前言：中文期刊网精心挑选了细胞核范文供你参考和学习，希望我们的参考范文能激发你的文章创作灵感，欢迎阅读。
细胞核范文1
1．知识目标
①概述细胞核的结构和功能。
②能够区别原核细胞和真核细胞。
③描述染色质组成以及与染色体的关系。
2．能力目标
①通过资料分析，提高实验设计的能力。
②尝试制作真核细胞的三位结构模型。
3．情感目标
①认同细胞核是细胞生命系统的控制中心
②确立生物体结构与功能相统一的辩证观点。
③在合作探究与交流中体验学习的乐趣。
【教学方法与策略】
1.探究式教学
利用多媒体课件展示克隆羊培育过程；伞藻实验和变形虫实验，实验展示过程中步步设疑，层层深入，启发学生带着问题去思考、去观察，让学生自己在探究过程中通过分析得出结论，掌握细胞核的功能。
2.导学案教学
精心设计编写导学案，通过导学案，激发学生的探究兴趣，提高学生自主学习的能力。
【学情分析】
经过初中阶段的学习，学生对细胞的基本结构有了一定的认识，有了“细胞核控制生物的遗传”的基本理念，但对于细胞核如何通过控制蛋白质合成来控制生物遗传和代谢还不了解，因此要把握好知识的延展，另外学生对克隆羊、伞藻嫁接等实验又很感兴趣，因此通过实验设计的探究，可以引发学生进行实验的兴趣，提高学生设计实验的能力。
【教学过程】
引入新课
【创设情境】
出示植物细胞和细菌的亚显微结构图片，要求学生观察比较两者的不用，同时说出细胞内各结构的名称。
【讲述】原核细胞和真核细胞最主要的区别是有无细胞核，以及细胞核中结构的区别，等我们学完这节课之后，再来完成两者细胞核的不同之处。
学生观察、回忆，说出各结构名称，同时通过比较，得出两者的区别。
植物细胞：有细胞核和各种细胞器，为真核细胞。
细菌细胞：没有细胞核，只有核区，只有核糖体，为原核细胞。
一、细胞核的结构
【提问】大家阅读课本，思考：
真正的细胞核具有什么样的结构呢？
学生通过阅读，回答：细胞核包括：核膜（2层膜，有核孔，是大分子物质出入的通道）、核仁（与核糖体的形成有关），染色质（由DNA和蛋白质组成，是遗传物质的主要载体）。
【讲述】染色质、染色体：主要有DNA和蛋白质组成，呈细长丝状，因易被碱性染料染成深色而得名。若细胞要分裂，染色质就螺旋化，缩短变粗，形成棒状或杆状的染色体（用自制的教具讲解）。
学生阅读课本填写染色质与染色体比较表。
二、细胞核的功能
【提问】具备这些结构的细胞核具有什么功能呢？
资料一：多莉羊的培育过程，使学生对细胞核的功能有初步的认识。
【提问】
1.多莉最像哪只羊？为什么？
2.从多莉的培育过程，你得出什么结论？
学生观察多莉的培育过程，回答：多莉最像B母羊。因为B母羊提供细胞核；得出的结论是细胞核控制着细胞的遗传。
资料二：美西螈核移植实验。
【提问】
1.移植长大后的美西螈是什么体色？为什么？
2.由此你认为生物性状的遗传主要由什么控制呢？
学生观察实验步骤，预测实验结果，得出结论。
【探究活动】验证细胞核控制着细胞的遗传
【提示】伞藻嫁接实验
实验设计思路：学生小组探究设计实验
依据学生的设计思路，以图示来表示实验过程。
【结论】伞藻的嫁接实验说明细胞核控制着细胞的遗传。
【小结】通过以上的实验，我们得出结论，细胞核是细胞进行生命活动所必需的。
三、原核细胞和真核细胞核区的比较
【提问】那么原核细胞中核区的功能与真核细胞的细胞核是否一样？结构又有什么不同呢？
（根据学生的回答，完成表格。）
【课堂小结】
细胞核是真核细胞特有的细胞器，它是真核细胞重要的组成部分。细胞核中包含着携带细胞全部基因组的染色体。由于绝大多数遗传信息贮存在细胞核中，DNA复制、RNA转录都在细胞核中进行，因此，它成为细胞生命活动的控制中心。
【作业布置】
教师：现在同学们已经学习了细胞各个结构的特点及功能，对细胞有了一定的认识，我们可以通过特殊的方法对已学的知识进一步的加深和巩固，这种方法就是建立模型。
注意：科学性、准确性应放第一位，还应考虑艺术性、成本低廉等等。
【板书设计】
细胞核范文2
一、教学设计思路清晰，教学目标明确，教材处理得当，符合学生发展
谭老师用黑绵羊能否生出一个美羊羊为问题导入，新颖又能激起学生学习的兴趣。
紧接着用展示四个资料，每一个资料推出一个细胞核的功能，最终总结出细胞核的功能，培养了学生归纳总结的能力。而且这四则资料并没有按照教材上的顺序按部就班，而是作了细微的调整，让学生更加容易接受。这四个材料并不是散的，每个环节都紧紧相扣，让学生明白下一个环节应该做什么。
二、注重学生能力的培养
谭老师采用启发诱导的方式来培养学生良好的思维习惯，思考问题和解决问题的能力。总共四则材料，首先前两则资料由老师通过提问方式引导学生回答，而且每一个资料分析完得出结论之后都会问：如何验证这一结论？让学生积极思考。在前面老师的引导下形成一定的思维模式之后，后面两个资料就放手让学生自己进行分析。达到了良好的效果。
通过课前模型的构建，课上模型分享，培养了学生的动手能力以及语言表达能力。让学生加深对细胞结构的理解和记忆。整个分享过程轻松愉悦，让学生在快乐中学习。
三、举例生活化，形象，易于接受
本节内容相对来说较为抽象，看不见摸不着，除了用模型让抽象的东西具体化来帮助学生理解之外，谭老师的举例也是一大亮点。比如说，在区别染色质和染色体的时候，用弹簧比作染色体，铁丝比作染色质。让学生一下子就明白了染色质螺旋化形成染色体，染色体解螺旋形成染色质的涵义。
四、其他方面
在整个教学过程中，指向性明确；效率高。课堂上没有一句废话，教材上的重点语句达到一字不差的境界，语言相当精准，让学生第一次接触内容就能够很标准的记忆，对于以后的答题标准化帮助很大。在最后模型分享环节能做到根据学生分享内容做到及时点评纠正，注重细节。
五、建议
