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牛血清白蛋白范文1
【关键词】荧光光谱法 可卡因 牛血清蛋白 相互作用
【Abstract】Objective To study the interaction of bovine serum albumin（BSA） with cocaine at different temperature and mechanisms underlying.Methods The quenching of fluorescence was determined by measuring fluorescence quenching spectra and synchronous fluorescence spectra of BSA interacted with cocaine.The type of binding foece was estimated according to the themodynamic equation.Results The fluorescence of BSA interacted with cocaine was quenched regularly .The values of binding constants（Ks）to be 1.38×103 L/mol （30℃），and6.19×103 L/mol （37℃），amounts of binding sites（1），and themodynamic parameters（ΔH： 167.44 KJ/mol，ΔS： 612.71J/mol・K ，ΔG： -18.21 KJ/mol（30℃）and-22.50（37℃））were obtained by analyzing and processing the fluorescence quenching data according to Stern-Volmer equation， Lineweaver-Burk equation and themodynamic equation，respectively.Conclusion It was shown that the fluorescence quenching process of BSA with Cocaine was attributed to static quenching. The force of the reaction was mainly due to hydrophobic action.
【Keywords】Fluoro-spectroscopy； Cocaine；Bovine serum albumin；Interaction
可卡因 （ cocaine） 化学名为苯甲酰甲基芽子碱 ，又称古柯生物碱。导致其滥用的主要原因是其强烈的中枢神经系统兴奋作用（ 欣） [1]。可卡因的滥用可导致机体多个系统、脏器的损伤[2]，严重者可诱发心律紊乱、全身抽搐、呼吸衰竭而致死。对于长期小剂量滥用所致的慢性中毒，主要是心理依赖性反应， 生理依赖很轻[3]。
血清白蛋白是人和动物血清中含量最丰富的一种蛋白质，与各种带正电荷的物质及电中性物质均有一定程度的相互作用。各类药物进入人体首先与血清白蛋白结合，通过血浆的存贮和运输，到达受体部位产生药理作用[4]。研究各种药物与血清白蛋白的结合，来获取药物分子对蛋白质分子构象的影响以及药物的药理等有用信息，已经引起了生命科学、化学、药学及临床医学科研工作者的普遍关注。目前研究生物大分子与药物小分子相互作用的方法主要有荧光光谱法[5]、紫外光谱法[6]、圆二色谱法[7]、拉曼光谱法[8]、电化学法[9]和核磁共振法[10]等。
荧光光谱法是研究生物大分子与药物小分子化合物之间相互作用很有效的方法，发射峰的位置、荧光偏振、能量转移、荧光寿命等指标均可以对蛋白质中荧光发色团的结构及其所处的微环境提供有用的数据信息[11]。
本文采用荧光光谱法，在模拟生理条件下，定性研究可卡因与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用机理，分析其作用力类型，确定其结合常数和结合位点数，再通过同步荧光法确定可卡因对BSA构象的影响方式，进而分析可卡因对人体的作用和运转代谢情况，获得蛋白质分子的构象及其变化和可卡因的药理效应等信息。
1实验部分
1.1仪器与试剂
1.1.1仪器
Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer型荧光分光光度计（Aglient Technologies）；FA1104N电子分析天平（上海恒平科学仪器有限公司）；HH-2数显恒温水浴锅（上海叶拓仪表有限公司）。
1.1.2试剂
牛血清白蛋白（BR，国药集团化学试剂有限公司）；盐酸可卡因（BR，公安部物证鉴定中心）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）（BR，国药集团化学试剂有限公司）；盐酸（HCl）（AR，上海久亿化学试剂有限公司）；氯化钠（NaCl）（AR，西陇化工股份有限公司）。
1.1.3溶液配置
牛血清白蛋白（BSA）标准储备溶液：准确称取纯度大于99%的牛血清白蛋白0.335g于50ml容量瓶中，以pH =7.4的0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲液（其中含0.1mol/L NaCl维持离子强度）定容为50ml，浓度为1.0×10-4mol/L，低温（≤4℃）保存于冰箱。
可卡因标准储备溶液：用电子天平准确称取4mg标准品于100ml的容量瓶中，以pH =7.4的 Tris-HCl缓冲液（其中含0.1mol/L NaCl维持离子强度）溶解并定容，浓度为40.0μg/mL，低温（≤4℃）保存于冰箱。
实验时所需浓度由Tris-HCl缓冲溶液（ pH =7.4，内含0.1mol/L NaCl维持离子强度）稀释而得。所用试剂均为分析纯，实验用水为怡宝纯净水。
1.2实验方法
于编号为 0-7的4mL离心管中分别加入2mL 1.0×10-4mol/L的BSA溶液， 使用移液枪分别加入的40mg/L 盐酸可卡因工作液0、10、20、30、40、50、60、70 μL，充分摇匀，并分别在T=30℃和T=37℃的条件下恒温水浴1h 。采用1cm石英比色皿，选择激发波长为292.03 nm ，狭缝宽度均为5nm ，光电管负高压为400V，扫描速率1200nm/min，扫描并绘制300-500 nm 的荧光光谱，以及固定荧光激发与发射的波长差λ=15nm和λ=60nm的同步荧光光谱。
2结果与讨论
2.1 荧光猝灭光谱
按照实验方法分别测定了30℃、37℃ 温度下不同浓度的可卡因对牛血清白蛋白的荧光猝灭光谱，30℃ 时的猝灭光谱见图1。由图1可知，随着可卡因浓度的逐渐增加，牛血清白蛋白的荧光特征峰逐渐降低。这是由于BSA中存在的色氨酸和酪氨酸，使其具有内源荧光[12]，当固定BSA的量而不断增加可卡因的浓度时，可卡因与BSA之间的相互作用导致BSA内源荧光强度有规律性的猝灭。
