前言：中文期刊网精心挑选了胚胎干细胞范文供你参考和学习，希望我们的参考范文能激发你的文章创作灵感，欢迎阅读。
胚胎干细胞范文1
关键词：人胚胎干细胞（hESC）；内细胞团；饲养层细胞；培养条件；mTESRl
中图分类号：Q2-33
文献标识码：A
文章编号：1007-7847（2014）04-0349-04
人胚胎干细胞（human embryonic stem cell，hESCs）是从早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有无限增殖、自我更新和全能分化的特性，基于这些特性，胚胎干细胞可以被广泛地利用于个体发育研究、药物药理、干细胞移植治疗等多个领域。尤其是胚胎干细胞移植治疗方面，被认为是治疗由于细胞退化及功能丧失所导致的多种退行性疾病的最有前景的治疗手段。1998年美国Thomson实验室建立起第一株人胚胎干细胞，同年，SHAMBLOTT小组从人原生殖嵴细胞及肠系膜细胞中分离出多能干细胞，以后的十几年中，虽然人胚胎干细胞的建株及维持培养条件不断地改进，但仍然没有解决异源性物质潜在污染的问题，最优化的培养条件的建立对于干细胞研究的发展以及最终的临床应用都是极其重要的。在此，本文从不同方面总结了在人胚胎干细胞建株和维持培养条件上所取得的进步。
1经典的建株和维持培养方法与存在的问题
经典的胚胎干细胞建株的方法是基于小鼠胚胎干细胞建株与维持培养方法的基础上的，采用免疫外科学的方法，用Tyrode's液去除透明带，用动物抗人抗体与囊胚的滋养层细胞结合，清洗并添加不含抗体的培养基，然后利用动物血清使滋养层细胞溶解，从而得到内细胞团（inner cellmass，ICM），继而将ICM转移到以小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）或者永生的MEF（STO line）怍为饲养层细胞（feeder cell）的条件中培养，最终得到胚胎干细胞。建立起来的胚胎干细胞株具有以下几个方面的特点：1）具有无限增殖的能力及自我更新、自我修复的能力，且在增殖过程中能够保持核型的稳定性；2）细胞表达全能性基因；3）无论在体内还是在体外环境中，都能分化成为机体所有类型的细胞。自此后的许多年，人们一直延用这种建株及维持培养的方法，但是这种方法有其不可避免的弊端，传统的培养办法中采用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞，同时在培养基中包含了一些动物源性的成分，这些外源性成分会对人胚胎干细胞造成潜在的污染，使其存在应用的风险。
2建株的细胞来源及细胞分离方法的发展情况
2.1干细胞的来源
传统的方法通过获得ICM，继续培养来建立胚胎干细胞株。有研究人员采用将已经建成的人胚胎干细胞与体细胞融合以及利用孤雌生殖的方法来获得囊胚，继而从中获得胚胎干细胞，这种方法所获得的细胞，由于染色体数目上的异常，并不是理想的方法。人们也尝试从桑葚期的胚胎和已经停止发育的胚胎中获得胚胎干细胞，但是由于建株成功率太低（1.5%），也不能成为有效的办法。采用类似于植入前诊断（preimplantationgenetic diagnosis，PGD）的方法，Chung等通过显微操作的手段，从处于8细胞期的胚胎中取出单卵裂球，与亲辈胚胎共培养后，转移到培养皿中培养，以期使具体的个体可以有遗传背景完全一致的全能干细胞，并成功建立起胚胎干细胞株。然而，没有一个被取出单卵裂球的胚胎继续发育成为一个完整的个体，使得这种方法不能被广泛地应用。有学者利用体细胞核移植（somatic cellnuclear transfer，SCNT）技术，将已经建立起来的胚胎干细胞的细胞核移植到卵细胞内，继续培养至囊胚后从中分离内细胞团建株，但是，利用这种方法并没有建立起胚胎干细胞株。为了获得疾病特异性的多能干细胞，有学者通过逆转录病毒载体转染和基因重编程的方法，使得已经是终末分化的体细胞重新具有干细胞的特性，这就是我们所熟悉的诱导多功能干细胞（induced pluripotent stemcell，iPS）。这种方法建立起来的iPS株具有一定的优势，由于体细胞是取自接受移植治疗患者本人，这就最大程度避免了异体移植有可能产生的移植排斥反应，成为了获得干细胞的另一重要来源。
2.2内细胞团的分离方法
第一株人胚胎干细胞的分离过程中，使用了动物抗人抗体及动物血清等动物源性的成分，由于这些动物源性成分可能对人胚胎干细胞造成潜在的污染，使得用这种方法建立起来的人胚胎干细胞株在后期的应用中存在风险。利用机械法直接分离囊胚的透明带以及滋养层细胞来获取ICM或用酶消化的方法去除透明带从而分离ICM，在一定程度上避免了ICM与动物源性成分的直接接触，从未来的使用方面来说是比较理想的分离1CM的办法。此外，通过利用激光束在透明带上打孔，在显微镜下，利用固定针固定囊胚，用活检针将囊胚从透明带中取出，之后，直接将取出的囊胚在培养皿中培养，或再利用激光束将ICM与滋养层细胞进一步分离，再在培养皿中培养，这种方法也是一种可行的方法。也有学者采用将单卵裂球与已经建成的干细胞共培养的方法来获得胚胎干细胞，但这种方法建株的效率不高。
3饲养层细胞的发展与无饲养层细胞培养条件
3.1饲养层细胞
