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高效液相色谱范文1
关键词：葛粉;葛根素;HPLC
Abstract:Object:DeterminationofPuerariainPuerariaPowderMethods:PuerariaweredeterminedbyHPLC.ThemobilephasewasMeOH－H2O－HAc（30：70：0.5）.Detectionwavelengthwasat250nm.Results:Puerariashowedagoodlinearrelationship.Theaveragerecoverywas98.6%andRSDwas1.76%.Conclusion:Thismethodwassimple,quickandaccurate.
Keywords:PuerariaPowder;Pueraria;HPLC
葛根为豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根,是常用中药材,具有解肌退热，生津，透疹，升阳止泻功效，用于外感发热头痛、项背强痛，口渴，消渴，麻疹不透，热痢，泄泻，高血压颈项强痛等[1]。现代研究证实，葛根中的主要有效成分为葛根素等异黄酮类化合物，具有抗炎解热、扩张冠状动脉血管、增加冠状动脉血流量的作用，同时也有降低血压的作用。有关葛根中葛根素等异黄酮的含量测定研究已有不少报道[2-5]，但对葛粉中葛根素含量测定报道不多。本文对葛粉中葛根素的提取条件和测试条件等进行比较研究,并采用高效液相色谱法对葛粉样品进行了定量分析,结果令人满意。
1实验部分
1.1仪器与试剂
岛津LC－10Atvp高效液相色谱仪；SPD－10Avp紫外检测器；岛津UV－265紫外分光光度仪，多功能榨汁机/搅拌机SG300－I（上海科骏电器有限公司）。甲醇（色谱纯），水（二次蒸馏），其余均为分析纯。葛根素对照品（中国药品生物制品检定所）；鲜葛（浙江省永嘉县潘坑乡）。
1.2色谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱C18diamonsil5ul(150×4.6mmI.D)，MeOH－H2O－HAc（30：70：0.5）为流动相，紫外检测波长250nm。
2结果与讨论
2.1提取溶剂浓度的选择
精密称取同一样品约0.1g,分别加30%乙醇、50%乙醇和80%乙醇10ml，超声提取60分钟，进样5ul,比较峰面积，实验结果表明30%乙醇提取最好。
2.2超声提取时间的选择
精密称取同一样品约0.1g,分别加30%乙醇10ml，超声提取30分钟、45分钟、60分钟，进样5ul,比较峰面积，实验结果表明超声60分钟为最佳提取条件。
2.3流动相及流速的选择
试验时曾采用下述流动相进行测定：甲醇－水（25：75）、甲醇－水－醋酸（30：70：0.5）、甲醇－水（30：70）为流动相，结果采用甲醇－水－冰醋酸（30：70：0.5）为流动相，样品分离好。而流速也以1.0ml/min为合适。
2.4标样溶液的制备
称取一定量葛根素对照品,用30%乙醇溶解配制成浓度为13ug/ml的葛根素标准液。
2.5葛粉制备
取鲜葛用水洗净切片,称取20g放入搅拌机内，搅拌三次，每次1分钟，每次加水200ml，150ml，100ml，合并浆汁放置二天，去掉上面的水，下面的粉浆用定量滤纸过滤，低温干燥，放入干燥器中备用。
2.6供试品溶液制备
精确称取一定量葛粉于10mL容量瓶中,加30%乙醇10ml,超声提取1h,滤纸过滤,滤液过0.45um滤膜作为供试品溶液。
2.7线性关系考察
在上述色谱条件下，分别进标样溶液0.5、3、5、7、10μl，测得各峰面积。以葛根素为横座标（A），以峰面积（Y）为纵座标，计算得回归方程：Y=3.90×106x+728.14,相关系数r＝0.9999；结果紫外检测葛根素在0.0065-0.13μg范围内呈良好线性关系。
2.8精密度试验
取上述标样溶液，连续进样5次，测定，RSD为1.11%。
2.9重复性试验
取同一样品重复测定5次，RSD为1.61%。
2.10稳定性试验
取上述供试品溶液，0、2、5、7、10h进样，RSD为2.1%，10小时内进样稳定。
2.11回收率试验
取已知含量的样品，分别加入葛根素标样，按上述方法测定5次，平均回收率为98.6%,RSD为1.76%。见表1。
2.12样品分析
精密吸取标样溶液5μl与供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定，结果:葛粉中葛根素的含量为0.06%（n=3），见下图。
3讨论
本文采用高效液相色谱法测定葛粉中葛根素的含量,方法简单、快速、准确，结果满意，可用于葛粉中葛根素的含量测定。
[参考文献]
[1]中国药典2005版一部.2005:233-234.