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综上所述，肿瘤细胞与正常细胞之间的蛋白表达一定存在着某种差异，使得凋亡素在肿瘤细胞中被特异地修饰。本实验通过蛋白质组学的方法来寻找肿瘤细胞与正常细胞核内的蛋白表达差异，以期望能够进一步探讨凋亡素诱导肿瘤细胞特异凋亡的机制。
2．材料和方法
2.2 pEGFP-C1-apoptin 载体的提取按照 Promega 公司PureyieldTM Plasmid Midiprep System 提取试剂盒进行质粒的提取。
2.7 细胞核蛋白的双向电泳将提好的细胞核蛋白样品分装，送公司进行双向电泳。
3．实验及结果分析
3.2 双向电泳结果我们通过双向电泳进行初步分析，发现HepG2 与L02 细胞核蛋白表达存在差异。
4．讨论凋亡素能够特异引起肿瘤细胞与转化细胞的凋亡，这种细胞凋亡是非P53 依赖的，而不能够导致正常细胞的凋亡。同时我们观察到，凋亡素在细胞内的定位与其凋亡功能密切相关。将凋亡素的基因转染进细胞，24 小时后，我们发现凋亡素无论在肿瘤细胞还是正常细胞，都定位在细胞核内，都不引起细胞的凋亡。48 小时后，凋亡素在肿瘤细胞核内聚集，行使凋亡功能，而凋亡素却从正常细胞的核内出来，在胞质内聚集，不能引起正常细胞的凋亡。于是我们推测，凋亡素行使凋亡功能与其在肿瘤细胞核内受到某种修饰，而停留在细胞核内有关。而这种修饰在正常细胞的核内是没有的，因此肿瘤细胞与正常细胞之间一定存在着某种蛋白表达的差异。
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【摘要】
目的探讨粉防己碱（Tet）对肝星状细胞（HSC）增殖的调控机制。方法培养大鼠HSC，MTT法测Tet对HSC增殖的影响，免疫细胞化学法测Tet对HSC增殖细胞核抗原（PCNA）和细胞周期素D1（CyclinD1）表达的影响。结果 Tet在0.5～1 mg/L的范围内显著抑制大鼠肝星状细胞的增殖(P
【关键词】 粉防己碱 肝星状细胞 增殖细胞核抗原 细胞周期素D1 免疫细胞化学
Abstract：ObjectiveTo observe the effect of tetrandrine on the proliferation and expression of PCNA， CyclinD1 of hepatic stellate cell.MethodsHepatic stellate cells were cultured in RPM1640 medium . The effect of tetrandrine with various concentrations on the proliferation of hepatic stellate cell was observed with the MTT method. The effects of tetrandrine with various concentrations on the expression of PNCA， cyclinD1 of hepatic stellate cells were observed with immunocytochemistry. Results①From 0.5 mg/L to 1mg/L， tetrandrine inhibited the proliferation of hepatic stellate cell in a concentration dependence manner (P
Key words：Tetrandrine； Hepatic stellate cell； PCNA； CyclinD1； Immunocytochemistry
粉防己碱（Tetrandrine，Tet）是粉防己的主要活性成分，有着广泛的药理作用，应用前景广阔，抗纤维化是其重要的药理作用，Tet是抗肝纤维化的有效药物［1］。各种致病因素引起肝脏损伤，细胞因子刺激肝星状细胞激活增殖及转化，细胞外基质(ECM)合成增多及降解减少，继而沉积在细胞间隙，从而发生纤维化。Tet不仅能直接抑制肝贮脂细胞的增殖及转化，而且可阻断血小板衍生因子的促肝贮脂细胞增殖及胶原合成作用。Tet可通过转化生长因子-β信号抑制体外培养大鼠肝星状细胞活性［2］。但是Tet抑制肝星状细胞增殖的具体机制不是很清楚，本研究观察Tet对肝星状细胞增殖过程中增殖细胞核抗原（PCNA）和细胞周期素D1(CyclinD1)的表达的影响，从细胞周期调控角度探讨Tet影响肝星状细胞增殖的机制。
1 器材与方法
1.1 材料大鼠肝星状细胞株，泸州医学院附属医院传染免疫实验中心保存。
1.2 仪器与试剂CO2恒温培养箱（美国Shel-Lab公司）；YJ-1450型医用净化工作台（苏州长春电子仪器厂）；1X71型倒置相差显微镜（日本Olympus光学仪器有限公司）。
粉防己碱（成都四川省药检所）；RPMI1640培养基（美国Gibco公司）；小牛血清（成都哈里生物公司）； PCNA单克隆抗体（NeoMarkers公司）； CyclinD1单克隆抗体（NeoMarkers公司）；ABC免疫组化试剂盒（深圳晶美生物有限公司）。其余试剂均为市售分析纯产品。
1.3 大鼠肝星状细胞培养 用含10%小牛血清的RPMI1640培养基将肝星状细胞培养于37℃，5%CO2孵箱中，换液1次/d，当细胞贴满培养瓶瓶底约80%时，用0.25%胰蛋白酶消化贴壁的细胞，进行传代培养，并细胞及时冻存备用。