传统的方法使用MEF作为饲养层细胞来维持胚胎干细胞的生长，但是由于潜在污染的问题，MEF并不是最理想的滋养层细胞。有研究者指出，MEF能够为胚胎干细胞提供更多的增殖空间，而HFF（human foreskin fibroblast，HFF）分泌的生长因子能够更好的促进胚胎干细胞的生长，鉴于这个特点，以期能更好的支持胚胎干细胞的生长，人们使用小鼠成纤维细胞跟人包皮成纤维细胞按比例混合而成的混合饲养层细胞来培养hESC，相对利用单一的饲养层细胞相比较来说，生长在单一的饲养层细胞上的人胚胎干细胞克隆扁平、较薄，而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实，其克隆形态显著好于单一饲养层，但是这种方法并没有避免异源性物质的污染问题。为了找寻非动物源性的饲养层细胞，人们采用了处于不同发育阶段的不同组织来源的人体细胞作为MEF的替代品，如：人类包皮成纤维细胞、胎盘细胞、子宫内膜细胞、成人骨髓基质细胞、胎儿肌肉细胞、胎儿皮肤细胞。尽管不同的细胞取得的效果不同，但都能使干细胞保持未分化的状态。此外，胚胎干细胞自身分化所形成的成纤维细胞样细胞也能成为一个自体的饲养层细胞来源。由此得到的饲养层细胞，具有特异性，避免了动物源性成分或异源性成分对于胚胎干细胞的污染。
3.2无饲养层细胞培养条件
为了进一步纯化胚胎干细胞以减少日后使用的风险，有学者提出是否能够采用成分明确的物质的组合来彻底替代饲养层细胞的粘附功能及分泌功能，为了解决这个问题，van Hoof等利用基底膜基质（Matrigel）和纤连蛋白（fibronectin）来代替饲养层细胞的功能，同时，利用饲养层细胞条件培养基（feeder conditioned media）跟成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor）维持干细胞的未分化状态，这种方法取得了不错的效果。事实上，这种无饲养层细胞的培养条件能够很好地维持胚胎干细胞的生长及未分化状态，许多实验室现在都采用这种条件培养胚胎于细胞。
3.3胚胎干细胞的体外培养液体系
为了避免培养液中所含成分对胚胎干细胞的潜在污染，人们从不同方而做出了努力。首先，在饲养层细胞的培养基方面，人们用成分确定的培养基、细胞因子以及人血清培养人成纤维细胞，得到了不含任何动物源性以及不确定成分的饲养层细胞株。这种方法既保留了饲养层细胞在胚胎干细胞培养过程中的作用，又避免了动物源性成分对胚胎干细胞的污染。胚胎干细胞的培养基方面，传统的培养基中含有FBS （fetal bovineserum），其中包含有动物源性的蛋白以及一些成分不确定的物质，使得所建的干细胞株可能被污染。为了解决这一问题，Richards等用人血清替代FBS进行胚胎干细胞的维持，以期能够避免动物源性成分对胚胎干细胞的潜在污染。但是，由于人血清中也含有许多复杂的、成分不明确的物质，而且有可能包含有一些诱导胚胎干细胞分化的物质，所以也没有很好地解决问题。后来的学者利用成分更加确定的血清替代品（knockout serumreplacement，KSR）来代替FBS。有趣的是，与含有FBS的培养基相比，在KSR培养基中胚胎干细胞表现出更强的增殖能力，但是，血清替代品仍然包含有动物蛋白，而且并不是成分完全确定的，所以也不是最理想的。此外专为培养胚胎干细胞而设计的培养基mTESRl能很好的维持人胚胎干细胞的生长，但是，这种培养基仍然包含有少部分动物源性成分。成分确定的培养基是至关重要的。学者们希望通过采用一些已知成分的组合来代替传统的培养基，这样既维持了胚胎干细胞的生长，也不会造成潜在的污染。一些研究组织报道了在培养基中成功使用各种不同组分能够成功地维持胚胎干细胞未分化状态的例子，如：bFGF和透明质酸（hyaluronic acid），转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、bFGF和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF），bFGF和GSK3抑制剂（GSK3 inhibitor），激活素A （activin A）和bFGF等。Wang、Xu等发现，利用BMP信号转导通路拮抗剂（BMP sig―naling antagonist Noggin）和高浓度的bFGF就可以维持胚胎干细胞处于未分化状态。Beattie等发现，在培养基中使用激活素A、烟酰胺（nicoti-namide，NIC）和角化细胞生长因子（keratinoCytegrowth factor，KGF）能够维持细胞的末分化状态，并认为激活素A能够阻断干细胞的分化，烟酰胺和角化细胞生长因子则在细胞增殖方面起作用。通过这些方法，将成分明确的物质组合起来，就使得培养基的组成更为简单，成分更为确定。近来，建立起第一株人类干细胞的Thomson实验室的学者们，为了使得培养出来的hESCs和iPS能够更接近于临床使用的目标，利用8种成分已经确定的成分组成胚胎干细胞的培养基（E8），在实际的应用过程中，这些成分确定而又简单的培养基在维持胚胎干细胞及诱导多能干细胞的未分化状态以及细胞增殖方面也取得了不错的效果。
4临床级别的人胚胎干细胞
