伤感日记范例6篇

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伤感日记范文1

“陈老板，你家生意这么火，为什么不多开几家加盟店呢?”

“陈老板，你家的技术能对外传授吗?”……

江苏泰州陈辣梓老汁馆的老板陈胜生，每天都会听到这些话。经过十多年的独立打拼，在当地创下了一个响当当的品牌。

一间不起眼的小门脸，三四个人。就是这个小店，在当地可以说是家喻户晓。

店面十几米开外，就可以闻到浓浓的香味，让人垂涎欲滴。众人闻香而来，吃过一次的人，下次哪怕排队一个小时，也一定要购买到陈辣梓老汁馆的老汁鸡、老汁肝。

陈辣梓老汁馆的老板陈胜生，是个四十岁上下的中年人，经营老汁馆已经有十多年的历史。刚开始是利用祖传的秘方烧制一些老汁鸡和老汁肝到集市上摆摊出售，因为买的人太多，需要排长队购买，曾经屡屡引起交通堵塞。

后来开陈辣梓老汁馆，生意更加红火。不提供堂吃，全部是对外出售，后来许多酒楼都闻香而米，要求批量配送到酒楼，以增加酒楼的菜品和顾客回头率，因为有许多顾客点名要陈辣子老汁馆的东西。于是陈胜生干脆另外成立了一个外送部，专门供应给酒楼饭店、喜庆家宴、以及普通老百姓的餐桌。

曾经有许多人看陈辣梓老汁馆的生意红火，也想如法炮制，分一杯羹，一时间众多所谓的老汁馆纷纷上马，但是，没有一家能够坚持到半年以上，全部关门倒闭。因为他们并没有真正的老汁技术，画虎不成反类犬。经常是陈辣梓的店前顾客排着长队，不远处其他老汁店冷冷清清、门可罗雀。

陈辣梓老汁馆老汁鸡香味浓郁、入口滑嫩，香入肺腑，唇齿留香，百吃不厌；老汁肝十分细腻，香味独特。特色风味食品的推广，各地口味不一，通常是限制发展的瓶颈，但是陈辣梓老汁馆在主味不变的前提下，有多种口味可供选择，可以适应全国各地的口味。

陈辣梓老汁馆的技术配方，不添加任何不利于健康的成分，纯天然原材料制成的配料包，独特的配方，专业的技术，可以使鸡肉、猪肝烧制不减重量，一斤原料入汤可以出肉一斤一两左右。

广西戚女士是一家原国营企业的工人，2005年下岗，一直在餐馆打工，丈夫外出务工，两个孩子都上了高中，生活压力可想而知，那年暑假和孩子到江苏走亲戚，在泰州鼓楼路看到一群人在排队购买陈辣梓老汁鸡老汁肝，老远就闻到喷香，两个孩子简直垂涎欲滴。在亲戚家的这段时间里，天天吃老汁鸡老汁肝，百吃不腻。戚女士开始琢磨自己能不能也回家开一个老汁馆呢?投资也很小，只要几千元就可以开张了。这不是比上班打工、开一般的小店强多了吗?于是在亲戚的陪同下，找到陈辣梓老汁馆的老板陈胜生，要求学习技术。陈老板欣然应允，但是前提条件是不能在当地开店，只能到戚女士的老家或者其他地方开店。陈老板教技术非常上心，从原材料的选购到操作的过程，从配方的要点到烧制的火候，可以说是知无不言，言无不尽。戚女士很快就学会了全套技术，回家后，租了个摊位，每天烧制200只鸡，100斤猪肝左右，傍晚2个小时就销售一空，获利可达到千元以上。

佳木斯的柳先生，原来是开烧烤店的，竞争很激烈、生意每况愈下，很想找个新项目来摆脱困境。听出差到江苏泰州的哥哥回家说，有一个叫陈辣梓的老汁馆，生意非常火爆，每天都要排长队才能买到店里的东西。柳先生很动心，专程到江苏考察了一下，发现果然名不虚传，可以做成各种口味。入口喷香，回味无穷，百吃不腻。柳先生核算了一下成本，一斤鸡成本6元左右，加上各种配料、燃料等，不超过7元，销售价格可达到25元左右。一斤猪肝成本5元左右，销售价格20元左右。每天各销售200斤以上的话，可以获利数千元。