1.4 MTT法测Tet对细胞增殖的影响 取对数生长期细胞，于加药前24 h消化后以1×104/ml接种于96孔板中，置于37℃，5%CO2孵箱中培养，待细胞生长达70%融合，将细胞分为 5 组:空白对照组（正常培养基）、0.25 mg/L组（培养基含0.25 mg/L Tet）、0.5 mg/L组（培养基含0.5 mg/L Tet）、1 mg/L组（培养基含1 mg/L Tet）、2 mg/L组(培养基含2 mg/L Tet)，每组设12个复孔。 加药前以无血清培养基洗细胞3次。Tet处理24 h后 ，每孔加入 MTT溶液(5 μg/m1)20 μl，37℃继续培养 4 h后终止反应，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，用酶标仪测各孔波长在490 nm的OD值，并以下列公式计算细胞抑制率 ：细胞抑制率=(空白对照组平均OD值-处理组平均OD值)／空白对照组平均OD值×l00%。
1.5 免疫细胞化学实验取对数生长期细胞，于加药前24 h消化后以4×104/ml接种于置有经多聚赖氨酸处理的盖玻片的24孔板中，置于37℃，5%CO2孵箱中培养，待细胞生长达70%融合，将细胞分为3组：空白对照组（正常培养基）、0.5 mg/L组（培养基含0.5 mg/L Tet）、1 mg/L组（培养基含1 mg/L Tet）。加药前以无血清培养基洗细胞3次。Tet处理24 h后上，PBS洗细胞3次，4%多聚甲醛固定细胞15 min，4%Tri-tonX-100通透细胞 30 min，过氧化物酶阻断剂孵育10 min，非免疫性动物血清中孵育10 min，加一抗4℃冰箱过夜后，生物素标记的二抗中孵育10 min，加SABC复合物孵育10 min，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察，照相。以 PBS代替一抗作阴性对照。每组细胞各进行6次独立性实验。 PCNA、cyclinD1阳性结果判断：PCNA染色：细胞核着色，染成棕黄（褐）色为阳性，浅（灰）蓝色视为阴性；cyclinD1染色：细胞核着色，染成棕黄（褐）色为阳性，浅（灰）蓝色视为阴性。400倍镜下，PCNA、cyclinD1指数通过随机选择5个高倍视野，每视野计数100个细胞中的阳性细胞数。取平均数作为计数指标。
1.6 统计学分析结果用 ±s表示，数据统计分析利用SPSS 14.0软件完成，比较采用单因素方差分析，以 P
2 结果
2.1 Tet对肝星状细胞增殖的影响用MTT法检测了不同浓度药物对细胞增殖的影响， Tet在0.5～1 mg/L的范围内显著(P
表1 不同浓度Tet对肝星状细胞增殖的影响（略）
与对照组比较，*P
2.2 Tet对肝星状细胞PCNA表达的影响PCNA以细胞核表达为主，细胞质也有表达。Tet 0.5，1 mg/L浓度组PCNA阳性表达细胞数与对照组有显著性差异(P
2.3 Tet对肝星状细胞CyclinD1表达的影响CyclinD1以细胞核表达为主，细胞质也有表达。Tet 0.5，1 mg／L浓度组CyclinD1阳性表达细胞数与对照组有显著性差异(P
表2 Tet对肝星状细胞PCNA及CyclinD1表达的影响（略）
表身中数据为每视野中个数；与对照组比较，﹡P
图1 各组PCNA阳性表达情况，SABC法染色，×400（略）
图2 各组CyclinD1阳性表达情况，SABC法染色，×400（略）
3 讨论
粉防己碱（Tetrandrine，Tet）是从中草药粉防己的根块中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱，是粉防己的主要活性成分。Tet是天然的非选择性的钙通道阻滞剂，又是钙调蛋白的拮抗剂，有着广泛的药理作用，应用前景广阔，抗纤维化是其重要的药理作用， Tet是抗肝纤维化的有效药物［1］。本研究通过MTT法发现在一定浓度范围内，Tet能够浓度依赖性的抑制大鼠肝星状细胞增殖。在真核细胞的细胞周期调控中，G0/G1-S期之间的调控点(restriction point，又称R点)是细胞内外信号经传递、整合，汇集到细胞核对细胞增殖进行调控的关键点，由G1期周期蛋白cyclinD1等调控［3，4］。细胞能否通过限制点从G1期进入S期很大程度上取决于G1期内CyclinD1的积累［5］。CyclinD1可与细胞周期蛋白依赖激酶 (cyclin dependent kinase，CDK)结合形成复合物，在 CDK激酶的介导下发生磷酸化，从而促进某些基因的表达 ，这些基因的表达产物可促使细胞通过G1-S调控点 ，使细胞进入自主分裂程序［6，7］。本实验通过免疫细胞化学进一步研究发现大鼠肝星状细胞中存在CyclinD1的表达，在一定范围内，随着Tet浓度的增加，大鼠肝星状细胞CyclinD1蛋白的表达逐渐减少。说明Tet可通过降低细胞周期素CyclinD1的表达而抑制大鼠肝星状细胞增殖。PCNA又称作细胞周期蛋白、DNA聚合酶6辅助因子等，在细胞DNA复制、细胞周期运行中发挥重要作用，PCNA合成与细胞增殖状态关系密切。PCNA从细胞G1后期开始出现表达，S期达高峰，M期表达出现下降，G0期则不表达。各种刺激因子可通过不同的途径诱导肝星状细胞增殖，但都必须通过PCNA的表达这一中间环节，因而它是细胞增殖的必经之路。本研究发现在一定范围内，随着Tet浓度的增加，大鼠肝星状细胞PCNA表达也逐渐减少。说明PCNA表达减少也参与了Tet抑制大鼠肝星状细胞增殖的机制。
可见Tet可以通过降低大鼠肝星状细胞CyclinD1、PCNA表达，进而发挥抑制大鼠肝星状细胞增殖的作用，具体途经可能是Tet通过阻滞钙离子通道，降低细胞内钙离子浓度，抑制钙离子信号途径，降低Cyclin D1蛋白表达进而减少PCNA蛋白表达，后者则阻止细胞通过G1-S调控点进入S期，使其停滞于 G0/G1期，如此细胞无法进入自主分裂程序，细胞增殖便受到抑制。
【参考文献】
［1］ Chen YW， Li DG．Progress in study of tetrandrine on antihepatofibrosis［J］.Zhonghua Xiaohua Zazhi， 2000，20:47.
