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淋巴细胞范文1
【关键词】 黄芪注射液 银屑病 Th细胞亚群 IFNγ IL4
Effects of Astragulus injection on Th cell subset function in patients with psoriasis in vitro
Abstract Objective：To study the effects of Astragulus injection on Th cell subset function in patients with psoriasis.Methods：The peripheral blood lymphocytes from 20 patients with psoriasis at the remission stage were stimulated with either phytohem agalutinin(PHA)(patientcontrol group)or PHA together with Astragulus(patientAstragulus group)and were then cultured in vitro for 48 hours.The samples from 10 healthy people stimulated with PHA were used as the normal control group.The levels of interferonγ(IFNγ) and interleuikin4(IL4) in the super
〔1〕本课题为山西省青年科技研究基金资助项目(课题编号：20011030)。
natants of lymphocytes were detected using ELISA.Results：The IFNγlevel in the patientcontrol group were statistically higher than those in the control group(P＜0.05).But the IL4 lever were lower than those(P＜0.05).The level of IFNγin the patientAstragulus group were markedly lower than those in the patientcontrol group(P＜0.05).But the IL4 level were higher than those(P＜0.05).Conclusion：Astragulus injection can lower the Th1 cell subset and promote disverting to Th2 cell subset，therefor shows an importont significance in treating psoriasis.
Key words Astragulus injection；psoriasis；Th cell subsets；IFNγ；IL4
银屑病是一种在遗传基础上与多种因素相互作用的慢性炎症性疾病，目前许多学者倾向于将银屑病归于自身免疫性疾病，其发病与机体T细胞亚群免疫失衡密切相关，认为其发病初期表现为外周血T细胞过度活化［1］，是Th1介导的细胞免疫疾病。中药黄芪对细胞免疫、体液免疫、非特异性免疫功能及细胞因子均有调节作用，实验已证实，黄芪可调节变应性鼻炎、肺癌［2］、糖尿病［3］、过敏性紫癜等疾病的T细胞亚群失衡状态。本研究通过体外检测黄芪注射液对两种主要细胞因子水平的影响，以探讨黄芪注射液对银屑病患者辅助T淋巴细胞亚群功能状态的影响。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2007年11月—2008年5月门诊及住院的进行期寻常型银屑病患者20 例，男14 例，女6 例，年龄17～65 岁，病程0.5～13年，所有病例均已除外自身免疫性疾病和其他系统性疾病，就诊前1个月未内用及外用糖皮质激素、免疫抑制剂等影响全身免疫功能的药物。对照组为10 例与病例组性别、年龄相匹配的健康志愿者，男5 例，女5 例，年龄25～56 岁。
1.2 主要试剂与仪器
淋巴细胞分层液(上海试剂二厂产品)，RPMI1640冻干粉(美国Gibco公司)，新生小牛血清(美国Gibco公司)，植物血凝素(PHA—P)冻干粉(美国Sigma公司)，黄芪注射液(每支10 mL相当于原药材20 g，正大青春宝公司)，人IFNγ、IL4定量ELISA试剂盒(北京邦定生物医学公司)，自动化板式酶标仪(ZS—CF 5000型中国航天工业总公司)，水平式离心机(LDZ5－2型北京医用离心机厂)，倒置显微镜(Olympus公司)，CO2培养箱(美国Asheville NC)。
1.3 方法
1.3.1 淋巴细胞分离与培养
