，主题直指“剩女”话题，生动地勾画出这一“外表光鲜、事业有成却感情曲折”的特殊女性群体，引发读者强烈反响，销量超过30万册。而该书一上市，就被著名导演滕华涛签下影视剧版权，并进行影视剧筹备。如今，郭敬明作品《小时代》的选角风波正闹得沸沸扬扬，对于自己是否会参与《剩者为王》的选角，落落说，这是她第一次卖出作品的电视剧版权，因此已经很满足，不会再多过问电视剧的进展情况 。“其实我是那种性格很‘怂’的人，所以我根本不可能在影视剧露脸客串。虽然之前导演有问过我是否要参与剧本的工作，当时我想都没想，就直接拒绝。因为剧本的写作要求在语言上有着非常强大的表现力，但我的长项并非在此，我比较擅长人物的内心刻画，所以我根本当不了编剧。”而对于是否关注过目前已经在荧幕上大火一把的同类剩女题材电视剧作品，如《大女当嫁》等，落落则说，因为剩女题材其实涉及的问题或故事会很类似，为了避免受到别人的影响，自己刻意回避去看同类的作品，“我想很单纯地写我和我身边的故事。”
下一个故事将回归校园
初步验收范文5
各位老师们：
大家好！我是咱们幼儿园的一名新老师，非常感谢组织的安排，让我有机会参加此次演讲活动。今天，我演讲的题目是《心系立德树人，坚守初心不改》。
记得我很喜欢的主持人董卿说过一句话：“初心的形成也许很简单，但是它的完成却是一个很艰苦，而且很慢长的过程。”作为一名教育工作者，我的初心和使命就是“立德树人”。很多人问过我，为什么选择幼儿教师这一职业。起初我怎么回答的都有，说实话，那时候我还没有很了解自己的工作内容。现在想想，估计我有话可谈了。
不知道在座各位，在你们的成长过程中，是否也像我一样，经历过一个迷茫、懵懂、不清楚自己想要什么的阶段。毕业前，我似乎只会做一个听话的孩子，在学校听老师话，在家听长辈话，因为我觉得我还小，他们一定比我懂得多。爸爸说女孩子，当老师好，稳当。我说行。爷爷说：咱们家是书香门第，祖上都是教私塾的先生。我说：好，我也要当老师。于是听从家人的安排报了天津师范大学。但是我从小就喜欢尝试各种新鲜事物，喜欢给自己留选择的余地。于是在校期间同时修读了师范类英语专业与非师范类经济学专业。毕业期间我有更多的择业机会，收到了上市公司的高薪offer, 进入过机关单位工作，也和朋友一起创过业。我十分感恩我的家人、我的老师、我的领导。一路给予我无私的关怀与鼓舞，让我能成为自己想成为的人。这些经历让我对未来也渐渐有了隐约的思考。我开始剖析、审视自己，思考自己想做什么、能做什么、擅长做什么。
“生活不止眼前的苟且，还有诗和远方”，这是我很喜欢的一句话。以前的老领导曾和我说过，除了物质、收入、福利这些现实考量，你们年轻人还应保留有一些情怀，一点理想。遇到机会别轻易放弃，都去试试。一直以来我都十分关心“解决城乡教育差距”这一话题，也做过许多相关调研，希望有一天能为政府建言献策。于是我选择了服务基层，支持农村教育事业的发展。理由很简单，我想做一个对社会有用的人，来感恩我脚下的这一方热土。我是生长在农村的孩子，更清楚家长和孩子的需要。我初中母校的办学理念“让农村的孩子就近享受优质教育”，鼓舞全体教师为学生呕心沥血。至今我仍记得老师们辛勤忙碌的身影，和我谈心说过的话，我深知一位老师对于学生的终身影响。本着大学“勤奋严谨，自树树人”的校训，来到了工作岗位上。
初步验收范文6
【摘要】 本研究的目的是改造猪红细胞（pRBC）表面抗原，使之与灵长类动物相容，以探讨异种输血的可能性。结合使用α半乳糖苷酶(AGL)酶解和甲氧基聚乙二醇（mPEG）修饰改造猪红细胞表面异种抗原，并输注给猕猴，观察pRBC在猕猴体内活存时间及安全性；使用免疫抑制剂（蛇毒因子CVF和地塞米松）延长pRBC在猕猴体内的存活时间；建立失血性贫血猕猴模型，观察输注pRBC治疗失血性贫血猕猴的可能性。结果表明： AGL酶解能够去除猪红细胞表面主要异种抗原（α－Gal抗原），减弱其与猕猴血清的凝集反应，酶解技术与mPEG修饰技术结合可以使猪红细胞与猕猴血清更为相容。异种输血试验表明，双修饰的pRBC在猕猴体内存活时间为12小时，使用免疫抑制剂后，可延长至40小时；pRBC在猕猴体内8小时的存活率为38％，在输注pRBC的8小时内，失血猕猴的血红蛋白和红细胞压积可维持在失血前的正常水平。结论：改造后的pRBC可安全地输注给猕猴，改善失血猕猴的贫血症状，提示用猪红细胞进行异种输血是可能的。
