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细胞培养范文1
【关键词】 内耳干细胞 培养 移植 中毒性耳聋 动物模型 大鼠
长期或过量使用链霉素、庆大霉素及丁胺卡那霉素等类药物导致的中毒性耳聋是临床常见的药物副作用。根据国家食品药品监督管理局统计，每年我国因药物造成听力损害的患者高达数百万人。经研究发现其致病机制主要为：耳毒类药如氨基甙类抗生素可抑制ATP 酶的活化，使内、外淋巴液中K+、Na+ 倒置， 引起膜通透性改变和多种水解酶释放， 最终使内耳毛细胞萎缩、变性、坏死，而且内耳毛细胞损伤通常是不可逆的。近年来，随着神经干细胞研究的不断深入，已有研究表明：内耳损伤后外源基因刺激可以产生新的毛细胞。因而，通过促进耳源性神经干细胞向毛细胞转化，利用其本身的分化特性， 重建毛细胞形态和神经连接， 恢复毛细胞功能也许是治疗中毒性耳聋的有效途径之一。本实验通过移植内耳干细胞入中毒性耳聋模型大鼠内耳，观察移植后的内耳干细胞生长、整合等情况，为治疗中毒性耳聋提供实验理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物 选用健康SD大鼠20只，雌雄不限，体重350～400 g，由南京中医药大学实验动物中心提供。
1.2 试剂和抗体 Neurobasal培养基、B27辅助培养基（GIBCO公司）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，Sigma公司）、胰蛋白酶（Sigma公司）、巢蛋白（nestin）抗体（Sigma公司）、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)及其单克隆抗体（Sigma公司）。
1.3 主要仪器 离心机、超净工作台、二氧化碳培养箱、恒温水浴箱、倒置相差显微镜、荧光显微镜、FACS Calibur型流式细胞仪（BD公司）等。
1.4 中毒性耳聋模型的建立 听耳廓反射和前庭功能正常的大鼠给予硫酸庆大霉素肌内注射。选用中等度的中毒剂量80 mg/（kg·d），连续使用10天。经听耳廓反射测定器检查判定鼠的听力下降程度以及耳蜗切片观察耳蜗损伤状况，特别是内耳毛细胞崩解的程度，确定造模成功与否。
1.5 实验分组 本实验随机分为2组，每组10只：干细胞组，行干细胞耳蜗内移植；生理盐水组，耳蜗内注入生理盐水。
1.6 耳蜗干细胞的分离、培养及鉴定
1.6.1 耳蜗干细胞取材 水合氯醛深度麻醉P0大鼠（胚鼠），无菌操作条件下分离内耳耳蜗。经碘酊、乙醇消毒后固定于烛台， 去外膜，在解剖显微镜下操作，剪去动物耳廓及外耳道(外耳道为软骨性) ，暴露鼓膜，透过菲薄的鼓膜可见到听骨链。用耵聍钩沿鼓膜下缘6点处进针，钩住下鼓室部位稍用力迅速将颞骨乳突部连同鼓膜整块摘除，暴露出鼓岬及其前下方的蜗锥，摘除听骨，刺破两窗膜(圆窗和卵圆窗)，用眼科剪剪开耳蜗前方的薄层骨连接至颅内，通过此口用耵聍钩入颅内向后外方骨折取出完整的内耳标本，剪去连接的颞肌， 找到大鼠耳蜗内螺旋沟及内毛细胞下方区域并取材。HBSS液冲洗几次后剪碎，加入0.125%胰蛋白酶37℃消化30 min。中止反应之后加入0.01% DNA 酶，吸管轻柔吹打成单细胞悬液。
1.6.2 耳蜗干细胞培养 无血清培养基进行培养〔DMEM/F12(1∶1)液 +2% B27 + bFGF 20 μg/L+表皮生长因子（EGF） 20 μg/L〕。待原代克隆形成后分离克隆制作单细胞悬液，按1×108/L 接种培养。7天后将其移至离心管中，500 r/min 离心， HBSS液洗涤，去上清，余液混匀，涂于多聚赖氨酸包被的载片上，晾干， 4%多聚甲醛固定。
1.6.3 耳蜗干细胞鉴定［1-2］ 免疫荧光细胞化学染色法，用抗巢蛋白抗体 (1∶200) 以及BrdU标记内耳干细胞，荧光显微镜下观察并拍照记录。
1.7 耳蜗干细胞耳蜗内移植 将中毒性耳聋模型鼠麻醉后，在无菌条件下，用微量注射器将经BrdU标记的内耳干细胞沿耳蜗壁或者圆窗和卵圆窗注射入内耳耳蜗结构。对照组耳蜗内注射生理盐水，方法同上。
1.8 取材与观察 移植4周后，取大鼠内耳移植部位的组织，剪切，1%胰酶充分消化30 min，过滤，离心洗涤5 min，弃上清，沉淀以PBS制成细胞悬液，流式细胞仪计数分析。制作实验动物内耳的组织切片及耳蜗铺片，在荧光显微镜下观察内耳组织结构的变化。