分别取三组外周静脉血10 mL，肝素抗凝对倍稀释后，以2∶1比例轻轻加入淋巴细胞分离液上，以2 000 r/min，离心15 min，吸取单个核细胞层，经吸附法获得淋巴细胞，Hank′s液洗涤2次，将洗好的细胞用RPMI 1640培养液配成2×107/mL的细胞悬液，取健康人上述细胞悬液200 μL加入1.8 mL含10％胎牛血清的RPMl1640培养液中，植入无菌培养板，设为正常对照组；取患者上述细胞悬液400 μL，均分2份，各200 μL如上加入1.8 mL含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，植入无菌培养板，1份设为病例未加药组；另1份加入黄芪注射液，终浓度为1 mg/mL，设为病例黄芪组。以上各组中均加入PHA体外诱导淋巴细胞，终浓度5 mg/mL。将培养板置37℃，含5％CO2的孵育箱中，用倒置显微镜观察细胞的生长状况，培养48 h，收集培养上清液500 μL，－20℃冻存备用。
1.3.2 细胞因子检测
培养上清液中IFNγ与IL4水平采用双抗体夹心法定量ELISA试剂盒检测，操作严格按照试剂盒说明书进行，最后在自动化CF5000板酶标上测定OD492值(此型酶标仪可直接报告标本的浓度值)。
1.4 统计学方法
采用SPSS10.0统计软件包进行分析，所测的实验数据采用±s表示，组间差异用t检验，P＜0.05有统计学意义。
2 结
果
2.1 病例对照组和正常对照组IFNγ与IL4比较(见表1)
病例对照组与正常对照组相比，IFNγ明显升高(P＜0.05)，IL4明显降低(P＜0.05)，差异均具有统计学意义，提示银屑病患者Th1细胞亚群呈优势状态，Th1/Th2失衡。
2.2 病例黄芪组和病例对照组IFNY与IL4比较(见表1)
经黄芪注射液刺激后，病例黄芪组IFNγ水平明显低于病例对照组P＜0.05，而IL4水平明显高于病例对照组(P＜0.05)差异具有统计学意义。表1 3组T淋巴细胞培养上清液IFNγ、IL4水平比较
3 讨
论
CD4阳性T辅助淋巴细胞(简称Th)为一多功能细胞群体，在调节免疫系统中具有双重作用，对免疫反应的启动、最终表现形式和强弱起着关键作用。根据细胞因子分泌模式，CD4＋T细胞可分为Th1和Th2亚群，它们来自一个共同的前体细胞Th0，Th1和Th2是由Th0发育而来的两种极化形式，Th1/Th2漂移需中间形式Th0的过渡。Th1细胞主要与细胞免疫介导的炎症反应有关，Th2细胞主要与体液免疫有关，二者同时还有相互抑制的作用。Th1细胞可分泌IL2、TNFα、IFNγ等，其中最主要的细胞因子是IFNγ，IFNγ可以活化巨噬细胞，刺激吞噬活性增强，是银屑病病理生理学变化过程中重要病因之一。Th2细胞主要分泌IL4、IL10等，可抑制巨噬细胞的活化，从而抑制Th1细胞，对自身免疫性疾病有很强的保护作用［4］。IL4是促进Th0向Th2分化的主要因素，它主要通过活化STAT6蛋白促进Th2分化，STAT6基因敲除的小鼠则Th2细胞分化受损［5］，由此可见，在Th1/Th2平衡中，IFNγ主要促进Th1的分泌，IL4主要促进Th2的分化。故本研究选择IFNγ、IL4作为检测指标来评价Th1与Th2功能状态。
正常机体内，Th1/Th2维持着动态平衡。当Th1/Th2失调时，则表现为Th1或Th2细胞中某一亚群功能增强，另一亚群功能减弱，可导致肿瘤、感染、自身免疫性疾病及移植排斥反应。一般而言，Th1反应过度活化可导致器官特异性自身免疫性疾病，如1型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、类风湿关节炎等；Th2反应过度活化可导致器官非特异性自身免疫性疾病，如变态反应性疾病(哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎)、抗体介导的免疫性疾病(SLE、肾炎、过敏性紫癜)。Austin等［6］从银屑病患者皮损中分离出T细胞，在体外给予刺激，使其分化、增殖并表达细胞因子，发现了Th1细胞分化偏态性。本研究结果显示，病例对照组中IFNγ水平较正常对照组明显升高(P＜0.05)，IL4水平明显低于正常对照组(P＜0.05)，呈现Th1类细胞因子优势状态，这与国外报道一致。IFNγ是角质形成细胞(KC)的促有丝分裂原，且抑制IL10的表达。给予系统性IFNγ和升高IFNγ的药物如锂制剂能诱导或加剧银屑病［7］。IFNγ在正常情况下有抗增殖作用，但在银屑病中，已证明KC对IFNγ改变了反应性，表现为对IFNγ的生长抑制不敏感，反而可提高KC的增殖反应，阻碍KC的分化。可见银屑病患者表皮细胞增殖与IFNγ过多表达有关。
黄芪为常用中药，又名独根、二人抬，来源于豆科植物蒙古黄芪和膜荚黄芪的干燥根。其性温和、味甘，具有很强的免疫调节作用，在变应性鼻炎、肺癌、过敏性紫癜、1型糖尿病等疾病的研究中已证实黄芪可调节其Th1/Th2的不平衡状态，且黄芪的免疫调节作用具有双向性，其作用很大程度上取决于机体的免疫状态，有利于调整机体的免疫失衡状态［8］。近年来，应用中药黄芪治疗银屑病已被众多基础及临床研究证明有效［9］。吴凡等［10］用黄芪注射液灌饲病毒性心肌炎小鼠2周后发现，小鼠心脏组织中IL2和TNFα的mRNA表达下降，IL10mRNA表达则升高，表明黄芪可通过调节细胞因子在心脏组织的表达，抑制炎症反应，从而发挥其治疗作用。本研究结果显示(病例黄芪组)黄芪注射液与银屑病患者外周血淋巴细胞共同培养后，IL4水平明显高于病例对照组(P＜0.05)，而IFNγ水平低于病例对照组(P＜0.05)，提示黄芪可下调银屑病患者病理性Th1优势状态，促进向Th2优势状态转换，上调IL4表达水平，抑制细胞免疫反应，促进其在自身免疫反应中的免疫保护作用，逆转Th1/Th2失衡状态，这可为黄芪注射液临床治疗银屑病提供一定的理论依据。