2.2 荧光猝灭机理及猝灭常数的测定
引起BSA荧光猝灭的原因可能有动态猝灭和静态猝灭两种。动态猝灭过程遵循 Stern-Volmer 方程[13]：
F0/F = 1 + Ksv[Q] = 1 + Kqτ0[ Q ] （1）
式中，F0和F表示不存在和存在猝灭剂时荧光物质的荧光强度，[Q]为猝灭剂的浓度， Ksv为动态猝灭常数（又称为 Stern-Volmer 猝灭常数）， Kq 是由扩散过程控制的双分子动态猝灭速率常数。τ0为没有猝灭剂存在下荧光分子平均寿命，生物大分子荧光寿命约为10-8s[14]。
静态猝灭过程遵循下式：
F0/F = 1 + Ks[Q] （2）
式中，Ks是静态猝灭常数（即配合物的缔合常数）。随温度升高动态猝灭常数增大，而静态猝灭常数减小，可由此判断荧光猝灭类型。
以F0/F对相应的[Q]作图，得到可卡因对BSA之间猝灭的 Stern-Volmer 曲线，继而得到不同温度下可卡因对BSA荧光猝灭的 Stern-Volmer 方程。由 Stern-Volmer 方程得到在30℃和37℃时 Ksv分别为：Ksv30 =2.1162×104 ； Ksv37 =1.3099×104 。
由于生物大分子的荧光寿命约为10-8s，由方程：
Ksv = Kqτ0 （3）
可以得到不同温度下的可卡因和BSA之间猝灭过程的速率常数 Kq数量级均为1012。Kq大于各类猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭速率常数2.0×1010 L/mol？S[15]，所以加入可卡因导致BSA荧光猝灭不是由动态碰撞引起的，可以初步判断猝灭过程是以静态猝灭为主，而随温度升高，Stern-Volmer 方程的斜率（即动态猝灭常数）逐渐减小，进一步表明猝灭过程是以静态猝灭为主。
2.3 结合常数及结合点数的测定
当小分子与大分子结合时，其表观结合常数K与结合位点数n可由下式求得[16]：
K + n （4）
式中：K为结合常数；n为结合点数。
对30℃和37℃时的lg[（Fo-F）/F]-1-lg[Q]-1作双对数图，如图3。
根据截距和斜率求得不同温度下的结合常数K和结合点数n（见表1）。由表可知在实验条件下结合位点数n接近1，说明盐酸可卡因与BSA可形成1个结合点数。而在30℃和37℃时的K值处于同一数量级，则更加印证了可卡因对BSA的猝灭方式为静态猝灭。
2.4 BSA与可卡因结合反应的热力学参数和作用力的确定
分子间的作用力包括氢键、范德华力、静电引力、疏水作用力等4种。当温度变化不大时，反应的焓变ΔH可认为是常数。根据反应前后的热力学参数焓变H和熵变S的相对大小， 可以确定分子间的相互作用力类型： 当H0时为疏水作用力[5]。由热力学公式： （5） （6） （7）
结合K，分别计算出不同温度时可卡因与BSA作用的自由能变ΔG、焓变ΔH和熵变ΔS（结果见表2），可得30℃，37℃时的可卡因和BSA的热力学参数ΔH均为167.44KJ/mol，自由能变（ΔG）分别为-18.21，-22.50KJ/mol，ΔS均为612.71J/mol・K。
根据Ross等总结出的判断生物大分子与小分子结合力性质和生物大分子自身结合力性质的热力学规律[17]，推断出可卡因与BSA之间的作用力以疏水作用力为主。
2.5 同步荧光光谱
对于蛋白质的同光荧光光谱，λ=15nm时仅表现为酪氨酸残基的荧光，λ=60nm时则显示色氨酸残基的荧光。因芳香族氨基酸残基的最大发射波长与所处环境极性有关，若其最大发射波长改变，说明残基所处的微环境发生了改变，由发射波长的改变可判断BSA中芳香氨基酸残基所处微环境的变化[12]。
由λ为15nm和60nm的同步荧光光谱（如图4）可知，酪氨酸残基和色氨酸残基的特征荧光光谱峰均随可卡因浓度的增加而产生猝灭，但对酪氨酸和色氨酸特征峰的位置影响不大，表明可卡因对牛血清蛋白构象的改变不大[18]。相比之下，色氨酸残基荧光猝灭程度比酪氨酸残基更显著，表明结合位点更接近于色氨酸残基。
在可卡因与牛血清白蛋白相互作用的过程中，随可卡因浓度升高，牛血清白蛋白的荧光强度呈有规律下降。在可卡因对牛血清白蛋白的荧光猝灭过程中，随温度升高，猝灭常数降低，猝灭方式为静态猝灭。两者以物质的量比1：1结合，作用力类型为疏水作用力；同步荧光扫描结果显示，可卡因对牛血清白蛋白的构象影响不大，两者的结合点可能位于色氨酸上。
3 结语
本文采用荧光光谱法研究可卡因与牛血清白蛋白之间的相互作用。结果表明：可卡因对BSA的荧光猝灭为静态猝灭，两者相互作用的结合常数K分别为1.38×103 L/mol （30℃）和6.19×103 L/mol （37℃）、结合位点数n为1、热力学参数ΔH、ΔS、ΔG分别为167.44KJ/mol、612.71J/mol・K、-18.21 KJ/mol（30℃）和-22.50 KJ/mol（37℃）。根据分子间相互作用力和热力学参数间的关系，可推断两者的相互作用力主要是疏水作用力。从同步荧光光谱法可知：由于两者之间的反应，BSA的荧光强度显著降低，并推测可卡因和BSA的结合点位于色氨酸残基上。
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牛血清白蛋白范文2
1结果与分析
1.1BSA与AP-AuNPs的物理吸附结果电泳检测蛋白质可以通过物理作用吸附在纳米颗粒表面。从图1可以看出，从左至右，随着BSA浓度的增加，BSA与AP-AuNPs的吸附量也随之增多。通过与纯的AP-AuNPs相比较我们认为，图中与AP-AuNPs在同一水平位置的条带为没有吸附上BSA的AP-AuNPs，图中微滞后的条带为吸附上一条BSA的AP-AuNPs。选取吸附1个BSA的样品进行分析。
1.2蛋白酶K酶切AuNPs-BSA的电泳检测结果本文中选取蛋白酶K(proteinaseK,ProK)对吸附在AP-AuNPs表面的BSA进行酶切。与AP-AuN-Ps-BSA相对比，随着ProK浓度的增加，AP-AuNPs-BSA的迁移率逐渐的增大，但最终还是小于AP-Au-NPs的迁移率，说明吸附结合在AP-AuNPs表面的BS段随着ProK浓度的增加而减少，但是还是有部分BSA的片段吸附在AP-AuNPs的表面，没有受到ProK的酶切(图2)。
1.3SDS洗脱及吸附在AP-AuNPs表面肽段的PAGE胶鉴定十二烷基硫酸钠(SDS)是一种阴离子表面活性剂。用10%的SDS对AP-AuNPs-BSA(酶)进行处理。通过2%的琼脂糖凝胶电泳我们看出，10%的SDS可以将吸附在AP-AuNPs表面的蛋白片段洗脱下来(图3A)。然后将洗脱后的样品进行SDS-丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳，来对洗脱下来的蛋白多肽片段进行鉴定。从图3B中我们可以看出，经过SDS洗脱的后的样品中，在分子量约26kD处，有一条带出现，经与其它的样品比较，我们认为，该条带则为吸附在AP-AuNPs表面的BS段。
