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胰蛋白酶范文1
[关键词] 中性粒细胞弹性蛋白酶；α1-抗胰蛋白酶；慢性阻塞性肺疾病
吸烟能导致全身多种疾病，其中有24%的吸烟者能发生慢性阻塞性肺疾病（COPD）。由于大多数COPD患者早期没有症状，所以不能及早就诊，这些患者只能做肺功能检查才能确诊。对于没有肺功能仪的医院和不适宜做肺功能检查的患者是否可以通过血清酶学检测达到早期诊断的目的呢？我们的研究发现中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）的血清含量在吸烟的COPD患者组、非患者组及健康组有明显不同，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选择2008年10月～2010年1月在我院体检者和呼吸科住院的COPD患者共86例。将其分成三组：A组33例是有吸烟史的住院治疗后处于稳定期的COPD患者；B组33例是有吸烟史但是没有COPD的健康体检者；C组20例是不吸烟的健康体检者。三组受检者的年龄和性别匹配，具有可比性。吸烟者吸烟指数均≥30包年，均进行吸入支气管扩张剂后的肺功能检查：B组一秒率>70%，排除COPD诊断，A组一秒率
1.2 方法
采集空腹静脉血5 mL，A组出院前采血，B组和C组在体检时留取血样，及时提取血清，每例取1 mL血清分装在2个待测管中，待测血清存于-70℃超低温冰箱保存。使用美国进口的原装试剂盒，用ELISA法检测血清中NE和α1-AT含量，具体步骤根据试剂盒操作说明书逐步进行。每组研究对象检测NE和α1-AT两种酶含量，然后比较每一种酶含量在两组间的差别有无显著性。
1.3 统计学处理
应用SPSS 18.0软件对数据结果进行统计学分析。六组数据有五组为非正态分布，所以各组数据取中位数进行组间秩和检验，P < 0.05为有统计学意义。
2 结果
见表1。NE血清含量以吸烟的COPD患者组最高，中位数为55.21 ng/mL，吸烟的非COPD患者组其次，中位数为25.76 ng/mL，两组比较差异有统计学意义（P < 0.01），吸烟的COPD患者组及吸烟的非COPD患者组均明显高于非吸烟的健康对照组（中位数为3.12 ng/mL）（P均< 0.01）。α1-AT血清含量以吸烟的非COPD患者组最高，中位数为627.72 ng/mL，吸烟的COPD患者组其次，中位数为421.08 ng/mL，吸烟的非COPD患者组和吸烟的COPD患者组均明显高于非吸烟的健康对照组（中位数为9.75 ng/mL），但是吸烟的两组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
3 讨论
我国流行病学调查资料显示40岁以上成年人COPD患病率为8.2%。吸烟是COPD发病的主要环境因素，在国外约占90%以上，我国为71.6%。吸烟导致COPD的重要
损害机制是酶失衡，即NE升高，同时α1-AT减少。NE是重要的弹性蛋白酶之一，主要来自肺内的中性粒细胞和肺泡巨噬细胞。吸烟者由于烟雾及有害气体的作用，使肺泡巨噬细胞和肺内中性粒细胞聚集、活化，释出NE。NE能够降解构成肺泡壁的细胞外基质和上皮连接结构，造成肺泡间隔破坏，肺泡腔扩大，小气道在呼气时失去了周围组织支持而陷闭，导致COPD发生。NE能导致气道黏液高分泌，增强病原菌与气道上皮的黏附力，而且NE还能降解免疫球蛋白、补体，降低机体对病原菌的清除，因此导致感染发生或不易控制。NE能激活中性粒细胞释放更多的NE，形成NE的恶性循环[1]。本研究显示：血清中NE含量的中位数在吸烟的COPD稳定期患者组和吸烟的非患者组均明显高于健康对照组，且患者组明显高于非患者组，这一结果说明，只要是吸烟者无论是否患COPD，都始终存在下呼吸道慢性炎症，只是吸烟的患者组气道炎症程度更重，非患者组炎症程度较轻。提示：测定血清NE含量对吸烟者是否患有COPD有早期预测诊断价值。
α1-AT是一种糖蛋白，主要由肝细胞合成，分泌入血后作用于肺脏。α1-AT也能产生于肺局部巨噬细胞和支气管上皮细胞，这些肝外合成的α1-AT在肺局部组织损伤的调节中起重要作用。α1-AT是活性最强的蛋白酶抑制剂，占NE抑制作用的92%，α1-AT可与NE 1∶1结合，使NE失活，拮抗NE对弹性蛋白的水解作用，体内NE增加时，α1-AT的产生也会相应增加。先天性的α1-AT缺乏（AATD）是一种遗传性疾病，发生COPD的风险显著增加，主要见于欧美国家的白种人，在东亚人群中较为少见。AATD的不吸烟者，呼吸困难发生在44～51岁，吸烟者呼吸困难发生在32～35岁，而且AATD的吸烟者中，仅30%女性、18%男性生存到55岁[2]。后天的α1-AT缺乏不是绝对值下降，而是相对不足。本研究发现，吸烟伴COPD稳定期患者α1-AT的含量高于健康对照组，与国内多个研究结果一致[3]，但低于吸烟的非患者组，即α1-AT的含量：非患者组>患者组>对照组，而对应的NE含量是患者组>非患者组>对照组。这一研究结果提示：①α1-AT的含量在患者组没有与NE平行增高，出现了相对缺乏。分析原因是α1-AT产生不足，破坏增多。正常人呼吸道中的α1-AT的含量远远大于NE的含量，所以肺组织不易遭到NE的破坏，但是α1-AT极易被氧化，吸烟时产生的烟雾中的自由基有很强的氧化作用，从而破坏肺组织中的α1-AT，因此，烟龄越长、吸烟量越大的老年人COPD发病率越高。②α1-AT的含量在非患者组高于患者组，由于非患者组的个体具有很强的产生α1-AT的能力，使非患者组的NE和α1-AT两种酶处于高水平的平衡，一旦平衡被打破，将导致COPD的发生。这也提示我们，在COPD的防治过程中可考虑应用促使肝细胞产生α1-AT的药物或补充α1-AT制剂。
总之，NE在吸烟的COPD患者中明显高于吸烟的非COPD患者，而α1-AT却没有出现相应的变化，因此，对吸烟者是否发生了COPD的早期诊断除了查肺功能以外，测定血清中NE含量有一定的意义，具体的参考值范围有待进一步研究。
[参考文献]
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[2] 田和平，徐金枝. α1-抗胰蛋白酶缺乏与疾病关系的研究进展[J]. 中华医学杂志，2006，30（5）：439-440.