1.9 统计学处理 所有数据均采用SPSS软件包进行t检验。P＜0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 内耳干细胞的培养及鉴定 取自 P0大鼠内耳的内耳干细胞在无血清培养基中，镜下观察刚分离的单细胞呈圆形，大小不一，折光性好，悬浮在培养瓶中，无突起长出。培养1天少数细胞伸出突起，3～4天贴壁的细胞突起伸长，5～6天细胞的突起相连交织成网。将离心后的细胞重新制备成单细胞悬液，6～7天后可见大量悬浮的细胞团形成，细胞团中有很多生长状态良好的单个细胞，呈桑葚形状。上述细胞球经巢蛋白免疫荧光鉴定呈阳性，表明分离培养的细胞是具有自我更新能力的干细胞。BrdU特异性标记细胞核，细胞团打散后，可观察到大量BrdU标记阳性的干细胞，说明这些细胞是具有增殖能力的内耳干细胞。继续培养后，有些克隆球自然贴壁， 并沿球体周围伸出突起向四周呈放射状延伸。细胞球贴壁后，少数细胞从球体迁移出来，细胞形态不规则，呈三角形、锥形或多角形（图1）。
2.2 内耳组织CD4（+）T细胞计数 用流式细胞仪计数分析，移植后内耳组织CD4（+）T细胞占整个淋巴细胞百分比与移植前差异无显著性〔（48±5）% vs. (45±6)%，P＞0.05〕。
2.3 内耳的镜下表现 在荧光显微镜下：生理盐水组表现为毛细胞核消失，在毛细胞核的位置出现染色空白区； 而干细胞组发现有大量BrdU标记阳性的内耳干细胞在移植区域，部分存活的内耳干细胞迁移至耳蜗毛细胞表面， 形态上与内、外毛细胞相似（图2）。
3 讨 论
Li等［3］在成年大鼠椭圆囊斑位置发现存在内耳干细胞， 内耳干细胞在体内和体外培养可分化成毛细胞样细胞，而且拥有高度的增生潜能和自我更新能力［4］。 Malgrange等［5］采用无血清培养基加丝裂原性生长因子( EGF或bFGF)从P0大鼠耳蜗和内耳螺旋沟区域分离培养出巢蛋白阳性的神经细胞球， 分裂后分化为耳蜗毛细胞和支持细胞， 提示这些巢蛋白阳性细胞可能是出生后损伤的Corti 器内新生毛细胞和支持细胞的来源。Ozeki等［6］也分别从E12和P5大鼠的耳泡和Corti器分离出永生化的毛细胞前体细胞系。
我们选择在前期实验中已得到证实的内耳Corti器位置取材，通过巢蛋白（早期神经上皮细胞的标志）以及BrdU（在细胞分裂前DNA的合成期，它可作为底物参与DNA的合成）标记，证明我们取材获得的细胞是具有增殖能力的干细胞。将获得的内耳干细胞移植前加BrdU（10 μmol/L）共培养72 h后，用微量注射器将耳蜗干细胞沿耳蜗壁或者圆窗和卵圆窗注射入内耳耳蜗内，镜下观察移植后4周大鼠内耳组织。其中生理盐水组表现为毛细胞核消失，在毛细胞核的位置出现染色空白区或毛细胞核肿胀，核体积明显增大，染色变淡，且不均匀，有些肿胀细胞核外形不规则［7］，表明毛细胞损伤是中毒性耳聋的前提；而干细胞组可见大量BrdU标记阳性的干细胞从移植区域向周围扩散，部分存活的内耳干细胞迁移至耳蜗毛细胞表面， 形态上与内、外毛细胞相似， 移植的细胞团外围与受体胶原有很好的融合，表明移植的内耳干细胞不仅能够存活［8］，而且有一定的增殖能力。
用流式细胞仪计数分析，内耳组织CD4（+）T淋巴细胞的百分比与移植前没有明显变化，表明移植后排斥反应较轻［9］。这主要是由于内耳干细胞与其他干细胞一样是一种非常原始的细胞，它们较低的免疫原性不会引起明显的排斥反应。
本实验结果显示：移植到中毒性耳聋模型大鼠内耳的内耳干细胞能够向周围扩散、存活，而且有一定的增殖能力；移植的细胞团外围与受体胶原有很好的融合，表现为正常的毛细胞形态。至于这种表现为内耳毛细胞形态的细胞能否重建毛细胞神经连接， 恢复毛细胞功能，是我们后期研究的内容。另外，由于属于同种同源性移植［10-11］，加上内耳干细胞又是一种非常原始的细胞，它的免疫原性较低，移植后的排斥反应没有想象的严重。
【参考文献】
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细胞培养范文2
【关键词】细胞培养室；技术服务与交流；培养室建设与管理
实验室是高等学校从事科研的重要基地，营造一个好的实验研究环境对实验室管理和建设起着至关重要的作用。实验室管理质量的好坏，直接关系到实验研究是否进展顺利。良好的实验室建设，能给研究者带来愉快的心情，同时也能有效的提高研究质量。
细胞培养室是综合实验室的一个重要组成部分, 细胞培养技术是生命科学各研究领域的一种最基本、最重要、也是应用最广泛的研究技术之一。对于高等医学院校来说,各生物医学相关学科均建有细胞培养实验室，其规模、档次、技术水平、使用效率、管理模式、服务保障等方面都缺乏统一的标准，普遍存在着小而全、投资分散、资金浪费、缺乏有效管理、无法提供服务保障、不利于技术交流和创新等诸多问题。本文总结了笔者在细胞实验室管理与建设方面的一些经验，并与广大同行进行探讨。