参考文献
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淋巴细胞范文2
【摘要】 目的： 探讨不同时期人胎肠系膜淋巴结淋巴细胞凋亡。方法： 收集人胎35例，采用常规组织学HE染色、免疫组织化学细胞凋亡（TUNEL法）染色和细胞计数法进行研究。结果： 9周，人胎肠系膜淋巴结原基内未见凋亡的淋巴细胞。11~12周，有极少量淋巴细胞凋亡，13~32周，各胎龄段均有淋巴细胞凋亡。凋亡的淋巴细胞呈单个分布且多被巨噬细胞所吞噬。经统计学处理，各胎龄段淋巴细胞凋亡数差异无显著性（P＞0.05）。结论： （1）淋巴细胞凋亡是人胎肠系膜淋巴结发育过程中的普遍现象；（2）人胎发育时期，肠系膜淋巴结通过细胞凋亡方式对淋巴细胞的发育有一定筛选作用。
【关键词】 淋巴结； 肠系膜； 人； 胎儿； 淋巴细胞； 凋亡
［Abstract］ Objective: To study the apoptosis of lymphocytes in mesenteric lymph nodes （MLNs）during different stages of human fetus development. Methods： Thirty-five human fetuses were collected. The Hermatoxylin-Eosin（HE） staining， immunohistochemistry apoptosis method (in-situ dT， dT-mediated dUTP nick labeling，TUNEL)， and cytometry were used in this study. Results： At the 9th week of fetal age， no apoptosis lymphocyte was seen in the primordium of the MLNs. In 11~12 weeks of fetal development， a few of apoptosis lymphocytes could be found. Obvious apoptosis lymphocytes were observed from the 13rd week to the 32nd week. They occurred singly and were phagocytized by macrophage. But there was not distinct difference between each stage of the developing fetuses (P>0.05)．Conclusions： (1) The apoptosis of lymphocytes is a common phenomenon during MLNs growth in human embryo development; (2)During the development of human fetus， the MLNs have screening function to lymphocytes through apoptosis.
［Key words］ lymph nodes； mesentery； persons； fetus； lymphocyte； apoptosis
细胞凋亡（apoptosis）不仅发生在一些疾病过程中，在胚胎发生、器官发育等方面也有重要的作用[1，2]。目前淋巴细胞的凋亡已有较多报道，但多侧重于对动物在体或离体及人离体淋巴细胞的研究，然而在人胎肠系膜淋巴结（mesenteric lymph nodes， MLNs）发生过程中淋巴细胞凋亡的动态情况如何[3，4]？为此，于2005年1月拟探讨人胎儿MLNs不同时期相关淋巴细胞凋亡的变化规律，以期对人胎肠系膜淋巴结的发生和腹腔内免疫防御的研究提供形态学资料。
1 材料与方法
1.1 材料
收集因故中止妊娠的人胎35例，各例均测量顶臀长（crown-rump length，CRL），按Patten[5]标准确定胎龄（表1）。表1 胎龄、顶臀长及例数分布
1.2 主要试剂
TUNEL（In-situ dT dT-mediated dUTP nick labeling）法染色细胞凋亡检测试剂盒（In situ cell apoptosis detection kit I， POD）和显色剂（Diaminobenzidine， DAB），均由武汉博士德生物制剂公司提供。
1.3 方法
各例均取部分肠系膜淋巴结，用10％Formalin固定，常规石蜡包埋，制成4 μm连续切片。进行常规HE染色和免疫组织化学TUNEL法染色。
免疫组织化学TUNEL法染色主要步骤：切片脱蜡下行入水，入3%H2O2 10 min，蒸水洗5 min，3次，依次加入标记缓冲液和标记液37 ℃孵育120 min，TBS洗3 min，3次，加入封闭液，封闭液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体37 ℃孵育30 min，TBS洗3 min，3次，TBS1∶100稀释SABC，37 ℃孵育60 min，TBS洗5 min，3次，DAB-H2O2液显色，中性树胶封片。