胰蛋白酶范文2
【关键词】 豆豉；，，胰蛋白酶抑制剂；，，分离纯化；，，降糖作用
摘要：目的从豆豉中提取胰蛋白酶抑制剂，并探讨其降血糖活性。方法以永川豆豉为材料，经脱脂，酸性溶液提取，硫酸铵沉淀得到胰蛋白酶抑制剂粗提物，再经Sephadex G-75凝胶层析得到纯化的胰蛋白酶抑制剂，以纯化的胰蛋白酶抑制剂给糖尿病小鼠灌胃并观察其降血糖活性。结果从豆豉里分离出的胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制率为30%~40%；用抑制剂提取液给四氧嘧啶糖尿病模型小鼠连续灌胃4 d，发现其血糖值明显低于模型组；观察小鼠的胰组织病理切片，与糖尿病小鼠比较，灌胃后的小鼠胰组织明显得到修复。结论 豆豉提取液有较明显的降糖作用。
关键词：豆豉； 胰蛋白酶抑制剂； 分离纯化； 降糖作用
Purification A Trypsin Inhibitor from Lobster Sauce Produced in Yongchuan and Hypoglycemic Action of Research
Abstract：ObjectiveTo isolate and purify the trypsin inhibitor from Lobster sauce and investigate its hypoglycemic action.MethodsA trypsin inhibitor was purified from the lobster sauce of Yong Chuan by defatting，extraction with axidic buffer，precipitation，chromatography on Sephadex G-75， and its hypoglycemic action in mice was studied.Results A series study on lobster sauce showed that the inhibitor had inhibition activity of thirty~forty percent to trypsin. In mesoxalyl carbamide model，the blood glucose levels were reduced after four days treated with lobster sauce extracts of Yong Chuan， compared with the model group.ConclusionThe trypsin inhibitor has hypoglycemic action.
Key words：Lobster saace； Trypsin inhibitor； Isolation and purification； Hypoglycemic action
蛋白酶抑制剂广泛存在于动植物和微生物中，具有抑制蛋白酶的活性的作用，能与相应的蛋白酶水解，参与体内许多重要生理过程的调节。其中胰蛋白酶抑制剂具有重要的药用价值，对于急性胰腺炎、肺气肿、出血性和败血性休克等疾病有独特的疗效［1］。蛋白酶抑制剂被认为是植物天然的自我防御体系，是植物抗病基因工程的重要目的基因来源［2］。大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）与其它临床上广泛应用的胰蛋白酶抑制剂具有相似的性质，但其生理活性研究还没得到足够的重视。和其他胰蛋白酶抑制剂相比，大豆胰蛋白酶抑制剂具有分子量较小、免疫反应较弱、植物来源的抑制剂能避免携带动物病毒、原料来源广、价格低廉等优点，应当得到足够的重视。大豆胰蛋白酶抑制剂的种类有7~10种，目前研究证明主要有两种在动植物体内能抑制胰蛋白酶活力：一种为鲍曼克抑制剂(BBI)，是由71个氨基酸组成的多肽，分子量为7 975，分子内有7个二硫键，另一个为库尼兹抑制剂（KSTI），分子量约2万，分子内有2个二硫键。近年来国外报道发现低浓度的BBI在动物体内对直肠癌、肝癌等多种癌症有抑制作用；另有报道大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗，调节胰岛素失调可能有一定效果［3］，但未见有降血糖作用的详尽报道。因此，对具有强抗癌活性且毒性小的胰蛋白酶抑制剂，从豆豉中分离纯化，使其成为抗癌、治疗糖尿病及其并发症的新药用于临床，有十分积极的意义。
1 仪器与材料
DS1高速组织捣碎机（上海标本模型厂）， KDC1042离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司），722分光光度仪（上海精密科学仪器有限公司），AE240电子天平（METTLER公司）；雄性昆明种小鼠（体重18~22 g），永川豆豉(市售咸豆豉) ，透析袋，牛胰蛋白酶(1∶250) 、BAPNA・HCl(购自上海维思科贸有限公司)， Tris( 成都化学试剂厂生产)，sephadexG75 (上海化学试剂厂生产)，四氧嘧啶(Alloxan，Sigma公司)，葡萄糖试剂盒GLU（氧化酶法，液体，北京北化康泰临床试剂有限公司），肝素钠（天津生物化学制药厂），其它试剂均为国产分析纯。
2 方法与结果
2.1 豆豉胰蛋白酶抑制剂的分离纯化
2.1.1 豆豉胰蛋白酶抑制剂粗提物的制备大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法已由Kakade等人在1974年提出。由于大豆胰蛋白酶抑制剂对热酸环境相对稳定，一般采用水浸酸提、沉淀再经离子交换或凝胶层析纯化制得。取2 kg永川豆豉，于46℃恒温干燥9 h，干燥后置于干净托盘中，把干燥豆豉粉碎、称重，然后加入去离子水2 L，于0℃提取15 h。15 h后于3 000 r/min离心6 min，沉淀弃去， 收集上清液。取上清液，加入正己烷［正己烷∶上清液(1∶2)］，静置30 min，后用1 000 ml的分液漏斗分离上述混合液，回收正己烷，收集棕色豆豉提取液。用稀盐酸20%(v/v)调豆豉提取液的pH约为4，于55℃水浴中保温1 h。称取固体硫酸铵，分次少量加入于水浴的上清液里，使硫酸铵的饱和度为30%，继续于55℃的水浴恒温15 min，离心15 min（3 800 r/min），弃去沉淀，留上清液。在上清液里加固体硫酸铵，使硫酸铵的饱和度为55%，55℃保温10 min，再离心15 min，弃去沉淀，收集上清液。再于上清液里加固体硫酸铵，使硫酸铵溶液的饱和度为70%，55℃恒温10 min，离心30 min（12 000 r/min），弃去上清液，收集沉淀，用20 ml磷酸盐缓冲液（pH 7.8）溶解沉淀，沉淀即为抑制剂粗提物［4］，于4℃保存在冰箱里。
2.1.2 抑制剂粗提物的透析将抑制剂粗提物置于透析袋中蒸馏水充分透析7 d，除去盐分。
2.1.3 凝胶柱的制备及抑制剂粗提物的纯化［5］取层析柱（16 mm×60 cm)洗干净并烘干。称取12.5 g sephadex G75溶解在250 ml 0.05 mol・L-1 pH 7.8的磷酸缓冲液中，充分混匀后，在100℃水浴中蒸煮5 h，赶走气泡，将凝胶连续沿壁缓缓倒入层析柱中，待有2 cm沉淀后，打开柱子下端的出口。稳定以后在凝胶的上缘留2~3 cm缓冲液，并放一个面积相当的滤纸片，吸出存留缓冲液，加入5 ml样品，连上缓冲液，打开出口阀，控制流速在2 ml/h。流出30 ml后，用干净的试管分部收集（2~3 ml），检测每管的抑制剂活性。
2.1.4 BAPNA法测定胰蛋白酶抑制剂活性 参考文献［6］略加改进，取不同胰蛋白酶抑制剂制备物并与0.2 ml胰蛋白酶溶液（0.1mg/ml）混合，于5 ml TrisHCl缓冲液（pH 8.0，0.05 mol・L-1）中37℃保温5 min，加入BAPNA 2.5 ml（5 mmol・L-1），于37℃恒温10 min，立即加入0.5 ml 33%醋酸溶液终止反应，以不加抑制剂的试样做对照，410 nm处测定吸光度值。每降低0.1个A410 nm为一个BCTI抑制活性单位（U）。
图1 豆豉胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制率（略）
由图1可看到纯化过的豆豉胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制作用是较强的，是一种抑制力较强的抑制剂。
2.2 抑制剂提取物对小鼠血糖水平的影响
2.2.1 实验性四氧嘧啶糖尿病动物模型的建立取雄性昆明种小鼠（体重18~22 g），随机分为3组。每组10只，分别为正常对照组、四氧嘧啶高血糖模型组、抑制剂提取物灌胃组。高血糖模型组及高血糖模型灌胃组禁食10 h。按200 ml/kg的用量，腹腔注射四氧嘧啶。72 h后人工断尾取血，选取空腹血糖值大于11.0 mol・L-1的小鼠作为高血糖模型小鼠。