人们期望利用胚胎干细胞的特性来治疗各种退行性疾病，这就要求我们所建立的人胚胎干细胞株必须是临床级别的细胞。如何获得临床级别的人胚胎干细胞是一个难题，目前人们大多使用GMP（good manufacturing practices，GMP）的标准来确保所获得的人胚胎干细胞的质量以及判断其是否为临床级别的细胞。GMP要求从人胚胎干细胞建株过程中的各个环节都有质量保证。首先，实验过程中所使用的耗材及试剂必须经过GMP认证，实验平台需通过GLP（good laboratorypractice，GLP）质量认证，实验中所使用的饲养层细胞必须是在符合GLP的实验平台上采用符合GMP标准的试剂与耗材建立起来的细胞株，饲养层细胞必须符合GMP标准或获得FDA（food anddrug administration，FDA）认证。同时，胚胎干细胞的操作必须有标准的操作程序，实验人员的培训必须符合GMP的标准，所获得的人胚胎干细胞需经过QC（quality certification，QC）的检测及生物安全性检测。现有的胚胎干细胞体外培养液体系，由于其未避免异源性基因的插入，或由于其体系中含有成分不确定的组分而可能对胚胎干细胞造成潜在污染的风险，都不能完全符合临床使用的要求。只有符合GMP标准的临床级细胞，使用到临床时，才能确保细胞的安全性。寻找更加优化、成分更加确定的、不含有动物源性成分的培养条件显得尤为重要。虽然现存的各种培养液体系经过全球科学家多年的不断悉心探索，已经取得了长足的进步，但是由于培养液体系中的种种缺陷，使得在这些条件下建立起来的人胚胎干细胞仍然不能完全符合临床使用的要求，在寻求最优化的培养液体系的道路上，我们仍然任重道远。
胚胎干细胞范文2
成年心脏心肌的再生能力有限，发生器质性损伤后，常导致不可逆的心脏功能减退。目前，药理、介入、外科等方面的治疗效果仍十分有限。ESC具有强大的分化潜能和增殖能力，能定向分化为结构、功能典型的具有收缩能力的心肌细胞，用于治疗心血管疾病有良好的前景。这一方面的研究目前还处于较基础的环节。
1 ESC可向心肌细胞分化
ESC主要来自囊胚内细胞团及受精卵发育至桑堪胚之前的早期胚胎细胞，经体外培养可以分化为心肌细胞。Kehat[1]对由鼠ESC（mESC）分化的心肌细胞进行了一系列鉴定：免疫组化染色显示α-MHC、α-actinin、cTnI、desmin、ANP等心肌特异蛋白都有表达；RT-PCR提示心脏特异的基因cTnI、cTnT、GATA4、human ANP、MLC-2A、MLC -2V、Nkx2.5和α-MHC特异表达；电镜观察到缝隙连接和桥粒，并且随着培养时间的延长，细胞内肌小节排列渐趋整齐；电生理也显示了典型的兴奋收缩偶连反应。Baharvand等[2]则进行了体内、体外分化情况的对比研究进一步支持了其定向成熟分化。Laura等[3]将人胚胎干细胞（hESC）体外诱导分化的心肌细胞，培养观察了达3个月，并通过膜片钳等技术来评估其功能成熟情况，以RT-PCR来评估编码离子通道的亚基的表达；可发现随着体外培养时间的延长，ESC分化的心肌细胞愈接近成熟心肌细胞表型。
2 定向诱导ESC向心肌细胞分化
ESC 体外分化为心肌细胞，一般采用胚胎体(EB)形成法，而EB自然分化得到的心肌细胞比较少，约5％[4]。大量的研究[5]认为转化生长因子（TGF）、骨形态发生蛋白(BMP)、Wnt家族蛋白(Wnt families)、成纤维细胞生长因子(FGF)以及全反式维甲酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)和垂体后叶素、维生素C、5-氮胞苷等可以促进ESC分化为心肌细胞。血清的影响近年来也受到重视， Passier等[6]采用无血清培养基诱导胚胎干细胞，发现心肌自发搏动的数量较含血清培养增加了24倍，如果在培养体系中加入维生素C，分化效率还可以再提高40％；Pal等[7]则发现低浓度血清(5%)维持及有BMP-2(25 ng/ml)的共同作用下，有利于人胚胎干细胞株BG01V和ReliCell((R))hESC的分化。除了提高心肌细胞在胚胎干细胞分化群落中的比例，Wang等的研究[8]发现旋转的细胞培养系统不但利于ESC分化形成EB，且分化得的心肌细胞成熟度优于普通悬浮培养，并能在3D胶原支架上形成组织。
3 纯化已经分化的心肌细胞
ES细胞可分化为心房肌、心室肌、房室结、蒲肯野细胞和窦房结样细胞。多种心脏细胞类型的混合物移植后，很可能导致心律不齐，不利于长期心功能的维持；纯化分化的心肌细胞，是临床应用的前提。MLC-2v启动子可特异地使心室相关基因表达，Muller等为ESC构造了CMVenh/MLC-2v启动子，使增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达，通过FACS筛选阳性细胞，特异地纯化了心室肌细胞，基本除去了心房肌细胞，但纯化生产大量ES细胞源心室样心肌细胞仍是ESC应用于心血管疾病治疗的一大障碍。目前hESC向心肌细胞诱导分化率较低，而且仅有早期心肌细胞的结构和特性，尚未建立有效的筛选纯化技术。有研究提出可通过添加细胞因子，经Percoll密度梯度离心分选获得，但经此分选后的心肌细胞活性肯定受到很大影响，体内是否具有参与心脏重建功能还有待验证。
4 移植细胞的选择
ESC的治疗属于细胞移植治疗，尚在摸索阶段。用未分化的ESC进行移植是一种探索，早期研究发现未分化的ESC进行移植，可改善心功能；近年Nussbaum等[9]的研究发现未分化的鼠胚胎干细胞不适合移植治疗，无论是在正常或是有梗死发生的心脏，不仅没有明显的心肌细胞分化，而且会形成畸胎瘤和发生免疫应答；故认为应该进行定向诱导后再用于移植治疗。
5 移植途径的选择
目前的实验中有以下移植途径：（1）经静脉移植:冠状动脉血流量约占心排血量4％，经静脉移植效率十分低下。在心肌梗死急性期，大量炎性介质释放使梗死区及周边毛细血管通透性增加，这可能使干细胞经冠状动脉移植成功，但此期心肌炎症反应较强，又容易导致移植细胞死亡。（2）心肌内注射:通过特制的针进行心肌内注射，靶部位可以是正常心肌、梗死边缘带或是以上二者的联合，适合与冠状动脉搭桥术同时进行，目前仅用于动物实验。（3）心内膜心肌内注射:心脏自动导航系统能够实现经心内膜心肌内注射，创伤小、安全性高，但移植细胞可随心脏运动从针孔溢出，无法均匀分布，可能造成移植后心室运动的不协调；且注射部位、注射剂量以及移植细胞在损伤心肌中的生存条件还需要进一步阐明。找到高效、安全的移植途径是临床应用前必须解决的问题。