这个生意没有竞争对手，市场空白，非常新颖，稳定，可以作为一辈子的事业来做。

柳先生毫不犹豫的决定学习了老汁馆的技术和配方，回家后把烧烤店改为老汁馆，一开张，没有做任何广告，靠老汁鸡老汁肝的香味就就吸引来了一大批尝鲜的顾客，可以说是一炮而响。但是柳先生并没有就此满足，他雇佣了几个有摩托车的员工，朝各个酒楼餐馆批发价送货，这样一来柳先生的老汁馆3个月就在本地市场大有名气，生意红火。柳先生很快又与签订了区域独家保护合同，公司不可在当地再设第二家加盟店。至今已经经营一年多了，依然生意红火，正在考虑进一步扩张的计划。

陈辣梓老汁馆现成立培训班，对外传授全套技术。面授老汁鸡1800元，老汁肝1500元，二项全学优惠价2980元。函授老汁鸡680元，老汁肝550元，二项全学980元(有全套光盘教程，与面授效果一样)。学成后可以使用陈辣梓某某分店的招牌。

伤感日记范文2

MCS

Marlboro Classics蜕变

用逃脱(Escape)象征着服装上的创新转变。

是MCS Marlboro CIasslcs

在用于创新、开拓不同商品的新理念下首个春夏季主题服饰。

踏入2010年，Ma rloro CLAS-SiCS以全新的商标示人，简单“MCS”三个英文字母作品牌的缩写，同时也保留的传统风格的字体形态，让入耳目一新。除此之外更为2010年春夏拍摄辑全新广告及目录，显示品牌锐意革新的决心。

豪迈都市

实用性强素来都是MCSMa rIboro Classics的过人之处，生，性豪迈的你，穿上品牌的siq-nature复古bIker羊仔皮衣或是儒雅的麂皮皮衣，即便身在森林，依然感受到那种无拘无束的探索精神，无损你的时尚气息。而布料方面，除了品牌一贯常用极致舒适的全棉、牛仔料外，现代感极强的尼龙料也会更多运用在外套之上，并着力做出仿棉的柔软质感，适合男士优悠的穿梭都市之间，享受生活的乐趣。

充满冒险精神的旧金山

本次广告拍摄选址在美国最西端，被喻为冒险之地的旧金山，MCS Ma rlbore Classlcs希望透过旧金山浓厚的文化特质，去表达品牌用于探索、开创服装潮流新领域的冒险精神。

法国巴黎知名摄影大师Re-mi JouteI更透过精湛的摄影技术，把三位穿上MCS Marlboroclasstcs春夏服饰、造型时尚的模特Ryan Nelson和Ayssa，完全融入这个充满冒险精神的大都会之中。他们一举手一投足，都散发出品牌贯不受拘束，自由自在的生活形态。除摄影师功夫了得，模特儿也专业之外，品牌设计ValentIno FashIon Group对服装裁剪、质料、以及制作时每个细节的坚持，也同样功不可没。

友谊商厦三楼有售

享受生活并乐于成为生活的艺术家

Roberta di Camerinoo

Roberta di Camerino(诺贝达丽卡密莉娜)系意大利著名设计师Careerin0夫人于1947年创立的高端品牌。从威尼斯到佛罗伦萨，从意大利到美国都可以看见Roberta dlCamerino的足迹。而我们与Roberta di Camerlno的邂逅地点，是在天津友谊商厦三楼的男服商场。Roberta dl Camerino正式登陆友谊商厦以来，已经有越来越多的成功人士，加入到Robena dlCamerIn0的时尚殿堂一享受生活，并乐于成为生活的艺术家!