【关键词】 猪红细胞
Preliminary Study on Xenotransfusion from Porcine Red Blood Cell into Rhesus Monkey
Abstract In order to study the possibility of xenotransfusion from porcine red blood cell (pRBC) to primate，the antigens on pRBC surface were modified to make it more compatible to primate sera. Porcine RBCs were subjected to both enzymatic removal of membrane α-Gal antigens with recombinant α-galactosidase (AGL) and covalent attachment of succinimid propionate-linked methoxypolyethyleneglycol (mPEG-SPA) to camouflage non-αGal antigens. The effects of double modifications were determinated by hemagglutination and clinical cross-match testing with rhesus sera. In vivo clearance rates and safety of modified pRBCs were measured after it was transfused into Rhesus monkey with or without immunosuppressant treatment .The validity of pRBC was detected in exsanguine Rhesus monkey model. The results showed that AGL could effectively remove α-Gal xenoantigens on pRBC membrane and reduce hemagglutination. The combination of mPEG modification with AGL treatment could significantly increased compatibility between pRBCs and Rhesus monkey sera. Modified pRBCs were detectable in Rhesus monkey blood at 12 hours after transfusion，and their survival time was 40 hours in the immunosuppressant-treated Rhesus monkey. In vivo survival rates of pRBCs were 38% in exsanguine Rhesus monkey at 8 hours after transfusion，and during that time，the hemoglobin and hematocrit of Rhesus monkey were maintained at the same level as before it lost blood. It is concluded that the modified pRBC can be safely transfused into Rhesus monkey and relieve the anemic symptom exsanguine Rhesus monkey . It suggested that pRBC can be hopefully used as a blood substitute for primate and human in the future.