[2]章育中，杨凡。高效液相色谱法测定葛根及其片剂中异黄酮的含量.药物分析杂志，1984,4(2):67.
[3]张蕾,潘扬，朱蓉贞，等。不同品种及产地的葛根中葛根素含量的比较。中国中药杂志，1995,20(7):399.
高效液相色谱范文2
【摘要】
目的： 建立夏枯草的指纹图谱分析方法，并对不同产地的夏枯草进行指纹图谱的比较研究。方法：以齐墩果酸为参照，采用高效液相色谱法，色谱柱为Hypersil C18，流动相为甲醇：水：醋酸（86：14：0.1），检测波长为208nm，流速为1ml/min。结果： 标出10个主要共有峰，方法学考察表明，本研究建立的分析方法有较好的重现性，比较了不同产地夏枯草药材与标准药材指纹图谱的相似性。结论： 方法稳定、可靠、简便，为提高夏枯草药材质量控制提供依据。
【关键词】 夏枯草； 高效液相色谱； 指纹图谱
夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，我国各地均产，主产于江苏、浙江、安徽、河南等地［1］。夏枯草临床应用广泛，药典中载有“清火、明目、散结、消肿”［2］之功效，现代研究表明夏枯草还具有降血脂，降血糖，免疫抑制以及抗肿瘤等作用［3］。目前，市场上夏枯草产地多，质量不一，缺乏统一质量检测标准，通常采用测定其中一、两种化合物含量的方法来进行质量评价，不足以全面反映药材的整体质量。本研究利用高效液相色谱法对夏枯草进行了指纹图谱的研究，结果表明，本方法稳定、可靠、重现性好，可为夏枯草药材质量控制提供有效的参考依据。
1 仪器与试药
日立高效液相色谱仪，DAD检测器，EZChrom Elite色谱工作站；KQ100A型超声波清洗器；电子天平。
夏枯草对照药材及齐墩果酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。夏枯草药材分别购自各地药材市场和药店，经鉴定为夏枯草药材的干燥果穗。
甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Hypersil C18，4.6*250mm，10μm；流动相：甲醇：水：醋酸（86：14：0.1）；检测波长为208nm；流速为1ml/min。
2.2 供试品溶液的制备
将夏枯草药材择去杂质，60℃恒温干燥，粉碎机粉碎，粉末过40目筛，反复进行，直至药材粉碎全部过筛为止。精密称定夏枯草药材粉末约1g，加入90%甲醇20ml，超声30min，过滤，洗涤，合并滤液和洗液，挥干溶剂，残渣加流动相溶解定容至10.00ml，溶液用微孔滤膜过滤，得夏枯草液，10μl进样。
2.3 流动相的选择
试验过程中，系统比较了不同配比的甲醇水（80：20；84：16；86：14；88：12）和乙腈水（80：20；85：15；90：10）及添加剂的用量。结果表明，以甲醇：水：醋酸（86：14：0.1）为流动相系统效果较佳。
2.4 检测波长的选择
试验采用DAD检测器，在波长190～400nm范围内进行夏枯草样品的吸收情况考察。通过比较各不同保留时间的峰的紫外吸收光谱，得知多数峰的最大吸收在203～210nm范围，少数在230nm附近，综合比较各波长处的色谱图，最终确定208nm作为检测波长。
2.5 参比峰的选择
为消除测定结果的系统误差，选取与其它组份分离较好、峰形对称、保留时间24.617min的色谱峰作为参比峰（经与标准品色谱图谱及紫外吸收图谱对照，得知此组份为齐墩果酸），以便计算夏枯草药材共同特征组份的相对保留时间和相对含量［4］。
夏枯草标准药材的色谱图及齐墩果酸标准品色谱图见图1和图2。
2.6 方法学验证
2.6.1 精密度试验 同一夏枯草样品液，在相同条件下，重复进样5次，得到色谱图，计算保留时间和峰面积的RSD%。结果见表1。
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2.6.2 重现性试验 同一夏枯草样品在相同条件下平行提取5份，分别进样，得到色谱图，计算保留时间和峰面积的RSD%。结果见表2。
2.6.3 稳定性试验 同一夏枯草样品液分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h进样，计算所得色谱图中各相对应的保留时间和峰面积的RSD%。结果见表3。