2讨论
本实验选取BSA与AP-AuNPs通过简单的物理吸附作用结合在一起，通过琼脂糖凝胶电泳结果可以看出，BSA可以稳定地吸附在AP-AuNPs的表面。在经过蛋白酶K酶切的电泳结果可以推测，BSA稳定的吸附在AP-AuNPs的表面是BSA中的一段氨基酸序列吸附在AP-AuNPs的表面所导致的。在经过SDS洗脱及SDS-PAGE电泳结果证明，BSA与AP-AuNPs是通过BSA的一段固定的多肽序列结合在AP-AuNPs所到导致的。该实验结果的发现，对于功能化的纳米颗粒在生物体内高效、稳定的应用奠定了坚实的基础。
3材料与方法
3.1AP合成AP合成的方法参照文献(Zhangetal.,2011)。简要概述：称取3.084g(15mmol/L)的聚异丁烯马来酸酐置于500mL的圆底烧瓶中，2.7g(15mmol/L)的十二胺干粉溶于100mL的四氢呋喃后与聚异丁烯马来酸酐混合，超声，使得溶液完全澄清。将混合液55~60℃加热、搅拌1h。用旋转蒸发仪将溶液浓缩到30~40mL后搅拌、过夜。次日，将溶液完全抽干，加入40mL的氯仿重新溶解。最终得到单元结构浓度(Cmononier)为0.5mol/L的两性聚合物。
3.2有机相AuNPs的合成合成方法参照文献(Linetal.,2008)。简要描述：称取2.17g四辛基溴化铵溶于80mL的甲苯中。称取300mg氯金酸溶于25mL的超纯水中。将两者混合至分液漏斗中，轻微震荡后弃水相，将有机相转移到圆底烧瓶中。称取334mg硼氢化钠溶于25mL的超纯水中，并迅速的加入到有机相中，搅拌60min后转移到250mL的分液漏斗中，分别加入NaCl、NaOH洗涤3次，弃水相后在转移到250mL的圆底烧瓶中，磁力搅拌，过夜。加入10mL十二烷硫醇，65℃水浴加热，搅拌3h。分装在40mL的小瓶中，2000r/min离心5min，收集上清。加入等体积的甲醇，2000r/min离心5min，弃上清，晾干，加入氯仿重新溶解。
3.3AP包裹AuNPs包裹的方法参照文献(Zhangetal.,2011)。简要概述：根据每个AuNP的有效表面积每平方纳米含有200个polymer单元结构比例混合。每个AuNP的有效表面积的计算方法为：Aeff=4•仔•(deff•2-1)2，其中的deff为油相纳米金颗粒的有效动力学直径。由于AuNP和polymer的体积小，密度大，使得它们在溶液中分布比较密集。由于氯仿挥发的太快，在进行真空抽气时不能够将polymer均匀的包裹在AuNP表面。在进行包裹时，先加入少量的氯仿有利于将polymer均匀的包裹在AuNP表面，真空抽气直到将氯仿全部抽干。加入适量的SB12缓冲液进行搅拌，直到混合物完全溶解且澄清。这样就将油相的AuNP转移至水相中(AP-AuNP)。
3.4BSA与AP-AuNPs的物理吸附实验取PCR管分别编号1~10，按表1中比例加入AP-AuNPs与BSA混匀，反应体系为30滋L，不足由超纯水补齐。室温下反应30min。
牛血清白蛋白范文3
[关键词] BrdU；免疫组织化学染色；胰酶抑制剂；牛血清白蛋白；漂片法
[中图分类号] R392-33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）02（b）-0016-03
Improvement in technique of BrdU immunohistochemical staining by bleach section
GUO Jingjing1 SHAN Lidong2 WU Gang3
1.Department of General Surgery, Huashan Hospital Baoshan Branch of Fudan University, Shanghai 200431, China;
2.Department of Neurobiology and Medical Psychology, School of Preclinical Medicine and Biological Sciences,Medical School of Suzhou University, Jiangsu Province, Suzhou 215123, China;3.Department of General Surgery, Huashan Hospital Affiliated to Fudan University, Shanghai 200040, China
[Abstract] Objective To reduce the tissue slice breakage, explore the technique of 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) immunohistochemical staining by blocking buffer in bleach section. Methods BrdU, which was detected by ABC immunohistochemistry on bleach section of brain slides, was used to incorporate the new born cells which were promoted proliferation by motor-driven wheel running. The different blocking effects of Goat serum, trypsin inhibitor and bovine serum albumin were compared in the process of immunohistochemistry. Results In the group of motor-driven wheel running in the dentate gyrus of the hippocampus in rats, the number of BrdU-positive cells was more than the control group. The breaking rate of slides was reduced obviously, especially in the groups with bovine serum albumin and trypsin inhibitor, after being added different blocking reagents. But cells in trypsin inhibitor group were appeared without specific staining. Conclusion Bovine serum albumin is preferable blocking buffer.
