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水解蛋白范文1
【关键词】 婴儿； 牛奶蛋白过敏性腹泻； 深度水解蛋白配方奶粉； 治疗
中图分类号 R725.7 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2016）27-0113-02
Effect Study of Depth Hydrolyzed Protein Formula Applied in Baby with Milk Protein Allergy Diarrhea/ZOU Su-juan，LI Wen-bin.//Chinese and Foreign Medical Research，2016，14（27）：113-114
【Abstract】 Objective：To investigate the effect of depth hydrolyzed protein infant formula applied in baby with milk protein allergy diarrhea.Method：From January 2013 to September 2015，50 cases of baby milk protein allergy diarrhea patients in our hospital were selected as the research objects，their clinical data were retrospectively analyzed.According to the method of random numbers they were divided into two groups，all patients avoided milk food，the control group received free amino acid milk powder（new kt） treatment，the research group was given depth hydrolyzed protein infant formula（new peptide）.The effect was compared between the two groups.Result：The total effective rate of the research group was 100%，higher than 76.0% of the control group，the difference was statistically significant（P
【Key words】 Infant； Milk protein allergy diarrhea； Depth hydrolyzed protein formula； Treatment
First-author’s address：Children’s Hospital of Okanagan Valley Area Maternity and Child Care Center in Quanzhou City，Quanzhou 362000，China
doi：10.14033/ki.cfmr.2016.27.059
婴儿牛奶蛋白过敏性腹泻属于婴幼儿常见疾病，主要因其胃肠道屏障及免疫系统发育不全，直接接触牛奶蛋白后引发的胃肠道过敏症状，以腹泻、呕吐、便血及腹胀等为主要临床症状，严重情况下会引发过敏性休克或死亡等风险[1-4]。及时采取正确、有效的治疗方案治疗，对于改善患儿预后有着积极的意义。笔者所在医院借鉴相关研究将深度水解蛋白配方奶粉应用在婴儿牛奶蛋白过敏性腹泻中，取得了比较良好的效果，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2013年1月-2015年9月笔者所在医院接诊的婴儿牛奶蛋白过敏性腹泻患儿50例为研究对象。入选患儿均及时确诊，符合牛奶蛋白过敏性腹泻诊断标准，月龄2～6个月，主要为奶粉配方喂养，病程不超过2个月，且以大便稀水样或不消化样为主要症状，无黏液脓血，经大便镜检等显示无异常，无其他并发症[5]。按照随机数字表法将其分为两组，各25例，对照组：月龄2～6个月，平均（3.8±0.8）个月；男14例，女11例；病程2 d～2个月，平均（6.9±1.1）d。研究组：月龄2～6个月，平均（3.6±0.7）个月；男13例，女12例；病程1 d～2个月，平均（6.7±1.3）d。两组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