图1 夏枯草标准药材色谱图（略）
图2 齐墩果酸标准品色谱图（略）
表1 精密度试验（略）
表2 重现性试验（略）
表3 稳定性试验（略）
2.7 夏枯草HPLC指纹图谱的建立
按供试品的制备和检测方法，对31份夏枯草药材分别测定色谱图。比较各夏枯草药材的色谱图，结合各组份峰的紫外吸收特征，确定相同组份峰，计算各组份相对保留时间及相对峰面积。
αi=ti / ts ，α为相对保留时间，ts为内参峰保留时间，ti为其它组分保留时间。
Ar=Ai×100/∑A ，Ar为相对面积值，Ai为各组分面积值，ΣA为总峰面积。
选取10个主要共有峰为特征峰，其面积和占到总面积的99%以上，建立夏枯草样品药材的HPLC相对保留值指纹图谱。结果见表4，其中αi为31种样品谱图中相同组份的相对保留时间值的平均值。
2.8 夏枯草HPLC指纹图谱相似度的计算
以10批夏枯草对照药材的HPLC图谱为标准，用计算机辅助中药指纹图谱相似度计算软件计算31个夏枯草样品药材的HPLC图谱与对照药材的相似度。结果见表5。
表4 夏枯草样品药材的HPLC相对保留值指纹图谱（略）
表5 样品相似度计算结果（略）
3 讨论
对夏枯草的高效液相色谱条件进行了考察，包括流动相的组成、配比等，并依据不同保留时间峰的紫外吸收特征确定检测波长。确定色谱条件为：流动相为甲醇水醋酸（86：14：0.1）；流速为1ml/min；进样量为10μl；检测波长为208nm。在此色谱条件下，基线稳定，各峰得到了较好的分离，峰形、保留时间等也较好。
对中药夏枯草的HPLC指纹图谱进行了系统的研究，建立了31种夏枯草样品药材的HPLC相对保留值指纹图谱，并进行了夏枯草样品药材与标准药材相似度的研究。为夏枯草药材的质量控制提供了依据，为建立规范化的夏枯草种植基地提供了有效的质量控制手段。
【参考文献】
1 郑汉臣，蔡少青．药用植物学与生药学.北京：人民卫生出版社，2004，389．
2 国家药典委员会，中华人民共和国药典（一部）.北京：化学工业出版社，2005，197～198．
高效液相色谱范文3
关键词：咽炎方含片；指纹图谱；高效液相色谱法
咽炎方含片由广东土牛膝、岗梅根和甘草组成，用于治疗急慢性咽炎、咽喉肿痛、扁桃体炎，是中山大学附属第一医院临床应用多年的经验方。方中广东土牛膝、岗梅根均为广东地产药材，其化学成分、尤其是有效成分或标志性化合物尚未明确，给有效控制及评价该制剂的质量带来了一定的困难。鉴于指纹图谱技术是一种多组分复杂样品质量评价的有效方法，本试验拟建立该制剂的中药高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，以便更全面地控制该制剂的质量。
1 仪器与试药
Waters 515液相色谱仪，AL204型电子天平（瑞士METTLER- TOLEDO公司）。
甘草苷对照品（批号111610-200604）购自中国药品生物制品检定所，乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。咽炎方含片样品为中山大学附属第一医院药学部自制。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
采用Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.2%磷酸溶液（A）-乙腈（B）。梯度洗脱程序为：0～30 min， 85%～75%A；30～40 min，75%～65%A；40～50 min，65%～85%A；50～60 min，85%A。检测波长为203 nm，柱温为室温，流速为1.0 mL/min。
基金项目：广东省重大科技专项（2011A080300004）
通讯作者：任斌，E-mail：
2.2 供试品溶液的制备
取20 片咽炎方含片，研细，取约6.0 g 片粉，精密称定，置100 mL量瓶中，加50%甲醇至90 mL，超声（1 200 W，20 kHz）处理15 min，放冷，加50%甲醇至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得[1]。
2.3 方法学验证