1956年，荣获时尚界的奥斯卡奖――尼曼・马卡斯奖之后，Camerlno夫人成为与ArmanI及VlentIno齐名的意大利国家级设计大师。其色彩鲜明的设计特色与风格深烙在世人心中。其充满传奇色彩的巴科旗包(Bagonghi)的生产和独创的颠覆双眼的二次原魔术一Pame Dress的设计手法，为品牌赢得无上的盛誉，成为社会名流的最爱。

2010春夏流行趋势

源于Roberta dl Camerino创始人Careerino女士对优雅气质不遗余力地营造，本季新品在款式和色彩上沾染了一丝华丽和自然的情绪，体现出设计师们对于昔日闲适生活的眷恋。

关键词一

回归经典Regressto Classlos

2010年春夏，Roberta diCareerlno男装依旧延续贯华丽经典的作风，强调精益求精的工艺及品质，简约流畅的线条力求永恒的经典与优雅不受时间限制。传承60余年历程的悠久制作工艺细节处提升高级时装的品质感，奢华材质确保每件商品无可挑剔的品质。

关键词二

惬意旅行Agreeablytravel

设计师在本季倡导给男人更多的自由空间。于是，Roberta di Camerino装扮成奢华的上流社会度假系列，改秋冬季暗沉的色调，转而用白色、浅灰、墨绿和宝蓝诠释本季天人台的自然心境。收放自如的尺寸，舒适的天然棉、天丝，可再生的功能性面料更加契合场自由自在的惬意旅行。

关键词三

伤感日记范文3

【摘要】

目的: 研究新型自杀基因亚麻苦甙水解酶/亚麻苦甙（lis/lin）统对人肝癌细胞HepG2的体外杀伤效应。方法: 应用分子克隆技术构建热带植物木薯的cDNA文库， 并从中扩增出lin基因克隆至pEGFPN1载体， 构建质粒pEGFPN1lis。通过电穿孔法将其转染人肝癌细胞株HepG2， 同时进行G418筛选， 直至出现抗性克隆， 扩大培养， 命名为HepG2/lis， 通过荧光显微镜观察、 RTPCR、 Western blot鉴定lis基因的表达; 采用MTT法观察不同浓度lin对已转染的HepG2的杀伤作用及旁观者效应。结果: RTPCR和Western blot证明转染的lis基因能够在HepG2细胞中表达并产生融合蛋白lisEGFP; 低浓度lin对转染了lis基因的HepG2细胞具有明显的细胞毒效应; 旁观者效应显示仅10%左右的HepG2/lis细胞与90%的HepG2细胞混合培养于lin浓度为500 mg/L的培养基时， 就可显示出明显的旁观者效应。结论: lis/lin自杀基因系统在lin浓度为500 mg/L时对人原发性肝癌细胞HepG2具有明显的杀伤作用和旁观者效应。

【关键词】 人肝癌细胞 HepG2 自杀基因 旁观者效应

[Abstract] AIM: To investigate the killing effect of linamarase/linamarin (lis/lin) system on hepatocellular carcinoma cell line HepG2 in vitro. METHODS: A cDNA library was built from RNA of cassava by RTPCR， then the linamarase gene was amplified from it by PCR and cloned into the eukaryotic expression vector plasmid pEGFPN1， which made up the recombinant plasmid pEGFPN1lis. The human HCC cells HepG2 were transfected with the recombinant plasmid mediated by electroporation and screened by G418 to yield the positive clone which was termed HepG2/lis. The expression of lis was confirmed by fluorescent staining， RTPCR and Western blot. The killing effect and bystander effect of linamarin with different concentrations on HepG2 was detected by MTT. RESULTS: RTPCR confirmed the expression of lis gene in HepG2 and Western blot analysis confirmed existence of lisEGFP fusion protein in HepG2. Linamarin in low concentration had shown notable cytotoxic effect on HepG2/lis. When HepG2/lis cells were mixed with parental HepG2 cells at a ratio of 10∶90 and cultivated in 500 mg/L lin medium， significant bystander effect was observed in vitro. CONCLUSION: The linamarase/linamarin suicide gene system has strong killing effect and bystander effect on HCCs with the concentration of 500 mg/L lin.

[Keywords]hepatocellular carcinoma cell; HepG2; suicide gene; bystander effect

我国是肝癌的高发区， 目前肝癌的治疗主要以手术切除为主， 但仍缺乏其他有效的治疗手段。近十余年来， 随着分子生物学技术的发展， 基因治疗的问世开辟了肝癌治疗的新途径， 其中以肿瘤的自杀基因疗法最为引人注目。将自杀基因导入肿瘤细胞后， 自杀基因的编码产物可以在体内将无毒性的前体药物转化为有毒性药物， 从而对转染的肿瘤细胞起到杀伤作用， 同时还可对肿瘤细胞邻近的未转染分裂细胞通过旁观者效应(bystander effect)起作用。通过转入自杀基因而赋予肿瘤细胞新的表型而引起药物对肿瘤细胞直接或间接杀伤作用的疗法称为自杀基因疗法。