［2］ Chen YW， WU JX， et al. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells in vitro via transforming growth factor-beta signaling［J］.World J Gastroenterol. 2005 ，11(19):2922.
［3］ Bellacosa A， Almadori G， Cavallo S， et al. CyclinD1 gene amplification in human laryngeal squamous cell carcinomas: prognostic significance and clinical implications［J］.Chin-cancer-Res.1996， 2:175.
［4］ Cattam P， Hohaus S， Bellacosa A， et al. Association between cyclinD1（CCND）gene anplification and human papillomavirus Infection in human laryngeal squamous cell carcinoma［J］.Chin-cancer-Res.1998，4:2595.
［5］ 曹跃琼， 乔守怡，赵寿元. 细胞周期抑制蛋白cyclinD1及INK4研究进展［J］.国外医学分子生物学分册，1998， 20:1.
细胞核范文5
关键词 糖尿病足 中医证型 胫后动脉 血管细胞核增殖相关抗原 临床研究
糠尿病足是糖尿病的严重并发症，据统计1996年全球糖尿病患者1．2亿，预计到2025年，将达到2．5亿以上，而大约15％的糖尿病患者将在其生活的某一时间发生足溃疡或坏疽[1]。目前对于糖尿病足病因及发病机制虽然还不是完全清楚，但大家公认糖尿病合并大血管病变导致动脉粥样硬化是糖尿病足发病的最主要因素。现将2004年10月～2005年5月间我们收治的32例糖尿病足患者的截肢动脉标本的血管细胞核增殖相关抗原(Ki67)与其中医辨证分型的相关性研究情况报告如下。
1 临床资料
1．1 一般资料：32例均为天津医科大学代谢病医院和天津中医学院第一附属医院2004年10月～2005年5月间的住院患者，其中男性24例，女性8例；年龄50～86岁，平均年龄69．2岁；糖尿病病程最长30年，最短6年，平均18±2．4年。
1．2 诊断标准：糖尿病足的诊断标准采用2000年中华医学会糖尿病学会第二届糖尿病足会议所制订的“糖尿病足(肢端坏疽)检查方法及诊断标准”。
1．3 截肢标准：参照国际糖尿病足工作组编写的《糖尿病足国际共识》中关于“大截肢的定义、标准和指标”[2]执行。
1．4 中医辨证分型标准：参照《中医外科学(第七版)》及《中药新药临床研究指导原则・脱疽》之中医辨证分型方案分为气阴两虚瘀阻证、脉络瘀热证、气血两虚瘀阻证、脉络热毒证四型。
2 观察方法
2．1 标本取材：坏疽截肢标本32例，其中按中医辨证分型气血两虚瘀阻组10例，脉络瘀热组10例，气阴两虚瘀阻组4例，脉络热毒组8例，取各例标本下肢胫后动脉。标本经过10％福尔马林固定，常规石蜡包埋，备用。
2．2 设备、试剂：美国PENGUIN-600CL自动图像分析系统，细胞核增殖相关抗原(Ki67)抗体PV9000试剂盒DAB购于北京中山生物技术有限公司。
2．3 免疫组织化学法：标本常规石蜡包埋，4μm连续切片，采用PV法进行免疫组化染色，染色过程严格按试剂盒染色程序进行，选取已知的阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。观察细胞核增殖相关抗原(Ki67)，阳性物质呈棕黄色细颗粒状于细胞核表达，采用美国PENGUIN-600CL图像分析系统进行图像分析，选取病变处每500个细胞Ki67的阳性表达率作为其阳性表达指数。统计学处理应用SPSS10．0软件包进行方差分析。
3 结果
3．1 中医各证型所占比例以及年龄、性别分布：各证型比例，气血两虚瘀阻组10例（31．25%），脉络瘀热组10
例（31．25%），气阴两虚瘀阻组4例（12．5%），脉络热毒组8例（25．0%）。年龄、性别分布情况，见表1。
表1 32例患者年龄、性别分布 n（%）
性别n50~60岁61~70岁71~80岁80岁以上男24（ 75．0）4（12．5） 8（25．0）11（34．4）1（3．1）女 8（ 25．0）1（ 3．1） 3（ 9．3） 4（12．5）0 总计32（100．0）5（15．6）11（34．4）15（46．9）1（3．1）3．2 免疫组织化学法观察各证型Ki67表达差异：具体情况见表2。
表2 各证型Ki67阳性表达指数比较 （%）
证型Ki67阳性表达指数脉络热毒 4．87±1．01*气阴两虚瘀阻1．86±0．47脉络瘀热1．49±0．13气血两虚瘀阻0．30±0．18注：与气血两虚瘀阻型比较，*P
气血两虚瘀阻证、脉络热毒证、脉络瘀热证、气阴两虚瘀阻证中均可见部分细胞Ki67呈阳性表达，在脉络热毒证中表达指数最高，气血两虚瘀阻证中表达指数最低，二者比较具有显著性差异(P
4 讨论
Ki67抗原为细胞核内与细胞分裂增殖相关的蛋白抗原，分子量为345kd和395kd，其编码基因位于第10号染色体上。Ki67的表达出现于G1中期到晚期，S期和G2期逐渐增加，有丝分裂期达高峰，分裂后迅速降解或丢失抗原决定簇，到G0期则不表达，半衰期为lh或更短[3]。有人认为它可能是具有蛋白结合特性的重要结构，在有丝分裂中起着维持DNA规则结构的重要作用[4]，是一个反映细胞增殖的敏感指标。