1 细胞培养室的服务职能
细胞培养除了需要娴熟的操作技术外，更多的体现在培养技术的过程复杂，无菌要求严格。研究人员掌握该门技术的时间周期较长。如果成天陷入清洗，包装和消毒等简单繁琐的劳动中，就会影响研究人员专心致志地从事研究活动中更重要的环节。建立大型细胞培养室，由专人进行工作流程服务，实验室按研究人员的要求提供标准化、规范化的实验用品和材料，可以极大地提高细胞培养实验室的成功率，确保实验器材符合细胞培养的要求，减少研究人员的无谓劳动。因此可以将研究人员从烦琐的劳动中解放出来，安心从事更重要的研究活动。
2 细胞培养实验室的技术交流
细胞培养是一项通用的技术平台。但针对各个研究课题而言，每个研究人员进行细胞培养的目的和要求又各不相同，即既有共性，又有特殊性。一个学科自建的细胞培养室，一般仅局限于本学科领域内有限的研究方向所必需的细胞培养方法和技术，对其它的特殊方法了解不多，因此不利于技术创新。即便是某个研究生掌握的新方法，常常由于毕业分配等原因离开科室，而使新的特殊技术不复存在，不利于特殊技术的建立和完善。
如果大型细胞培养室面向全校开放，自学科的研究人员中具有丰富科研经验的研究人员、博士、硕士等不同层次、不同研究目的和不同要求，他们相互之间不存在利害关系，容易交流，毫无技术保留。每个人的经验和教训很快为大家所用，可极大缩短技术学习的周期和提高新技术的交流。同时，实验室建立了技术档案制度，不同学科的研究人员探索的新技术不会因走人而流失，可以极大地丰富和积累特殊技术，提高技术水平，为后来者提供更多的方便。
3 细胞培养室的建设
3．1 细胞培养室面积和房间安排 实验室的面积应由实验台的长度、净化工作台的大小等仪器设备情况决定，同时还应考虑科研及实验人员有足够的空间，以便安全地进行科研及实验活动。此外,还应设置面积不小于6 m2的缓冲间及与工作分开的更衣柜等。如果细胞培养室面积大于一个标准单元，至少应有两个出口，以随时保持畅通。细胞室里的试验台和仪器布局应合理。一般来说，二氧化碳培养箱和净化工台不应对着门摆放，离心机不应离得太远。
3．2 培养室的环境和设施 ① 照明以不影响对实验中产生的各种现象的观察为基准，一般采用荧光灯。宜设置专门电力变压器供电,提高供电质量和可靠性；②房间装修密闭性应较高，且不宜开设外窗，设窗主要为采光好，必要时还应安装空调。门、窗、墙表面应涂布便于清洗去污和耐腐蚀的材料。由于细胞原代培养要求较高，设置空气净化装置；③对于配制有毒的试剂，产生较大的气味和有害气体的实验应在规范的通风柜中操作。操作有放射性同位素的实验,应配备个人防护用品和淋浴室,其废液应妥善处理。
4 细胞培养室管理制度的建立
4．1 消毒清洁制度 ①每个进入细胞室的工作人员应保证其个人卫生；②进入缓冲间时,应更换洁净的工作服和拖鞋,进入培养室时须戴帽子和口罩。如做原代培养,工作服应消毒；③第一个进入培养室的人员请及时开启空气净化装置,最后离开人员请关闭空气净化装置；④每天实验前必须紫外线常规消毒1 h。每周一次卫生消毒工作并做空气细菌培养检查。每月一次全面清洁工作。
4．2 培养箱的使用 ①每天观察二氧化碳压力表,及时更换二氧化碳钢瓶。同时观察二氧化碳流量指示表,同时培养箱内应放置一温度计,记录其温度与指示表温度是否一致；②培养箱应划分不同区域，不同细胞应放不同区域，同时保持适当的湿度；③有的培养箱有高温消毒功能，注意非管理人员不要动此功能键，以免造成某些元件烧毁。
4．3 洁净工作台的使用 ①使用前1 h应紫外线照射；②洁净台内也应划分不同的区域，如材料区、操作区、污物区等；③注意安全，特别是酒精灯，如有酒精漏出应立即吸干擦净，如发生意外用纱布、棉布类盖灭酒精灯；④ 实验完毕,所用过的器皿、杂物必须清理,同时进行台面清洁。
4．4 液氮瓶和低温冰箱的管理 ①定期检查液氮的容量，并做好记录；②存、取细胞株时，注意防冻安全；③存放细胞株时，根据其种类不同，放置不同盒内，同时应标记好名称和时间并记录；④低温冰箱使用时应按其种类划分不同区域，做好标记并记录。
4．5 实验室资料管理制度 ①收集课题计划书、实验路线、操作步骤、操作记录，各种实验的数据及仪器说明书等；②由负责人指定专人负责并督促不同时段内完成。如果有不规范的资料，请有关人员及时纠正；③资料归档后的资料由专人统一管理。若有些课题涉及专利与发明等知识产权问题，应注意保密。
总之,随着现代科学技术的快速发展,适应高等医学院校科研要求,如何建设好和管理好大型细胞培养实验室对于促进学校科学研究水平的提升是值得探讨的课题。