源自热带植物木薯的亚麻苦甙水解酶/亚麻苦甙（linamarase/linamarin， lis/lin）系统是一种新型自杀基因系统， 一些文献研究报道， 相比较以往自杀基因系统， lis/lin系统具有更高的杀伤效率以及更为强大的旁观者效应[1]， 成为自杀基因研究的新方向。本研究旨在从木薯中提取lis基因Cas5， 构建lis/lin自杀基因系统， 并对其体外杀伤效应及旁观者效应进行初步的研究， 为后续的实验打下基础。

1 材料和方法

1.1 材料 木薯嫩芽（购自广西玉林）。大肠杆菌DH5α（本室传代冻存）， 人肝癌细胞系HepG2(本室保存) ， 质粒pEGFPN1（西京医院肝胆外科李韧博士惠赠）。植物RNA提取试剂盒RNAplant、 PCR试剂盒Tag Plus Mix（TIANGEN公司）; RTPCR试剂盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司）; 琼脂糖、 DNA胶回收试剂盒（上海生工公司）; T4连接酶、 内切酶Xhol I、 Sal I（TaKaRa公司）; 质粒提取纯化试剂盒（OMEGA公司）; 高糖DMEM无血清培养基、 新生牛血清（Gibco公司）; 前体药物亚麻苦甙（linamarin， lin）为International Laboratory USA产品; G418、 丁胺卡那霉素、 MTT（Invitrogen公司）; 低渗电穿孔缓冲液lipofectin（eppendorf 公司）; 其余试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据NCBI上报的木薯linamarase全长cDNA序列， 设计上游引物5′ACTCTCGAGATGCTCGTCTTGTTCATAAG3′， 下游引物5′CGAGTCGACAACATCACATAGAATTTGC3′， 其中上游引物含有Xho I酶切位点， 下游引物含有Sal I酶切位点（下划线即为酶切位点）。设计下游引物时将lis全长cDNA的3′端的终止密码子删除并使其阅读框与下游的EGFP基因一致。引物由北京奥科生物科学技术有限公司合成， 预计扩增长度为1.6 kb。

1.2.2 木薯cDNA文库的构建 摘取新鲜木薯嫩芽， 液氮中碾磨破碎细胞壁， 按TIANGEN公司的植物RNA提取试剂盒RNAplant说明书进行总RNA提取。植物总RNA溶液260 nm及280 nm测定A值， 鉴定RNA的量和纯度， 并行核酸电泳鉴定总RNA完整度。以该总RNA为模板， 按Feminegon RTPCR试剂盒说明进行反转录反应， 构建木薯cDNA文库。

1.2.3 PCR扩增lis基因 以木薯cDNA文库为模板， 按照TIANGEN公司Tag Plus Mix试剂盒说明进行PCR反应， 按下列参数循环40次: 95℃变性30 s， 62.5℃退火30 s， 72℃延伸3 min， 10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析， 见1.6 kb处出现一条条带， 切下该条带所在凝胶， 按照凝胶回收试剂盒说明进行胶回收， 回收产物溶于40 μL水中。

1.2.4 重组pEGFPN1lis质粒的构建 将上述DNA产物用Xhol I 和Sal I进行双酶切， 10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析后切下lis基因所在凝胶， 按照凝胶回收试剂盒说明进行胶回收， 回收产物溶于40 μL水中。将载体pEGFPN1质粒（约4.7 kb大小）用Xhol I和Sal I双酶切后与酶切回收后的lis基因在16℃条件下进行连接， 电穿孔法转化至大肠杆菌DH5α， 涂布含丁胺卡那霉素的琼脂糖平板后， 37℃过夜培养。挑取单个菌落行扩增培养， OMEGA质粒试剂盒提取质粒后， 用Xhol I、 Sal I分别进行单酶切及双酶切， 10 g/L琼脂凝胶电泳分析， 同时将构建好的质粒送检测序（由北京奥科生物科学技术有限公司测序）。