在糖尿病足的不同辨证分型中气血两虚瘀阻证、脉络热毒证、脉络瘀热证、气阴两虚瘀阻证中Ki67表达均呈阳性，在脉络热毒证中表达最强、气血两虚瘀阻证中表达最弱，二者相比具有显著性差异(P＜0．05)。根据Ki67阳性指数可以判断细胞增殖的活性，指明细胞增殖与糖尿病足动脉病变的关系。在糖尿病足的不同辨证分型中动脉的硬化闭塞程度由轻到重依次是脉络热毒证、气阴两虚瘀阻证、脉络瘀热证、气血两虚瘀阻证。Ki67的阳性表达与糖尿病足动脉硬化闭塞程度呈负相关。而在通过对32例糖尿病足截肢的动脉进行病理学观察的过程中发现糖尿病足血管病变主要体现在中动脉的病理学变化，其中脉络热毒、气阴两虚瘀阻两证型以动脉周围及全层的炎症性改变为主；脉络瘀热、气血两虚瘀阻证以中膜钙化、平滑肌细胞萎缩、变性、坏死及胶原纤维增多及内膜粥样斑块形成为主，炎症表现不明显；而Ki67的阳性指数与血管炎症病变程度呈正相关。这说明炎症在糖尿病的大血管病变的过程中起了重要的作用，特别是在脉络热毒证、气阴两虚瘀阻证两型，这对临床具有重要的指导意义。
5 参考文献
1 Boulton A J. The diabetic foot：a global view. Diabetel Metab Res Rev，2000，16(1)：2．
2 许樟荣，敬华．糖尿病足国际共识．中华糖尿病学会第二届足病第一次足病研讨会．2002，435．
细胞核范文6
关键词：癫痫；大针手法；督脉；海马；核转录因子-κB
中图分类号：R742.1 R246 文献标识码：A
doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2014.04.045
文章编号：1672-1349（2014）04-0471-04
Effects of Nuclear Factor-kappa B Expression in Hippocampal Nerve Cells of Epileptic Rats through Dazhen Acupuncture Manipulation on Du Meridian
Ni Wenjie，Zhao Lixin，Duan Shuqin，et alShanxi Hospital of Traditional Chinese Medicine（Taiyuan 030012）
Abstract：Objective To study the effects of nuclear factor-kappa B（NF-κB） expression in hippocampal nerve cells of epileptic rats through dazhen acupuncture manipulation on Du Meridian，then explore the mechanism of anti-epilepsy through dazhen acupuncture manipulation on Du Meridian，provide new theoretical basis for clinical acupuncture treatment of epilepsy.Methods Thirty health rats were randomly and enenly divided into blank control group（group A），epilepsy model group（group B），dazhen acupuncture manipulation group（group C），Lithium chloride and pilocarpine were injected the rats’ enterocoelias of group B and group C，induce status epilepticus（SE） model.The rats’ behavior changes were observed.Equal dose of normal saline were injected the rats’ enterocoelia of group A.Any treatment was not given to group A，dazhen acupuncture manipulation was applied at points of Du Meridian ：Fengfu，Dazhui，Taodao，Wuming，Shenzhu，once a day，20 minutes every time，treatment for 14 days.The pathological morphological changes in the hippocampal nerve cells of the three groups were observed by using HE staining.The expression of NF-κB P65 in hippocampal nerve cells of the epileptic rats were observed by immunohistochemistry.Results The status epilepticus were induced in group B and group C，one rat dead in two groups.The rats in group B had obvious pathological morphological changes，the pathological morphological change in group C had obvious improvement. There was no obvious pathological morphological changes in group A.Immunohistochemical staining：The expression of NF-κB P65 was（13.95±6.99） in group A，（28.75±8.80） in group B，（19.25±8.60） in group paring each two groups，the differences are statistically significant（P