2.3.1 精密度试验 取同一批号（20100201）样品，按“2.2”项下方法操作，在上述色谱条件下，重复进样5次，记录指纹图谱。结果各色谱峰对参照峰（7号峰，甘草苷）相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于4.0%，符合指纹图谱要求。
2.3.2 重复性试验 取同一批号（20100201）样品5份，按“2.2”项下方法操作，在上述色谱条件下进样分析，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD值均小于3.6%，符合指纹图谱要求。
2.3.3 稳定性试验 取同一批号（20100201）样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，于室温下放置，分别在0、2、4、8、12、24 h进样分析，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD值均小于2.7%。结果表明，咽炎方含片样品溶液在24 h内稳定。
2.4 指纹图谱的建立
2.4.1 特征峰的确定 在上述色谱条件下，测定10批咽炎方含片，记录图谱。对10批供试品结果进行分析比较，标定了9个共有指纹峰，典型色谱图见图1。2、4、6号峰来源于广东土牛膝，1、5、9号峰来源于岗梅根，3、7、8号峰来源于甘草。
2.4.2 参照峰的选择 保留时间为25.1 min的7号色谱峰峰面积较大，出峰时间适中且稳定，经标准品对照认定为甘草苷的吸收峰，因此选择甘草苷作为HPLC指纹图谱的参照峰，以其保留时间和峰面积为1.0，计算各批指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表1、表2。
2.4.3 相似度分析 采用国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（版本2004 A），对10批咽炎方含片的指纹图谱进行分析，以色谱峰的平均值建立对照指纹图谱，利用相关系数法计算指纹图谱的相似度，结果见表3。
3 讨论
本研究考察了3种不同型号色谱柱：Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamond C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。结果表明， Phenomenex Luna C18柱分离出的色谱峰分离度好、峰数多、稳定性好。故选择 Phenomenex Luna C18柱为分析色谱柱。
试验发现，采用常规的水浴（50 ℃）搅拌法，咽炎方含片完全溶解需40 min，而采用50%甲醇超声处理，只需15 min即可完全溶解。超声处理法不但能加快含片的溶解速度，省时、节能，最主要的是能避免加热导致的热敏成分的破坏。因此采用50%甲醇超声处理15 min来溶解咽炎方含片。
咽炎方含片中岗梅根主要含有皂苷类成分，紫外吸收波长短。为使各被测组分均有较大吸收，选用203 nm为指纹图谱检测波长[2]。比较乙腈-磷酸水溶液和甲醇-磷酸水溶液系统下的色谱图，结果乙腈-磷酸水溶液系统梯度洗脱的柱压较低，流动相的改变对其基线影响较小。
各批次药材的来源、质量对指纹图谱有明显影响。根据相似度分析结果，结合色谱峰面积相对于称样量与平均片重量化，相似度在0.90以上的样品质量较好，0.90以下的为质量较差[3]。批次2、3、4、6、7、8、9、10样品指纹图谱相似度为0.949 0～0.990 2，说明各批次咽炎方含片之间具有较好的相似性，样品质量较好，而批次1、5样品指纹图谱相似度小于0.90，说明质量较差。
本试验建立了咽炎方含片的HPLC指纹图谱，确定了9个共有峰，计算了10 批咽炎方含片的指纹图谱的相似度。同时，本试验明确了9个共有峰的原药材归属，为咽炎方含片的定量指标的选择和确定提供了参考。本试验建立的咽炎方含片指纹图谱具有重复性好、特征性强、方法简便等特点，为咽炎方含片的质量控制奠定了基础。
参考文献：
[1] 韦炳华，李瑞明，卢进，等.咽炎方含片的制备工艺研究[J].今日药学， 2012，22（5）：272-273.
[2] 卢进，任斌，陈孝.广东岗梅药材的HPLC指纹图谱研究[J].热带医学杂志，2011，11（5）：550-552.