1.2.5 整合lisEGFP基因及EGFP基因单克隆细胞的筛选 电穿孔法分别将重组pEGFPN1lis质粒和pEGFPN1质粒转染入HepG2细胞中， 穿孔后把细胞移入6孔板中加入含血清的DMEM培养基。37℃温育48 h后， 换含有600 mg/L G418培养基进行压力筛选， 直至抗性克隆出现， 挑选含荧光的抗性克隆进行扩增， 筛选后阳性克隆细胞分别命名为HepG2/lis和HepG2/EGFP。利用RTPCR鉴定HepG2/lis细胞中lis基因的mRNA表达、 Western blot鉴定lisGFP融合蛋白的表达。

1.2.6 pEGFPN1lis系统的细胞毒性试验 将1×104的HepG2/lis、 HepG2/EGFP、 HepG2细胞分别接种于96孔培养板内作为实验组、 阴性对照组和空白对照组， 24 h后分别加入含有50、 100、 250、 500和1000 mg/L lin的含100 mL/L小牛血清的高糖DMEM培养基。分别于加药培养后的第2天和第4天用MTT法检测细胞的相对存活率: 每孔加入20 μL MTT（5g/L）， 37℃继续培养5h后， 吸弃上清， 每孔加入100μL DMSO， 37℃放置30 min， 使色素沉淀充分溶解后570 nm测定A值， 结果以相对存活率表示， 每种浓度同时进行6孔， 重复3次。

1.2.7 旁观者效应的观察 将总数为1×104的HepG2细胞与HepG2/lis以不同比例混合， 即100∶0， 95∶5， 90∶10， 70∶30， 0∶100， 接种于96孔板中， 第2天换含有250、 500和1000 mg/L lin的含100 mL/L小牛血清的高糖DMEM培养基继续培养， 分别培养2 d和4 d后， 用MTT法观察活细胞比例， 每种比例同时进行6孔， 重复3次。

2 结果

2.1 木薯总RNA的提取、 鉴定 在液氮中研磨木薯嫩芽， 利用RNAplant试剂盒提取木薯总RNA。分光光度法测定RNA纯度， 其A260/A280值为1.843; 凝胶电泳可见28 S、 18 S条带清晰无脱尾， 28 S条带亮度约为18 S条带的2倍， 5 S条带不明显（图1）。

2.2 lis基因PCR扩增及其产物电泳鉴定 以木薯总RNA为模板通过反转录构建木薯cDNA文库，然后通过PCR扩增出预期的大小约为1.6 kb的目的片段， 条带清晰， 无非特异性扩增现象（图2）。

图1 木薯RNA电泳鉴定（略）

Fig 1 RNA electrophoresis analysis of cassava

图2 lis基因PCR电泳鉴定（略）

Fig 2 Electrophoresis analysis of lis gene by PCR

M: DNA marker; 1: lis gene.

2.3 重组pEGFPN1lis质粒的酶切鉴定 通过XholI和SalI双酶切重组质粒， 分别切出4.7 kb和1.5 kb的片段， 大小与预期相符（图3）。进行克隆片段两端测序鉴定（测序为北京奥科公司）， 与文献报道的基因序列相同。以上结果表明， 重组质粒pEGfPN1lis构建正确。

图3 重组质粒pEGFPN1lis的酶切鉴定（略）

Fig 3 Restrictive engyme digestion analysis of recombinant vector pEGFPN1lis

M: DNA marker; 1: pEGFPN1lis+Xhol I+Sal I; 2: pEGFPN1lis+Xhol I; 3: pEGFPN1lis+Sal I; 4: pEGFPN1.

2.4 重组pEGFPN1lis质粒转染HepG2细胞后EGFP表达观察 电穿孔法转染细胞24 h后在488 nm激发光荧光显微镜下观察， 发现部分细胞发出绿色萤光（图4）。稳定转染后挑取lisEGFP单克隆阳性细胞扩增培养， 荧光显微镜下观察， 细胞绿色荧光明显， 提示细胞有稳定的的lisEGFP基因表达（图5）。

图4 瞬时转染24 h细胞（略）

Fig 4 Cells of transient transfection after 24 hours (×200)

图5 稳定转染阳性单克隆细胞（略）

Fig 5 Cells of stable transfection positive clone (×200)