[Key words] BrdU; Immunohistochemical staining; Trypsin inhibitor; Bovine serum albumin; Bleach section
5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU）是胸腺嘧啶核苷的类似物，在细胞周期的S期掺入到增殖或分裂细胞的核内，只要细胞不消亡，BrdU 将永久地存留在胞核DNA 中，且在体或离体都能通过免疫组织化学的方法检测到，可用于标记BrdU暴露期间进行DNA合成的细胞[1]。故BrdU阳性细胞可被看作是具有增殖活性的细胞。
1 材料与方法
1.1 材料
动物：SD大鼠，雌雄不拘，体重220~230 g，苏州大学实验动物中心提供。试剂：BrdU（ Roche Diagnostic Co.）。
1.2 分组
踏转轮运动对成年大鼠海马齿状回细胞增殖的影响。实验分两组，①踏转轮运动组：转轮速度为10 m/min，每天训练2次（09:00，15:00），每次训练30 min，连续6 d；②对照组：动物置于转轮中，速度为0。放置次数与时间同运动组。在染色过程中每一组又分为三个亚组，分别为加入羊血清组、胰酶抑制剂组和牛血清白蛋白组。
1.3 BrdU标记
踏转轮运动的第4天开始给药，于每次运动前1 h腹腔注射BrdU（50 mg/kg，美国ROCHE公司），2次/d，连续3 d。末次给药后24 h处死动物，从前囟后3.3~5.1 mm作连续冰冻切片，进行BrdU染色。
1.4 BrdU免疫组织化学
切片经2 mol/L HCl（室温30 min）变性， 用0.01 mol/L PBS 充分漂洗后转入0.1%胰酶中（37℃ 15 min）消化后，0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），分别加入羊血清组、胰酶抑制剂组和牛血清白蛋白组，室温下30 min, 然后加入小鼠抗BrdU单克隆抗体（1∶200，Biosource）室温孵育16 h，0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），转入羊抗小鼠二抗（1∶200，Vector）室温孵育2 h，再用0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），移入亲和素生物素试剂（avidin-biotin complex，ABC，1∶200）室温孵育2 h，最后用含0.03% H2O2的0.05% DAB显色3~5 min， 0.01 mol/L PBS终止显色。常规脱水、透明、封片。镜检BrdU阳性细胞计数。
1.5 统计学方法
随机选取每只大鼠位置相同的5张不连续切片，光学显微镜下（×200）计数每张切片双侧海马齿状回颗粒细胞层（granular cell layer，GCL）免疫反应阳性细胞数。阳性细胞的均数作为统计数据，以均数±标准差（x±s）表示。用SPSS 10.0软件作方差分析（one-way ANOVA）检测组间差异性。
2 结果
2.1 踏转轮运动对成年大鼠齿状回细胞增殖的作用
经过6 d的踏转轮运动训练后，各组BrdU阳性细胞见图1。免疫组织化学结果显示，海马齿状回BrdU阳性细胞数，对照组为（22.55±1.91）个/切片，踏转轮组为（57.89±1.90）个/切片，两组相比差异有高度统计学意义（P < 0.001）。由此可见，踏转轮运动可增加BrdU阳性细胞，促进齿状回细胞增殖。
a、a′为对照组， b、b′ 为踏转轮组。a、b分别是a′、b′的高倍视野
图1 踏转轮运动6 d后海马齿状回BrdU阳性细胞数
2.2 不同的封闭液对组织片染色效果的影响
末次给药后24 h处死动物，从前囟后3.3~5.1 mm作连续冰冻切片，将切片随机分成三组。在染色过程中，这三组分别加入羊血清、胰酶抑制剂和牛血清白蛋白作为封闭液和终止胰酶作用的抑制剂。各组BrdU阳性细胞如图2所示。免疫组织化学结果显示，三种方法均能使BrdU着色，但各组的本底颜色和非特异性着色程度不同：羊血清组中虽然阳性细胞与非特异性着色细胞有明显区别，但非特异性着色细胞显色度较深，且遍布整个视野。胰酶抑制剂组阳性细胞与非特异性着色细胞也有明显差异，而且非特异性着色细胞显色度较浅，整个本底相对较为干净、清爽。牛血清白蛋白组几乎见不到非特异性着色细胞，本底颜色非常淡。
除了本底颜色和非特异着色的观察外，笔者还重点观察了组织切片的破损情况。实验结果显示：牛血清白蛋白和胰酶抑制剂组无切片破损，而羊血清组有少部分脑片破损。细胞计数显示：羊血清组为（23.22±2.38）个/切片，胰酶抑制剂组为（22.54±2.12）个/切片，牛血清白蛋白组为（23.14±3.12）个/切片，各组间差异无统计学意义（P > 0.05）。
3 讨论
自从20世纪末神经干细胞发现以来，其目前已经成为神经科学研究的热点之一。而研究在体或移植后的神经干细胞的增殖、迁移、分化中常用的标记新生细胞的方法有BrdU、3H、Ki-67、 PCNA（proliferating cell nuclear antige）[2-3]，前两者在细胞增殖时整合入细胞以后，即使在细胞静止期仍能表达；后两者是细胞增殖过程中表达的内源性蛋白，当细胞处于静止期时，它们并不表达。因此，BrdU和3H是常用的追踪细胞的标记物，而BrdU的检测又较3H更为方便、简单，所以BrdU是最为常用的标记细胞增殖的标记物。
丰富环境对神经发生有影响，而在各种环境因素中，运动对其影响较为显著[4-5]。本课题的前期研究建立了踏转轮运动的模型[6]，并发现运动对神经发生的作用具有强度依赖性，这早于国内外的相关报道[7-8] 。故本课题选用运动作为促进细胞增殖的方法，观察了不同的染色方法对切片及结果的影响。
组织切片BrdU染色时，常用的方法有贴片法和漂片法。漂片法与贴片法相比有一定的优点：前者能使抗体从两侧渗透，更有利于抗体与抗原充分反应，相应的在洗片时，也能使未结合的抗体充分漂洗干净；漂片法比贴片法所使用的抗体数量少，而且必要时抗体还可以回收，重复利用。标本量大时，漂片法比贴片法更省时、省力。但是，用漂片法进行BrdU染色时，由于在加入抗体前要用盐酸和胰酶对脑片进行预处理，经过处理（尤其是胰酶处理）后，进行染色的脑片极易破损，从而导致整个染色过程无法正常完成，或最终所得到的脑片极少。因此，在本实验中针对胰酶的消化作用，笔者分别选用了与二抗同源的羊血清、牛血清的主要成分白蛋白（牛血清白蛋白）及胰酶抑制剂来抑制（或终止）胰酶的消化作用。