Key words：epilepsy；dazhen acupuncture manipulation；Du meridian；nucler factor-kappaB
癫痫（Epilepsy）是由多种原因引起的脑部兴奋性过高以致某些神经元突然过度异常放电，导致脑部功能短暂异常，临床表现为阵发性意识改变或丧失，同时可有阵发性抽搐、感觉异常、特殊感觉现象或行为障碍的一种慢性临床综合征。持续而频繁的癫痫发作可导致大脑神经元细胞的凋亡，本病长期反复发作，不仅使患者躯体遭受痛苦，而且在一定程度上导致精神及社会心理障碍，在智能及人格方面均受到损害。
许多实验研究发现，在癫痫发病中，核转录因子-κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）作为转录因子参与了急性炎症过程，作为细胞因子参与了神经兴奋和/或神经胶质瘢痕的形成。因此，本实验研究NF-κB在癫痫大鼠海马中的表达，进而研究大针手法对癫痫大鼠神经NF-κB表达的调节作用，对针刺治疗癫痫的作用机制进行研究，为针灸临床治疗癫痫提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 Wistar大鼠30只，体重200 g～250 g，雌雄各半，由山西省中医药研究院中心实验室提供，实验动物生产许可证号：SCXK（晋）2010-0002，实验动物使用许可证号：SYXK（晋）2010-0002，实验动物合格证号：0000014，室温22 ℃～26 ℃室内，湿度70%，分笼喂养。
1.2 试剂与仪器 氯化锂（Lithium chloride，美国Sigma公司），毛果芸香碱（匹鲁卡品，Pilocarpine hydrochloride，美国Sigma公司），水合氯醛（Chloral hydrate，天津市科密欧化学试剂有限公司），多聚甲醛（Paraformaldehyde，天津市化学试剂研究所），兔抗NF-κB多克隆抗体（sc-372，美国Santa Cruz公司），山羊抗兔IgG （sp-9001，北京中杉金桥），DAB显色试剂盒（ZLI-9032，北京中杉金桥公司），切片机（德国莱卡RM2015），离心机（北京离心机厂LDZ5-2型），电子天平（瑞士METTER AE100型），移液器（德国EPPENDORF），干燥箱（日本三洋MIR-153型），低温冰箱（日本三洋MDF-382E型），恒温水浴箱（江苏太仓医用仪器厂DSHZ-300型），医用微波炉（浙江临安爱迪仪器厂YWY781B型），显微镜（日本OLYMPUS公司 BX51T-PHD-J11），计算机图像处理系统CMOS（日本OLYMPUS公司），多功能真彩色细胞图像分析管理系统（美国Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus）。
1.3 实验方法
1.3.1 动物分组及模型制作 30只大鼠随机分为3组：空白对照组（Α组）、癫痫模型组（Β组）、大针手法组（C组），每组10只，雌雄各半。Α组：腹腔注射同等容量的生理盐水代替氯化锂和匹鲁卡品；Β组：腹腔注射氯化锂3 mmol/kg，24 h后腹腔注射匹鲁卡品30 mg/kg，分3次注射，每次间隔10 min，直至出现无间歇的癫痫持续状态；C组：腹腔注射氯化锂3 mmol/kg，24 h后腹腔注射匹鲁卡品30 mg/kg，分3次注射，每次间隔10 min，直至出现无间歇的癫痫持续状态。
参考Racine分级标准（0级～V级）：0 级，正常；Ⅰ级，湿狗样颤动，面肌痉挛，如眨眼、动须、节律性咀嚼等；Ⅱ级，节律性点头； Ⅲ级，前肢阵挛；Ⅳ级，站立伴双侧前肢阵挛； Ⅴ级，跌倒失平衡，四肢抽动。B组、C组大鼠诱导出Ⅳ级～Ⅴ级癫痫持续状态（SE）且SE发作持续1 h视为造模成功，SE发作持续1 h后，予大鼠腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）终止发作，若注射水合氯醛30 min后未终止发作，予150 mg/kg重复注射，直至终止发作（以3次为最高限）。记录大鼠行为学变化。
1.3.2 治疗方法 Α组、Β组不做任何治疗；C组用1寸不锈钢针，针刺大鼠督脉穴：风府、大椎、陶道、无名（2～3胸椎棘突之间）、身柱（取穴参照《实验针灸学》中大鼠的穴位），每日1次，每次20 min，中间行针1次，平补平泻，治疗14 d。
1.3.3 海马取材 针刺14 d后，第15天时对大鼠脑组织进行取材。各组大鼠用10%水合氯醛腹腔注射，每只1 mL，过度麻醉，迅速剪开胸腹腔，暴露心脏肝脏，先经左心室快速灌注4 ℃生理盐水300 mL（灌注针由左心室进针穿入主动脉，止血钳固定，剪破右心耳，快速灌注生理盐水300 mL），后接含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS，0.1 mol/L，pH=7.4）300 mL，先快后慢，灌注固定，大鼠迅速出现四肢颤动，颈部变硬，尾部变硬伸直，待大鼠全身僵硬后，迅速断头开颅取脑，将修整后的脑组织置于4%多聚甲醛中，4 ℃冰箱保存。24 h后，将大鼠脑组织移入含20%蔗糖的0.1 mol PB溶液（磷酸盐缓冲液，pH=7.4，4 ℃）中至沉底。待脑组织下沉后，每个大脑半球于背侧海马最大断面处，切取3 mm厚的组织，制成石蜡包块，再做冠状切片，厚度为4 μm（冰冻切片机切取），每只大鼠切取4张切片，贴于经明胶处理过的载玻片上。
1.3.4 HE染色 石蜡切片经常规脱蜡入水后，在苏木素溶液浸染10 min，1%盐酸酒精分色3 s～5 s（当深蓝紫色变为淡粉色则中止）；氨水反蓝5 min（由淡粉红色变为淡蓝色），自来水冲洗，终止反应，镜下观察，细胞核清晰染色呈蓝紫色，细胞浆及其他背景基本无色即可。伊红溶液染色5 min，自来水冲洗，镜下观察，细胞浆呈红色，细胞核蓝色即可。随后经梯度乙醇脱水（从低浓度到高浓度，70%乙醇，80%乙醇，90%乙醇，100%乙醇，每级5 min），每次2 min，二甲苯透明2次，每次10 min，最后用中性树胶封片。光镜下观察大鼠海马神经元形态学改变。