方法对照：均用TBS缓冲液代替标记液，余步骤相同。
1.4 切片观察、图像分析及数据处理
以有核阳性细胞数/视野（物镜40倍目镜10倍）对人胎肠系膜淋巴结内凋亡的淋巴细胞进行计数。每胎龄段标本随机取5例，每例取非连续切片2张，每张计数5个视野，将各胎龄段淋巴细胞凋亡数两两比较。用SPSS12.0进行统计学处理。
2 结果
2.1 淋巴细胞凋亡的HE染色观察
光镜下，经HE染色的凋亡的淋巴细胞主要表现为胞体变小、胞质浓缩、嗜酸性变、核染色质凝集成块、核固缩和颜色深染、致密度高。
9周，人胎肠系膜淋巴囊腔内淋巴结原基形成，未见凋亡的淋巴细胞。11~12周，淋巴结原基周的淋巴囊壁结缔组织形成被膜，原基增大，淋巴细胞增多并集中于一侧（图1）。15周以后，形成早期髓索，索间的间隙分化为淋巴窦，23周时皮质可辨别，并且在皮质内见初级淋巴小结，29周以后，随胎龄的增加，皮质继续增厚，可辨别浅层皮质（内有较多的初级淋巴小结）与薄层副皮质区，在淋巴结内均可见凋亡的淋巴细胞，单个散在分布于MLNs内（图2~4）。可见巨噬细胞吞噬凋亡淋巴细胞的现象（图1~4)。
2.2 淋巴细胞凋亡的免疫组织化学观察
光镜下，凋亡的淋巴细胞经免疫组织化学TUNEL法染色后，免疫反应产物呈棕黄色颗粒，位于胞核内（图5）。对照片结果为阴性。9周，人胎肠系膜淋巴结原基内未见凋亡的淋巴细胞。11~12周，出现极少的淋巴细胞凋亡，散在分布（图5）。早期凋亡的淋巴细胞，核染色质成大小不等的深褐色颗粒，边集于核膜下，形成环状核（图5~7）；晚期细胞核染色质凝集成块，核固缩，深染，进而核碎裂，形成凋亡小体（图7、图8）。
13~32周，各胎龄段均见有淋巴细胞凋亡，凋亡的淋巴细胞数略有增加，但经细胞计数及统计学处理，人胎肠系膜淋巴结凋亡的淋巴细胞细胞计数在各胎龄段间差异没有显著性（P＞0.05）。
3 讨论
细胞凋亡是生命有机体内正常的生理现象，是有核细胞在一定条件下通过启动自身的内部机制，主要是通过内源性DNA内切酶的激活而发生的细胞自然死亡过程，这种基因控制下的细胞自我消亡过程，亦称为程序性细胞死亡（programmed cell death， PCD），细胞凋亡是多细胞动物生命活动过程如胚胎发生过程中重要组成部分[1~9]。本实验观察到从11周MLNs原基形成到32周各胎龄段肠系膜淋巴结发育过程中均有淋巴细胞凋亡现象存在，证实了淋巴细胞凋亡也是人胎MLNs发育过程中的普遍现象。有研究报道，中枢淋巴器官内，绝大多数的与自身抗原发生反应的淋巴细胞往往不能发育成熟而被筛选掉，这一过程是通过细胞凋亡的方式实现的[10]。本实验观察到在外周淋巴器官发育过程中，淋巴细胞凋亡也作为一种普遍现象存在，这与一些学者认为胎儿发育时期淋巴细胞是在中枢淋巴器官内获得死亡信号，而在外周凋亡的观点相符合[1，11，12]。同时，也说明迁入MLNs内的初始T、B细胞大多数按正常规律发育分化。提示在人胎淋巴结的发育过程中，淋巴结对来自中枢淋巴器官的淋巴细胞仍存在一定的筛选作用。本实验研究表明，随着胎龄增加，淋巴结体积逐渐增大，凋亡细胞细胞数量并未随胎龄增大而明显增加（P＞0.05），提示了人胎发育过程中，淋巴结内成熟淋巴细胞数量呈逐渐增多趋势。
参考文献
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淋巴细胞范文3
【摘要】 目的 探讨弱激光对机体免疫刺激作用的机理。 用剂量63.7J/cm2的He-Ne激光照射小鼠神阙穴，照射时间为10天，每天照射5min，（1）采用台盼蓝活体注射显示巨噬细胞吞噬力试验方法；（2）采用吖啶橙（AO）显示核酸的荧光染色法分别观察小鼠肠系膜淋巴结内巨噬细胞的吞噬功能和淋巴细胞内核酸含量的。（3）观察淋巴结组织结构。结果 （1）照射组淋巴结内巨噬细胞吞噬功能较对照组显著增高，差异有非常显著性(P
【关键词】 激光；巨噬细胞； 淋巴细胞
An experimental study of He- Ne laser irradiation on the macrophages and lymphocytes in lymph node
【Abstract】 Objective To research the effects of He-Ne laser irradiation on immunity of organism.Methods Shenque acupoints of mice abdomen were irradiated by He-Ne laser at the dosages of 63.7J/cm2 for 10 days，5 minutes each day.n following methods are taken：(1)Observing the phagocytosis of the macrophages in lymph node after trypan blue injecting the live mice.(2)Observing the changes of nucleic acid of lymphocytes with fluorescence microscope.(3) Observing the tissue structure of lymph node by HE stain.Results The four indexes：number of trypan granule，area of granule，ratio of granule area to cell area and granule integral optical density at irradiated group were higher than that of non-irradiated group (P