羊血清是免疫组织化学中常用的封闭液，但是，在本实验中并未取得预期的成果，虽然羊血清能终止胰酶的消化作用，但并未能有效地封闭非特异性染色。其原因目前仍不清楚，有待进一步研究。胰酶抑制剂（取自火鸡蛋清）组和牛血清白蛋白组非特异性染色较少，尤其是牛血清白蛋白组。其原因可能是二者的成分单一，纯度较高。
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牛血清白蛋白范文4
【关键词】 脑梗死 脑卒中 小牛血清去蛋白注射液
脑梗死作为临床常见的突发病，目前尚无有效的治疗方法，其发病率和致残率极高，严重威胁着人们的健康，小牛血清去蛋白注射液对脑细胞缺血缺氧具有保护作用，其主要成分为磷酸肌醇寡糖和小分子激活肽［1］，其通过增强脑代谢储备力，延长细胞生存时间，可以持续多靶点抑制缺血瀑布的启动和运行，并能抑制缺血再灌注损伤，同时能够促进神经细胞的修复。本文对我院2006年10月-2007年11月应用小牛血清去蛋白注射液治疗脑梗死进行了观察，旨在探讨小牛血清去蛋白注射液治疗脑梗死患者的疗效及对患者运动功能和日常生活能力康复的影响。
1 资料与方法
1.1 病例入选标准
(1)发病1周内的颈内运动系统脑梗死患者，诊断符合全国第四届脑血管疾病会议通过的诊断标准［2］，均经螺旋CT或核磁共振检查证实，肌力4级以下(包括4级)，FMA(Fugl-Meyer Assessment)的上下肢运动功能评分总分≤50分；(2)年龄在30岁以上，首次发病或过去发病未留下神经功能缺损者；(3)无严重并发症及严重认知功能障碍和智力障碍者。
1.2 分组与治疗
符合入选条件的入院病例共74例，按入院日期分为研究组和对照组，其中研究组38例，对照组36例。两组患者治疗前基础情况相似，具有可比性；两组病人均给以抗凝、降血压、溶栓等基础治疗，研究组在基础治疗上加用小牛血清去蛋白注射液20mL溶于生理盐水250mL中静脉滴注，1次/日，2周为1个疗程。对照组加脑蛋白水解物20mL溶于生理盐水250mL中，1次/日，2周为1个疗程。如出现消化道症状及颅高压等严重并发症时可对症治疗，有高血压、冠心病、糖尿病者可继续服用相应的药物。
1.3 疗效评定
采用1995年全国第四届脑血管病会议制定的评定方法［2］；(2)临床神经功能缺损程度评分(Mess)：采用1995年第四届全国脑血管病学会议制定的脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分草案及治疗判断标准［2］进行评定；(3)偏瘫的运动功能评定采用Fugl-Meyer运动功能(FMA)评分法［3］：上肢FMA最高分为66分，下肢FMA为34分，上下肢运动总分为100分。
1.4 统计学方法
数据以(±s)表示，采用χ2检验。
2 结果
2.1 两组患者的疗效比较(表1)
研究组治疗有效率高于对照组(χ2=5.01，P＜0.05)。
表1 两组患者的疗效比较（略）
与对照组比较χ2=5.01，P＜0.05
2.2 两组患者治疗前后神经功能缺损程度评分比较(表2)
神经功能缺损程度评分研究组和对照组患者治疗后均低于治疗前，对照组又明显低于治疗组(P＜0.05或0.01)。
表2 两组治疗前后神经功能缺损程度评分比较（略）
与治疗前比较 P＜0.01，两组比较*P＜0.05
2.3 两组患者治疗前后FMA评分的比较 (表3)
研究组患者治疗后上下肢FMA评分均高于治疗前(P＜0.01或0.05)，对照组治疗后上肢FMA评分高于治疗前(P＜0.01)。
表3 两组治疗前后FMA评分比较（略）
与治疗前相比P＜0.01；两组比较*P＜0.05
2.4 不良事件和副反应
两组在治疗过程中均未发现不良事件和副反应。治疗前后患者的肝肾功能及血尿常规无明显变化，心电图亦无明显的改变。
3 讨论
脑梗死是临床常见病，其发病率和致残率极高，严重威胁着人们的健康。脑卒中后如何促进中枢神经系统(CNS)功能恢复一直是人类研究的课题，PET和MRI的出现，使大脑和脊髓的可塑性和功能重组得到了客观的证据，证明了神经元的内在发育特性和内部微环境是主要的内因，而外部环境的丰富，中枢神经刺激和药物是主要的外因［4］。
小牛血清去蛋白注射液主要成分为磷酸肌醇寡糖(IPOS)和小分子激活肽。药理研究表明：小分子激活肽是神经细胞蛋白质合成的主要成分，通过激活细胞代谢S6激活酶的活性，促进缺氧状态下神经细胞的修复和再生［5］。另外一个主要成分磷酸肌醇寡糖能够激活葡萄糖载体，能促进葡萄糖向细胞内转运，并且通过特殊的IPOS载体使得IPOS也可以进入细胞内，从而纠正能量代谢障碍；可以增加线粒体的呼吸能力和高能磷酸的合成而促进细胞对氧的利用，从而促进能量物质ATP的生成。它能使神经细胞由糖酵解的代谢途径转变为糖有氧氧化的途径，纠正缺血神经细胞的酸中毒，增强脑代谢的储备能力，延长细胞的生存时间。
小牛血清去蛋白注射液能够减轻脑缺血后再灌注损伤。通过抑制一氧化氮合成酶(eNOS)的活性，从而降低NO的过多形成，进而延迟脑缺血后的细胞毒性水肿，延缓脑缺血损伤的进程［6］。基础试验表明，小牛血清去蛋白注射液能够显著减少大脑皮层含水量，同时，使氧自由基破坏反应的产物丙二醛显著减少［7］，说明小牛血清去蛋白注射液能够减少氧自由基的生成。
本研究结果显示，应用小牛血清去蛋白注射液治疗脑梗死疗效确切，其总有效率为92.11%，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。我们在研究中还发现小牛血清去蛋白注射液能够改善脑梗死患者的日常生活能力，提高生活质量，降低患者的致残率，并且能促进脑梗死后神经功能的恢复，对脑梗死的康复具有增强作用，在治疗过程中无不良反应，不失为脑卒中后神经功能恢复新的途径。
参考文献
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牛血清白蛋白范文5
【关键词】 中药活性成分； 牛血清白蛋白； 甘草次酸； 药物-药物相互作用