1.3.5 免疫组化染色 切片常规脱蜡至水，3%双氧水室温下作用10 min后，以蒸馏水冲洗3次，每次30 s，滴加复合消化液，室温下作用10 min，以蒸馏水冲洗3次，每次30 s，滴加正常山羊血清封闭液室温20 min，甩去多余液体，吸水纸吸取多余水分，滴加兔抗鼠NF-κB多克隆抗体（1∶50），4 ℃过夜；取出后自然复温30 min，PBS（pH7.4）冲洗3次，每次5 min；滴加生物素标记山羊抗兔IgG（1∶100），37 ℃孵育20 min，PBS（pH7.4）冲洗3次，每次3 min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（1∶100），37 ℃孵育20 min，PBS（pH7.4）冲洗3次，每次3 min；DAB显色：使用DAB显色试剂盒内AB试剂各一滴，混合后加至切片。室温下显色，镜下控制反应时间， 约5 min～20 min。然后用蒸馏水充分冲洗。苏木素复染。乙醇梯度脱水（70%乙醇，80%乙醇，90%乙醇，100%乙醇，每级5 min）。二甲苯透明5 min，中性树胶封片，晾干即可。每张切片测5个视野，以人机交互方式，由计算机计算出每个视野的NF-κB P65阳性细胞数及平均光密度，取其平均值。计算机图像处理系统由CMOS及多功能真彩色细胞图像分析管理系统组成。
1.3.6 主要观察指标 各组大鼠造模过程中行为学变化；各组大鼠海马神经细胞病理改变；各组大鼠海马神经NF-κB P65表达的变化。
1.4 统计学处理 采用SPSS17.0 统计软件对NF-κB P65阳性细胞数进行统计学分析。实验数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，P
2 结 果
2.1 各组大鼠行为学观察 A组大鼠腹腔注射生理盐水后，行为活动无异常，无死亡。B组和C组大鼠腹腔注射氯化锂（3 mmol/kg）后，所有大鼠行为活动均无异常，24 h后，腹腔注射匹鲁卡品（30 mg/kg，分3次注射，每次间隔10 min）2次或3次后，2 min～15 min内，大鼠逐渐出现外周胆碱能反应：立毛、流涎、颤抖、流血泪，同时或先后出现刻板行为：凝视不动、咀嚼、吸鼻或探索行为、湿狗样震颤、反复头颈上仰，随后出现眨眼、面肌痉挛、点头，口吐白沫，嘴唇、四肢皮肤发绀，甚至大小便失禁，最后出现反复双侧前肢阵挛伴直立、跌倒或翻转，部分动物出现四肢强直-阵挛发作。开始发作尚不频繁，随着时间延长，发作频率增高，全部达到Ⅳ级～Ⅴ级癫痫持续状态。SE状态1 h后，B组和C组大鼠腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）终止发作。终止发作后，B组死亡1只，存活率90%，C组死亡1只，存活率90%，A组存活率100%。B组与A组存活率比较，差异无统计学意义；C组与A组存活率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。详见表1。
2.2 各组大鼠海马神经细胞的病理改变 经HE染色后，光镜下观察海马组织病理改变： A组海马CA1区神经元结构正常，排列整齐，形态完整，细胞核圆或椭圆形，规则，核膜清楚完整，染色质分布均匀，胞质内可见尼氏小体，核仁清晰可见。
B组海马CA1区神经元排列不整齐，正常神经元数量显著减少，细胞间隙增大，部分神经元形态不完整，核膜结构不清楚，细胞核开始出现固缩，核仁不明显，胞浆浓缩深染，呈空泡样变，大部分细胞尼氏体消失，还可见变性坏死的神经细胞。
C组海马CA1区神经元排列较整齐，接近正常，正常结构的神经元较多，大部分神经元细胞核、核膜结构清楚，少部分细胞尼氏体消失或胞浆浓缩深染，变性或坏死的细胞较少，损伤程度较癫痫模型组轻。
2.3 各组大鼠海马NF-κB P65阳性细胞数的表达 免疫组化结果：A组大鼠海马CA1区，棕黄色的NF-κB P65阳性反应物在胞浆、胞核染色非常弱，且几乎都分布于胞浆中，胞核中的阳性物质很少甚至没有。
B组大鼠海马CA1区可见很多NF-κB P65阳性细胞表达，神经元细胞核、胞浆内棕黄色的NF-κB P65的阳性反应物染色较正常组明显加深，多呈团块状分布，且胞核内染色较胞浆深。
C组大鼠海马CA1区可见较少NF-κB P65阳性表达细胞，NF-κB P65阳性反应物在胞核、胞浆棕黄色染色非常浅，在胞核内的棕黄色染色较癫痫模型组染色浅，接近空白对照组，未见棕黄色染色团块状分布。详见表2。
3 讨 论
目前，对癫痫的发病机制尚未完全明了，在治疗癫痫方面，所有的抗癫痫化学药物都有不良反应。因此，探寻防治癫痫的新途径、新方法具有重要的意义。
针灸治疗癫痫早在《内经》中就有记载，也是现在临床上较为有效的办法。针灸治疗癫痫选穴多样，但总的是以任、督穴位为多。彭光超[1]取穴鸠尾、筋缩、腰奇、间使、丰隆，痰热较盛加太渊；肝热加太冲；体弱加足三里，痊愈34例，显效10例，好转4例，无效6例。张智龙[2]用意气行针法治疗癫痫35例，取丝竹空、三阴交、太冲、阴陵泉、阳陵泉、丰隆、内关（均双侧）、鸠尾、关元，从头到足依次取穴，针丝竹空得气后密切注意守气勿失，拇指向前捻转180°，紧捏针柄不动，意守针尖，以意聚气，待针下有跳动感时，以意行气，余穴用平补平泻法，痊愈25例，显效7例，好转2例，无效1例，总有效率97.14%。翟文生等[3]用醒脑开窍针法治疗60例，治愈9例，显效18例，好转30例，无效3例。许永迅[4]采用芒针治疗102例，大椎透灵台，至阳透筋缩，脊中透命门，腰奇透长强，神庭透囟会，百会透后顶，璇玑透膻中，鸠尾透中院、内关（双）、丰隆、太冲、双侧顶颞前斜线，显效54例，有效25例，效差10例，无效13例。