6 移植免疫
细胞的免疫原性主要是由I型主要组织相容性抗原（MHC I)介导的。hESC虽然只表达低水平的MHC I类抗原，但移植治疗时仍存在移植排斥反应。目前提出了一些解决ESC移植排斥反应的可行途径：（1）体细胞核转移(SCNT)：即治疗性克隆技术。将患者的体细胞核移入去核的卵母细胞中，体外培养形成含有患者遗传信息的ES细胞系，再将其诱导分化成特定细胞（如：心肌细胞）进行移植。（2）通过转基因技术向ESC转染患者组织相容性抗原(MHC I)基因。（3）建立ESC细胞库，将具有不同组织相容性的ES细胞系冻存建库。（4）通过基因敲除去ESC的MHC基因，建立可共用的供体ESC细胞系。此外，有研究者提出把ESC分化的多能造血干细胞移植到已去除T细胞的受者体内，使受者和供者干细胞形成嵌合体，新生成的T细胞将对移植的心肌细胞形成特异的免疫耐受，达到稳定的中枢清除性耐受，这样受者无需事先进行免疫抑制。Fandfich等直接用大鼠胚胎干细胞(RESC)打入MHC配型不符的大鼠门静脉，发现可形成稳定的造血干细胞嵌合体，并成功地诱导对移植心脏的耐受。其具体机制还不清楚，可能是因为RESC不表达免疫刺激因子，不能触发T细胞的反应；另外RESC表达FASL，与带有FAS的免疫细胞接触后触发免疫细胞的凋亡 。近年有研究[10]发现在有免疫活性的小鼠体内移植ESC未观察到免疫耐受或淋巴嵌和现象，但观察到有免疫赦免，会允许ESC形成畸胎瘤。
7 安全性评价
由ESC分化的心肌细胞移植到体内后可能受到局部微环境信号的影响发生变化，目前尚无一个统一的标准对细胞发生的恶性转化加以确定，有必要进行多项指标的评估：（1）形态学特征的改变。（2）刀豆球蛋白A(ConA)凝集试验观察细胞表面结构的改变。（3）锚定非依赖性生长(AIG)。是细胞癌前转化的特征，同时也是检测细胞恶性转化的重要指标。（4）染色体核型分析。（5）动物体内成瘤性检测。Koch等[11]发现由ESC形成的肿瘤部分地受控于补体的旁路途径，对补体的易感性也是与ESC形成肿瘤的能力相关的； Behfar等[12]发现TNF-α这种程序重排细胞因子在体内可以促进ESC向心肌细胞的分化，这种作用也许可以抑止ESC在分化中发生肿瘤。建立严格控制的标准化干细胞培养体系对于保证干细胞生物学特征的稳定及增强移植的安全性具有重要意义。移植后长期的安全性评价很少，有待于进一步研究。
8 ESC移植治疗的动物实验
Min等将小鼠ESC分化的心肌细胞用GFP基因进行转染，然后移植到梗死的大鼠心脏，于第六、三十二周观察，免疫荧光证实GFP基因在心脏表达，植入区的毛细血管增加且大鼠的存活率提高，这说明移植的细胞能长期存活，并保持良好的功能状态[13]。Yang等将血管内皮生长因子（VEGF）基因转入ESC，这种转基因的ES细胞在体外诱导分化后移植到梗死的心脏，显著增强了心脏的收缩力，免疫组化显示梗死区域新生血管大量形成[14]。ESC源性心肌细胞移植后促进心功能的恢复，得益于有功能的心肌细胞取代了疤痕组织，使梗死面积减小，减少了梗死局部心肌细胞的凋亡[15]，也使正常心肌组织过度牵张程度降低，保护了其收缩功能。另外，移植细胞可以释放一些心脏保护因子，如VEGF等，促进心脏功能的更好恢复。但是，移植细胞能否完全整合入心脏组织，是否导致心律失常以及远期后遗症等问题还有待研究。现在的实验研究多基于啮齿类动物，相对较短时间内观察到心功能改善，在更长时间内的效果及在大型动物和灵长类的实验模型涉及尚少。故在评价动物模型时，应该注意基因表达、细胞信号途径、物种体内生物学环境等方面的差异，注意实验室结果与临床实践运用的差异性，对其临床运用的可能给予恰当评价。
ESC不可避免地需要来源于胚胎组织，我国学者赞成以维护和提高人类健康为目的的hESC研究，强调必须严格、审慎，坚持伦理原则，严格控制使用人为配子制造的胚胎和克隆人的胚胎。作为当今医学生物技术研究的前沿领域，ESC在心血管疾病治疗方面的研究必将为心血管疾病的治疗展开新的篇章。
参考文献：
[1] Kehat I，Kenyagin-Karsenti D，Snir M，et al．Human embryonic stem cells can differentiate intomyocyteswith structural and functional properties of cardiomyocytes[J]．J Clin Invest，2001，108(3):407.
[2] Baharvand H，Piryaei A. Ultrastructuralcomparison ofdeveloping mouse embryonic stem cell- and in vivo-derived cardiomyocytes[J].Cell Biol Int，2006，30(10):800.
[3] Sartiani L，Bettiol E，Stillitano F，et al.Developmental changes in cardiomyocytes differentiated from human embryonic stem cells: a molecularand electrophysiological approach[J].Stem cells，2007，25(5)：1136.