Abstract：ObjectiveTo evaluate the influence of glycyrrhetinic acid (GA) on the binding of active ingredients of Chinese herbs with serum albumin. MethodsSpectroscopic method and capillary electrophoresis frontal analysis were utilized to determine the binding data. Stern-Volmer equation and Scatchard plot were used to process the data. ResultsBinding constant and sites etc of GA with BSA were got. Binding constants of active ingredients of Chinese herbs and influence of GA on the binding of them were aslo obtained. ConclusionThere are two kinds of binding sites (high and low) in BSA while binding with GA and the total binding sites are eight. The binding percentages of GA are up to 95% when the ratio of BSA to GA is 0.38. In the presence of GA， binding constants of active ingredients of Chinese herbs decrease up to 67%， which may exert an influence on their pharmacological action
Key words：Active ingredients of Chinese herbs; Bovine serum albumin; Glycyrrhetinic acid; Drug-drug interaction
近年来，中药活性成分与血清白蛋白结合的研究已经出现热潮，如，桑色素［1］， 岩白菜素［2］， 芒果苷［3］， 大黄素［4］等。然而绝大多数研究以获得活性成分的结合特征为目的，只有极少数研究探讨中药活性成分相互之间对结合的影响。如中国药科大学李萍研究小组最近对中药汤剂的整体成分与血清白蛋白的结合进行了研究，发现当归补血汤成分间对各自与BSA的结合有显著影响［5］，在金银花整体活性物质与牛血清白蛋白相互作用中，绿原酸等3种成分在整体成分与BSA结合时比单个成分与BSA结合程度低，而咖啡酸、芦丁则相反［6］。可见，中药活性成分与蛋白结合时相互之间确实存在协同效应。甘草是最常用的中药之一，也是常用食品添加剂；甘草中甘草酸含量较大（3%～10%）［7～9］，是甘草中最具特色的活性成分之一；甘草酸在体内代谢后以甘草次酸的形式吸收进入血液。因此，本文研究了甘草次酸对中药活性成分与血清蛋白结合的影响，尝试从成分之间血浆蛋白结合的协同效应（药物-药物相互作用）探讨甘草的配伍规律，同时对甘草及相关药物的安全、合理用药提供参考。
1 仪器与材料
1.1 仪器
F-4500型分子荧光分光光度计（Japan，Hitachi）；Tu-1800SPC型紫外-可见光分光光度计(北京普析公司)；1cm石英比色皿；微量注射器；微型旋涡混合器，精密天平（Germany，Sartorius），pHS-3酸度计。J-810圆二色分光光度计（Japan，Jasco）；彩陆毛细管电泳系统（北京，中科院化学所），配紫外检测器和HW-001色谱工作站（中国，千谱软件有限公司）；未涂层石英毛细管，52 cm ×50 μm i.d.，有效长度为44 cm（中国河北永年光学纤维公司）；超滤管，截留分子量15 000（PALL FILTER CO.， LTD， USA）；TGL－16型高速台式离心机（湘仪）。
1.2 试剂
牛血清白蛋白（Roche），以水配成2.0×10-5 mol/L的储备溶液，4 ℃保存备用；18β－甘草次酸（GA，≥97%，Fluka， product of Spain）；槲皮素、金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、山萘酚、大黄酸、大黄素对照品，购自中国药品与生物制品检定所（中国北京）；甲基莲心碱（由中南大学湘雅医院药剂科刘韶惠赠，HPLC纯度大于98％）；中药活性成分均以90%甲醇配成2.5×10-3 mol/L的溶液；pH 7.40的Tris-HCl缓冲溶液；Tris（淮安和元化工有限公司），氯化钠二水磷酸二氢钠（河南焦作），盐酸（湖南师范大学化学试剂厂）。除已标明者外，试剂均为分析纯；水为双重蒸馏水。
2 方法
2.1 光谱实验方法
2.1.1 荧光猝灭方法
在10 ml 容量瓶中依次加入2 ml 0.50 mol/L NaCl 溶液、2 ml pH 7.40 的Tris-HCl 缓冲溶液、2 ml BSA储备溶液，以水定容为10 ml， 摇匀， 在一定温度下静置30 min。取该溶液1 ml于石英比色皿中，依次加入一定体积的中药活性成分溶液（加入总量＜0.03 ml)，旋涡混匀。经指定温度下恒温放置3 min后，在280 nm的激发波长下，扫描290～420 nm荧光光谱。在相同条件下，测其紫外光谱。甘草次酸对中药活性成分的影响是在蛋白中先加入GA，然后按照上述方法进行。在实验条件下活性成分在290～450 nm范围内吸收很小，荧光内滤作用可以忽略，故直接对数据进行处理，结果为3次平行实验的平均值。
2.1.2 圆二色（CD）谱方法
光源系统用氮气保护(流量为5 L/min)，样品池的光径为0.1 cm。测量参数：扫描速率100 nm/min。分辨率0.1 nm，响应时间1 s，累积次数3次，扫描波段为190～250 nm，BSA浓度为2×10-6 mol/L，实验时向BSA中分别加入不同量的甘草次酸，混合均匀后测量，得到其CD谱。
2.2 毛细管电泳前沿分析（CE-FA）方法
CE运行缓冲是pH 7.40，67 mmol/L的磷酸钠，由适量的二水磷酸二氢钠溶解于水，然后在pH计上用2 mmol/L NaOH调节到指定的酸度，再经过0.45 μm滤膜过滤。BSA储备液（200 mmol/L）是通过溶解适量的BSA粉末于运行缓冲中得到，并于4度冰箱保存。工作蛋白由储备液用运行缓冲稀释而得。药物储备液（2 mmol/L）由运行缓冲配制，内含30％（V/V）以下甲醇。药物工作液由其储备液通过运行缓冲稀释而得，其中甲醇含量小于3％（V/V）。药物的标准溶液也用于配制其校准曲线，游离浓度由校准曲线求得。所有测试溶液在应用前进行脱气。
一系列BSA溶液中（20，30，35，40，45，50，55，60 μmol/L） ，加入等量的GA至 160 μmol/L，再加入缓冲至1 ml，涡旋混合30 s。然后在36℃水浴加热孵化2 h，再于室温下平衡2 h。若要进行超滤，则于室温平衡后进行，即取适量平衡液于超滤管，然后16 000 r/min下进行分离，滤液由CE进行测定。试样重复两份，结果取平均值，毛细管电泳在室温下进行。
新毛细管要做预处理，以1 mol/L HCl 冲洗30 min，水冲洗5 min，1 mol/L NaOH冲洗30 min，然后水冲洗5 min，磷酸盐缓冲冲洗15 min。为了获得较好的峰形和迁移时间的重现性，毛细管在每天实验开始按照下列程序进行冲洗和平衡：水冲洗2 min，1 mol/L氢氧化钠冲洗2 min，水冲洗2 min，缓冲冲洗5 min。