2.5 RTPCR检测重组pEGFPN1lis质粒转染HepG2细胞后lisEGFP基因的表达 TRIzol法从培养的lisEGFP单克隆阳性细胞中提取总RNA， RTPCR法检测lis基因的mRNA表达情况。电泳结果显示经RTPCR扩增出大小约为1.6 kb的片段， 其大小与理论预期值相一致， 提示lis基因有mRNA表达; 而对照组未转染HepG2细胞中没有该条带。

2.6 Western blot检测重组pEGFPN1lis质粒转染HepG2细胞后lisEGFP蛋白的表达 破碎lisEGFP单克隆阳性细胞后取上清液， Western blot检测蛋白表达， 结果显示试验组重组蛋白Mr约为95000， 与预期融合蛋白大小相一致， 提示有融合蛋白lisEGFP蛋白的表达; 而对照组未转染HepG2细胞结果为阴性（图6）。

图6 融合蛋白lisEGFP Western blot鉴定（略）

Fig 6 Western blot analysis of recombinant protein lisEGFP

1: HepG2/lis cells; 2: HepG2 cells.

2.7 重组pEGFPN1lis质粒对人肝癌细胞的细胞毒作用 通过MTT法检测细胞存活率显示， lis/lin自杀基因系统具有强烈的细胞作用。由图7A可见， 在给药48 h后， HepG2/lis细胞生存率随前体药物的浓度的增加而逐渐降低， 当前体药物浓度达到500～1000 mg/L时， 可观察到lis/lin自杀基因系统对其产生的明显的细胞毒作用。由图7B可见， 在给药96 h后， 随着毒性物质的积累， lis/lin对HepG2/lis细胞产生了更为明显的杀伤作用， 在lin浓度为250 mg/L时， 绝大部分细胞被杀伤， 在lin浓度大于500 mg/L时， 全部细胞被杀死。而作为阴性对照的HepG2/EGFP细胞组和空白对照的HepG2细胞组， 在48 h和96 h两个时间点上可以观察到不同浓度lin对其生存率都不产生任何影响。

图7 lis/lin自杀基因系统对HepG2细胞的杀伤效应（略）

Fig 7 Killing effect of lis/lin suicide gene system on HepG2 cells

A: Survival rate (%) of HepG2 cells treated with lin after 48 hours; B: Survival rate (%) of HepG2 cells treated with lin after 96 hours.

2.8 Lis/lin系统旁观者效应的观察 通过不同比例表达和不表达lis基因的HepG2细胞混合， 可以观察添加lin时， lis/lin系统的旁观者效应。由图8A可见在给药48 h后， 小于10%的混合比例的HepG2/lis细胞在不同浓度lin下所表现的旁观者效应并不明显; 而大于30%的混合比例时， 不同浓度lin下的细胞相对生存率同100% HepG2/lis细胞的细胞相对生存率相接近， 有明显的旁观者效应。由图8B可见在给药96 h后， 只需5%～10%的HepG2/lis细胞， 90%的细胞即可被杀死; 在HepG2/lis细胞混合比例大于30%、 lin浓度大于500 mg/L时， 全部细胞被杀死。这个结果提示， lis/lin系统具有强大旁观者效应。

图8 lis/lin自杀基因系统的旁观者效应（略）

Fig 8 Bystander effect of lis/lin suicide gene system

A: Survival rate (%) of cells treated with lin after 48 hours; B: Survival rate (%) of cells treated with lin after 96 hours.

3 讨论

自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗的一个重要发展方向。目前， 研究多集中于单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷 (herps simplex virus thymidine kinase/ganciclovir， HSVTK/GCV) 和胞嘧啶脱氨酶/5氟胞嘧啶(cytosine deaminas/5flucytosine， CD/5FC) 这两个自杀基因系统， 此两系统的抗瘤效能已在多种肿瘤[2-5]的体内外实验中得到证实并进入临床试验。但是， 转染效率低下、 肿瘤细胞不敏感出现抗性[6]等问题成为制约自杀基因疗法进一步发展的阻力。Lis/lin自杀基因系统源于热带植物木薯体内存在的一种氰化物生成系统， lis是一种存在于木薯叶柄和根部中的β葡萄糖苷酶， 最适温度为55℃， 它可以水解无毒的底物lin， 生成丙酮氰醇和葡萄糖。丙酮氰醇在pH值大于6时不稳定， 可自发水解成丙酮和氰化物（CN-）。目前研究认为， lis/lin自杀基因系统的代谢产物CN对生物细胞具有强烈的杀伤能力［1］; 同时由于CN-能够在细胞膜间自由扩散， 因而使其表现出强大的旁观者效应。