两组患儿入院后确诊符合牛奶过敏所致腹泻，回避食物2～4周，尤其要回避牛奶食品，对照组予以游离氨基酸配方奶粉（纽康特），至少食用3～6个月或者食用至9～12个月龄。研究组停用普通奶粉，并予以深度水解蛋白配方奶粉（纽肽特）。其中患儿有母乳混合喂养，则将母乳喂养也一并停用，采取深度水解蛋白配方奶粉喂养时间为2周；2周后可尝试加用普通奶粉喂养，剂量控制在1/4普通奶粉+3/4深度水解蛋白配方奶粉，然后对患儿的大便性状进行观察，2～3 d，若正常则继续增加1/4普通奶粉（1/2普通奶粉+1/2深度水解蛋白配方奶粉），继续观察大便性状，2～3 d；反之，若大便异常则改回100%深度水解蛋白配方奶粉喂养，直到有所正常后才改为前述增加方案，直到最终患儿过渡为100%普通喂养为止。若为纯母乳喂养的患儿则停母乳，妈妈回避牛奶及牛奶制品2周，婴儿服用深度水解蛋白配方奶粉，2周后继续母乳喂养，若再次发生腹泻，则停母乳，改为深度水解蛋白配方奶粉喂养3～6个月。
1.3 观察指标
对两组患儿临床症状、腹泻次数、大便性状等进行观察，总结临床效果及随访半年复发率，并对比分析。
1.4 疗效评价标准
本研究疗效按照《腹泻病疗效判断的补充意见》中相关评价标准执行，显效：治疗5 d后患儿全身症状彻底消失；粪便性状与次数均恢复正常。有效：治疗5 d后全身症状显著缓解；粪便性状与次数明显好转。无效：全身症状未改善，亦或者是病情恶化[6]。总有效率=有效率+显效率。
1.5 统计学处理
将本次研究的相关数据录入EXCEL表格中，数据均经统计学软件SPSS 18.0进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，P
2 结果
2.1 两组临床效果比较
研究组治疗后显效19例、有效6例、无效0例，总有效率100%，对照组则分别为8、11、6例，总有效率为76.0%，两组总有效率比较差异有统计学意义（P
2.2 两组随访半年复发率比较
研究组随访半年无任何患儿复发，而对照组则有3例复发，复发率为12.0%。两组复发率比较差异有统计学意义（P
3 讨论
牛奶蛋白过敏属于比较常见的婴幼儿症状，近几年国内一些研究中显示0～3岁小儿发生牛奶蛋白过敏的概率约为0.83%～3.50%，高居食物过敏第二位。婴幼儿作为食物过敏公共健康问题高危人群，发生牛奶蛋白过敏后表现形式多样，且症状轻重不一，轻者有腹泻、腹痛、便血、呕吐等，而严重情况下则有休克、死亡等，严重威胁患儿的生长发育，需加强重视。牛奶中有多种可引发过敏的蛋白质，这些蛋白质可能属于过敏原而引发患儿发病，尤其是过敏性腹泻极为常见。婴儿在消化道黏膜、免疫系统等方面发育不完善，极易受到致病过敏原的侵袭。结合本次研究与同类研究，可见其主要特点有：其一，本次研究接诊的患儿月龄均未超过6个月，而且大多数患儿为多次添加不同品牌配方奶粉喂养后发生超敏反应，以皮肤过敏反应为主，进而出现腹泻；其二，尽管一些患儿经血液变应原筛查后对牛奶蛋白未过敏，但其IgE不足100 IU/ml[7]。为此，在治疗前应对患儿有无病史进行详细询问，并了解与掌握他们牛奶喂养后出现症状的时间。笔者所在医院针对接诊的50例牛奶蛋白过敏性腹泻患儿进行回顾性分析，按照随机数字法分为两组，对照组回避食物+氨基酸配方奶粉治疗，研究组用深度水解蛋白配方奶粉治疗。两组总有效率比较差异有统计学意义（P
胃肠道作为小儿出生后最早接触食物蛋白的部位，也是蛋白过敏最早的器官之一，若发生牛奶蛋白过敏后，极易出现呕吐、腹泻、腹胀及便血等，进而有休克等，严重情况下导致患儿死亡。基于此，尽早发现相关症状，及时入院诊断十分关键。牛奶蛋白过敏性腹泻诊断需详细询问患儿病史，同时可实施皮肤点刺试验、牛奶蛋白特异性IgE、血清总IgE及激发试验等处理[8]。但是这些方式各有优劣，比如牛奶蛋白特异性IgE检测，虽然有很高的特异性，但其费用昂贵，一般医院难以普及；部分患儿胃肠道牛奶蛋白过敏为非IgE介导，为此血清总IgE检测阴性也无法否定其属于非IgE介导过敏；皮肤点刺试验尽管费用低廉，但会对患儿产生额外疼痛，结果也不确定。总之，目前尚无确切统一的有效诊断方案，为此大多数学者一致认为可采取综合诊断处理。
婴儿发生牛奶蛋白过敏性腹泻后，应及时回避牛奶及含有牛奶蛋白的食品，在未应用特殊药物治疗前，应及时回避原有配方奶、辅食及母乳喂养等，可更换为氨基酸配方奶粉处理。当然，母乳喂养属于解决这类过敏最为理想的方式，但是目前无法母乳喂养的小儿较多，或者一些进入转奶期的小儿，无法一直予以母乳喂养，此时需根据小儿过敏性疾病风险选取合适的低敏配方奶粉处理，比如深度水解蛋白配方奶粉、纯氨基酸配方奶粉等，尽管后者可完全回避过敏原，但其价格昂贵且口感不佳，无法逐步耐受，不能作为初级预防处理。深度水解蛋白配方奶粉经加热、超滤及水解等程序加工处理而成，使得蛋白质成分抗原性明显降低，加上其营养价值等同于普通奶粉，成为近几年治疗牛奶蛋白过敏性腹泻最为理想的配方奶粉。通过本次研究及同类研究，证实婴儿牛奶蛋白过敏性腹泻采取深度水解蛋白配方奶粉治疗，不仅能缓解症状，且能支持患儿的正常发育[9-10]。