2.2.2 豆豉胰蛋白酶抑制剂对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖水平的影响高血糖模型灌胃组按每天0.3 ml/只用量经口服灌胃给药4 d。正常组和高血糖模型组每天注射等剂量的生理盐水。每日观察小鼠皮毛、活动等生长情况。末次给药后，所有动物禁食10 h，按试剂盒方法测定血糖值。
表1 豆豉胰蛋白酶抑制剂对四氧嘧啶高血糖模型小鼠血糖水平的影响（略）
P＜0.001
由表1可见，第1天灌胃后的小鼠血糖值比高血糖模型组有所降低，第4天灌胃后的小鼠血糖值比高血糖模型组明显降低，说明豆豉胰蛋白酶抑制剂提取物有较明显的降血糖作用。
2.2.3 豆豉胰蛋白酶抑制剂对胰组织的影响处死小鼠，分别取四氧嘧啶糖尿病模型小鼠灌胃前后的胰腺组织做病理切片（HE染色），显微镜下观察，结果如图2~3。 由图2~3可见，四氧嘧啶高血糖模型小鼠胰组织严重病变，灌胃后小鼠胰组织形态好于四氧嘧啶高血糖模型组织，胰岛结构较清晰，边缘与周围腺胞界限明显。说明豆豉胰蛋白酶抑制剂提取液对胰岛组织有明显的修复作用。
图2 抑制剂灌胃后小鼠胰组织 （略）
图3 四氧嘧啶糖尿病模型小鼠胰组织（略）
3 讨论
据报道大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗，调节胰岛素失调有一定效果。我们在实验中观察到豆豉胰蛋白酶抑制剂提取液有降低四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖的作用。我们尚在本实验中做了豆豉胰蛋白酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶活性抑制实验，结果显示无抑制活性作用。提示其降糖机理可能不是通过影响胰岛素受体后糖代谢的环节，而可能是通过保护或修复胰岛β细胞及胰岛组织促进胰岛素分泌或释放起作用的［7］。可能是豆豉提取液中胰蛋白酶抑制剂对胰腺产生了一定作用，促进胰岛素的释放，从而降低了血液中葡萄糖的浓度，但降糖作用机理尚有待再进一步分析研究。
参考文献
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胰蛋白酶范文3
【关键词】 大豆胰蛋白酶抑制剂 人宫颈癌细胞 细胞增殖
Abstract: Objective To study the influence of soybean trypsin inhibitor (Trypsin inhibitor.SBTI) on the human hela cells' (Ishikawa) proliferation in vitro. Methods Hela cells were cultured in vitro and effects of SBTI on cell proliferation were measured by using methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. Results For 0.20～1.00 g/L SBTI concentration， with the increasing concentration of the drug and with the duration of the same concentration， the inhibition to cell proliferation was significantly strengthened. The characteristics of the apoptosis can be observed under the light microscope. Conclusions SBTI markedly inhibited hela cells' proliferation on dose- effect and time- effect relationship.
Key words:soybean trypsin inhibitor; the human hela cells; cell multiplication
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。患者年龄分布 呈双峰状，35～39岁和60～64岁，平均年龄52.5岁。宫颈癌不仅发病率居于首位，近年来发病年龄有提前的趋势，探寻一种经济有效的、非手术的、能够免除平常化疗药物副作用的方法可谓当务之急。大豆胰蛋白酶抑制剂是从大豆中提取的，是指能够抑制胰蛋白酶作用的一类物质。国内外已经有文献报道大豆胰蛋白酶抑制剂具有多种药理活性，其中包括抗炎，抗病毒，抗肿瘤等。现在人们在对结肠癌，前列腺癌，乳腺癌的研究已经证明大豆胰蛋白酶抑制剂有明显的抗肿瘤作用［1-3］。大豆胰蛋白酶抑制剂已经受到人们的关注，成为研究的热点。但是国内外关于大豆胰蛋白酶抑制剂对宫颈癌的研究报道较少。本实验以细胞培养为基础，对大豆胰蛋白酶抑制剂的抗肿瘤作用进行了初步研究，通过证明大豆胰蛋白酶抑制剂对宫颈癌细胞增殖的抑制作用，以期对临床用药和开发提供科学依据，积累实验资料，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 药品和试剂
大豆胰蛋白酶抑制剂为北京中医药大学细胞与生化实验室提取（浓度为98%）；RPMI-1640培养基为美国Gibco公司产品，胎牛血清为杭州四季青血清；胰蛋白酶和EDTA均购于Ameresco公司。四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购于Sigma公司；HERAD—6345型二氧化碳培养箱(德国赫利氏公司)；IⅩ71倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）;FCANF129004酶标仪(澳大利亚TECAN公司)。
1.1.2 细胞株
人宫颈癌细胞株（Hela）由北京病毒学研究所惠赠。
1.1.3 培养液
RPMI1640全培养液（RPMI1640+10％胎牛血清+青链霉素100 U/mL及100 μg/mL）。
1.2 实验方法
1.2.1 肿瘤细胞培养
Hela细胞使用含有10%胎牛血清的RPMI1640全培养液，在设定为37.0 ℃、5%CO2 培养箱中培养。细胞可贴壁生长，待细胞生长贴满底壁的80%左右时传代。传代时移去旧的培养液，用PBS洗涤2 次，用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的混合消化液消化，培养液重悬细胞于新培养液中，每瓶传代为2或3 瓶。取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 MTT法测定细胞生长
将用上述方法培养得到的细胞消化，l 000 rpm离心10 min，计数，以2×105个/L密度接种于96孔培养板中，每孔100 μL，在37.0 ℃、5% CO2 培养箱培养24 h后，加入浓度分别为0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L 的 SBTI (溶解在含10%胎牛血清的1640全培养液中)100 μL。每一浓度各设6个平行孔，并分别设空白孔(即只加入药液和培养液，不加细胞)以调零。继续培养24、36、48 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，再培养4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡器上震荡10 min，应用酶标仪于490 nm处测吸光值（A），按照公式：抑制率％=(对照组A－实验组A)/对照A×100％，求抑制率。实验在相同条件下均重复进行3 次。
1.2.3 光镜下形态学观察
hela细胞接种于50 mL培养瓶中，培养24 h后，加入0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L的SBTI，培养24 h后，光学显微镜下观察细胞形态学变化，并拍摄照片。
1.2.4 统计学处理
数据利用SPSS13.0统计软件处理，求抑制率，采用重复测量的方差分析。并绘制出SBTI对Hela细胞抑制作用的量效和时效依赖关系曲线。
2 结果
2.1 SBTI对Hela细胞增殖的抑制作用