高效液相色谱范文4
关键词：绿谷隆；反相高效液相色谱；外标法
1 概述
绿谷隆纯品为白色结晶固体，是一种用于防除禾谷类及玉米田中杂草的除草剂，目前国内尚无绿谷隆的国家标准和行业标准，根据绿谷隆的物化性质和实际生产的需要，我们选择高效液相色谱法进行定量分析，该方法具有较高的精密度和准确度，且快速、准确，可作为绿谷隆的产品检验分析方法。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
岛津LC-20AT具紫外可变波长检测器，色谱工作站，绿谷隆标准品≥98%，甲醇HPLC，新蒸二次蒸馏水，色谱柱：150mm×4.6mm×5μm，C18不锈钢柱，进样针：100μL。
2.2 液相色谱操作条件
流动相：甲醇+水=70+30（V/V），柱温：（25±5）℃，检测波长：254nm。流速： 1.0ml/min。保留时间：绿谷隆约：7.1min，绿谷隆标准品分离见图1，样品分离见图2。
2.3 测定步骤与计算
2.3.1 测定步骤
（1）标准溶液的的配制。准确称取约0.1g（精确到±0.0001g）绿谷隆标准品于50ml容量瓶中，用甲醇在超声波中溶解，取出冷却至室温，用甲醇稀释到刻度并摇匀。用移液管准确移取2.00ml该溶液于50ml容量瓶中，用流动相稀释定容至刻度，摇匀备用。
（2）样品溶液的配制。准确称取约0.1g（精确到±0.0001g）绿谷隆样品于50ml容量瓶中，用甲醇在超声波中溶解，取出冷却至室温，用甲醇稀释到刻度并摇匀。用移液管准确移取2.00ml该溶液于50ml容量瓶中，用流动相稀释定容至刻度，摇匀备用。
（3）测定。在上述色谱条件下，待仪器稳定后，连续注入绿谷隆标准溶液于色谱柱内，待相邻两针的绿谷隆标样峰面积变化小于1.0%时，按下列顺序进行色谱分析：标样溶液、样品溶液、样品溶液、标样溶液。
2.3.2 计算
将测得两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中绿谷隆的峰面积分别进行平均，试样中绿谷隆质量百分含量X按下式计算：
式中：r1-标样中绿谷隆的峰面积；r2-试样中绿谷隆的峰面积；m1-标样的质量，g；m2-样品的质量，g；P-标样中绿谷隆的质量百分含量%；
允许误差：两次平行测定结果之差小于0.5%，取其平均值作为样品中绿谷隆的百分含量。
2.4 结果与讨论
2.4.1 色谱条件的确定
（1）分离方法及检测器的选择。经过反复实验证明，绿谷隆在HPLC反相C18柱上分离效果和峰形良好，保留时间短，因此选用反相HPLC法分析。紫外检测器是高效液相色谱仪中应用最广泛的检测器，它灵敏度高，噪音低，线性范围宽，对流速和温度均不敏感，根据绿谷隆的结构特点，通过实验证明，绿谷隆在紫外区内有很大吸收，因此紫外检测器可以作为分析绿谷隆的首选检测器。
（2）溶剂的选择。反相色谱法：固定相（填料）为非极性，流动相为极性。对应的色谱柱：烷基硅烷化键合硅胶填料，如C18（ODS）C8，C4，C3，苯基等。反相色谱中最常用的流动相及其洗脱强度：水
（3）流动相配比的选择。绿谷隆在流动相甲醇+水=80+20（V/V）时，保留时间过短，分离效果较差，在流动相甲醇+水=70+30时，峰形对称，分离效果良好，保留时间适中，且绿谷隆在甲醇中都有很好的溶解度，因此确定流动相甲醇+水=70+30为流动相操作条件。
（4）波长的选择。通过对绿谷隆吸收曲线的测定，绿谷隆在波长254nm和220nm处，都有很强的响应；在波长220nm处，吸收太强，峰高太高，超出检测器线性范围，若减少称样量或进样量，会影响结果的精密度和准确度；在254nm处，样品的称样量和峰高的比例适中，所以最后选择254nm作为绿谷隆的测定最佳波长。
2.4.2 方法的线性范围
准确称取不同质量的绿谷隆标准品配成不同浓度的溶液，在2.2色谱操作条件下测定，线性回归方程为：Y=06X+7E+58477，相关系数R2=0.9994。
2.4.3 精密度的测定
用同一样品在规定色谱条件下进行多次测定，其结果如表1所示：
表1 精密度测定结果数据表
2.4.4 回收率的实验
用绿谷隆标样加入到已知含量的绿谷隆的样品中，在规定的色谱条件下测定其回收加入率。结果如表2所示：
由23可知绿谷隆的回收率在98.8-100.4之间，说明方法的准确度较好。
3 结束语
利用反相高效液相色谱的外标法测定了绿谷隆的含量。该方法简便、快速，具有较高的精密度和准确度，是一种较好的优化方案，可以作为绿谷隆产品的质量分析。
参考文献
[1]杭州大学.分析化学手册（第二分册）化学分析[M].北京：化学工业出版社，2001.