【Key words】 laser;macrophage; lymphocyte
淋巴结是机体的主要周围淋巴器官，位于淋巴循环的通路上，其大小、结构及内含细胞成分的变化与机体的免疫功能状态密切相关。本文采用He-Ne激光照射小鼠神阙穴后，观察激光对肠系膜淋巴结组织结构和其内巨噬细胞吞噬力及淋巴细胞增殖能力的影响。旨在探讨低强度激光对机体免疫刺激作用机制，为临床提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料 昆明种小白鼠，体重18~22g，雌雄各半，随机分成对照组和照射组，采用上海产1000B(c)He-Ne激光器照射小鼠神阙穴（剪毛），照射功率25mW，照射剂量为63.7J/cm2，光斑直径0.3cm，照射时间为10天，每天照射5min。
1.2 方法 （1）取材前3日，每天往腹腔内注射0.5%的无菌台盼蓝0.3ml，第4日取肠系膜淋巴结。用10%福尔马林固定，常规法制成石蜡切片，用伊红淡然，将切片用HI-CI型医学图像系统于每组600倍光镜下随机选择12屏，统计巨噬细胞吞噬台盼蓝的颗粒数目(GN)、颗粒面积(GA)及其与细胞面积之比(GA/CA)和颗粒积分光密度(IOD) 4项指标，并输入微机作F检验。（2）取肠系膜淋巴结涂片，用Carnoy 氏固定液固定15min，再用0.01% AO缓冲液染色10min，置OLYMPUS BHF-型荧光显微镜的高倍镜下观察，DNA呈黄色荧光，RNA呈红色荧光，DNA或RNA含量越多，黄色或红色越深越亮。（3）常规HE染色方法观察淋巴结的组织结构。
2 结果
2.1 He-Ne激光对淋巴结巨噬细胞吞噬能力的影响 淋巴结的每组切片置图像分析系统的光镜下放大600倍，随机选择12屏观察淋巴结髓质区，巨噬细胞胞质内出现蓝色颗粒为阳性，台盼蓝颗粒呈大小、粗细不等，分布不均，颜色深浅各异。图像分析结果用统计软件作F检验，见表1。
淋巴细胞范文4
淋巴细胞的分离随机选择采集后6h内的ACD抗凝全血(200ml,上海市血液中心提供)并制备成浓缩白细胞,在无菌条件下用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞,用PBS(含EDTA0.5mmol/L)洗涤2次,1640培养基洗涤1次,弃上清后重悬于1640完全培养基(含10%胎牛血清),置5%CO237℃孵箱中培养过夜;次日离心收集悬浮细胞,加入自体血浆重悬至106个细胞/mL。对照组和实验组淋巴细胞样本的制备在避光条件下,取5ml细胞悬浮液,加入终浓度100μmol/L的核黄素,混合均匀后,注入PVC光照袋中,编入实验组;另取5ml细胞悬液加入上述核黄素等体积的PBS,混匀注入PVC袋,编入对照组。实验组置于420nm的可见光光源下进行双面照射,照射量为40J/cm2;对照组不接受光照。将各组淋巴细胞离心后,重悬于1640完全培养基(含10%胎牛血清)。各取2.5ml加入24孔板,每孔中加入终浓度0.5μg/mL的PHA;同时,以同等样本量的不加PHA的细胞悬液作为平行对照。于5%CO237℃孵箱中培养。淋巴细胞增殖检测对照组及实验组细胞培养48h后,分别取各组淋巴细胞100μl加入96孔细胞培养板,加入BrdUlabelingreagent,混匀,置5%CO237℃孵箱中培养24h;用BrdU细胞增殖检测试剂盒内相关试剂处理后,于450nm处读取吸光度值。根据读数计算实验组淋巴细胞增殖抑制率:实验组细胞增殖抑制率I=[1-(O.D.PHA+实验组–O.D.PHA-实验组)/(O.D.PHA+对照组–O.D.PHA-对照组)]×100%。淋巴细胞细胞因子分泌检测对照组及实验组细胞培养72h后,收集上述各组淋巴细胞各1ml,1600rpm离心5min,取上清,用细胞因子酶标检测试剂盒检测细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-4的含量。AnnexinV-PE/7-AAD细胞凋亡检测收集培养24h的对照组和实验组细胞各1ml,经1600rpm离心5min弃上清,用PBS洗涤2次,重悬于1×bindingbuffer中,加入3μlAnnexin-V:PE和3μl7-AAD,混匀,室温避光放置15min,加入400μl1×bindingbuffer,混匀,流式细胞仪检测。数据分析使用MicrosoftExcel软件,所有量值数据均采用“均数±标准差(珋x±S)”表示,作配对t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