SBTI能够明显的抑制Hela细胞的增殖，并且呈现明显的量效和时效依赖关系。在不同的作用时间分别是24、36、48 h，随着药物浓度（为0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L）的依次增加，抑制率依次增加，最高可达83.24％，87.83％，96.01％， 除了0.50 g/L与1.00 g/L组之间差异没有显著性（P>0.05）外，其他各组差异均有显著性（P﹤0.01）；在不同的作用浓度（如上的6个浓度），随着作用时间（24，36，48 h）的依次增加，抑制率也依次增加，除了0.50 g/L和1.00 g/L组的24 h与36 h比较差异没有显著性（P>0.05）外，其他的均有有显著性差异（P﹤0.01），抑制率最高可达49.2%，59.77%，77.52%，80.92%，96.01%。见表1、图1。表1 不同浓度大豆胰蛋白酶抑制剂在不同作用时间对Hela细胞的抑制率（略）注：* 实验组与对照组比较P﹤0.01。#与前一组比较P﹤0.01，与上一组比较P﹤0.01但是0.50 g/L与1.00 g/L两组间在24 h时差异没有显著性P>0.05， 0.50 g/L组的24 h与36 h比较差异没有显著性P>0.05，1.00 g/L组的24 h与36 h比较差异没有显著性P>0.05
2.2 SBTI对Hela细胞形态上的影响
正常培养时，Hela细胞在传代后陪培养3～4 h即可贴壁，呈现长椭圆形，10 h后贴壁结实，呈现多角形而且细胞大小不一，可见巨大细胞，胞质也多少不一，核大小不等，可有双核。24 h后细胞呈现活跃的增殖。48～72 h后细胞生长贴满一底壁，此期间细胞称为对数生长期，见图2，图3。96 h后则由于细胞之间互相的抑制而不再增殖。在对数生长期的细胞，加药不同浓度后培养24 h，可见1.00 g/L浓度的细胞不再增殖，细胞间距变大，而且贴壁不紧固，见图4，10.00 g/L浓度的细胞，细胞大部分变圆，边缘跷起，且已脱离底壁，少量细胞聚集成一个一个的小细胞团，见图5。
3 讨 论
胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor ，TI)是指能够抑制胰蛋白酶作用的一类物质。天然的胰蛋白酶抑制剂来源广泛，动物植物以及人体内均含有TI，如可从黄豆、南瓜籽、牛肺或牛胰以及人尿中提取等。大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor ，SBTI)是从大豆中提取的 ［4］，无毒副作用［5］，具有广泛的生物学活性和作用，有着良好的科学研究和临床治疗前景。
肿瘤的发生有其遗传物质基础，主要表现为多基因突变所致的细胞失控性生长，细胞增殖失控和凋亡受阻是其发生、发展的主要原因，有效的抑制肿瘤细胞的增殖和诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的新的手段之一。
大豆胰蛋白酶抑制剂具有抗肿瘤作用。Zhang［6］等研究了单纯型的大豆胰蛋白酶抑制剂BBI 对人类乳腺癌细胞（MCF7）、人类头颈肿瘤细胞 （SCC61 和 SQ20B） 、人类宫颈癌细胞（Hela ，Hela-R1 ，Hela-R3） 、非肿瘤生成性人类上皮细胞 （MCF10）、非肿瘤生成性人类甲状腺上皮细胞（Htori-3）及小鼠成纤维细胞（C3H10T1/2）的影响 ，结果显示单纯型的大豆胰蛋白酶抑制剂BBI 和结合型的大豆胰蛋白酶抑制剂BBIC 能够显著降低MCF7 和SCC61 细胞系的存活率。
有实验证明大豆胰蛋白酶抑制剂具有明显的抑制肿瘤细胞降解基质膜的作用，从而能够抑制肿瘤细胞离开原来的生长部位，突破细胞外基质（ECM）的屏障和侵犯周围毗邻的正常组织［7］。
大豆胰蛋白酶抑制剂的还可以通过抑制肿瘤细胞的纤溶酶原激活系统起作用。这一系统包括:尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase type plasmino gen activator， uPA)及其受体(uPAR)和uPA抑制剂。大豆胰蛋白酶抑制剂与目前研究较为成熟的尿胰蛋白酶抑制剂（B ikunin）有着类似的作用，即与uPA结合形成一个复合体，并竞争地与uPAR 结合，封闭uPAR 的激活部位，使uPA酶活性不被激活，从而防止肿瘤细胞的转移和浸润。Kobayashi等［8］研究发现，肿瘤可分泌大量uPA，分泌后随即与肿瘤细胞表面的uPAR高度结合，活化的uPA再催化细胞表面的纤溶酶产生蛋白溶解级联反应，导致基底膜和细胞外基质被破坏。Kobayashi 等［9］ 通过Northernblot、Western blot、酶联免疫吸附法等证实，SBTI以一种时间及剂量依赖形式，在基因及蛋白水平抑制卵巢癌细胞系HOC－Ⅰ和HRA 的uPA 表达。
另外，大豆胰蛋白酶抑制剂调节信号传导途径而抑制肿瘤细胞的生长。大豆胰蛋白酶抑制剂通过直接抑制CD44 的二聚化抑制肿瘤转移。白细胞分化抗原CD44是一种多功能跨膜糖蛋白，它促进肿瘤细胞粘附、迁移，参与新生血管形成等一系列关键步骤。Kobayashi等［10］对人类软骨肉瘤细胞系HCS22 /8研究显示，肿瘤细胞间是通过CD44相互识别透明质酸，其相互作用是通过CD44蛋白二聚化完成。SBTI 通过直接抑制CD44二聚化介导激活的促细胞分裂原活化蛋白激酶系统，从而抑制uPA mRNA及其蛋白的表达及肿瘤的侵袭。
本实验用大豆胰蛋白酶抑制剂处理人宫颈癌细胞Hela细胞后，Hela细胞的生长受到明显抑制， 随着药物浓度为0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L依次增加，作用时间为24、36、48 h的依次延长，其抑制率也明显增加。并且出现凋亡的特征性改变：细胞大部分变圆，边缘跷起，且已脱离底壁，少量细胞聚集成一个一个的小细胞团，并随着药物浓度的增加，细胞均漂起，聚集成一个一个的大细胞团。这些结果表明大豆胰蛋白酶抑制剂能抑制Hela细胞增殖，与文献报道相似这可能是诱导Hela细胞发生凋亡有关。有关于大豆胰蛋白酶抑制剂抑制Hela细胞的机理方面我们将在以后做进一步的研究。
总之，大豆胰蛋白酶抑制剂，作为一种新型又无毒副作用的抗癌药，很有值得研究的价值，尤其我国是一个大豆资源丰富的国家，对其机制的深入研究，将对临床肿瘤治疗步入一个新的阶段有着重要的意义。
参考文献
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胰蛋白酶范文4
[关键词] 玉屏风散；变应性鼻炎；类胰蛋白酶；实验研究
[中图分类号] R285.5[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2009）02（a）-013-02
Experimental study on YU-Pingfeng San to the tryptase released by mast cells of allergic rhinitis
ZHANG Zhong-lin, ZHONG Ling, ZANG Zhi-he, XIN Zhi-wei
(Pharmacy College of Chengdu Medical College, Chengdu610083, China)
[Abstract] Objective: To investigate the effect of YU-Pingfeng San on the tryptase of allergic rhinitis. Methods: Serum pharmacological and extra-cell culture methods were employed to study the effect of blood serum of YU-Pingfeng San on the tryptase released by rat peritoneal mast cell (RPMC) in allergic rhinitis model rat. Results: Compared with the blank serum group, the content of tryptase of administration serum group decreased remarkably. Conclusion: YU-Pingfeng San can inhibit the RPMC to release tryptase in allergic rhinitis model rat, which is probably one of the mechanism of the prescription to stable mast cells to cure the allergic rhinitis.