在每次测量之间，毛细管以水冲洗2 min，1 mol/L氢氧化钠冲洗2 min，水冲洗2
min，再以缓冲冲洗2 min。在这样的条件下，可以保证消除蛋白的吸附。平衡后的BSA-GA液或超滤液重力进样60 s（毛细管进出口高度差为30 cm）。运行电压为19 kV，常规极性运行，典型电流为85 mA，紫外检测波长为254 nm。
3 结果
3.1 甘草次酸与BSA作用的研究
3.1.1 甘草次酸对BSA 的荧光猝灭光谱甘草次酸在与BSA 作用的过程中能显著地猝灭BSA 的荧光，这种猝灭在GA加入便可迅速观察到，这提示［10］BSA的一个高亲和结合位点位于色氨酸残基的附近。测得297 K甘草次酸对BSA的荧光猝灭光谱见图1。在此过程中，GA/BSA=3时，最大发射峰由341 nm变为最终的337 nm，略有蓝移，显示色氨酸残基所处环境的疏水性增加。并最终移至334 nm，在研究范围内荧光强度下降87.6％，说明GA和BSA发生了结合作用，并使BSA的构象发生了变化。此外，可以观察到色氨酸荧光下降幅度比酪氨酸大。见图1。
3.1.2 荧光猝灭作用的Stern-Volmer分析见图2。图2是根据Stern-Volmer 猝灭方程（方程1）作图，式中，F为有猝灭剂时BSA 的荧光强度， F0为无猝灭剂时BSA 的荧光强度， ［Q］为猝灭剂浓度，KSV 为动态猝灭常数，Kq 为动态荧光猝灭速率常数， 各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大动态荧光猝灭速率常数约为2.0×1010 L·mol-1·s-1［1］；τ0 为无猝灭剂时荧光分子的平均寿命。从图2可见，在pH 7.40时，猝灭呈现两种不同的模式，这表明，GA与BSA的有两类不同的结合位点。由斜率求的前半段（［GA］/ ［BSA］≈3），得在297K，Kq=2.47×1013 L·mol-1·s-1， R=0.999 1；在292 K， Kq=2.26×1013 L·mol-1·s-1， R=0.997 5；在287 K， Kq=2.11×1013 L·mol-1·s-1， R=0.998 8。而GA与BSA浓度比大于3之后也有较好的线性，297 K时Kq为2.74×1012 L·mol-1·s-1。很显然，由于由于各类猝灭剂对生物大分子最大扩散控制的碰撞猝灭常数为2.0×1010 L·mol-1·s-1，而由GA引起的BSA的猝灭速率常数远远大于此值，由此可见，GA对BSA的两类猝灭不是动态而是静态猝灭。
F0/F＝1＋KSV［Q］＝1＋Kqτ0［Q］ ①
3.1.3 结合常数假定小分子在生物大分子上有n个相同且独立的结合位点，则小分子与生物大分子的结合平衡可以由方程②［11］ 表示。
lg(F0-F)/F) =lgK+nlg［Q］②
这里，K表示某类结合位点的结合常数；n表示一个BSA中某类结合位点能够结合的小分子数目，即结合位点数；［Q］表示游离小分子浓度，在研究中通常以其总浓度代替。根据方程②，以低浓度的GA（GA/BSA＜3）进行试验，求得GA的结合常数和结合位点数分别为：在297 K， K =8.28× 105 L·mol-1， n =1.12 (R=0.998 5) ；292 K ，K =1.60× 105 L·mol-1 n =1.04 (R=0.996 0)；在287 K， K =1.60× 105 L·mol-1， n=0.986 (R=0.998 1) 。
CE-FA测定的药物-蛋白结合数据通过Scatchard作图（方程③）进行处理，方程中，r是结合的药物浓度于蛋白浓度的比率，Df是游离药物浓度，K是结合常数，n是一个蛋白分子的结合位点数。药物结合的百分数（PB）用方程④进行计算。
r/Df ＝－Kr＋nK
③
PB (℅) ＝100 (Dt－Df)/ Dt ④
图3是GA与BSA结合的Scatchard作图。图中呈现两类不同的线性，根据Scatchard方程，直线在X轴的截距即为结合的位点数，分别为3.0和5.3，所对应的高低亲和位点的结合常数分别为6.70×105 L·mol-1和5.49×104 L·mol-1，该数值与荧光法的结果相近。160 μmol/L的GA在不同浓度的BSA中的结合率如表1所示。蛋白与药物浓度之比为0.375时，结合率已高达95.2％，因此，可以预测，GA在体内是与血清蛋白高度结合的。表1 GA在不同浓度BSA中的结合百分数 （略）
3.1.4 甘草次酸与BSA结合的热力学参数及作用力药物小分子与生物大分子的作用力包括氢键，范德华力，静电引力，疏水作用力等，药物不同，与牛血清白蛋白作用力类型也不相同。当温度变化不大的时候，反应的焓变可以视作常数，根据van't Hoff热力学方程（方程⑤）可以计算出药物小分子与生物大分子作用间的有关热力学常数：G0=-RTlnK=H0-TS0; lnK=-H0/RT+S0/R ⑤
H0， G0， S0分别表示焓，自由能和熵的变化。根据方程②的结果，在pH 7.40，第一类结合位点的H0 = 117KJ/mol ，S0＝507 J/(K.mol)，H0>0 ，S0>0，可以推断，GA与BSA的结合力在pH7.40是典型的疏水作用［12］
3.1.5 甘草次酸在BSA结合位点的确定血清白蛋白至少有三个特异的高亲和药物结合位点，分别称为药物结合的site Ⅰ～Ⅲ。血清白蛋白的重要结合位点位于site I 和siteⅡ，分别对应于ⅡA和ⅢA亚结构域。许多药物对血清白蛋白的结合具有特异性，如苯基保泰松（PB）结合于site I，氯灭酸（FA）和布洛芬（IB）结合于siteⅢ，地高辛（digitoxin）结合于site Ⅲ，这些药物可以用作位置探针（site-probe）。本试验利用PB、FA和IB作为位置探针，研究GA与这些药物的竞争结合情况。在与BSA等物质的量的PB、FA和IB存在下，利用方程进行计算，相应的结合常数K的数值分别为，1.72×105，R=0.999 6; 9.04×105，R=0.999 2；9.48×105， R=0.994 8。 考虑到在同样条件下，无探针时结合常数K是8.28×105，显然GA与BSA的结合受到PB的影响较大而几乎不受FA和IB的影响。因此，可以推断site I是GA的高亲和结合位点之一。
3.1.6 甘草次酸与BSA结合距离GA的吸收光谱和BSA的发射光谱存在重叠。根据Fster［11］-偶极非辐射能量转移理论。求重叠光谱的积分，J＝8.926×10-15 cm3·L·mol-1。用K2=2/3， N=1.36， Φ=0.15［1］，求得R0＝2.47 nm，而计算得能量转移效率E＝0.514，最后可以得到GA到色氨酸残基的距离r=2.45 nm。r和R0的数值均在理论的范围内，转移的距离r