参考文献
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细胞培养范文3
关键词：小鼠单核巨噬白血病细胞；细胞刮棒；高压灭菌；酸碱度
细胞培养技术是目前很多医学研究离不开的技术，肿瘤细胞在细胞培养中占据核心的地位。肿瘤是对人类威胁最大的疾病之一，是研究癌变机制和抗癌药物筛选的重要手段。肿瘤细胞虽具有无限增殖的特性，但并不表示培养起来很容易，很多因素都会影响到细胞的形态及功能。如：酸碱度、CO2浓度、环境温度等。小鼠单核巨噬白血病细胞（RAW264.7）是炎症研究中非常常见的研究对象，炎症是伴随多种疾病的并发症，因此越来越受到重视。本文根据实践经验，总结RAW264.7细胞在培养过程中的生活特性及影响因素，为细胞科研工作提帮助。
1 RAW264.7细胞研究
RAW264.7细胞是小鼠源性破骨前体细胞，该细胞株由Raschke WC等建立。它来自Abelson小鼠白血病病毒所致的肿瘤[1]。据知网上不完全统计，可以发现我国从1986年就已经有对 RAW264.7细胞的研究了[2]，至2014年共有2700余篇，截止2013年其研究趋势，见图1，可见RAW264.7细胞研究越来越受到重视，因此对于RAW264.7细胞的培养需一个规范化的标准。
图1 RAW264.7细胞研究趋势
2 RAW264.7细胞的培养
RAW264.7是破骨前体细胞，因此在培养过程中很容易分化形成破骨细胞，另外 RAW264.7细胞也是一种巨噬细胞，具有很强的黏附和吞噬抗原的能力，很容易将外界环境中抗原吞噬，而发生分化，出现伪足现象，这是困扰科研工作者的一个难题。因此对RAW264.7细胞的培养也是一个很长时间摸索的过程。正常的RAW264.7细胞是圆形透亮的，而分化之后很容易产生触角，此时细胞已经在功能上发生改变，进而影响实验结果。在我国很多细胞库给购买者的建议是用0.25%的胰酶消化，因此我们采取了用0.25%的胰酶消化法来进行培养，发现用一般的胰酶配制的0.25%的胰酶可以很快的将细胞消化下来，但是对细胞的损伤很大，细胞传代之后在培养瓶中很难贴壁，很少贴壁的细胞，细胞棱廓也变得模糊不清，细胞再也很难恢复之前的状态。根据很多培养RAW264.7细胞的科研工作者的经验，认为RAW264.7细胞很难用0.25%的胰酶消化这一说法，一直困惑着我们。提示这种反差的现象也许跟胰酶的纯度有关。于是我们改用细胞刮棒的方法进行传代，发现细胞状态损伤较小，细胞在传代2~4 h内基本贴壁，且细胞状态完好。具体方法是沿着细胞壁的一端顺势往另一端刮，力度要轻柔，能够将细胞刮掉即可。这里强调一定要轻，细胞是个很脆弱的个体，力度过大对细胞会造成物理损伤，严重时不能恢复其正常形态。对于RAW264.7细胞培养使用的培养基很多经验者建议使用1640，中科院上海细胞库则建议使用DMEM高糖培养基，胎牛血清可使用GIBCO胎牛血清，也可使用国产杭州四季清。因此我们对培养基和胎牛血清（FBS）的使用进行了正交实验，研究发现DMEM高糖培养基与GIBCO胎牛血清培养的细胞状态最好，但对于资金短缺的科研工作者也可以使用DMEM高糖培养基与国产杭州四季清进行培养，1640则需与GBICO胎牛血清配合使用，这样才能保证细胞状态圆而透亮。关于FBS是否灭活则需要根据你所买的FBS是否含有对细胞刺激较大的抗原决定，如有些杭州四季清含有低内毒素，内毒素是引起巨噬细胞炎症反应的激动剂[3]，此时我们则需灭活，因此在购买血清时应尽量避免含有这类抗原的血清。血清购买回来需及时分装，分装需在无菌条件下操作，然后置于-20℃保存。下面根据对RAW264.7培养研究，将细胞复苏，细胞传代以及细胞冻存的要点归纳如下。
2.1细胞复苏 从液氮罐中取出冻存管，迅速将冻存管放到已经预热的水浴锅（37℃）中迅速解冻，不断的摇动，待冻存管内液体完全溶解（控制在1 min内），取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内，将冻存管内的液体转入15 mL离心管，加入2倍体积含10%胎牛血清的DMEM培养基，800 rpm离心3 min，弃去上清液，重悬细胞，接种到培养瓶中，37℃，5%CO2条件下培养，此时重点是细胞冻存本来就是对细胞的损伤，需采用的是20%的胎牛血清进行复苏培养，第二次传代后换成10%FBS培养。