高效液相色谱范文5
关键词：谷氨酰胺 高效液相色谱法 测定
中图分类号：R927 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2014）05（b）-0240-02
谷氨酰胺（Glutamin）亦被称作麸酰胺酸，为人体中含量最丰富的非必需氨基酸。临床上主要用于改善胃溃疡和十二指肠溃疡的症状。常见的分析方法有毛细管电泳法[1]。本文建立了通过高效液相色谱法测定谷氨酰胺的方法，实验证明该方法操作简便、专一性及灵敏度高，结果准确可靠。
1 材料与方法
1.1 仪器
HLPC色谱仪型号：LC-20A，色谱仪编号：L20134506488AE，分析天平型号：AE100 分析天平编号：LS012，超声波型号：AS3120A，检测波长：λ=215 nm。
1.2 色谱条件
检测器型号：SPD-20A，检测器灵敏度：2.0AUFS柱温：35 ℃，进样体积：20 ul流速：1.0 ml/min，流动相：0.05 moL/L的磷酸二氢钾（取磷酸二氢钾6.8 g，加水至1000 ml，用磷酸调节PH值为4.0）∶乙腈=70∶30，色谱柱：NH￠4.6×250 mm，色谱柱号：312316。
1.3 材料与试剂
乙腈（色谱纯，康科德公司），磷酸二氢钾（AR级），磷酸（AR级），谷氨酰胺对照品（山东宝生物技术有限公司），高纯水。
1.4 样品制备
标准溶液的制备：精密称取谷氨酰胺标准品250 mg于50 ml容量瓶中，用纯化水稀释并定容至刻度，摇匀，再精密吸取2 ml于10 ml容量瓶中，用流动相稀释定容至刻度，摇匀，备用。其浓度为1 mg/ml。
样品溶液的制备：称取本品约250 mg，精密称定于50 ml容量瓶中，用纯化水稀释并定容至刻度，摇匀，再精密吸取2 ml于10 ml容量瓶中，用流动相稀释定容至刻度，摇匀，备用。其浓度为1 mg/ml。
1.5 测定方法
分别取标准品溶液和供试品溶液盛装于2 ml自动进样瓶中，进行自动进样（进样量为20 ul），注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算供试品中谷氨酰胺的含量。
2 实验结果
2.1 系统适用性试验
在上述色谱条件下，取标准溶液进行自动进样，连续进样6针，谷氨酰胺峰与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5；理论板数、拖尾因子，6次色谱峰峰面积的相对标准偏差（RSD）、六次色谱峰的保留时间分别为：9.80、9.79、9.79、9.78、9.70、9.71，其相对标准偏差RSD=1.2%，小于2.0%；6次色谱峰面积分别为：1205488、10665、1200380、1204391、1170905、1186594，其相对标准偏差标准偏差（RSD）为1.2%小于5%；拖尾因子分别为：1.2、1.2、1.3、1.4、1.4、1.4，其相对标准偏差标准偏差（RSD）为0.7%均小于2%；理论塔板数分别为：4886、4867、5001、5185、5545、5867，均大于4000。
2.2 线性
用对照品制备不同浓度的样品，使其浓度分别为0.5 mg/ml、0.75 mg/ml、1.0 mg/ml、1.25 mg/ml、1.5 mg/ml。每个浓度连续进样3针。以检测得到的峰面积平均值、浓度作线性回归，其线性回归方程为y=1188457x，其中y为峰面积，x为谷氨酰胺浓度（见图1），线性相关系数R2为0.999。结果表明在目标浓度0.5 mg/ml～1.5 mg/ml内，该方法具有良好的线性关系。
2.3 准确度
分别制备浓度约为1 mg/ml的对照品溶液和浓度约为1 mg/ml的样品溶液。分别吸取样品溶液1 ml和标准溶液0.8 ml；样品溶液1 ml和标准溶液1.0 ml；样品溶液1 ml和标准溶液1.2 ml分别加入10 ml容量瓶中，用流动相稀释定容至刻度，制备浓度分别为80%、100%、120%的三种浓度的混合溶液。每个浓度连续进样三针，记录实验结果。实验结果表明该方法在三个浓度下其回收率分别为99.5%、97.6%、97.9%。平均回收率达到98.3%，表明该测定方法具有较高的检测准确度。
2.4 精密度
称取标准品约250 mg，精密称定于50 ml容量瓶中，用纯化水稀释并定容至刻度，摇匀，作为贮备液备用。再分别加标准贮备溶液0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml，用流动相稀释定容至刻度，摇匀，制成浓度分别为80%、100%、120%的三种浓度，备用。每个浓度连续进样三针，记录色谱图。实验结果表明三个实验下其相对标准偏差RSD分别为0.47%、0.42%、0.20%，平均相对标准偏差RSD=0.37%。该结果表明该方法重现性较好。