3.1.7 圆二色谱研究甘草次酸对BSA构象的影响图4是BSA在GA存在下的圆二色谱。由图可见，BSA在210 nm和220 nm附近有明显的负峰，GA加入使峰强度呈现减少的趋势，GA浓度不大时，强度变化不大。根据文献［11］计算方法，得不同GA浓度下BSA中α螺旋的比例的变化情况（表2），结果表明GA加入对BSA构象产生影响，α螺旋的比例下降。表2 GA存在下BSA (2 μmol/L) 中α螺旋的变化（略）
3.2 甘草次酸对中药活性成分与BSA作用的影响用荧光猝灭法对槲皮素、金丝桃苷、芦丁、槲皮苷、山萘酚、大黄酸、大黄素、甲基莲心碱与BSA的结合进行了研究，同时探讨了甘草次酸对活性成分结合的影响。所选取的黄酮（苷）和大黄酸、大黄素等都能明显地猝灭BSA的荧光，猝灭数据直接按照方程①、②、⑥行处理，结果（3次平行试验）列于表3。从表可以看出，黄酮比相应的黄酮苷的结合要强，苷元的结合要比对应的苷的结合强。甘草次酸对黄酮苷的结合有很大的影响，结合常数下降54.6%～67.3%。甘草次酸的存在使山萘酚和槲皮素的结合常数有所下降，而对大黄酸、大黄素和甲基莲心碱的结合常数影响较少。从结合常数看，黄酮苷一般在104，而其它几种物质与GA都为105，可见中药活性成分与GA结合常数的相对大小可能是影响甘草次酸能否对其结合产生影响的一个重要因素之一。故甘草次酸可能对其它中药活性成分的药理作用产生影响。表3 甘草次酸对中药活性成分与BSA结合的影响（略）
(F0-F)-1=F0-1+K-1F0-1［Q］-1 ⑥
4 小结
利用多种光谱技术和毛细管电泳前沿分析方法对甘草次酸与BSA的结合进行了研究，获得甘草次酸与BSA结合的结合常数、热力学参数、作用力类型、位点数等参数，位置探针方法确定GA的结合位点，并通过能量转移确定GA与色氨酸残基的距离，同时以圆二色谱考察GA对BSA构象的影响。结果显示光谱方法获得的结合常数与毛细管电泳前沿分析方法的结果基本一致，但是两种方法在确定位点数时差距较大。结果还表明甘草次酸对中药活性成分与BSA的结合有较大影响，可能对其它中药活性成分的药理作用产生影响。
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牛血清白蛋白范文6
[关键词] 类风湿因子； 胶乳凝集试验； 临床应用
[中图分类号] R446.6 [文献标识码] B [文章编号] 1005-0515（2011）-12-345-01
类风湿因子(rheumatoid factor,RF)是在类风湿性关节炎病人血清中发现。是一种以变性IgG为靶抗原的自身抗体，无种属特异性。主要存在于类风湿性关节炎患者的血清和关节液中，它是一种抗变性IgG的抗体，属IgM型。可与IgGFc段结合。RF有IgG、IgA、IgM等多种Ig类型，以IgM类型多见。检测RF对类风湿性关节炎(RA)的诊断、分型和疗效观察有着重要的意义。
RF是一种主要发生于类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)病人体内的抗人变性IgG自身抗体，可与IgG的Fc段结合。胶乳凝集试验是将变性IgG包被于聚苯乙烯胶乳颗粒上，这种致敏胶乳在与待测血清中的RF相遇时，于一定时间内发生肉眼可见的凝集。
1 对象与材料
1.1 研究对象 1)体检健康组：在本院体检中心体检健康者410例，其中：男性：180例，女性：230例，年龄 25-75 岁。2)类风湿性关节炎组：经临床诊断为类风湿性关节炎的患者42例，其中：男性：9例，女性：33 例，年龄 29-76岁。
1.2 标本采集与保存 空腹采集静脉血3ml，30min后离心分离血清，当日完成检测，或置2-8℃保存，第2天完成检测。
1.3 方法与试剂 手工操作法。类风湿因子(RF)测定试剂盒(胶乳凝集法)。
1.4 试剂主要成份 胶乳液成份：类风湿因子胶乳、牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液；阳性对照成份：羊抗人IgG抗血清、牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液；阴性对照成份：牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液。
1.5 测定原理 胶乳凝集试剂是由纯化的人IgG和羧化聚苯乙烯胶乳共价交联而成的抗原胶乳。RF胶乳超过20U/ml即出现肉眼可见的凝集颗粒。
2 实验与结果
2.1 定性实验 试剂自冰箱取出后恢复至室温(18-25℃)；轻轻混匀胶乳试剂；核对阳性和阴性对照，在反应板孔中加一滴未稀释血清(20ul)；然后加一滴胶乳试剂在血清中；搅匀、轻轻摇动使其充分混合，二分钟后于直射光下观察结果。每次试验均设阳性与阴性对照。
2.2 半定量实验 血清以生理盐水(0.9g氯化钠溶解于蒸馏水中，稀释至100ml)倍比稀释。见表1。
2.3 结果判定 定性实验：2min出现肉眼可见凝集者为阳性(RF＞20U/ml)；无凝集出现者为阴性(RF＜20U/ml)。半定量试验：1:2稀释血清出现凝集者为40U/ml；1:4稀释血清出现凝集者为80U/ml；1:8稀释血清出现凝集者为160U/ml；1:16稀释血清出现凝集者为320U/ml。
2.4 参考范围 正常人血清RF＜20U/ml。
2.5 初步临床应用 在健康体检者的410例测定中，RF出现凝集(＞20U/ml)的19例占4.6%。已确定的42例类风湿性关节炎患者中，RF出现凝集(＞20U/ml)的38例占90.4%。
3 讨论 胶乳凝集法主要是测定IgM类RF(IgG、IgA类RF极少)，据全国临床检验操作规程报道：70%-90%的类风湿性关节炎(RA)患者的RF呈阳性。因此，RF测定是美国风湿病学会1987年类风湿性关节炎诊断标准之一。但是RF阴性也不能排除类风湿性关节炎(RA)诊断。除RA外，还有其他很多疾病RF亦可阳性，如干燥综合征，混合性结缔组织病，2型混合性冷球蛋白血症，慢性活动性肝炎、亚急性细菌性心内膜炎，全身性红斑狼疮，多种细菌真菌、螺旋菌等，健康人群中约有5%的人RF阳性。
本研究结果说明，胶乳凝集法90.4%的类风湿性关节炎(RA)患者的RF呈阳性，健康人群中约有4.6%的人RF阳性。此结果与全国临床检验操作规程报道的结论相符。此方法可定量或半定量，灵敏度高，血清用量少、操作简单、便于在基层医院推广使用。
参考文献
[1] 吕绳凯等.抗链球菌溶血素“O”胶乳试验快速试剂的研究[J].上海医学检验杂志,1989,4(2):97.