Key words porcine red blood cell；Galα1-3Gal；α-galactosidase；methoxypolyethyleneglycol；xenotransfusion blood
血液供应的严重短缺是临床输血面临的难题。猪血液生理生化指标与人类非常接近，无传染甲肝、乙肝和艾滋病等疾病的危险，因而近年来人们开始探讨猪红细胞作为人类红细胞替代品的可能性，以缓解血源紧张的矛盾［1-4］。
猪红细胞输给人体会产生强烈的排斥反应，这主要是由猪红细胞表面的异种抗原引起的。研究证明猪红细胞表面存在两类异种抗原，即α-半乳糖(α-Gal)抗原和非α－半乳糖(non-Gal)抗原。α-Gal抗原是主要异种抗原，它表达于除人和旧大陆猴外的所有哺乳动物体内，只是种类和个体间表达量有所差异［5-7］。人体内存在天然抗-α-Gal抗体，如果将猪细胞、组织和器官移植给人和灵长类， 人和灵长类会出现超急性排斥反应（HAR），导致移植物被迅速清除。研究表明，使用α半乳糖苷酶（AGL）能有效清除猪细胞表面Galα1-3Gal抗原（α-Gal抗原）末端的α-Gal残基，减弱HAR的程度，延长移植物的存活时间［2，8，9］。甲氧基聚乙二醇（mPEG）是无毒性、无免疫原性的高分子化合物，已被用于修饰蛋白和多肽类药物，延长药物的半衰期，提高治疗效果。国外和我们前期的研究均表明，mPEG可与人红细胞膜表面的-NH2、-OH共价结合，非特异性地遮蔽血型抗原，修饰后的红细胞与相应抗血清的凝集反应减弱或消失［10，11］。本研究结合AGL酶解技术和mPEG修饰技术，改造猪红细胞（pRBC），检测改造后的pRBC与猕猴血清的相容性。在此基础上，把双修饰的pRBC输注到猕猴体内，观察双其在猕猴体内的活存时间，探讨异种输血的可能性。
材料和方法
血液和试剂
猪血液为无特定病原体的猪血，由北京市SPF育种中心提供；抗体：Isolectin B4-Biotin（Sigma），Streptavidin-FITC（Southern Biotech，USA）；试验猕猴及猕猴血清由北京市动物园提供；基因重组咖啡豆α－半乳糖苷酶（rC－AGL，简称AGL）为本研究室研制；mPEG-SPA（20 kD）购自美国Nektar。
血液标本的采集与处理
颈静脉采猪血，肝素抗凝，4℃保存。抗凝的全血500×g离心5分钟，弃上层血浆，生理盐水洗涤沉淀红细胞。
AGL改造猪红细胞及α-Gal抗原清除
取压积pRBC，用等渗磷酸-柠檬酸-NaCl缓冲液（58 mmol/L Na2HPO4，21 mmol/L柠檬酸C6H8O7·H2O，77 mmol/L NaCl，pH 5.6±0.5，PCS）洗涤4次，按每毫升PCS红细胞悬液中添加酶量为0、50、100 U，分别加入AGL，26℃反应2小时，PBS（pH 7.4）洗涤。
用PBS将酶解前后的pRBC稀释为0.2％悬液，1.5%的多聚甲醛固定，室温过夜，加入生物素标记的IB4凝集素，24℃反应2小时，PBS洗涤后加入FITC-链亲和素，24℃反应30分钟，PBS洗涤，用流式细胞仪（FACS Calibur，Becton Dickinson）检测红细胞表面的荧光强度，计算α-Gal抗原的清除率。
酶解后的猪红细胞(EpRBC)的mPEG-SPA修饰
用PBS（pH 8.0）洗涤酶解后的pRBC 4次，稀释成12%细胞悬液，在红细胞悬液中加入mPEG-SPA至终浓度为1.0，2.0，3.0 mmol/L，混匀后25℃反应1小时，PBS洗涤红细胞。
红细胞与mPEG结合的两相法检测