我们从木薯嫩芽中提取总RNA经反转录成功构建木薯cDNA文库， 并从中克隆出lis基因Cas5， 经测序验证正确连接于pEGFPN1载体， 构建融合基因lisEGFP， 观察了lis基因在肿瘤细胞中的表达情况， 对原发肝癌细胞HepG2进行了杀伤效应研究， 结果发现在较低浓度前体药物浓度下， 转染的lis基因对HepG2细胞可产生明显的杀伤效应。旁观者效应研究发现， 只需5%～10%左右的转染lis基因的细胞就可杀死90%的细胞， 而当这一比例达到30%时， 全部的细胞被杀死， 表明我们构建的lisEGFP基因具有良好的肿瘤杀伤作用， 为进一步和其他基因构建融合基因提供了良好的基础。而在未转染lis基因的阴性对照组和空白对照组中， 即使当lin浓度达到1000 mg/L时， 细胞生长没有受到任何影响， 说明lis/lin自杀基因系统是一种高效、 无毒的自杀基因系统， 为后续的体内试验研究提供里一个安全、 理想的试验平台。在本试验的旁观者效应研究过程中发现， 在给药的最初48 h， 小于10%的混合比例的HepG2/lis细胞在不同浓度lin下所表现的旁观者效应并不明显， 但是给药96 h后， 5%的HepG2/lis细胞就可杀死90%的细胞， 表现出较为明显的旁观者效应。这一结果提示该自杀基因系统具有明显的“好施者”效应。所谓“好施者”效应（“Good Samaritan” effect）是指转染自杀基因的细胞受到旁观者细胞（周围不含有自杀基因的细胞）保护， 生存周期得以延长的效应称为好施者效应[7]。该效应在延长了转基因细胞存活时间的同时， 也同时延长了其传递基因表达产物的时间， 进一步增强了旁观者效应的杀伤作用。在HSVTK/GCV、 CD/5FC等自杀基因系统中也存在“好施者”效应， 但由于杀伤性物质多产生于细胞内或不易扩散， 使得转染细胞较早即被杀伤， 不能够表达更多的产物对周围非转染细胞产生杀伤作用， 表现出微弱的“好施者”效应。Cortes等[1]认为在lis/lin系统中由于具有杀伤作用的CN-离子产生于细胞外， 可以迅速扩散到周围细胞， 使得含有自杀基因细胞内的CN-离子浓度同周围细胞相一致， 在一定时间内， CN-离子浓度达不到杀伤作用浓度， 保证了linamarase的持续表达， 扩大了对周围非转染细胞的杀伤范围， 从而表现了强大的旁观者效应。关于lis/lin系统“好施者”效应的发生机制有待通过对lis的定位表达、 细胞培养上清CN-浓度的变化曲线、 转染细胞及周围细胞的亚细胞结构观察等试验加以进一步研究验证。

参考文献

[1] Cortes ML， GarciaEscudero V， Hughes M， et al. Cyanide bystander effect of the linamarase/linamarin killersuicide gene therapy system[J]. J Gene Med， 2002， 4(4): 407-414.

[2] 刘 志， 成诗银， 鱼 兵. HSVtk/GCV自杀基因系统对喉癌细胞杀伤作用的体外研究[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 18(6): 582-585.

[3] Satoh T， Irie A， Egawa S， et al. In situ gene therapy for prostate cancer[J]. Curr Gene Ther， 2005， 5(1): 111-119.

[4] Wang XP， Yazawa K， Yang J， et al. Specific gene expression and therapy for pancreatic cancer using the eytosine deaminase gene directed by the rat insulin promoter[J]. J Gastrointest Surg， 2004， 8(1): 98-109.

[5] Carri NG， Sosa YE， Brown OA， et al. Studies on in vivo gene transfer in pituitary tumors using herpesderived and adenoviral vectors[J]. Brain Res Bull， 2005， 65(1): 17-23.