2.2细胞传代 待细胞长至80%~90%时，从培养箱内取出细胞，小心吸出培养液，用PBS清洗，加入3 mL 10%胎牛血清的DMEM培养基，用细胞刮棒沿一个方向轻轻的将细胞刮下来，将细胞悬液转移到15 mL离心管中，800 rpm离心3 min，弃去上清液，加入培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液，分装入培养瓶后，放入培养箱37℃，5%CO2条件下培养，因为RAW264.7细胞的增殖非常快，因此传代比例根据自己实验需要1∶3~1∶10均可。
2.3细胞冻存 待细胞长至80%~90%时，按细胞传代方法把细胞收集起来，将配制好的冻存液加入细胞中重悬，每管2 mL，冻存液的配制方法是：胎牛血清与二甲基亚砜（DMSO）的比例为9∶1，依次放在4℃中40 min，-20℃中40 min，-80℃中过夜，第2 d转移至液氮灌中保存。
3影响RAW264.7细胞培养的因素
3.1培养基酸碱度 根据对RAW264.7的培养研究发现酸碱度对于RAW264.7细胞的培养影响最大，GBICO的DMEM建议在配制过程中加入3.7 g NaHCO3，中科院上海细胞库建议加1.5 g NaHCO3，然后用1MHCL调pH至7.2～7.4，过滤分装置在4℃冰箱备用。但是在冰箱里放置3 d或1 w后培养基就很容易变紫，但是很多研究者并没有在意这个问题，仍然用变紫的培养基继续培养，之后细胞就会出现漂浮或者变成梭形。文献提示可采用HEPES法进行缓冲[4]，我们研究发现虽然HEPES缓冲能力更强，培养基变碱的时间会延长，但放置时间久后仍然会变紫，通过比较可采用将HEPES配置成母液，过滤并分装，然后每次传代的时候用HEPES调节培养基，将培养基调至所需的pH。
3.2培养耗材 RAW264.7细胞是一类巨噬细胞，因此对于接触细胞的培养耗材如：枪头、培养皿等要求需要高一些，研究发现高温180℃烘干的耗材比120℃高压灭菌的耗材培养的细胞，细胞的形态更圆更亮，提示尽量减少抗原有助于RAW264.7细胞的培养，这与方瑶等研究发现相一致[5]。
4结论
RAW264.7细胞的培养和研究已然成为一个趋势，对于RAW264.7细胞的培养也需要标准化的方法，本实验研究发现RAW.264.7细胞的最佳优化条件即：DMEM高唐培养基+10%FBS，细胞刮棒沿着一个方向轻轻刮取细胞，传代的比例最佳为1∶4，采用过滤的HEPES每次实验时调节pH。细胞的培养本身就是一个复杂的过程，只有细胞处于最佳状态时才能给科研工作者带来更可靠的实验结果，因此对于细胞的培养，我们更要花耐心和精力去呵护。
参考文献：
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细胞培养范文4
【关键词】高职院校；细胞培养技术；教学改革
一、细胞培养技术课程教学中存在的问题
（一）课程的教学目标与工作需求之间存在一定差距。高职教育应注重培养学生的实践操作能力，因此在实际的教学过程中也要以此为目标进行教学。但在实际的教学过程中，尽管学校安排的实践教学的课时不少，但却并没有取得良好的教学效果，其原因在于教学的过程过于形式化，并没有把培养综合动手能力这一具体教学目标渗透到实践教学中，并且，在该课程考试中，也偏重于对理论知识的考核，轻视对职业技能的考核。教学目标并没有完全纳入整个课程的教学体系，不能有效满足社会对人才的需求。
（二）课程的教学内容与实践工作联系不紧密。在课程的实践教学内容中，普遍存在着设计性、综合性实验较少的问题，新的知识和技术不能有效的运用于实验中，这就造成了学习内容与工作内容相脱离的现象。不利于学生日后的工作发展。
（三）课程的保障设施不足制约教学进一步深入。细胞培训课程需要良好的配套设施来支撑整个教学计划，然而，目前高职院校普遍存在着教学实践设备不足、缺乏现代化生产模型的问题。并且，在校外实训环节，由于缺乏与实际一线工厂的联系和沟通，学生在实训场合没有太多的锻炼机会，这些都制约着课程的推进和学生实践能力的提升。
（四）课程的实践教学环节管理不规范。高职院校对学生的实践过程未能实现全程管理，缺乏对学生的实时指导，学生在实践环节中主要依靠自觉性进行自我锻炼。管理的不科学、不深入、不具体造成了很多学生在实习中敷衍了事，影响了整体的教学质量。
二、细胞培养技术实践教学的设计理念
（一）细胞培养技术课程的具体定位。高职院校的细胞培养技术课程应立足于市场，深入探究当前农业、畜牧业、食品加工等行业的具体需求，依托自身的资源优势，培养符合企业要求的具有高素质技能的人才。
（二）细胞培养技术课程的未来岗位技能需求。通过对高职院校学生就业情况、生物科技行业发展情况、企业岗位的需求情况的调研，市场上主流的关键技能为动物细胞培养技术、生物检测技术、分离纯化技术。专业的设置要充分满足企业对专业技能的需求，只有这样才能真正提高学生的职业技能。