2.5 专一性
从图2可以看出，用该方法可以较好的分离测定谷氨酰胺的相关物质如谷氨酸、焦谷氨酸等，具有专一性高的特点。
3 讨论
本文建立的高效液相色谱法测定谷氨酰胺含量的方法，其检测波长为215nm，流动相为0.05 mol/L的磷酸二氢钾（用磷酸调节PH值为4.0）∶乙腈=70∶30，实验结果表明该方法在其线性范围内具有专一性高，检测结果准确的特点。
高效液相色谱范文6
【Abstractobjective】TosetupamethodforqualitycontrolofFuyankangtablets.METHOD：HPLCmethodwasdevelopedtoquantitativedetermination.TheseparationwasperformedonAgilentTechnologiesZORBAXExtend-C184.6×250mm,5μm.Themobilephasewasacetonitrile-methanol-phosphatebuffer(pH=6.8)(16：16：68).Theflowratewas1.0ml·min-1.TheUVdetectionwavelengthwas220nm.Thecolumntemperaturewas30℃.RESULTS：ThelinearrangeofMatrineandOxgmatrinewereat0.02～0.40mg·ml-1(r=0.9995)and0.01～0.20mg·ml-1(r=0.9997)respectively,theaveragerecoveries(n=6)were98.2%and97.6%withRSD1.4%and2.2%.CONCLUSIONThemethodissimpleandaccurate,itcanbeusedforqualitycontrolofKangfulingcapsules.
【Keywords】HPLC；Kangfulingcapsules；Matrine；Oxgmatrine；Determination
康妇灵胶囊为《国家药品监督管理局标准（试行）》收载的品种，由苦参、杠板归、黄柏、益母草、鸡血藤、红花龙胆、土茯苓、当归等8种中药组成。具有清热燥湿、活血化瘀、调经止带的功效，为妇科常用中药[1]。苦参含有苦参碱、氧化苦参碱等成分，我们采用高效液相色谱法测定制剂中苦参碱、氧化苦参碱的含量，该项方法操作简便、快速、准确可靠，可用于康妇灵胶囊的质量控制论文。
1仪器与试药
1.1仪器LC-2010A高效液相色谱仪，CLASS-VP色谱工作站。
1.2试药苦参碱对照品（批号：100078-200414），氧化苦参碱对照品（批号：110780-200004），由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用；康妇灵胶囊为市售样品（贵州和仁堂药业有限公司，规格：0.4g·粒－1，批号：20061108，20061202，20061216）。乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件与系统适用性试验色谱柱：AgilentTechnologiesZORBAXExtend-C184.6×250mm，5μm，流动相：乙腈-甲醇-磷酸盐缓冲液（PH6.8）（16:16:68），检测波长：220nm，流速：1.0ml/min，柱温：30℃。
2.2溶液配制
2.2.1对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷减压干燥12小时以上的苦参碱对照品和氧化苦参碱对照品各适量，分别加甲醇制成每1ml各含0.4mg的对照品贮备液；再精密量取苦参碱对照品贮备液和氧化苦参碱对照品贮备液各适量，加甲醇制成每1ml含苦参碱0.2mg、氧化苦参碱0.1mg的混合溶液，作为对照品溶液。
2.2.2样品溶液的制备取康妇灵胶囊10粒内容物，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨溶液2ml使湿润，再加三氯甲烷（CHCl3）30ml，超声处理（功率250W，频率33KH2）20分钟，滤过，取滤液，再用三氯甲烷洗涤残渣、容器及滤器4次，每次5ml，滤过，滤液合并，置水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3阴性对照溶液的制备取除苦参以外的处方中其余药材的十分之一量，按法制成片，再按样品制备方法，制成阴性对照溶液。