伤感日记范文4

伦非常聪明，所有的考试对他而言，都是小菜一碟，有一次，在大家还在埋头赶做考题的时候，他已经全做完了，百无聊赖，只好想米，咫尺天涯的感觉，让他难熬，于是写了张字条。悄然扔给斜对面的米，米太专注于考题，根本就没有反应，但是，这一切被监考老师看到了，他捡起那纸团，打开一看，不是写什么答案，而是更出位的文字：“我想你了，米!”

这个缺心眼的老师，居然当场朗读纸条上的情话，全班哗然，米哭了，伦咬牙切齿，可是又奈何?他悔恨，心疼着米的感受。原来他们的地下情是神不知鬼不觉的，这下，他们的恋情大白于天下。伦顾虑的仍然是米的处境。为了自己心爱，的女孩能有个没有舆论压力的学习环境，他自动退学，立即人间蒸发，至了外地继续求学，并且在双方家长面前保证“不再打扰”米。因为他的离去，米重回宁静中。

渐渐地他们真的就失去了联系。后来，他们都考上了理想的大学。米一直珍藏着唯一的一张字条，就是被老师误会为“小抄”的那张，他最后一张、之前收到的字条，他们双方都按约及时烧掉，像间谍销毁情报一样，根本不留一丝痕迹。日子一天夫过去。米的日记本一次次换掉，每次换日记本，都会把那张字条转移到最新的日记里，成了书签。终于，有一天，米突然想起那张字条，可是已经找不到了，她真的不知道是在哪个日记本里失踪的。

那一刻，是午夜，月色清凉，顺着窗帘流泻，无声，她莫名地有些感伤，中学那些秘密交往的记忆，怎么变得那么渺茫，像是未来的，而不是昨天的。伦怎么没有再来找过自己?米终于释然了 ，因为岁月让彼此都有从容的空间成长或者遗忘，所以她不会责怪与埋怨对方的，因为她自己也在岁月流逝中丢失了那张初恋的纸条，而且非常自然。没有波痕，犹如时光的流逝方式，不痛，不觉。

伤感日记范文5

一只口琴，可抒发出你内心的情感。当你快乐的时候，吹一曲欢乐的歌，释放出你高兴的心情；当你伤心的时候，吹一曲伤情的歌，抒放出你的伤感；当你烦闷的时候，吹一曲苦恼的歌，表现出你的苦闷。

而掌上电脑呢，装有摄像头可以随时拍下美丽的风景；具备网线就可以随时上网查询各地的特色和风土人情，无聊的时候还可以玩游戏来解闷。

我首先会在掌上电脑上记录下我的感受，写下日记，运用上平时积累的好词、好句，再配上一幅美丽的照片，最后画一幅精美的插图，组合，就成了一页旅行日记。这样一页一页地写，一天一天地画，就会变成一本内容丰富的旅行日记书。

伤感日记范文6

墨香凝请，落笔成忆。多雨的六月，心中匿藏无尽的思念；多云的六月，人世间无底的尘埃，可否挥散？伤感的六月，那份闲愁，是一生悲伤的花落；离别的六月，浮云流动，蔚蓝的天空澄净如水。青春的六月，再多的思念，终将缱绻在我的心头。青春离别的六月，可否支离破碎？可否永驻于心？

翻开心灵的日记本，泛黄的页面，是受过的伤，是破碎的梦，是错过的时光，是擦肩而过的离别，是流过的泪，是心灵的痛，是离开的寂寞，是深夜的徘徊，是遗弃的坚强，是妥协的开始 ……

六月的天空，多雨，是上天在为我哭泣吗？那芳华的岁月，抽心为谁？黑玫瑰，枯萎；相思豆，凝结；梅花深印人心。渴望成为你的倒影，又怕走进无底的回音；渴望化作一场惊雷，有怕打破这含泪的宁静。不知为何，六月，多的是一份伤感，一丝离别的惆怅。

离别，就不要开始，虽然余情未泯；离别，只是心与心的距离，愈来愈远，可留恋的也只有过去；离别，似夕阳的余晖，而日出的美丽，可否重新上演？离别，冬日寒风，鞭打着脆弱的心，阳春三月的回忆，能否春暖花开？

青春离别的六月，放弃，就彻彻底底？

青春离别的六月，思恋，还是放手？

青春离别的六月，相别，当初为何相聚？