文献报道［12，13］，PEG8000 (Sigma) 和葡聚糖T500 (Pharmacia) 组成的两相系统(5%葡聚糖 T500、35% PEG8000、0.15 mol/L NaCl、6.84 mmol/L Na2HPO4、3.16 mmol/L NaH2PO4，pH 7.4)可分离mPEG修饰的红细胞。用50 ml的聚丙烯离心管盛两相溶液，室温静止过夜，分层后，用吸管吸取上相（PEG），试管底部扎孔收集下相（葡聚糖），弃中间层（上下相在3天内使用）。取上、下相各500 μl于EP管中混合，mPEG-pRBC和对照红细胞（108 cells/ml）各10 μl加到此EP管中，上下颠倒20次，静止15分钟，红细胞在两相中分配（设重复），计算上相中的细胞数与加入到系统中总细胞数的百分比，即为分配率，亦即被修饰的红细胞比率。
双修饰的pRBC与猕猴血清的配血实验
2.0%的pRBC悬液20 μl，与40 μl猕猴血清混合，250×g离心30秒，肉眼和显微镜下观察红细胞凝集程度。
少量输血实验
5 ml AGL和mPEG修饰的压积pRBC，PBS(pH 72)洗涤，加入异硫氰酸荧光素（FITC，Sigma）37℃反应20分钟，生理盐水洗涤，重悬至压积为50％。在输血前，将受血猴麻醉，分为3组： ①自身输血组，受血猴取出10 ml猴血，离心去白细胞，荧光素标记后回输；②无免疫抑制剂试验组，将10 ml经FITC标记的双修饰pRBC经静脉输入受试猕猴（体重约为6.0 kg）；③免疫抑制剂试验组，将10 ml经FITC标记的双修饰pRBC经静脉输入受试猕猴，受试猴接受免疫抑制剂处理。具体免疫方法为：在输血前24小时，按0.05 mg/kg体重的量将蛇毒免疫抑制因子〖眼镜蛇毒因子（cobra venom factor，CVF)，中国科学院昆明动物研究所研制］静脉注射给受试猴，并在输血前半小时静脉注射地塞米松（5 mg，0.5 mg/kg）以及第二次注射CVF（200 μg，002 mg/kg），输血后1小时再次静脉注射地塞米松（5 mg）。整个试验过程中，监测受试猴的心率、血压；在输血后的5、10、15、30分钟及1、2、4、8、12、24、28、32、36、40、44、48小时取血，流式细胞仪检测荧光细胞百分率，计算pRBC在猕猴体内的活存时间，并在输血4小时后进行血常规、血生化和尿常规检测。
失血猴模型输血实验
从猕猴体内放血12％（体重10 kg，放血100 ml），建立失血性贫血猕猴模型。将实验分为两组，其中一组输入相同体积代血浆（羟乙基淀粉-盐水注射液），另一组使用免疫抑制剂处理受试猴（方法同少量输血试验），输入相同体积双修饰的pRBC (40 ml压积红细胞)和代血浆（50 ml），静脉滴注输血，然后检测失血前后及输血/液后不同时间点的血红蛋白(Hb)和红细胞压积(Hct)，并在放血前及输血/液4小时后进行猕猴的血生化、尿常规检测，记录猕猴心率、血压变化。
结 果
AGL酶解改造后的猪红细胞表面抗原分析
IB4凝集素可特异地与以α-Gal为末端的多糖结合［14］，用来检测酶解前后pRBC表面α-Gal抗原的变化情况。流式细胞术检测结果表明，以未酶解pRBC的荧光标记率为100％，使用≥50 U/ml的AGL可有效清除pRBC表面主要异种抗原—α-Gal抗原，清除率达99.42%（图1）。
红细胞与mPEG结合的两相法检测
图2为mPEG-SPA修饰的酶解后的猪红细胞在两相中的分配，从图中可看出未修饰的红细胞分布在界面下相，mPEG修饰的红细胞均匀分布在上相，mPEG-SPA浓度为2.0 mmol/L时，＞80%的mPEG-RBC分布在上相，mPEG-SPA为3.0 mmol/L时，红细胞的修饰率大于90%。这种技术对于规模化分离回收被修饰的红细胞和应用于输血是非常重要的。
AGL酶解和mPEG-SPA遮蔽双修饰的pRBC与猕猴血清的配血试验