（三）细胞培养技术课程的教学设计思路。搭建开放性和职业性的实践平台，充分体现专业内涵，着重培养学生的职业能力素养。实践的内容要严格基于工作过程需求，并在此基础上改变过去单一学校的教育模式，积极实施校企合作的教学理念，让学生在学校期间就能切实体会到工作环境和氛围，从而提升细胞培养技术的教学质量。
三、细胞培养技术课程的教学新体系的建立
（一）立足企业产品，设计教学活动。以疫苗为例，细胞培养技术的课程未来的就业方向其中很有分量的一份工作就是生产疫苗。目前，疫苗的生产主要依托于鸡胚成纤维细胞进行。所以，在课程的实践教学活动中要以鸡胚成纤维细胞的培养为侧重点，以具体的岗位要求为标准，设置相应的教学体系。
（二）以工作过程为导向，设计教学的具体任务。以企业鸡胚成纤维细胞疫苗的生产为例，要结合具体的生产岗位需求，按照生产流程，把细胞培养技术课程分解为六个部分。分别为鸡胚成纤维细胞培养准备工作、鸡胚成纤维细胞的原代培养、鸡胚成纤维细胞培养过程的检测、鸡胚成纤维细胞的传代培养、鸡胚成纤维细胞的病变培养、鸡胚成纤维细胞的冻存与复苏六项具体任务。通过细化培训任务，把教学目标融入到实际的教学环节中，进一步培养学生严谨的科学态度，培养学生分析和解决问题的能力，锻炼学生的创新意识和职业能力，为学生适应好日后的工作打下坚实的基础。
（三）以教学做一体化为核心，设计教学模式。所谓教学做一体化是指重点培养学生的自主学习能力，以学生为主体，在教师的主导下，通过实践活动锻炼学生的创新意识和职业素养。在具体的教学实践中，以行动为导向，以任务为驱动，拓宽实践教学的渠道，从感知理解到学以致用，充分激发学生的学习热情，营造和谐有序的学习氛围。
四、细胞培养技术课程的教学体系的组织和落实
（一）校企合作共同开发课程的实践内容和目标。改变传统的教材编写模式，采用校企合作的方式，以具体的工作流程为主线，以工作任务为载体，严格按照企业的岗位需求进行编写实践教学内容，使教学与工作不分离，使教学更有针对性。
（二）具体教学任务的开展。紧紧围绕教学目标，把具体的工作任务细化为七个步骤，第一，教师讲解工作任务和工作方式；第二，学生根据具体任务组建团队，并策划出具体工作方案；第三，将团队工作方案进行汇报，经教师指导进一步完善实施方案；第四，在教师指导下，开展团队工作；第五，团队进行内部总结和交流；第六，班级内开展团队间的交流与沟通；第七，以团队为单位进行教学实践活动总结。
（三）搭建开放式教学实践平台。开放式教学是产学研相结合人才培养模式，是指在时间、地点、内容、手段等方面全方位的向学生开发的教学模式。高职院校与企业合作，运用实际的企业项目进行教学实践，由学生分组进行，采取教师带队、组长负责的原则，利用课余时间开展项目研究，并定期对项目进展做出报告，最终实现项目的成功研发。
五、细胞培养技术课程的教学评价体系
科学的教学评价体系不仅是对教学实践的监控，更重要的是有利于激发学生的学习兴趣，培养学生的职业素养、创新精神和团队精神。根据细胞培养技术课程的自身特点，考核体系主要分为四个部分，即常规教学部分，开放实践教学部分、专门考核部分和奖励部分。结合技能评价、定量评价、校企合作评价等方式完善评价体系。
细胞培养技术课程的改革任重而道远，需要学校、企业、学生三方的密切配合，不断深化改革，切实实现教学做一体化，推动高职院校的细胞培养技术课程的教学培养质量，为社会输送高素质的人才。
细胞培养范文5
羊水细胞培养是产前诊断的一个重要技术手段，主要应用于胎儿染色体疾病的产前诊断。由于羊水中存活细胞比较少、培养周期长、无菌要求和技术要求高，容易失败，使羊水细胞培养在产前诊断的应用受到限制。针对以上情况，近年来我们吸取了国内外的一些先进经验[1，2]，结合自身的条件，与相关科室进行合作，对羊水细胞培养技术进行改进，并对1 200例孕15～30周孕妇进行了羊水细胞培养的产前诊断，取得了理想效果。
对象与方法
1.对象：选取2003年7月至2005年12月在河南省新乡市妇幼保健院接受产前羊水细胞培养检查的孕妇共计1 200例，常规羊水细胞培养(常规组)和高效改良羊水细胞培养(改良组)均抽取600例。来诊孕妇按1∶1的比例随机分成2组。常规组年龄分布(28.8±3.6)岁，孕周分布孕15～24周，平均(20.2±2.8)周，改良组年龄分布(28.5±3.7)岁，孕周分布15～24周，平均(20.3±2.7)周，2组年龄、孕周比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本次高效改良羊水细胞培养科研项目经过新乡市妇幼保健院医学伦理委员会批准施行。