[4] Kehat I，Gepstein L．Derivation and prope rties of human emb ryonic stem-derived cardiomyocytes[J]．Gene Therapy and Regulation，2002，4(1)：387．
[5] Singla DK，Sobel BE． Enhancement by growth factors of cardiacmy- ocyte differentiation from embryonic stem cells:a promising founda-tion for cardiac regeneration[J].Biochem Biophys Res Commun，2005，335(3):637．
[6] Passier R，Oostwaard DW，Snapper J，et al. Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cul-tures[J]．Stem Cells，2005，23(6):772.
[7] Pal R，Khanna A. Similar pattern in cardiac differentiation of human embryonic stem cell lines，BG01V and ReliCell((R))hES1，under low serum concentration supplemented with bone morphogenetic protein-2[J].Differentiation，2007，75(2):112.
[8] Wang X，Wei G，Yu W，et al.Scalable producing embryoid bodies by rotary cell culture system and constructing engineered cardiac tissue with ES-derived cardiomyocytes in vitro[J]. Biotechnol Prog，2006，22(3):811.
[9] Nussbaum J，Minami E，Laflamme MA，et al.Transplantation of un-differentiated murine embryonic stem cells in the heart: teratoma for-mation and immune response[J]. FASEB J，2007，21(7):1345.
[10] Magliocca JF，Held IK，Odorico JS，et al. Undifferentiated murine embryonic stem cells cannot induce portal tolerance but may pos-sess immune privilege secondary to reduced major histocompatibilitycomplex antigen expression[J].Stem Cells Dev，2006，15(5):707.
[11] Koch CA，Jordan CE. Complement-dependent control of teratoma formation by embryonic stem cells[J]. J Immunol，2006，177(7):4803.
[12] Behfar A，Perez-Terzic C. Cardiopoietic programming of embryonic stem cells for tumor-free heart repair[J]. J Exp Med，2007，204(2):405.
[13] Min JY，Yang Y，Sullivan MF，et al. Long-term improvement of car-diac function in rats after infarction by transplantation of embryonic stem cells[J]. J Thorac Cardiovasc Surg，2003，125(2):361.
[14] Yang Y，Min JY，Rana JS，et al．VEGF enhances functional improve-ment of postinfarcted hearts by transplantation of ESC-differentiatedcells[J].J Appl Physiol，2002，93(3)：1140.
胚胎干细胞范文3
【关键词】 川芎； 胚胎干细胞； 细胞分化； 心肌细胞
【Abstract】 Objective：To explore the features of differentiation of mouse embryonic stem cells into cardiomyocytes induced by Chuanxiong containing serum，establish a simple and efficient system of ES cells differentiation cardiomyocyte.Method：The action of ES cell activity under Chuanxiong containing serum were observed，visible spontaneous and rhythmic beating embryoid bodies occurred at 3 d，reached peak at 5 d.Myocardial cell specific genes β-MHC were detected by using RT-PCR method.Result：Compared with the rat serum and fetal bovine serum group，theβ-MHC of the cells cultured by Chuanxiong containing serum expression and differentiation rate increased significantly，the differences were statistically significant（P
【Key words】 Chuanxiong； Embryonic stem cells； Cell differentiation； Cardiomyocyte
First-author’s address：Longgang Central Hospital of Shenzhen City，Shenzhen 518116，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.30.005
心肌细胞移植在临床中已经广泛使用，移植细胞包括多种，其中最适合于移植的细胞为胚胎干细胞，主要是由于其具有较强的分化能力和增殖能力。胚胎干细胞分化为心肌细胞是研究心肌细胞分化机制的良好平台和模型[1-2]。随着现代药学的发展，人们更加重视中药的应用，中药历史悠久，很多中药均具有较好的活性，可用于疾病的治疗，其中保护心肌功能的中药应用也较为广泛，具有保护心肌、改善机体免疫功能、促进蛋白增长及防治细胞凋亡等特点[3-4]。与传统的化学药品相比，中药具有安全有效、价格便宜等特点[5-6]。本实验利用胚胎干细胞实验模型，对川芎含药血清诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞进行实验研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 中药川芎含药血清的制备 选取健康未过的SD雄鼠30只[许可证编号：syxk（粤）2013-0085，广州中医药大学实验动物中心]，个体质量（200±10）g，适应性饲养3 d后进行实验。将其随机分为空白对照组、低剂量组及高剂量组，每组10只。给予大白鼠川芎水煎液灌胃（取一定量川芎饮片置容器中，加水没过药面，浸泡30 min后，煎煮3次，60 min/次，合并水煎液，过滤，浓缩至含生药1 g/mL备用），低剂量组的剂量约为正常用量（0.8 g/kg）的5倍，为4 g/kg，2次/d，连续3 d；而高剂量组则为正常用量的30倍，为24 g/kg，