AGL基本清除了pRBC表面的α-Gal抗原后，配血试验显示，EpRBC与猴血清仍然有凝集反应，但凝集程度有所减弱（从++++降到++），凝集时间延长。进一步使用mPEG-SPA修饰EpRBC，镜检结果表明，随着mPEG-SPA浓度的升高，修饰的pRBC与猕猴血清的盐水凝集反应逐步减弱，当mPEG浓度为2.0 mmol/L时，盐水凝集反应完全消失（图3），这说明AGL和mPEG-SPA双修饰能有效清除和遮蔽猪红细胞表面主要和非主要异种抗原。
转贴于
少量输血试验
所有受试猴在输血过程中和输血后，呼吸、心率、血压和血氧饱和度均无大幅度的波动，无明显的输血反应症状出现。流式细胞术检测结果表明，输入的pRBC约占猕猴体内总红细胞数量的4％左右，这与理论值是一致的，以此为100％，计算输血后不同时间点pRBC存活的百分率。检测结果表明：自身回输组，3天后检测红细胞存活率在90%以上；无免疫抑制剂试验组，在输血后12小时时仍可检测到FITC标记的pRBC；免疫抑制剂试验组，输血8小时时有38%pRBC存活，而在输血40小时后，猕猴体内仍可检测到荧光标记的pRBC（图4）。
受试猴的尿常规和血生化等多项指标检测表明，各组的血清K、尿素氮，胆红素和转氨酶等均有一定程度的上升。值得注意的是，无免疫抑制剂试验组总胆酸升高了15倍。尿常规指标中，无免疫抑制剂试验组受试猴在输猪红细胞后，尿液中出现大量的尿胆原，尿蛋白和尿红细胞（均为+++）；而免疫抑制剂组在输猪红细胞后，尿液中未出现尿胆原和尿蛋白，仅红细胞有略微的增加，与自身回输组相似（表1）。这些结果说明使用免疫抑制剂可减轻异种输血的免疫反应。Table 1. Blood and urine biochemical analysis of autologous blood transfusion Rhesus monkey and transfused pRBC Rhesus monkey with or without immunosuppressant (CVF) treatment（略）
失血性贫血猕猴的pRBC治疗
为了检测双修饰后pRBC是否在猕猴体内行使红细胞的功能，我们建立了失血性贫血猕猴模型。猕猴失血约12％后，输入代血浆-羟乙基淀粉，恢复血容量，失血猕猴出现贫血症状，表现为面色苍白，血红蛋白和红细胞压积降低等（3小时内Hb降低了15%，RBC降低了13%）（图5）。失血后3小时，猕猴血清中乳酸脱氢酶(LDH，乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶)的水平升高了约5倍，说明动物无氧酵解水平上升，提示动物处于缺氧的状态；而输入双修饰pRBC治疗的贫血猕猴，面色红润，输血3小时后，LDH仅为放血前的1.5倍，明显低于未治疗贫血猴（表2）；其它生化指标变化不大。在输血后8小时内，受试猴体内血红蛋白和红细胞压积与失血前一致（图5），维持正常水平，而未治疗的猕猴在失血18小时内一直表现典型的贫血症状。这说明经酶解和mPEG包裹的双修饰猪红细胞输给猕猴在一定时间内可发挥正常的携氧功能，因此失血猕猴未出现失血后的贫血症状。这一结果提示异种输血的可能性。Table 2. Blood and urine biochemical analysis of hemorrhagic Rhesus monkey and pRBC treated hemorrhagic Rhesus monkey（略）
讨 论
据统计，我国每年的血液需求量为50亿毫升，但目前的供应量仅为16亿毫升，供需之间存在巨大差距，血液来源问题已经成为制约临床输血应用的瓶颈。在实行义务献血法后供需矛盾更显突出，很多病人由于不能及时获得输血治疗而延误抢救的最佳时机。为解决这一矛盾，人们开始寻找红细胞代用品，其中以化学修饰的牛血红蛋白和纳米氟碳乳剂最为成功，但它们不完全具备有形红细胞的功能。猪红细胞无论从形态、结构，还是生理功能、生化特征，都与人红细胞极为相近，近年来逐渐成为人红细胞代用品研究的对象。