2.检验方法：对羊水细胞培养后在显微镜下进行观察，检查染色体情况，进行染色体异型性分析。根据分析结果统计检验量。(1)常规羊水细胞培养。取妊娠16～20周的羊水10～20 ml，注入10 ml离心管中，1 000 r/min心10 min，弃去上清液，留0.5～1.0 ml轻轻吹打成细胞悬液，移入25 ml培养瓶中，加入pH值为6.8的F10培养液3 ml和血清1 ml，置37 ℃温箱中静置培养5～6 d，见纤维或上皮样细胞生长，以后每天或隔天观察一次，一般培养8～14 d，细胞进入旺盛生长期[3]。(2)高效改良羊水细胞培养。穿刺抽取羊水25 ml，然后分别取10 ml注入2只20 ml试管中，高速离心(1 000 r/min)8 min，上清液弃去，每只试管中留4～5 ml制备成细胞混悬液。在培养皿中培养液4 ml，缓慢滴入细胞混悬液，恒温(37.5 ℃)静置。根据文献报道，一般6～9 d细胞生长最为旺盛，可以收获细胞。收获前30 min，滴定秋水仙素终末浓度2 mg/L。收获先后进行离心，低渗，固定和制片程序。标本经过老化后用胰酶染色并消化，然后在显微镜下观察。我们于10倍目镜和10倍物镜下观察。以梭长形羊水细胞为主要类型的生长细胞，形成的细胞克隆覆盖1个或1个以上的完整视野;培养瓶中有2～3个以上细胞克隆，且每个细胞克隆中存在有20个以上的圆形、双圆形或葡萄状透亮细胞，细胞核大而圆，细胞圆而大，明亮如一片明珠，相互联接，细胞克隆中央的细胞开始老化，克隆周边细胞生长旺盛。
3.统计学处理：统计培养时间，镜下观察后，进行统计记录，然后进行计数资料的χ2检验。
结果
1.2组培养时间比较：常规组的总体培养时间为9～14 d，平均(11.0±2.6) d;改良组的总体培养时间6～10 d，平均(7.5±2.3) d。改良组培养时间和常规组相比较明显缩短，差异有统计学意义(P
2.成功率比较：改良组羊水细胞培养的成功率为95.8 %(575/600)，常规组成功率为37.7 %(226/600)，改良组羊水细胞培养的成功率明显高于常规组，差异有统计学意义(χ2 =4.25，P
3.分裂相检出率比较：改良组分裂相平均每例为(93.6±22.1)个，常规组分裂相为(53.2±19.9)个，改良组分裂相的检出率明显高于常规组，差异有统计学意义(χ2=4.95，P
4.异常检出率比较：改良组发现异常核型12例，其中21-三体综合征6例(50.0 %)，18-三体综合征3例(25.0 %)，其他3例(25.0 %)，总阳性率为2.0 %(12/6 000)。常规组发现异常核型4例，其中21-三体综合征2例(50.0 %)，18-三体综合征2例(25.0 %)，其他2例(25.0 %)，总阳性率为0.7 %(4/6 000)。改良组异常核型检出率高于常规组，但是2组检出的异常核型的比例基本相同，都分别是21-三体综合征50.0 %，18-三体综合征25.0 %，其他25.0 %，差异有统计学意义 (χ2 =4.12，P
讨论
羊水细胞培养法是1966年首先应用于临床胎儿染色体疾病的产前诊断并获得成功的[4]，此后广泛应用并成为目前产前诊断的重要技术手段[5];然而其无菌要求、恒温要求、培养接种和收获技巧比较高，容易失败。在此基础上，我们结合临床实际，对该方法进行了改良：(1)增加抽取羊水量;(2)2只试管离心;(3)细胞悬液量增加;(4)收获前30 min，滴定秋水仙素终末浓度2 mg/L。收获先后进行离心，低渗，固定和制片程序。标本经过老化后用胰酶染色并消化。经改良后提高了效率，并且在临床应用中取得了良好的效果。
普通羊水细胞培养法和高效改良羊水细胞培养法都是比较安全可靠的产前诊断方法。高效改良羊水细胞培养法的培养时间可以缩短3～4 d，培养成功率远远高于普通羊水细胞培养法，而且分裂相，异常核型的发现比率等技术指标都高于普通羊水细胞培养法，具有较高的临床应用价值，值得在临床推广应用。
参考文献
1Lam Y H， Tang M H， Sin S Y， et al.Clinical significance of amniotic-fluid-cell culture failure[J]. Prenat Diagn，1998.18(4)：343-347.
2马长俊，陈园茶，霍沛丹.羊水培养与染色体制片方法[J].生殖与避孕，1985，5:23.
3程在玉，主编.医学遗传学基础与临床[M].青岛：青岛出版社，1993.75.