2 次/d，连续3 d，空白对照组灌生理盐水（4 mL/kg）。人与大鼠动物等效剂量系数由《实验动物学》可知为6.3。每次给药10 min后，对其进行取血，将血液静置2 h后离心（离心条件：3000 r/min，离心10 min），离心后取上清液56 ℃加热30 min，过滤，保存于-20 ℃。体外含药血清按20%计算[7-10]。
1.2 胚胎干细胞培养
1.2.1 来源与试剂 小鼠胚胎干细胞选自中科院生化细胞研究所[11-12]；DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、明胶、β-巯基乙醇（β-ME）、丝裂霉素C、非必需氨基酸（NEAA）购自美国GIBCO公司，白血病抑制因子（LIF）购自法国Millipore公司。
1.2.2 胚胎干细胞培养与诱导分化 将冻存在液氮罐中的胚胎干细胞取出，于37 ℃水浴锅中迅速融化，将细胞立即转移至10 mL的ep管中，加入适量的培养基，采用300 rcf，10 min离心，去除上清液，加入1 mL培养基吹打，转移细胞并进行培养，当细胞生长至70%左右时，对细胞进行传代。培养液分四组，即：川芎血清低剂量组、川芎血清高剂量组、大鼠血清组、胎牛血清组，将收集到的川芎含药血清和大鼠血清、胎牛血清，配制成10 mL备用，各组培养液终浓度为20%。（1）悬滴培养：ES细胞中加入20%川芎含药血清（低剂量组和高剂量组）的分化培养液，将细胞密度设置为3.75×104/mL。细胞培养在6 cm培养皿中，取1.6 mL细胞置于10 cm的培养皿内盖上，将内盖翻转使其生长，加入5 mL PBS，孵育1 h。（2）悬浮培养：细胞孵育后对细胞进行观察，控制细胞悬滴液中细胞个数为1，第2天于倒置显微镜下观察，每个悬滴内均含有1个，吸去PBS，加入分化培养基，移至6 cm中培养，孵育2 h。（3）贴壁培养：细胞培养2 d后，观察细胞个数，大约为10个，接种至4孔板，第3天时肉眼观察每个培养皿中均可见数十个EBs。分别接种至事先用明胶包被的24孔板内，每孔中加入2 mL分化培养液。
1.3 实时定量PCR检测心肌细胞特异基因β-MHC的表达 实验细胞分四组，即川芎血清低剂量组，川芎血清高剂量组，大鼠血清组和胎牛血清组，每组6孔。提取总RNA并测定浓度，分析其完整性，进而合成cDNA，β-MHC Forward：5’-AGAGCTCATCCTTTCTGGTCAT-3’，Reverse：5’-ACCATCTGACATTCTACAGTCT-3’；GAPDH Forward：5’-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’Reverse：5’-ATGCCTGCTTCACCACCTTCT-3’[4-5]。PCR体系为：12.5 μL SYBR Green Realtime PCR MasterMix，2.5 μL样品溶液，1.0 μL引物加水至25 μL。反应条件：95 ℃下加热60 s，进行预变性；95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，如此循环40次。扩增后的产物主要是采用荧光检测，用ABI 7500 Software v2.0软件对其进行分析，绘制曲线表，计算Ct值，对系统数据处理后可以得出不同浓度对于细胞分化的影响。
1.4 统计学处理 使用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，以P
2 结果
2.1 川芎诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化 细胞培养2 d后呈密集状态，一般为圆形，细胞界限和形态不明显（图1）；体外细胞个头小，但生长速度快（图1～2）。川芎分化液培养3 d的胚胎干细胞会收缩配体，导致培养时间增加，收缩越明显，则时间越长。自发节律性收缩区域较大，且细胞形态较单一（图3～4）。于细胞培养的第3 d可见零星EB球发生自发性节律性跳动，5 d时约有70%的EB球出现节律性跳动，低、高剂量川芎血清组（图3～4）EB球发生自发性节律性跳动的细胞数量明显多于胎牛血清（图1）和大鼠血清组（图2）。
2.2 实时定量PCR检测心肌细胞特异基因β-MHC的表达 川芎低、高剂量含药血清组β-MHC表达量均明显高于胎牛血清组和大鼠血清组，比较差异均有统计学意义（P
3 讨论
随着人们生活水平的进步，大部分人均处于亚健康状态，心血管疾病是临床上常见的疾病。心血管疾病的临床突破主要来自胚胎干细胞的发展，胚胎干细胞会根据诱导自发分化成多种细胞，如心肌细胞和血管内皮细胞等[13-15]。心肌细胞对于恢复正常供血、免疫功能均有重要的意义[16-17]。一般情况下，胚胎干细胞能够自然分化，但分化率低，因此提高分化率显得至关重要。临床上对于胚胎干细胞的研究较为广泛，但是研究方向各不相同，关于中药的研究更是凤毛麟角，因为涉及人体、细胞、动物等各个方面，给研究工作带来了一定的困难，但也有部分学者取得了可喜的成果[18-19]。有研究方向为将细胞采用不同密度制成悬浮液，采用不同的方法和改变环境进行培养，分析其分化成心肌细胞的分化率。最后对具有促进分化功能的中药进行相关的安全性评价，致力应用于临床。川芎是伞形科藁本属植物，经研究表明，其具有多种临床功效，如使血管扩张、增加脑部血流量、改善供血、降低血液黏稠度及改善心肌缺血[20]。本课题组在研究川芎含药血清的胚胎毒性时发现川芎含药血清对胚胎干细胞转化为心肌细胞有促进作用（P
参考文献
[1] Paquin J，Danalache B A，Jankowski M，et al.Oxytocin inducesdifferentiation of P19 embryonic stem cells to cardiomyocytes[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（14）：9550-9555.
[2]孙敬方.实验动物学[M].北京：人民卫生出版社，2004：150-194.
[3]刘建文.药理实验方法学新技术与新方法[M].北京：化学工业出版社，2004：258-261.
[4] Qi Y J，Zhu Q L，Zhang K B，et al.Activation of foxo1 by insulin resistance promotes cardiac dysfunction and β-Myosin heavy chain gene expression[J].Circulation Heart Failure，2015，8（1）：51-63.
[5] Wang S，Deng Z，Seneviratne C J，et al.Enterococcus faecalis promotes osteoclastogenesis and semaphorin 4D expression[J].Innate Immunity，2015，21（7）：726-735.
[6] Zhu D Y，Lou Y J.Inducible effects of icariin，icaritin and desmethylicaritin on directional differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in vitro[J].Acta Pharmacol Sin，2005，26（4）：477-485.
[7]金玉青，洪远林，李建蕊，等.川芎的化学成分及药理作用研究进展[J].中药与临床，2013，4（3）：44-48.
[8]罗莎，方海琴，杨辉，等.两种胚胎干细胞实验模型评价邻苯二甲酸（2-乙基己基）酯胚胎发育毒性的比较研究[J].中华预防医学杂志，2016，50（7）：645-651.