综上所述，深度水解蛋白配方奶粉治疗婴儿牛奶蛋白过敏性腹泻可取得不错效果，可有效改善患儿症状，预防疾病复发，值得借鉴。
参考文献
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水解蛋白范文2
1.1 大豆蛋白的研究背景
近年来，随着人们生活水平的提高，对膳食结构的要求也越来越高，而大豆的营养价值很高，是一种优质的高蛋白、高脂肪作物，含蛋白质40％-45％，每100g含蛋白质36-50g，生物学价值接近肉类。氨基酸组成也与动物蛋白质近似，并含有较多的赖氨酸，属于完全蛋白质(完全蛋白质就是包含有人体所需的22种氨基酸，且比例适当的蛋白质，动物蛋白和豆类蛋白都属完全蛋白），可以充足地提供人体所需的八种必需氨基酸以及多种维生素和矿物质等，并有降低人体血液中胆固醇含量的作用，因此被越来越多的人所认可。并且，其在食品加工领域也有广泛的应用前景，可制成各种富有营养的食品，充分使人体最大限度地吸收大豆蛋白质以满足恢复期病人、消化功能衰退的老年人、消化能力尚束成熟的婴幼儿及急需体力补充的运动员及高血脂、高血压等人群的营养要求[1]。
大豆蛋白资源丰富，原料成本低廉，具有乳化性、起泡性等功能特性。同时，大豆蛋白也有一些性质不能满足人们的要求，从而影响它作为食物的可接受性，例如溶解性、胀气因子、不良气味等。因为大豆蛋白主要由7s和11s球蛋白组成，从而使得SPI的消化率和生物效价远不及牛奶等动物蛋白质：一般动物蛋白质的消化率为90％-98％ ，而植物蛋白质的消化率为73％。但经过对大豆蛋白的酶法水解，将大分子大豆蛋白质水解成小分子多肽和氨基酸，可提高大豆蛋白的生物效价，易为人体吸收和消化。同时还可以提高溶解度，降低粘度，改善大豆蛋白的功能特性[2]。
1.2 固定化酶的研究背景
1.2.1 酶固定化的方法
酶的固定化是利用化学或物理手段将游离酶定位于限定的空间区域，并使其保持活性和可反复使用的一种技术[3]。
酶的固定方法有很多，主要有吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法等。
吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。采用吸附法制备固定化酶或固定化菌体，操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用，但由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。
包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。包埋法制备固定化酶或固定化菌体时，根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。包埋法不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基，反应条件温和，很少改变酶结构[4]，应用最为广泛。包埋法对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都适用，包埋材料主要有琼脂、琼脂糖、卡拉胶、明胶、海藻酸钠、聚丙烯酰胺、纤维素等，其中海藻酸钠具有无毒、安全、价格低廉、材料易得等特点，是食品酶工程中常用的包埋材料之一[5]。
结合法：选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定方法。根据结合的化学键不同，结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。用离子键结合法固定，条件温和，操作简便。只需要在一定的pH值，温度和离子强度等条件下。用共价键结合法制备的固定化酶，结合很牢固，酶不会脱落，可以连续使用较长时间。但载体活化的操作复杂，比较麻烦，同时由于共价结合时可能影响酶的空间构想而影响酶的催化活性。
交联法：借助双功能试剂使用酶分子之间交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不方便。
热处理法：将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到的固定化菌体。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不方便。
以上这5种常见的酶的固定方法各自有各自的优点和缺点，必要时可以结合其中的不同种方法进行固定以取长补短，可以制备出酶活性高、机械强度又好的固定化酶或固定化菌体[6]。
1.2.2 固定化酶的应用
固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之出，具有显著的优点。因此已广泛地应用于食品、医药、环境等领域。
(1) 固定化酶在食品方面的应用