细胞培养范文6
胶原是动物体内含量最丰富的蛋白质，属于不溶性纤维蛋白质，遍布于体内各种器官和组织，如皮肤、骨、软骨、肌腱、角膜等等。明胶（Gelatin. Gel），是胶原的部分变性衍生物，无抗原性，生物相容性好，可生物降解[7]。
甲壳素是一种天然高分子化合物，属于多糖。壳聚糖（Chitosan, CS）, 是甲壳素的脱乙酰化产物，是细胞外基质中糖胺聚糖结构类似物。壳聚糖是一种具有优良生物相容性的可降解材料，其在哺乳动物体内能被溶菌酶降解成氨基糖，氨基糖可以进入糖胺聚糖和糖蛋白的代谢循环，也可以排除体外。它还具有低抗原性、促进伤口愈合，抗菌等特性。此外壳聚糖是带正电荷的线性多糖，它可与带负电的生物大分子，如明胶形成聚电解质配合物。壳聚糖还具有较好的力学性能，而且易于加工成型。综合明胶和壳聚糖的优点，将壳聚糖和明胶复合制备多孔支架材料, 将能满足对支架材料的要求[8-10]。
目前，气管组织工程研究的方法是在体外的支架材料上培养气道平滑肌细胞(airwaysmooth muscle cell, ASMC )，形成有功能的组织。本实验研究在不同条件下制备壳聚糖-明胶三维支架的结构和性质，以及平滑肌细胞在支架中生长的状态，为筛选可作为气道组织工程研究用的材料奠定基础。
2 材料和方法明
明 胶（ Sigma Chemical Co. ） ； 壳聚糖（HaiHui Bioengineering Co. ） ； 溶菌酶（7000u/mg,Biosharp,Japan）；戊二醛(分析纯,成都科龙化工试剂)；醋酸（分析纯，成都科龙化工试剂）；DMEM/F-12 培养基（Hyclone, USA）；胎牛血清(Sigma, USA)；培养用三蒸水；细胞培养瓶及培养板（Costar，USA）；MTT（Sigma, USA）；FITC-Phalloidin（Sigma,USA）。
2.1 制备三维壳聚糖-明胶支架 2.2 结构观察
用扫描电子显微镜（SEM，TESCAN VEGA ?? LMU）对支架的架构进行观察。在使用SEM 观察支架之前，先用液氮冷冻支架的表面和部分使之断裂,然后喷涂上金。支架孔的平均直径作为支架的有效孔径。随机选择每个样品的三个不同区域，至少选择20 个孔测量孔径。
2.3 孔隙度的测量 支架浸入量筒后，原正己烷和支架的总体积记为（V2）。取出支架后，剩余的正己烷体积记为（V3）。支架的孔隙度ε 可以通过以下公式获得：ε（%）=（V1－V3）／(V2－V3) [13]。
2.4 大鼠气道平滑肌细胞的培养 2.5 细胞在壳聚糖-明胶三维支架中的增殖 2.6 免疫荧光染色
将细胞种植于三维支架材料上以后，选择适当的时间，对细胞骨架进行染色。实验步骤： 2.7 统计学方法
所有实验都反复进行4 次，数据用平均值±标准方差表示，n=4。组间数据采用χ2 分析，p<0.01 表示差异有显著统计学意义；p<0.05 表示差异有统计学意义。计算、统计软件采用Originpro7.5 及ImageJ 1.4g program。
3 结果
3.1 预冻温度和材料浓度对支架微结构的影响 比较不同的预冻温度，最高的孔隙度为93±0.6 %，其预冻温度为-196℃。而同样的预冻温度下，浓度为2wt%和3wt%的支架的孔隙度降为90±0.6%和84±4.7%（表1）。在-20℃、-80℃的预冻温度下，孔隙度有着同样的变化趋势，而相比于-196℃的预冻温度，孔隙度都降低了，显示出孔隙度取决于材料的预冻温度和浓度。
冻干过程是在冰点以下使材料中冰晶升华，形成与原冰晶同样尺度的孔径。在较低的预冻温度下，由于冷冻速度较快，形成数量较多和体积细小的冰晶，导致冻干材料孔径较小，孔壁较薄，孔隙度较大。在预冻温度较高时，冰晶可以不断生长，形成数量较少和体积较大的晶体，导致冻干材料孔径较大，孔壁较厚，孔隙度较小 [19]。而溶液的浓度直接影响溶液的粘度。当溶液浓度较大即粘度较大时，不利于水和分子链的迁移，以至于形成的冰晶较小。
因此孔径与溶液的浓度成反比[13]。
3.2 细胞在支架中的生长
通过扫描电镜来观察平滑肌细胞在材料上的生长。由图2 可以看出，细胞接种到三维支架上以后，能贴附到支架上，在细胞数较少的情况下，细胞更趋向于沿着孔壁生长。多孔结构的优势在于为细胞提供了足够的生长空间和更大的附着面积, 同时有利于营养成分的进入和代谢产物的排出而不致引起细胞的生长抑制作用[20]。培养6 天的时间内，细胞在支架上黏附生长良好，但细胞并未完全伸展。同时细胞没有铺满孔壁，还较少向孔中生长。
3.3 MTT 检测细胞增殖
通过MTT 实验来测试气道平滑肌细胞在材料中的细胞活性。细胞在材料中的生长受到多种因素的影响，包括表面结构、理化性质等。把等量的细胞种植于支架中。由图3 可见，随着时间的增加OD 值也随之增加，说明细胞在材料中生长良好。同时有图3 可以看出，支架的微结构对细胞的增殖情况有一定的影响。实验发现，随着支架孔径以及孔隙度的增大，时间的延长， 细胞的增殖情况良好。而且孔隙度对细胞增殖的影响较为显著（*p<0.01,**p<0.05）, 说明支架的孔径对细胞的增殖起着重要的作用，然而支架的孔隙度在细胞增殖过程中起着更为显著和决定性作用。
3.4 免疫荧光染色