核黄素光化学法对PHA诱导后的淋巴细胞增殖的影响如表1所示,对照组接受PHA刺激的淋巴细胞较未接受PHA刺激的细胞O.D.值显着升高,而实验组淋巴细胞接受PHA刺激后O.D.值没有明显变化,核黄素光化学处理对淋巴细的增殖抑制率为(94.49±7.61)%。核黄素光化学法对淋巴细胞细胞因子分泌的影响因淋巴细胞样本来自不同的捐献者,对抗原刺激产生细胞因子的能力存在个体差异,因此不同淋巴细胞对同一细胞因子的分泌量存在很大差异,导致SD值比较高,但对同一份淋巴细胞样本,接受PHA刺激后,对照组淋巴细胞和实验组淋巴细胞同一细胞因子分泌量的比较仍具有统计学意义。PHA刺激后,与对照组淋巴细胞细胞因子相比较,实验组淋巴细胞IFN-γIL-10和IL-12的分泌量分别降低了(89.54±22.75)%、(77.83±22.3)%和(88.57±15)%。AnnexinV-PE/7-AAD细胞凋亡检测结果FSC-SSC散点图(图略)显示,核黄素光化学处理之后的淋巴细胞前向角散射减少,表明处理后细胞大小发生改变;从AnnexinV-PE/7-AAD双标图(图略)可以看出,实验组绝大多数淋巴细胞位于Annexin阳性的两个象限内,其中早期凋亡细胞和晚期凋亡或坏死细胞均高于对照组。,经核黄素处理后的实验组淋巴细胞的早期凋亡率和晚期凋亡或坏死率较对照组有显着性差异。
TA-GvHD的发生率与输入的具有免疫活性的淋巴细胞数量呈正相关,输入的供血者的淋巴细胞数量越多,发病的可能愈高,病情愈严重,死亡率也愈高。因此血液制品中淋巴细胞的灭活是预防TA-GvHD的最有效的办法。利用γ射线照射可以有效抑制血液制品中淋巴细胞的增殖活性,射线产生的电离辐射会对淋巴细胞的DNA造成不可逆的损伤,使其失去增殖和分化能力。因此,该方法是目前国际上公认的预防TA-GVHD的有效方法。由于辐照对红细胞的代谢及功能可造成不同程度的影响,所需仪器设备昂贵,对操作人员存在辐射危害等原因,该方法在临床实践中的使用受到了一定的限制[10]。核黄素是一种自然存在于哺乳动物体内的多环平面结构的芳香族化合物,可穿越细胞膜、病毒脂薄膜以及核膜与核酸结合,在接受了UVA或可见光提供的能量后,发生电子转移,使鸟嘌呤碱基氧化并形成共价加成化合物,阻止核酸的转录、复制,进一步的反应甚至可使核酸骨架链断裂,达到灭活淋巴细胞和病原体的目的。由于核黄素(即维生素B2),是人体必需的一种维生素,对人体无任何毒性,在这一点上核黄素光化学法明显优于其他血液病原体灭活方法[11]。核黄素光化学法成为近年来血液制品病原体灭活技术领域研究的热点,已有研究证明该方法可以用于血浆、血小板等血液成分的病原微生物的灭活[12]。为了研究核黄素光化学对人外周血淋巴细胞的灭活作用,本实验将淋巴细胞悬浮于自体血浆,所得结果能够真实反映血液中淋巴细胞的灭活效果。实验中使用PHA诱导实验组和对照组淋巴细胞的增殖,观察核黄素光化学法对淋巴细胞增殖活性的抑制作用和效果。结果显示,对照组淋巴细胞经PHA刺激后细胞增殖明显,而经核黄素光化学法处理的实验组淋巴细胞接受PHA刺激后几乎没有增殖,表明核黄素光化学法可有效抑制淋巴细胞增殖活性,增殖抑制率为(94.69±7.61)%。TA-GvHD发生的“细胞因子风暴学说”认为,活化的供者T细胞释放大量IFN-γ等细胞因子,这些细胞因子又能够进一步活化供者T细胞使其扩增,这种逐级放大形成恶性循环的细胞因子网络系统能够促进TA-GvHD时的组织和细胞损伤[13];临床研究发现IL-12在临床急性移植物抗宿主病(aGvHD)发生中起重要的正向调节作用[14];IL-10在aGvHD的发病过程中的重要作用也已得到证实[15,16];Mur-phy等研究发现以IL-4基因剔除小鼠作为骨髓移植供体,移植后aGvHD的发生率降低,提示供体来源的IL-4在aGvHD中可能起正调控作用[17]。鉴于细胞因子在GvHD的发生发展过程中起着重要作用,研究核黄素光化学处理对供血者淋巴细胞相关细胞因子的分泌能力的影响,有利于进一步探讨利用核黄素光化学法预防TA-GvHD的可行性。实验结果显示,在PHA刺激条件下,核黄素光化学处理的淋巴细胞IFN-γ、IL-10和IL-12的分泌量较对照组均有明显降低。对照组和实验组淋巴细胞分泌IL-4的量较少,2组分泌量无明显差异。这一结果表明,核黄素光化学法可明显抑制人外周血淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-10和IL-12的活性,这与我们之前将淋巴细胞悬浮于PBS中进行光化学处理的结果一致[18]。另外,由于TA-GvHD一般发生于输血后1~30d内[19],为了更准确地描述核黄素光化学处理对淋巴细胞分泌细胞因子的影响,有必要延长培养时间进行继续检测。位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl-serine,PS)外翻,是细胞凋亡早期的1项重要标志,而AnnexinV作为一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS发生特异性结合。用荧光素PE标记An-nexinV作为荧光探针,利用流式细胞仪可以检测细胞凋亡的发生,而将AnnexinV与非侵入性染料7-氨基放线菌素D(7-Amino-ActinomytinD,7-AAD)联合使用则可以区分凋亡细胞和坏死细胞。本次研究结果显示,在经核黄素光化学处理24h之后,绝大多数细胞发生死亡,其中凋亡和坏死细胞的比例均明显高于对照组,这一结果表明核黄素光化学处理可能是通过诱导淋巴细胞发生凋亡,达到灭活的目的,这一点还有待从其他方面进行验证。核黄素光化学法作为血液制品病原体灭活的新方法,其有效性及安全性已经得到证实[20,21],本次研究则表明核黄素光化学法可以有效灭活人外周血淋巴细胞。由此可以推测,核黄素光化学法可以在灭活血液制品中病原体的同时,达到灭活淋巴细胞,预防TA-GvHD的目的。这样可以简化血液安全处理的程序,降低因反复处理对血制品造成的影响,因此核黄素光化学法是1种非常有潜力的血液安全处理方法。