[Key words] YU-Pingfeng San; Allergic rhinitis; Tryptase; Experimental study
变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）又称过敏性鼻炎，是已致敏患者再次接触过敏原后，由IgE介导的鼻黏膜超敏反应性疾病。AR是全球性的常见病与多发病，我国每年约有2 000万人患病，10％～40%的世界人口经受AR困扰[1]。肥大细胞（mast cells，MCs）来源于造血干细胞，广泛分布于结缔组织、黏膜组织及血管周围，易接触病原体和变应原等物质从而参与过敏反应的病理过程，MCs被激活而释放出类胰蛋白酶等炎症介质引起过敏反应。玉屏风散是中医的传统经典方剂，出自元・朱丹溪的《丹溪心法》，由黄芪、白术、防风组成，具有益气固表之功，为肺气虚证治疗的传统经典方剂，临床上常用该方或加味治疗AR并取得良好疗效。本研究从MCs脱颗粒释放类胰蛋白酶研究玉屏风散对AR的作用及其作用机制，为临床上应用该方治疗AR提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料
健康SD大鼠由四川医学科学院动物中心提供；RPMI 1640培养基、胎牛血清均美国Gibco公司提供；α-N-苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基苯酰胺盐酸盐（BAPNA），二甲基亚砜（DMSO）、Tris-HCl由美国Sigma公司提供；酮替芬由安徽华源医药股份有限公司提供。
1.2 实验分组及模型制作
健康SD大鼠40只，体重180～220 g，随机分为4组：模型组、阳性组、给药组和空白组，每组10只。造模方法参照文献[2],前3组为致敏组，将10％ TDI橄榄油溶液用微量移液器滴入豚鼠双侧鼻孔（每侧5 μl），每天1次，连续用5 d，后改为隔日激发给药1次，直至末次给药后45 min再激发1次；后一组为空白组，仅给生理盐水滴入双侧鼻孔内，每天每侧5 μl，其方法同致敏组。以鼻部症状和体征为主要观察内容。造模成功后，即于第2次激发后（第9天）开始，除空白组外，各组分别给予生理盐水、120%玉屏风散和16%酮替芬10 ml/kg，给药时间为15 d。自给致敏药开始，依据鼻痒、喷嚏、流涕轻重程度、次数多少、出现的时间长短为评分标准并评分记录，参照文献[2]拟定评分标准（表1）。
表1 过敏反应行为学评分
各症状记分叠加，总分5分者为模型成功，其症状观察时间为每次给致敏药后30 min内。
1.3类胰蛋白酶活力测定
取“1.2”实验中的模型组大鼠，按文献[3]方法分离大鼠腹腔肥大细胞（rat peritoneal mast cell, RPMC），RPMC置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中悬浮，37℃孵育2 h备用。另取健康SD大鼠15只，分为空白组（n=5）、阳性组（n=5）和给药组（n=5）。后两组大鼠分别给予120%玉屏风散和16%酮替芬10 ml/kg，空白组给予生理盐水40 ml/kg灌胃，2次/d，连续3 d，于末次给药后1 h，各组大鼠经股动脉取血，通过离心取得含药血清，并经56℃水浴30 min灭活备用。将悬浮的RPMC细胞分为三组，每组包括10个样品，加入以上制备好的含药血清，在37℃下孵育2 h，收集培养的RPMC上清液待测。类胰蛋白酶活力测定根据Lavens SE等[4]的方法：BAPNA以20 mg/ml溶于DMSO，取40 μl加入含待测液的1.5 ml 0.1 mol/L的Tris-HCl（pH 7.4）反应缓冲液中, 30℃反应20 min，加入0.5 ml 30%（体积/体积）乙酸终止反应；在405 nm处测吸光度值，以反应缓冲液作参比调零。
1.4统计学方法
数据以均数±标准差(x±s)表示，先对每组数据做正态性检验，再做方差齐性检验。若方差齐，则做单因素方差分析；若方差不齐，则进行变量转换。使用SPSS 13．0统计软件对数据进行分析，P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01表示差异有高度统计学意义。
2 结果
2.1 模型动物鼻部症状表现
从造模第1天开始，观察动物鼻部症状，采用症状积分叠加评分法，比较组间差异。模型组大鼠中出现变应性鼻炎发作症状，表现为不同程度的喷嚏、流涕、搔抓鼻部等表现，约40 min后症状逐渐缓解。玉屏风散治疗后大鼠所表现症状的程度较同期模型组明显减弱， 5～10 min后症状缓解或消失。末次激发后，玉屏风散给药组鼻部症状积分明显降低，与空白组比较差异有显著性（P＜0.05）。具体评分结果见表2。
表2 末次给药45 min后激发大鼠鼻部症状积分情况（x±s，分）
与空白组比较，P＜0.001；与模型组比较，*P＜0.05， ***P＜0.001
2.2 类胰蛋白酶测定
不处理组（即模型组）类胰蛋白酶释放水平高，经阳性组与药物组含药血清处理后，RPMC脱颗粒释放类胰蛋白酶释放水平均降低。具体结果见图1。
3 讨论
在变应性鼻炎效应阶段，因抗原－抗体反应使MCs活化并释放多种炎症介质（如组胺、白三烯、类胰蛋白酶、前列腺素和白介素等）激活下游的次级效应靶细胞――嗜酸粒细胞和中性粒细胞，最终引起流涕、鼻痒、喷嚏和鼻塞等急性过敏反应。近年来的研究发现，肥大细胞类胰蛋白酶水平的病理性改变在肥大细胞介导的过敏性炎症疾病如哮喘中起重要作用。肥大细胞是人类速发性超敏反应的主要效应细胞，该细胞一旦被激活，就会释放类胰蛋白酶。人β类胰蛋白酶的血清水平与速发型超敏反应的严重程度相平行[5]。类胰蛋白酶是黏膜型肥大细胞颗粒内的主要中性蛋白酶类，是MCs的特征性组成成分，当MCs被激活后，它以胞吐的方式排出而在MCs介导的过敏性疾病中发挥炎性效应放大作用[6]。因此，可以通过检测类胰蛋白酶的含量衡量MCs的活性状态，进而评价肥大细胞稳定剂在治疗过敏性疾病中的作用与作用机制。现代药理研究证实，玉屏风散主要有免疫双向调节作用；提高巨噬细胞吞噬能力；提高淋巴细胞转化百分率，促进细胞免疫能力；增强溶血素和溶血空斑形成反应，增加免疫球蛋白IgA，降低IgE；增强迟发型超敏反应（DTH）等[7]。
本研究结果表明，与空白组大鼠比较，模型组大鼠鼻部症状积分明显升高且差异有统计学意义，表明模型复制成功；经玉屏风散治疗后，治疗组与模型组比较其积分明显下降，且差异有统计学意义（P＜0.05），可见玉屏风散对模型动物鼻部过敏性症状有明显改善作用。与空白血清处理组比较，玉屏风散含药血清能明显降低变应性鼻炎RPMC释放类胰蛋白酶的量。可见，玉屏风散治疗变应性鼻炎的机制可能是通过稳定肥大细胞，抑制其脱颗粒释放出致炎症介质――类胰蛋白酶，从而减轻过敏性症状的发生而实现的。当然，对玉屏风散抑制肥大细胞释放类胰蛋白酶的量效关系、最佳配伍剂量以及方剂起作用的物质基础，还有待进一步地深入研究。配伍配比、物质基础的研究，必将为临床上应用玉屏风散有效治疗变应性鼻炎提供实验依据，这也是现代方剂学研究的关键科学问题。
[参考文献]
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胰蛋白酶范文5
【摘要】