研究表明，将猪的细胞或器官移植到人体内，会引起强烈的免疫排斥反应，主要是超急性排斥反应（HAR），人血液中的天然抗体与猪细胞表面主要异种抗原α－Gal结合，激活补体系统，导致在数分钟内被排斥。去除猪细胞表面的α－Gal抗原、抑制补体系统激活、清除人体内的天然抗体是克服HAR的三条技术途径。异种输血比异种器官移植更有可能实现，因为成熟红细胞无核，缺乏细胞器，使用AGL可永久去除pRBC的α-Gal抗原。
为克服异种输血的HAR，我们首先使用基因重组咖啡豆α-半乳糖苷酶(AGL)处理pRBC。结果表明，AGL可以有效地清除pRBC表面的α-Gal抗原，AGL浓度为50 U/ml时，抗原清除率达到99.4%以上。然而，AGL处理的pRBC与猴血清仍有弱凝集反应。这可能是由于pRBC表面还存在non－Gal抗原或残存少量的α-Gal抗原分子，因此必须将异种抗原完全去除或遮蔽。为此，我们进一步用SPA端基活化的mPEG修饰AGL处理过的pRBC，mPEG-SPA与红细胞膜蛋白以酰胺键的形式共价结合［10］，其形成的高度水化膜和柔韧的长链阻止抗体等大分子的进入，对抗原起到空间遮蔽作用。随着mPEG-SPA浓度的升高，pRBC与猕猴血清的盐水凝集反应进一步减弱，当mPEG的浓度大于2.0 mmol/L，凝集反应消失，提示双修饰的pRBC与猕猴血清基本兼容。Doucet等［3］的研究结果表明，双修饰对猪红细胞的形态、结构、功能和变形性等均无明显影响，我们前期的工作也得到了相同的结论。
据文献报道，Eckermann等［2］曾用pRBC、AGL处理的pRBC、AGL处理的pRBC配合使用免疫抑制剂（CVF，补体抑制剂）及结合使用BSA-Gal分别输给1只猩猩，试验结果发现，pRBC相应的存活期分别为不到15分钟、2小时、24小时和72小时。我们将双修饰的pRBC对未处理猕猴进行少量输血试验，结果显示 pRBC相应的存活期为12小时，比Eckermann报道的存活时间长5倍。我们的实验还表明，使用CVF和地塞米松处理猕猴进行大量输血试验，输血8小时后约有38％的pRBC存活，输血40小时后仍可检测到pRBC。结果说明mPEG可以遮蔽猪红细胞表面的non-Gal抗原，使之与猕猴体内的天然抗体的反应能力减弱，降低迟发型排斥反应的程度；双修饰的方法明显优于AGL单处理法，能显著降低异种输血排斥反应的程度。
我们首次用双修饰的pRBC配合使用免疫抑制剂治疗失血性贫血猕猴，输血后8小时内，受血猕猴的Hb和Hct恢复到和失血前水平，失血猴未出现面色苍白等贫血症状，说明经酶解和mPEG包裹双修饰的猪红细胞可在一定时间内在猕猴体内发挥正常的携氧功能，因此失血猕猴未出现贫血症状，尤其是在输入修饰的pRBC后，血清中LDH水平升高幅度较贫血猴低，说明输入的猪红细胞能够缓解动物的缺氧状态。
在给猕猴输入双修饰的pRBC的异种输血过程中，猕猴的呼吸、心率、血压和血氧饱和度等指标均没有明显变化，这提示在异种输血过程中受血猕猴的生命指标是平稳的，未出现剧烈的输血反应。无免疫抑制剂试验组猕猴的尿胆原，尿蛋白和尿红细胞均出现强阳性，而使用免疫抑制剂试验组和自身回输对照组在尿中仅检测到少量的红细胞。我们推测，其机理是使用CVF抑制受试猴体内的补体系统，减弱了IgG介导的补体激活途径，减轻了肝脏和肾脏损伤，因此免疫抑制剂试验组的血生化和尿常规检查指标均较无免疫抑制剂组正常。
试验结果提示将经修饰的pRBC输注给猕猴，即异种输血是有可能的。本研究结果为实现将pRBC作为人红细胞代用品，以及用pRBC抢救失血的珍稀动物，提供了有意义的参考。
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