淋巴细胞范文5
【摘要】 目的 分析HBV感染者外周血各亚群淋巴细胞的变化。方法 对112例乙肝患者采用荧光定量PCR技术和流式细胞术分别检测血中HBV-DNA及检测各组外周血T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD3-/CD16+CD56+(NK细胞)、CD3-CD19+(B细胞)表达百分比。结果 与急性肝炎组比较，慢性肝炎、肝硬化组CD3、CD4、CD8均有下降(P
【关键词】 乙肝病毒;T淋巴细胞亚群;急性肝炎;慢性肝炎
乙型肝炎的病变由HBV感染诱发的免疫病理反应造成。为探讨乙型肝炎发生发展过程中免疫功能变化特点，本研究采用荧光定量PCR技术对112例乙肝患者血清中HBV-DNA的感染情况进行检测，同时对其外周血T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD3-/CD16+CD56+(NK细胞)、CD3-CD19+(B细胞)进行分析，探讨HBV感染者的细胞免疫状态及其与病毒复制的关系。
1 材料与方法
1.1 病例选择 我院2008年1—6月收治的住院患者112例，男79，女33例，年龄15～65岁，平均(31±22)岁。病程6～106个月。诊断符合西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》诊断标准[1]，其中慢性乙型肝炎(CAH)57例，乙型肝炎肝硬化(LC)36例，急性乙肝(AHB)19例，均排除甲、丙、丁、戊型肝炎。入院前3个月内无免疫制剂史。
1.2 主要试剂和仪器 北京医用离心机厂低速离心机，日本日立公司SANYO型低温冰箱，Ficoll淋巴细胞分离液(比重1.077±0.002)购自上海试剂二厂，TagDNA聚合酶购自晶美生物制品公司，荧光定量试剂盒购自深圳达安基因公司，淋巴细胞亚群单抗试剂：simultestTM IMK-Lymphocyte购自BD公司，FACS Calibur流式细胞仪购自Beckman coulter公司。
1.3 流式细胞仪测定淋巴细胞亚群百分比
将含EDTA2Na空腹全血3mL，在采集后4h通过simultestTM IMK-Lymphocyte试剂盒、FACScalibur流式细胞仪分析淋巴细胞亚群，包括CD3+、CD4+、CD8+、NK、B细胞表达百分比，最后进行各淋巴细胞亚群百分比统计学分析。
1.4 血清HBV-DNA检测 参照试剂盒说明书进行。直接吸取血清50μL，加等量的DNA提取液混匀，100℃沸水浴10min，转至4℃静置6～8h，离心5min，取上清液5μL做PCR反应。
1.5 统计学方法 数据以均数±标准差(±s)表示，两组间样本均数比较采用Student`s t检验，组间的两两比较采用Student-Newman-Keuls。
2 结果
2.1 各组外周血淋巴细胞亚群检测结果 见表1。
2.2 血清HBVDNA(+)与HBVDNA(-)组的CD3、CD4、CD8、NK、B细胞比较 见表2，两组差异无统计学意义P>0.05。表1 各组外周血淋巴细胞亚群检测结果比较
3 讨论
HBV感染人体后可引起肝脏和其他脏器的病变。乙型肝炎的发生是机体与病毒相互作用的结果。HBV侵入肝细胞内增殖，可使受染细胞表达HBsAg、HbcAg等，能为机体免疫系统所识别，引起一系列的免疫应答。人体外周T淋巴细胞由不同的亚群组成，T淋巴细胞是宿主抗病毒、抗肿瘤免疫反应中起主导作用的免疫活性细胞，构成了免疫系统的主要部分。
T淋巴细胞由不同的亚群组成。人成熟T细胞按表型不同可将其分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD3+代表总T淋巴细胞，CD4+T细胞为辅T细胞，CD8+T细胞为细胞毒性T细胞。本研究通过流式细胞仪测定发现，随着病情发展从急性肝炎组到慢性肝炎、肝硬化组CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞均有所下降(P
NK细胞是机体天然免疫的主要承担者。本组实验结果显示在HBV感染中肝硬化患者的NK细胞均低于慢性肝炎及急性肝炎组(P
乙型肝炎细胞损伤和炎症反应是由宿主免疫应答和病毒共同作用的结果。HBV的慢性感染使机体的免疫系统发生明显的异常。T淋巴细胞是人体主要的免疫细胞，其数量和比例是反映机体免疫水平的主要指标。淋巴细胞计数与乙肝临床分型有一定关系。本文结果表明检测CD3+、CD4+、CD8+、NK、B细胞对了解肝病发病机制及肝脏损害程度有重要临床意义。
参考文献
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[2] 肖光明.乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群的变化[J].实用肝脏病杂志，2005，8(1)：22-24.