目的建立一种能够检测不同分子大小（尤其是低分子量）蛋白酶抑制剂的电泳方法。方法根据特异蛋白酶抑制剂抑制靶蛋白酶活性的原理，借助明胶-Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，胶板经蛋白酶水解后，以考马斯亮蓝染色。结果小分子量的胃蛋白酶抑制剂与较大分子量的BBI均能在该方法中显示出活性带，并且利用该方法检测到山合欢种子中含有一种胰蛋白酶抑制剂。结论该方法能够满足不同分子大小、不同类型蛋白酶抑制剂检测的需要。山合欢胰蛋白酶抑制剂的发现对山合欢进一步的研究和综合开发有重要意义。
【关键词】 山合欢 Tricine系统 蛋白酶抑制 电泳
Abstract：ObjectiveTo establish an detecting method for protease inhibitors， especially for low-molecular-weight inhibitors. MethodsInhibitor samples were separated on a gelatin-SDS-PAGE in a Tris-Tricine buffer system. After electrophoresis， the gel was incubated with the target proteases to hydrolyze the background gelatin. The inhibitor bands， which were undigested by the target proteases， were stained.ResultsLow-molecular-weight inhibitor (pepstatin A) and larger inhibitor (soybean Bowman-Birk inhibitor) were demonstrated by this method and showed clear blue inhibitor bands in the white background. By this method， a trypsin inhibitor was detected from the seeds of Albizzia kalkora (Roxb.) Prain. ConclusionThis method not only fit for inhibitors with different molecular mass， but fits for inhibitors with various species. Moreover， the trypsin inhibitor found in Albizzia kalkora is important for further research and overall exploration.
Key words：Albizzia kalkora (Roxb.) Prain； Tricine buffer system； Protease inhibitor; Electrophoresis
蛋白酶抑制剂是一类可以抑制靶蛋白酶水解活性的功能多肽，参与体内许多重要生理过程的调节，广泛存在于豆科、禾本科及葫芦科等植物的种子及块茎中［1］。此外，动物的血液、、胰脏中以及酵母菌、链霉菌属等微生物中亦有蛋白酶抑制剂的存在［2］。蛋白酶抑制剂具有抗炎抗感染的能力，已被广泛用于治疗急性胰腺炎，烧伤后休克及产后大出血等疾病［3］。更重要的是许多临床前研究发现蛋白酶抑制剂具有降糖、抗辐射、抑制因不良环境因素引起的癌转化过程、抑制肿瘤细胞生长的作用，有可能开发出新型的治疗糖尿病、抗癌药物［4～6］。因此寻找及利用蛋白酶抑制剂是极具研究意义的。由于蛋白酶抑制剂属于小分子多肽，有些蛋白酶抑制剂的分子量甚至小于1 000，为了能从材料中寻找新的蛋白酶抑制剂，建立适合于低分子量蛋白酶抑制剂的检测方法十分必要。我们采用Tricine系统，在分离胶中加入明胶，电泳分离样品后，胶板以特定蛋白酶水解，最后用考马斯亮蓝染色的方法，建立了一种满足不同分子量大小、不同类型的蛋白酶抑制剂检测需要的电泳方法。
1 仪器与材料
TU-1901紫外分光光度计(北京普析)；Mini Protein III垂直板电泳槽（美国BioBrad公司）；山合欢Albizzia kalkora (Roxb.) Prain的成熟种子采自西南交通大学峨眉校区；Acrylamide、Bisacrylamide、胰蛋白酶、甘氨酸、Tris、Tricine、胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin A，分子量为685 Da)为Amresco.产品；胃蛋白酶、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(BBI，分子量为8800 Da)为Sigma产品；其余试剂均为国产分析纯。
2 方法与结果
2.1 山合欢蛋白酶抑制剂粗提物制备按Genov等［7］的方法略加修改。山合欢种子(20 g)打磨成粉，加入200 ml去离子水，室温搅拌提取2 h，离心(6 000 ×g，20 min， 4℃)，沉淀再用100 ml去离子水抽提1次，离心(6 000 ×g，20 min，4℃)，合并2次上清液。加固体硫酸铵至35%饱和度，4 ℃静置过夜，离心(6 000 ×g，20 min，4 ℃)收集上清液。上清液加入固体硫酸铵至55%饱和度，4 °C放置2 h，离心(6 000 ×g，20 min，4℃)，收集沉淀，用少量去离子水溶解，对去离子水充分透析，离心(10 000 ×g，10 min，4℃)，所得上清液即为山合欢蛋白酶抑制剂粗提物，置-20 °C下储存。
2.2 合欢蛋白酶抑制剂粗提物抑制活力的测定蛋白质浓度的测定采用Bradford法［8］，以牛血清白蛋白为标准蛋白。抑制活力按照Erlanger等人的方法［9］，以实验条件下，与不加抑制剂的样品的吸收值比较，每降低0.1个A410 nm的吸收值为一个抑制活性单位。
实验结果：由20 g山合欢种子可以制备得到14 ml粗提物，用Bradford法测定蛋白质含量为0.5 mg·ml-1，测定对胰蛋白酶的抑制活力为202 单位/mg蛋白。实验结果表明山合欢粗提物中含有胰蛋白酶抑制剂。
2.3 明胶-SDS-PAGE明胶-SDS-PAGE采用Hanspal等［10］的方法略加修改，分离胶浓度12%(pH 8.8)，分离胶中含有0.2% (W/V)明胶。样品处理液配方：6% SDS，300 mM Tris-HCl，pH 8.0，50%甘油，0. 05%溴酚蓝。样品与样品处理液按2∶1比例混合。电极缓冲液为25 mM Tris，250 mM甘氨酸 (pH 8.3)，0.1% SDS。电泳完毕后，胶板经去离子水冲洗3次，置于2.5% Triton X-100溶液中复性25 min（两次）。用去离子水冲洗胶板多次，将含有BBI和山合欢粗提物的电泳胶条置于胰蛋白酶酶解缓冲液中，另将含有Pepstatin A的电泳胶条置于胃蛋白酶酶解缓冲液中，37 °C水浴保温30 min，再用考马斯亮蓝R-250染色40 min，10%乙酸-10%乙醇脱色过夜。胰蛋白酶酶解缓冲液配方为100 mM Tris-HCl，pH 8.0缓冲液(内含50 μg/ml胰蛋白酶)。胃蛋白酶酶解缓冲液配方为0.2% NaCl，HCl，pH 3.0缓冲液(内含50 μg/ml胃蛋白酶)。结果见图1。