[9]王宏茂，邱彬，邓然，等.胚胎干细胞对孕鼠缺血受损心肌的修复作用[J].中国实验动物学报，2016，24（2）：127-133.
[10]任聪，孟宪生，包永瑞，等.体外筛选川芎治疗冠心病的有效成分的提取纯化工艺研究[J].中国医药导报，2011，8（35）：81-83.
[11]刘丹，尹东，曾姝，等.川芎嗪对LPS致心肌细胞损伤的影响及机制研究[J].中国药理学通报，2012，28（11）：1531-1535.
[12]彭霞，黄政德，成细华，等.加味丹参饮预处理调控自噬相关基因Beclin-1和Atg5表达抗大鼠心肌缺血再灌注损伤[J].湖南中医药大学学报，2016，36（7）：20-24.
[13]于妍，王硕仁，聂波，等.川芎嗪、缬沙坦及曲美他嗪对乳鼠肥大心肌细胞线粒体结构和能量代谢的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2012，10（3）：321-324.
[14]于妍，王硕仁，孙逸坤，等.川芎嗪在逆转心肌细胞肥大过程中对心肌细胞线粒体结构和功能的影响[J].中国中西医结合杂志，2012，32（5）：661-665.
[15]姜晖，陈霞霞，王金艳，等.川芎嗪对柯萨奇病毒B3感染小鼠心肌细胞凋亡的影响研究[J].中华医院感染学杂志，2014，24（13）：3121-3123.
[16]周雅萍，刘强.川芎嗪对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用[J].实用临床医学，2011，12（2）：5-7.
[17]许玲莉.小鼠胚胎干细胞不同分化阶段UGT1a1、UGT1a6和mGST1的表达特征[J].中国组织工程研究，2016，20（28）：4130-4135.
[18]赵润英，郝伟，孟祥军，等.阿魏酸川芎嗪后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响[J].中国医科大学学报，2012，41（11）：1018-1021.
[19]赵润英，郝伟，孟祥军，等.阿魏酸川芎嗪对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响[J].中国病理生理杂志，2013，29（12）：2139-2143.
胚胎干细胞范文4
一般资料：2010年5月～2011年1月收治2型糖尿病患者10例，足部病变严重程度按中华医学会糖尿病学会1996年糖尿病足检查方法及诊断标准。按入院先后随机分为两组。胚胎多潜能干细胞组6例，男4例，女2例，年龄52～78岁，平均613±21岁，其中糖尿病足Ⅱ级4例、Ⅲ级1例、Ⅳ级1例。对照组4例，男3例，女1例，年龄54～82岁，平均602±22岁，其中糖尿病足Ⅱ级2例、Ⅲ级1例、Ⅳ级1例。两组患者年龄、性别等一般资料比较无显著性差异。
方法：治疗组与对照组基础治疗基本相同。两组所有皮肤溃疡创面均用01%新洁尔灭液和生理盐水依次清洗，清除溃疡创面的坏死组织，溃疡创面有感染者先用3%双氧水清洁脓性分泌物后再按程序清创。在上述基础上，治疗组予胚胎多潜能干细胞治疗。既患者在局麻下经股动脉输入胚胎多潜能干细胞。
结果
两组患者ABI及足趾皮肤温度的比较：结果见表1。
讨论
糖尿病足属于祖国医学“脱疽”范畴，1956年Oakley首先提出糖尿病足一词，1972年Catterall将糖尿病足定义为“已因神经病变而失去感觉和因缺血而失去活力，合并感染的足称为糖尿病足”，是糖尿病慢性并发症之一，也是导致糖尿病病人致残死亡的主要原因之一。主要临床表现为足部溃疡和坏疽，严重者需要截肢，截肢率高达40%。由于神经病变，患肢皮肤干而无汗，角化变脆，肢端刺痛，感觉迟顿或消失。因肢端营养不良，肌肉萎缩，屈肌和伸肌失去正常的牵引张力平衡，趾间关节变曲，形成弓形足、鸡爪趾等畸形，周围血管病变，足背动脉搏动消失，足部皮肤温度下降，休息时伴疼痛等。间歇性跛行，是早期下肢症状，行走一定距离后感觉下肢乏力、劳累、麻木，下蹲起立困难，夜间出现休息痛。
根据世界卫生组织(WHO)定义，糖尿病足是指糖尿病患者由于合并神经病变及各种不同程度末梢血管病变而导致下肢感染、溃疡形成和(或)深部组织的破坏。在临床上，由于糖尿病患者由于长期受到高血糖的影响，下肢血管硬化、血管壁增厚、弹性下降，血管容易形成血栓，并集结成斑块，而造成下肢血管闭塞、支端神经损伤，从而造成下肢组织病变。而“足”离心脏最远，闭塞现象最严重，从而引发水肿、发黑、腐烂、坏死，形成脱疽。目前，各大医院对糖尿病足患者一般采取截肢、搭桥或干细胸移植手术。
胚胎多潜能干细胞在缺血组织中分化合成血管内皮细胞，并分泌多种血管生长因子，促进新生血管生成，从而改善患者病情以及以愈合为目的的一种治疗方法。胚胎多潜能干细胞移植治疗糖尿病足的疗效机制［1］可能是移植后干细胞在缺血组织内分化成内皮细胞后演变为毛细血管，再逐渐塑形成小的侧支血管。本研究将10例糖尿病足患者随机分为两组，治疗组6例和对照组4例，均在控制饮食，严格控制血糖稳定基础上采用清创，抗感染，治疗组予胚胎多潜能干细胞及硫酸锌。对照组予硫酸锌。结果显示，治疗组有效率为900%，对照组为571%，治疗组总有效率明显高于对照组(P＜005)。本研究发现，应用胚胎多潜能干细胞及α-硫辛酸后，患者血糖迅速达标，感染迅速局限，溃疡愈合良好，并且下肢供血明显改善。此外，经胚胎多潜能干细胞治疗后［2］足趾皮肤温度明显增加，且显着高于对照组，说明胚胎多潜能干细胞在改善糖尿病足血液微循环方面优于对照组。