2.3专属性试验
分别精密吸取样品溶液、阴性对照溶液及对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图（图1）。由图1可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间（1氧化苦参碱：6.866min；2苦参碱：15.422min）的色谱峰，阴性试验无干扰，证明本法可行。
2.4线性范围考察
精密吸取对照品贮备液各适量，分别加甲醇配成浓度分别为苦参碱：0.02、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40mg·ml－1，氧化苦参碱：0.01、0.03、0.05、0.10、0.15、0.20mg·ml－1的溶液，摇匀，滤过，精密吸取续滤液各10μl，注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，其浓度（C）为横坐标，线性回归，苦参碱回归方程为：A=4.34×105C＋3.87×102，r=0.9995；氧化苦参碱回归方程为：A=1.21×104C＋8.07×102，r=0.9997。结果表明，苦参碱在0.02～0.04mg·ml－1范围内峰面积与其浓度呈良好线性关系；氧化苦参碱在0.01～0.20mg·ml－1范围内峰面积与其浓度呈良好线性关系。
2.5精密度
取样品（贵州和仁堂药业有限公司，批号：20061108）按“2.2样品溶液的制备”方法制备样品溶液，重复进样5次，进样量10μl，在上述色谱条件下求得苦参碱峰面积RSD为0.9%，氧化苦参碱峰面积RSD为1.2%，表明精密度较好。
2.6稳定性试验
取样品（贵州和仁堂药业有限公司，批号：20061108）溶液，在0、2、4、8、24h分别进行测定。结果表明样品溶液在24h内基本稳定，苦参碱峰面积
的RSD为1.1%，氧化苦参碱峰面积的RSD为0.8%。
2.7重复性试验
取样品（批号：20061108）共6份，分别按“2.2样品溶液的制备”方法制备样品溶液，进行测定，求得苦参碱含量的RSD为0.7%，氧化苦参碱含量的RSD为1.6%，表明重复性较好。
2.8加样回收率试验
精密称取已知含量的样品（贵州和仁堂药业有限公司，批号：20061108，苦参碱含量3.01mg·g－1，氧化苦参碱含量2.42mg·g－1，平均装量0.3916g·粒－1）适量，共6份，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入苦参碱对照品溶液（0.2001mg·ml－1）、氧化苦参碱对照品贮备液（0.1000mg·ml－1）各适量，挥去甲醇，按“2.2样品溶液的制备“方法操作，得回收率试验溶液，依法测定，结果见表1。
2.9样品含量测定
分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定三批样品中苦参碱、氧化苦参碱峰面积，按外标法计算其含量（n=5），结果见表2。根据三批样品所测结果，暂定每粒康妇灵胶囊的苦参碱含量质控定量限为1.8mg，氧化苦参碱含量质控定量限为0.5mg。表1苦参碱、氧化苦参碱加样回收率试验表2三批样品含量测定结果
3讨论
3.1流动相的选择笔者选择了三种流动相：①乙腈-0.1%磷酸溶液（20:80）（三乙胺调节PH值至8.0）[2]；②乙腈-甲醇-磷酸盐缓冲液（PH6.8）-三乙胺（18:18:70:0.1）[2]；③乙腈-甲醇-磷酸盐缓冲液（PH6.8）（16:16:68）。经多次测试结果表明，前两种流动相所得峰形较宽，含杂质多，而采用③乙腈-甲醇-磷酸盐缓冲液（PH6.8）为流动相所得样品峰形好，干扰成分少，故选此做为含量测定的流动相。
3.2溶剂的确定笔者比较了用甲醇溶解供试品及用流动相溶解供试品，结果以甲醇为溶剂分离效果好，且保留时间短。
3.3通过对3批样品中苦参碱、氧化苦参碱的测定，结果表明苦参碱最高含量为1.38mg·粒－1，最低为1.18mg·粒－1；氧化苦参碱最高含量为1.08mg·粒－1，最低为0.94mg·粒－1。综合考虑确定限量，每粒含苦参碱不得低于1.8mg，含氧化苦参碱不得低于0.5mg。
本方法结果准确，方法简便，重现性及回收率均理想，可以有效地控制产品质量。
【参考文献】