2.4 明胶-Tricine-SDS-PAGE采用Schagger等人建立的Tricine系统［11］并略加修改，分离胶为12%(W/V)丙烯酰胺，0.32%(W/V)双丙烯酰胺，0.2%(W/V)明胶，10%(W/V)甘油，0.75 M Tris-HCl，pH 8.45，0.1% SDS。浓缩胶为5%(W/V)丙烯酰胺，0.13%(W/V)双丙烯酰胺，0.33 M Tris-HCl pH 6.8。样品处理液配方及样品的处理与明胶-SDS-PAGE方法相同。电泳时，以0.2 M Tris (pH 8.9)缓冲液为阳极缓冲液，以0.1 M Tris，0.1 M Tricine，0.1% SDS (pH 8.25)缓冲液为阴极缓冲液，电流大小为1 mA/孔，当溴酚蓝迁移至凝胶底部时停止电泳。电泳完毕后，胶条的处理过程与明胶-SDS-PAGE相同。结果见图2。
3 讨论
明胶-SDS-PAGE是根据Laemmli系统而建立的检测蛋白酶抑制剂的常用电泳方法［10］。该方法适合于检测较高分子量的蛋白酶抑制剂，如BBI在明胶-SDS-PAGE中能观察到清晰的抑制活性带(图1a)。然而在传统Laemmli系统中，小分子短肽的浓缩是较困难的，因为小分子短肽与SDS形成的复合体具有与SDS本身类似的电荷和大小，会出现短肽-SDS复合物与SDS颗粒共迁移的现象，导致分子量小于1 kDa的短肽无法取得较好的分离效果［11，12］。如图1c中，含有Pepstatin A的电泳胶条未发现有抑制活性带的出现。
Schagger等［11］报道了一种改进的Laemmli 法， 用Tris-Tricine体系代替Tris-glycine体系后可很好地分离分子量在1～100 kD的蛋白质。该方法降低了分离胶的pH值(pH 8.45)，使蛋白质的移动速度变慢，提高了电泳分辨率；其次，采用不连续的电极缓冲体系和使用Tricine替代甘氨酸作为慢迁移离子，解除短肽-SDS复合物与SDS颗粒的共迁移效应，改善小分子量短肽的电泳效果［11］。我们首先考察该方法的灵敏度，结果发现500 ng的BBI在明胶-Tricine-SDS-PAGE中能观察到清晰的抑制活性带(图2a)，其电泳迁移率要低于明胶-SDS-PAGE，表明该方法具有很高的灵敏度。更为重要的是Pepstatin A在明胶-Tricine-SDS-PAGE中能够观察到一条清晰的抑制活性带(图2c)。以上结果表明该方法的优点在于灵敏度高，能够检测不同类型、不同分子大小的蛋白酶抑制剂，弥补了明胶-SDS-PAGE无法检测低分子量蛋白酶抑制剂的缺陷，从而为大量样品的筛选工作提供了有效、快捷的技术手段。
山合欢Albizzia kalkora属豆科含羞草亚科乔木。近年来发现山合欢皮具有镇静安神、抗抑郁等功效［13， 14］，是一种极具开发价值的药用植物。但一旦山合欢皮被使用后，会损坏树木，破坏生态环境。山合欢种子一般在秋天结果后作为废料任其自然消失，未充分加以利用。因此，在应用山合欢皮时，应同时开发山合欢种子，一可充分利用自然资源，二可保护环境。我们分别利用明胶-SDS-PAGE和明胶-Tricine-SDS-PAGE检测了山合欢粗提物，结果均发现只有一条抑制活性带(图1b，图2b)，说明山合欢种子只含有一种胰蛋白酶抑制剂。迄今未见国内外有关山合欢胰蛋白酶抑制剂的报道。因此，本实验结果对山合欢进一步的研究和综合开发具有重要意义。对此我们将进一步分离纯化这种胰蛋白酶抑制剂，并进行抑制肿瘤细胞实验。 参考文献
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胰蛋白酶范文6
[关键词] 金属蛋白酶组织抑制剂； 涎腺腺样囊性癌； β-肌营养不良蛋白聚糖
[中图分类号] R 739.87 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.002
β-肌营养不良蛋白聚糖（β-dystroglycan，β-DG）是一种跨膜蛋白，是连接细胞外基质和细胞内骨架的重要结构，对维持细胞膜的完整性和信号转导起着关键性作用[1]。人类宫颈癌、乳腺癌、结肠癌、前
列腺癌患者会出现β-DG异常，舌鳞状细胞癌患者有β-DG断裂的现象[2]。涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常见的唾液腺恶性肿瘤之一，侵袭性较强。目前有关SACC中β-DG的研究尚不多见。本研究通过观察细胞骨架与细胞外基质这一连接体是否发生断裂，从抑制SACC基底膜和细胞外基质降解的角度出发，检测金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）调控SACC肺高转移株ACC-M和SACC肺低转移株ACC-2表达β-DG的情况，探讨SACC侵袭和转移的机制，为治疗SACC提供新的理论基础。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料
人SACC肺高转移株ACC-M和人SACC肺低转移株ACC-2购至武汉大学保藏中心。主要试剂：GM6001（属于TIMPs的一种，美国Enzo Life Sciences Interna-tional公司产品），胎牛血清、DMEM培养液（HyClone公司，美国），含0.02%乙二胺四乙酸（ethylenedia-
mine tetraacetic acid，EDTA）的0.25%胰蛋白酶（杭州吉诺生物医药技术有限公司），一抗Beta-Dystro-glycan mouse monoclonal antibody（Novocastra Labo-ratories Ltd.，英国），SP9002（生物素标记山羊抗小
鼠IgG）HistostainTM-PlusKits免疫组织化学染色试剂盒、ZLI-9018DABKit/DAB浓缩型DAB试剂盒（北京
中杉金桥生物技术有限公司）。主要实验仪器：CO2恒温细胞培养箱（上海力申科学仪器有限公司），倒置相差显微镜（Nikon公司，日本），超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），数码显微摄影系统，冰冻切片机等。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 将ACC-M和ACC-2用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液在37 ℃、5%CO2条件下培养，当细胞长满80%时进行细胞传代。
1.2.2 GM6001储存液制备 将1 mg GM6001粉末溶于100 μL二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）后配制成25 μmol·L-1的储存母液，过滤除菌后，置于
-20 ℃冰箱内保存，备用。使用时稀释，使GM6001浓度分别为25、20、15、10 μmol·L-1。
1.2.3 细胞爬片制备 使用台盼蓝染色进行活细胞计数，确定活细胞数达到全部细胞的95%以上，用含10%胎牛血清的DMEM培养液稀释细胞（密度为每毫升5×104个），接种于经灭菌处理的盖玻片上，待细胞贴壁后，去除培养液，按照实验分组在适宜的条件下继续培养24 h。