[3] Gamadia LE，Rentenaar RJ，Barrs PA，et al.Differentiation of cytomegalovirus-specific CD8+Tiers cells in healthy and immunosuppressed virus carriers[J].Blood，2001，98(10)：754-761.
[4] 王静艳，穆桂玲，刘沛，等.乙型重型肝炎基因变异与免疫异常的关系[J].中华传染病杂志，2001，4(19)：73-76.
[5] 肖光明，姚细安，连粤湘，等.乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群的变化[J].实用肝脏病杂志，2005，8(1)：22-24.
淋巴细胞范文6
[关键词]流式细胞仪；艾滋病；T淋巴细胞亚群
[中图分类号]R511 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2007）05（c）-057-01
获得性免疫缺陷综合征（艾滋病）是由免疫缺陷病毒HIV感染所引起的一种严重的传染性疾病，HIV主要侵犯CD4＋T淋巴细胞，并可导致细胞免疫损害。 T淋巴细胞亚群的水平和疾病的进展程度有密切关系，是判断病情进展，推测预后及评价抗病毒疗效的一项重要指标。
1 材料与方法
1.1 病例资料
15例AIDS患者，20例HIV感染者来源于本市疾病控制中心送检和本院就诊的2003~2006年病例，均经免疫印迹试验确诊。30例健康成人标本为本院体检中心送检。根据临床医生分期诊断将感染者分为两组，即HIV感染者无症状组(AS组)、艾滋病组(AIDS组)。
1.2 主要仪器和试剂
BeckmanCoulter Epics XL流式细胞仪； CD4+-FITC/CD8+-PE/CD3+-PECYS三色荧光标记抗体，IgG二色荧光标记抗体。
1.3 研究及统计方法
3组均采空腹静脉血2 ml，EDTA-K2抗凝。取CD4+-F ITC/CD8+-PE/CD3+-PECYS三色荧光标记抗体20 μl和抗凝全血50 μl加入TruCOUNTTube绝对计数专用试管中充分混匀，室温，避光孵育20 min，加入1×FAGS溶血剂450 μl，充分混匀，室温下避光孵育15 min待测。另取一支管加入IgG二色荧光标记抗体20 μl和抗凝血50 μl作为阴性对照。运行SYSTEM Ⅱ程序上机检测，用FLOW CHECK校准FCM的光路和流路。确定其CV值小于2%。每管收集5 000个以上细胞进行分析。
数据以x±s表示,采用t检验,方差分析,判断各组之间的相关程度。
2结果
AS组和AIDS组的CD4＋淋巴细胞的绝对数和百分率均明显低于正常组(P
3 讨论
人免疫缺陷病毒感染逐渐耗竭在免疫调节中起重要作
用的CD4＋T淋巴细胞，最后引发获得性免疫缺陷综合征，因此CD4＋淋巴细胞水平被广泛应用于确定HIV感染的病期，本文中的数据验证了这点：AS组病人比正常对照组的CD4＋水平明显降低，而AIDS组病人的CD4＋水平则较AS组有明显降低，即随着病程的进展，外周血CD4＋水平呈进行性地下降。HIV感染所致免疫功能的损伤不仅是CD4＋淋巴细胞的破坏，其他免疫细胞也不同程度地受到影响。CD8＋淋巴细胞通过分泌各种细胞因子杀死被病毒感染的靶细胞，它是机体抗HIV最主要的免疫细胞，在HIV感染初期，随着病毒量的增加，CD8＋淋巴细胞的数量也随之上升，其数量与病毒量呈正相关[1]。本研究结果显示，AS组CD4＋淋巴细胞减少，而CD8＋淋巴细胞增多及CD4＋/CD8＋比值显著下降等都与上述讨论相吻合，3组中仅AIDS患者CD3＋水平有显著下降（P＜0.05)，但表1中数据显示，在AIDS组中三种T细胞均有不同程度的下降，这说明AIDS病人整体的免疫防御与监视功能均有所下降，这与CD4＋衰竭引起的全身性免疫功能下降有关[2]。
另外，CD3＋与CD8＋的水平也能在一定程度上体现HIV病情的进展，可作为辅助检查项目，以便综合分析病情。
[参考文献]
[1]Paul ME,Shcarcr WT,Kozinctz CA,et parison of CD8+T cell subsets in HIV infected rapid progressor children versus non-rapid progressor children[J].J Allergy Clin Immunol,2001,108(2):258-264.
[2]Sieg SF,Mitchem JB,Bazlar DA,et al.Close link between CD4+ and CD8+ T cell proliferation defects in patients with human immunodeficiency virus disease and relationship to extended period of CD4+ lymphopenia[J].J Infect Dis,2002,185(10):1401-1416.