参考文献
胚胎干细胞范文5
关键词：干细胞；胚胎干细胞；全能；多能；单能
干细胞是指机体内一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞。干细胞有不同的分类方法，其中之一是根据细胞的分化潜能，分为全能干细胞、多能干细胞和单（专）能干细胞。在人教版选修三教材中写到：胚胎干细胞具有发育的全能性。那么它是全能干细胞吗？造血干细胞是多能干细胞还是单能干细胞呢？本文将对此进行初步辨析。
一、全能干细胞
全能干细胞具有形成完整个体的分化潜能。哺乳动物的生命始于受精卵，经卵裂形成桑椹胚，再经过囊胚、原肠胚、组织器官形成，直至发育为完整个体。而真正意义上的全能干细胞只有受精卵和卵裂早期（一般不超过16个细胞的胚胎）的细胞，其中的每个细胞安置到适宜的子宫内，不仅可以分化产生3个胚层中的各种类型细胞，还能发育成胎盘组织，最终都可以发育为一个完整个体。
二、多能干细胞
多能干细胞分为两类，一类称为多潜能干细胞，与全能干细胞相比，多潜能干细胞已经失去了发育成完整个体的能力，但仍具有分化为体内全部200多种类型细胞的潜能。如囊胚内细胞团细胞和原始生殖细胞。另一类多能干细胞是指分化潜能有限，一般局限于分化成与其来源相近（同一胚层）的细胞类型的干细胞。例如骨髓间充质干细胞，它们可分化形成骨、肌肉、软骨、脂肪等组织细胞，却不能分化出全部类型的细胞；又如存在于人体骨髓中的造血干细胞，可以分化成红细胞、血小板、粒细胞和淋巴细胞等十种以上的血细胞，但它们都不能分化出体内全部类型的细胞。
三、 单（专）能干细胞
单（专）能干细胞是指只能向一种或几种密切相关的细胞类型分化的干细胞。如小肠上皮中的干细胞，它能够分化为小肠上皮细胞等4种细胞；神经干细胞可分化产生3种细胞。
四、胚胎干细胞
20世纪60年代，人们发现小鼠畸胎瘤中存在有未分化的多能干细胞，在适宜的条件下，它们可形成多种类型的细胞，由于畸胎瘤是原始生殖细胞癌变而成，因此，人们就把这种畸胎瘤中发现的干细胞称为胚胎癌细胞。1981年，科学家用小鼠囊胚的内细胞团细胞建立了多能干细胞系，这种多能干细胞被称为胚胎干细胞。此外，人们还尝试从原始生殖腺中直接分离未分化的多能干细胞，他们也可以在体外适宜的环境中保持未分化状态并较长期增殖，这种干细胞被称为胚胎生殖细胞。虽然胚胎癌细胞、胚胎干细胞和胚胎生殖细胞是三种不同的细胞，但它们在体外都具有无限增殖或较长期增殖和多向分化的潜能，而且从细胞起源来看，它们都直接或间接的来自胚胎组织，因此可把它们统称为胚胎干细胞。
综上所述，人体骨髓中的造血干细胞应属于多能干细胞；而来自囊胚内细胞团和原始生殖嵴的胚胎干细胞亦属于多能干细胞，它虽是一种高度未分化细胞，具有发育的全能性，但却不儆谌能干细胞，只有受精卵和卵裂早期的细胞才是真正意义上的全能干细胞。
参考文献：
胚胎干细胞范文6
今年诺贝尔生物奖颁给了在基因靶向技术领域有杰出贡献的科学家，下一次，可能就会轮到干细胞研究了。整个11月，医学和生物学界最大的新闻就是华裔女科学家余君英领导的实验室成功分离出“万能细胞”，即将普通的人体皮肤细胞改造成干细胞，然后通过基因重组，最终培育成人体组织或器官。
另外一个干细胞的新进展是11月14日发表在《自然》杂志上的论文：如何利用一种被称为“体细胞核移植”的技术创造胚胎干细胞。研究人员已经在猴子身上成功进行了试验，第一批原始胚胎已经克隆出来。所谓“体细胞移植”指的是将人体细胞的细胞核取出，将其放入一个未受孕的卵子中，最终成功孕育出一个新胚胎干细胞。
获取胚胎干细胞的另外一种办法是干细胞里携带有个人基因。这种方法是利用一套分子指令，将一个体细胞转变成干细胞。日本京都大学的研究人员于去年在老鼠身上成功进行了试验。第一个成功克隆羊的伊万・维尔穆特在同一期《自然》杂志上发表评论说，迄今为止，没有任何迹象表明京都大学的这项技术在人类细胞上同样有效。然而，就在《自然》杂志发表“体细胞核移植”论文后不久，京都大学研究人员和威斯康星州立大学的科学家俞君英分别在《细胞》和《科学》杂志上发表了论文，两篇论文说的其实是一件事：如何将“体细胞移植”这项技术有效地运用在人类细胞上。维尔穆特看了双方公开的数据后，马上改变他之前的坚持，并表示今后他也会把精力集中在这项最新的技术上。
科学家们之所以对胚胎干细胞如此感兴趣，是因为胚胎干细胞可以转化成其他各种身体细胞，这样，用带有病人基因的新组织或器官替换那些已经不再起作用的组织或器官的可能性就会大大增加，病人身体的免疫系统也就不会出现排异反应，再生药物也将因此诞生。
当然，再生药物距离问世还有很长的一段路，但在可以预见的未来，在研制新药方面，培育某些身体组织的这种能力将体现出巨大的价值。从基因经济学的角度说，利用这一新技术获取干细胞将拥有巨大的商业前景。