1.2.4 实验分组 对照组加含10%胎牛血清DMEM培养液，在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h；实验组分别加入含GM6001浓度为10、15、20、25 μmol·L-1的培养液，于同样条件下培养24 h。
1.2.5 免疫细胞化学染色法检测ACC-M和ACC-2中β-DG的表达 将细胞爬片置于冰面上，用4%多聚甲醛固定5 min，PBS洗片3次，每次5 min；将细胞爬片浸入过氧化氢/甲醇溶液（150 μL 30%过氧化氢溶于50 mL甲醇液）中，室温浸泡30 min，再用PBS液洗片3次，每次5 min；滴加山羊血清封闭液，室温下作用30 min，甩去多余液体，不洗。实验组加一抗（一抗与无菌三蒸水的体积比为1∶200），4 ℃孵育过夜，PBS洗片；对照组不加一抗，以PBS液孵育，4 ℃过夜后，PBS洗片。上述步骤完成后，滴加二抗，于37 ℃孵育60 min，PBS洗片；然后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素亲和素复合物于切片上，作用30 min，PBS洗片；最后DAB显色，自来水洗涤，苏木精复染15 s，脱水，透明，封片，置于光学显微镜下观察，数码显微摄影系统成像。结果判定：细胞核为蓝色，β-DG阳性表达者呈棕黄色。
1.2.6 临床标本中β-DG的表达 选择2010年12月—2012年6月在宁夏医科大学总医院口腔颌面外科住院治疗的7例SACC患者采集标本。患者术前未经任何治疗，所有病例均经病理诊断后确诊，所有患者均行手术治疗。7例患者中，男4例，女3例；年龄42～68岁，平均55岁；病史1～6个月，平均3.5个月；原发部位在左侧者2例，右侧者5例。另外取10例涎腺组织作为对照，其中5例取自舌下腺囊肿的正常舌下腺组织，3例取自腮腺多形性腺瘤瘤旁正常组织（切缘在腮腺下极距病灶约1 cm处），2例取自腮腺腺淋巴瘤瘤旁正常组织。所有标本均于术中切取，大小约1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm，立即放入冻存管并投入液氮中保存备用。在制作冰冻切片的过程中，切片机的温度要维持在-20 ℃。切片完成后在冰面上用冷丙酮和甲醇固定4 min，PBS反复冲洗，再将冰冻切片浸入3%过氧化氢溶液中，室温浸泡30 min以灭活内源性酶，PBS液洗片，滴加山羊抗小鼠血清封闭液，室温下作用60 min，甩去多余液体，不洗，后续步骤同1.2.5。
1.2.7 统计学分析 用Image Pro-Plus 6.0病理细胞图像分析系统，将各组免疫细胞化学结果进行图像分析，每张切片至少选取5个高倍（40×10倍）视野，
计算出平均光密度值。采用SPSS 19.0统计软件分析数据，不同浓度的GM6001分别干预ACC-M和ACC-2细胞24 h后β-DG表达变化的比较采用单因素方差分析，ACC-M和ACC-2两种细胞株β-DG表达变化的比较采用独立样本t检验，检验水准为双侧α=0.05。
2 结果
2.1 加入GM6001后对ACC-M和ACC-2细胞株β-DG
表达的影响
加入不同浓度GM6001后，用免疫细胞化学法检测ACC-M和ACC-2细胞株中β-DG的表达，结果见表1：实验组与对照组β-DG表达的差异有统计学意义（ACC-M：F=60.247，P
其余3种浓度下，ACC-M和ACC-2中β-DG表达量的差异均有统计学意义（P
加入GM6001前后ACC-M和ACC-2细胞株中β-DG表达的情况见图1～4：加入GM6001前（对照组），
ACC-M和ACC-2细胞株中均无β-DG表达；加入GM6001后，2种细胞株中β-DG表达均为阳性。
2.2 临床标本中β-DG的表达
2.2.1 正常涎腺组织β-DG的表达 正常涎腺组织中β-DG主要位于腺泡基膜上。图5为正常舌下腺组织，可见舌下腺腺泡的外周有一层基膜包绕，基膜β-DG染色为阳性。
2.2.2 SACC组织β-DG的表达 7例SACC临床标本中，癌巢周围及癌细胞中β-DG表达均为阴性。图6
中SACC组织呈管状型，肿瘤细胞排列呈小管状或条索状结构，管状结构的内层衬有导管细胞，外层为肿瘤肌上皮细胞，均未见β-DG阳性染色。
3 讨论
β-DG是广泛表达于各种组织的跨膜糖蛋白，其功能很复杂，与细胞和基底膜的连接有关，而细胞与基底膜的连接对肿瘤细胞的侵袭和转移至关重
要[3]。在胃癌的研究[4]中，β-DG是一种功能性蛋白，在原发性肿瘤和转移性淋巴结中表达降低。在SACC中的表达情况，目前尚不明确。
SACC约占涎腺肿瘤的10%，易沿神经扩散发生远处转移，其远处转移的机制尚不清楚，对其预防和治疗尚无有效的方法。DeAngelis等[5]对24例SACC患者进行了长达22年的临床回访，发现患者5、10、20年的生存率分别为92%、72%、54%。对于SACC治疗方式的选择和预后的评估可能需要结合一些实验室检测指标。
β-DG是基质金属蛋白酶（matrix metalloprotei-
nase，MMPs）的靶点。β-DG被MMPs降解后，造成
β-DG复合体断裂， 使上皮细胞与细胞外基质的连接出现断裂[6-7]。本实验运用免疫组织化学法检测临床组织标本，结果发现：正常涎腺组织表达β-DG，提示β-DG对维持正常涎腺的结构和功能有重要作用；7例SACC组织中β-DG表达缺失，提示细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的连接发生了断裂，意味着癌细胞失去了自限性，获得向邻近正常组织侵袭和转移的能力。应用ACC-M和ACC-2两种细胞株进行体外研究，β-DG的表达情况与组织学的研究结果一致。
TIMPs是MMPs的天然抑制剂，正常情况下在组织细胞中MMPs和TIMPs处于一种相对平衡的状态[8]，如果这种平衡被打破，细胞就会出现病理学表现。有研究[9]表明，TIMP-1会干扰由某些因子的受体复合
物介导的凋亡作用，并能阻止病变发展和促进组织修复。由此可以推测，通过TIMPs调控MMPs有可能逆转β-DG的异常表达，从而影响SACC的侵袭和转移，这为治疗SACC提供了新思路。本研究中，ACC-M和ACC-2两种细胞株的β-DG表达均为阴性，经GM6001干预后，ACC-M和ACC-2的细胞膜均出现了棕黄色的β-DG表达区域，这说明GM6001能够抑制SACC中β-DG的断裂，而且对β-DG的调控是通过抑制MMPs对基底膜的降解实现的。本研究还比较了不同浓度的GM6001干预ACC-2和ACC-M细胞株24 h后β-DG表达的变化，结果提示，低转移细胞株ACC-2在10、15、25 μmol·L-1的GM6001调控下，β-DG表达较高转移细胞株ACC-M为高，说明GM6001对ACC-2中异常β-DG的调控作用比ACC-M明显，其机理还需后续的研究来证实。
本实验分别从细胞和组织水平展开研究，检测到SACC中β-DG表达缺失，通过GM6001的调控，ACC-M和ACC-2两种细胞株均可恢复β-DG的表达。本研究证实了GM6001能够逆转SACC中β-DG的表达，为治疗SACC提供了参考，但其机理还需要进一步研究。
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