已有研究表明，针刺可对癫痫动物中枢神经的脑电活动、神经递质、环核苷酸等产生影响[5]，张颖[6]研究了针刺对电刺激癫痫大鼠模型的作用，发现针刺可显著降低癫痫大鼠的放电平均波幅、放电最高波幅及放电频率，提高其脑电基本频率，说明针刺可显著抑制痫性放电、控制癫痫发作。杨帆等[7]发现大鼠癫痫模型组脑内兴奋性氨基酸天门冬氨酸、谷氨酸升高明显，而抑制性氨基酸γ-氨基丁酸明显降低，经电针百会、风池后γ-氨基丁酸、丙氨酸明显升高，而谷氨酸降低明显。杨帆等[8]用戊四唑（PTZ）制作的点燃型癫痫大鼠模型海马结构内环磷腺苷（cAMP）、环磷鸟苷（cGMP）含量均有增加，其中cGMP增加非常明显，经电针百会、风池、风府后cAMP、cGMP含量均明显降低，电针对PTZ点燃型癫痫大鼠海马结构内cAMP、cGMP含量的改变有一定的调节作用，对cAMP的调节迅速但持续时间短，而对cGMP的调节缓慢而持久。
NF-κB在癫痫发病机制中的作用也是目前研究热点之一，NF-κB是一种重要的核转录因子，参与真核细胞多种基因的表达调控，影响细胞的许多生物学功能[9]，其活化形式通常是P50和P65，当细胞处于静息状态时，NF-κB和其抑制因子IB结合存在于细胞质中，当细胞受到各种刺激后，许多实验研究发现，在癫痫发病中，NF-κB作为转录因子参与了急性炎症过程，作为细胞因子参与了神经兴奋和/或神经胶质瘢痕的形成。Blondeau研究发现，海人藻酸可快速增加NF-κB与DNA的连接活动度，使其亚单位产生核移位，认为NF-κB活化作为癫痫发病机制的基础信号转导通路的一个关键步骤[10]。Matsuoka等[11]利用大鼠海人藻酸点燃模型发现痫性发作后4 h～16 h内海马神经元NF-κB活化明显增加，并伴胶质细胞NF-κB持续活化。Crespel利用合并海马硬化的颞叶癫痫患者术后病理切片进行免疫组化分析发现，胶质细胞和大脑锥体细胞NF-κB/P65过度表达，并推测癫痫形成过程是由NF-κB介导的炎症反应过程，其过程是一个被痫样发作反复、短折激活的慢性过程[12]。
用大针手法治疗癫痫是我院针灸专家冯尚武和郭耀康老师在长期的临床工作中，发现的一种治疗癫痫的针刺方法，疗效确切，已得到临床验证。此法是用21号、长3寸～4.5寸的不锈钢针，针刺督脉穴的风府、大椎、陶道、无名（胸椎2～3之间）、身柱。操作时，先用捻转法进针，当针尖到达两椎骨棘突之间时，改用缓慢推进法（不捻转慢慢向前推进），约当针尖达脊髓腔时，其方向为：若针风府穴，须使针和耳垂成水平线，缓慢推进；若针大椎、陶道、无名、身柱，均按45°～60°角向斜上方缓慢推进（注意：不可用力过猛，更不可行捻转捣刺术）。针到适应处时，患者常尖叫一声，全身抽动一次，此时立即停止针刺，患者意识不清的可能稍转清醒，有的可出现胸部灼憋闷，全身发麻发软，颜面苍白，瞳孔散大，全身肌肉松弛，出冷汗等症状，属正常反应，可留针15 min～30 min。若在针刺狂躁厉害或体格强壮的患者时，未出现上述诸症之一者，可再行抽刺，抽刺时一般采用扇形往两侧抽刺，每抽刺一下，患者的腿随即跳动一下，抽刺后有的患者可出现双下肢的暂时性瘫软，一般在1 h～2 h后即可恢复，必要时可架扶慢慢行走或适当休息。另外，如患者体质比较虚弱，可选用26～28号针进行针刺，以减少刺激。
本实验通过大针手法治疗癫痫大鼠，研究大针针刺督脉对癫痫大鼠神经NF-κB表达的影响。证实癫痫大鼠的海马神经发生病理改变，大针手法针刺督脉穴位可以改善海马神经的病理改变，癫痫大鼠的海马神经NF-κB P65阳性细胞数的表达增多，减少海马神经NF-κB P65阳性细胞数的表达。针灸治疗癫痫可能是通过抑制海马神经细胞NF-κB的表达，从而减轻了NF-κB作为转录因子参与的急性炎症过程，减少了NF-κB作为细胞因子参与的神经兴奋和/或神经胶质瘢痕的形成，从而减少正常海马神经细胞的凋亡，达到治疗癫痫、减轻癫痫症状的目的。
参考文献：
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[2] 张智龙.意气行针发治疗癫痫35例临床观察[J].天津中医，1990，（1）：30-31.
[3] 翟文生，王建明.醒脑开窍法治疗癫痫60例[J].浙江中医杂志，1992，27（10）：445.
[4] 许永迅.长针和头针为主治疗运动性癫痫[J].上海针灸杂志，1991，10（3）：16-17.
[5] 李梦.针刺治疗癫痫的临床及实验研究进展[J].中国中医急症，2005，14（5）：469-470.
[6] 张颖.针刺对电刺激致痫动物模型影响的实验研究[J].河南医药信息，1999，7（7）：10-12.
[7] 杨帆，徐国龙，王频，等.电针对戊四唑点燃型癫痫大鼠脑内氨基酸含量的影响[J].针刺研究，2002，27（3）：174.
[8] 杨帆，徐国龙，王频，等.电针对癫痫大鼠海马内cAMP，cGMP含量的影响[J].中国中医药科技，2002，9（4）：199-200.
[9] Rauch BH，Weber A，Braun M，et al.PDGF induced akt phosph orylation does not activate NF-κB in human vascular smooth mascle cells and fibroblasts[J].FEBs Letters（S0014-5793），2000，481（1）：3-7.
[10] Erner Natoli M，Montpied P，Rousset MC，et al.Sequential expression of surfacean tigens and transcription factor NF-kappa B by hippocampal cells in excitotoxicity and experimental epilepsy[J].Epileps Res，2004，41（2）：141-154.