固定化酶得到最早和最广泛应用的领域是食品工业，目前已有几十种酶应用于食品工业。据2000 年的统计，国际上所生产的酶总产量有近40%应用于食品工业的生产。而且应用的酶剂还在不断增加。食品工业中应用的酶法生产方式也由传统的向现代化的方式转变。而且，固定化酶和固定化细胞在食品领域的应用越来越广泛 [7]。比如说，固定化酶在乳酸生产、果汁生产等食品工业方面都有一定的应用。
(2) 固定化酶在医药方面的应用
固定化酶在医药方面的应用已经越来越广泛。固定化酶应用于医学工业不仅仅限制于药物合成上。如Odaci 等[8]将漆酶固定于生物传感器的氧极制成酶电极，用于检测药物扑热息痛(paracetamol)。Tang 等[9]基于固定anti-AFP酶制成了一种免疫测定系统，并分析了它的作用原理,并预期能在临床上有广泛的用。
(3) 固定化酶在环境方面的应用
废水处理中，由于废水组分复杂而且经常变化，利用单一的固定化酶，很难收到好的处理效果。因此，要用多种单一的固定化酶组合处理，才能使有机物完全无机化和稳定化。如德国将九种降解对硫磷农药的酶共价组合固定在多孔玻璃珠、硅胶珠上，制成酶柱处理硫磷废水获得95%以上的处理效果，连续工作70天酶的活性没有变化，说明多种酶的作用大于单一酶的作用[10]。
(4) 固定化酶应用的展望
毋庸置疑，固定化酶已经在多个方面都有了广泛的应用，而且仍有很多尚在研究过程中。不过，有一点是可以明确地：随着固定化技术的发展, 将会有更多的固定化酶应用于生产, 充分显示出固定化技术的优越性, 开启固定化技术的新局面。
1.3 固定化酶水解大豆蛋白的优势
传统工业从大豆中得到能被人体直接吸收的游离氨基酸是采用酸水解，但是在酸水解过程中常会产生对人体有害的致癌物——氯丙醇[11]。中性蛋白酶具有较高的蛋白水解能力，但是如果直接用游离酶进行水解，酶的稳定性差，酶只能使用一次，所得的产物难以分 离。而固定化酶可提高酶的稳定性，其热稳定性、pH稳定性均显著高于游离酶[12]，还有易于和产物分离、可反复多次使用等优点，因而受到越来越广泛的重视和应用。目前世界各国都在不断研究这一领域。
2.实验部分
2.1 材料和准备工作
2.1.1 实验材料与仪器设备
(1) 主要实验材料
木瓜蛋白酶（BR）： 江苏天锡天达酶制剂有限公司
无水氯化钙（AR）： 衢州巨化试剂有限公司
海藻酸钠（AR）： 中国医药上海化学试剂公司
无水乙醇（AR）： 安徽安特生物化学有限公司
氢氧化钠（AR）： 杭州萧山试剂厂
甲醛（AR）： 衢州巨化试剂有限公司
草酸（AR）： 上海美兴化工有限公司
其他试剂均为常规试剂
大豆： 市售
(2) 主要实验设备
SW-CJ-1B型单人单面净化工作台： 苏州净化设备有限公司
XQ-LS-30SI型立式压力蒸汽灭菌锅： 上海博迅有限公司医疗设备厂
DHZ-DA型摇床： 太仓实验设备厂
HZ-9210K型摇床： 太仓市科教器材厂华利达实验设备公司
MJX-250B-Z型霉菌培养箱： 上海博迅有限公司医疗设备厂
双层铁皮电炉： 浙江嘉兴市凤桥电热器厂
GO-5003B型搅拌机： 广东省中山市哥尔电器有限公司
自制固定床装置如图1所示。
↑产物
大豆蛋白液→
图1 自制固定床装置图
2.1.2 准备工作
(1) 大豆蛋白液制备
称取一定量大豆加一定量温水浸泡12h后在0.1Mpa高压蒸汽灭菌锅内煮熟10min，迅速降压至常压下取出，用豆浆机磨浆，过滤去渣， 调pH值到中性（pH=7.0），再用高压蒸汽灭菌锅灭菌，冷却后放入4OC冰箱中备用。
(2) NaOH标准溶液的配制及标定
a. 快速称取化学纯固体氢氧化钠约4g（因它易吸潮，不易称准），先用烧杯将NaOH溶解，倒入容量瓶中加蒸馏水定容到1L。
b. 标定：用草酸标定
干净的碱式滴定管用少量NaOH溶液洗三遍, 再将NaOH溶液装入滴定管中,赶走橡皮管和尖嘴部分的气泡,调整管内液面的位置恰好为“0.00”。
用洗净且已用标准草酸溶液润洗过三遍的移液管准确量取20.00mL标准草酸溶液，加入锥形瓶中,加入2-3滴酚酞指示剂,摇匀。
将NaOH溶液滴入锥形瓶中,边滴边摇动，开始时，滴定速度可快一点，当接近终点，粉红色消失较慢时，开始逐滴加入碱液，每加入一滴都应摇匀,观察红色是否消失，决定是否再滴加，最后应控制加入半滴碱液,并用洗瓶冲洗锥瓶内壁,摇匀,30s内粉红色不消失,即认为已达终点,记下滴定管液面的位置。
如此标定三次（求三次液量相差不超过0.05mL），取其平均值。按N1V1=2N2V2公式计算当量浓度。
2.2 实验方法
2.2.1 酶的固定化方法
本实验采用海藻酸钠包埋法。
用天平准确称取一定量的海藻酸钠于100mL水中，再准确称取10g CaCl2于200mL水中，放入立式压力蒸汽灭菌锅灭菌中灭菌（另量取一定体积的水放入其中一起灭菌以制备无菌水）。
先将仪器、玻璃器皿等在净化工作台中在紫外灯的照射下灭菌15min，再用天平准确称取一定量的酶，在净化工作台将酶缓慢加入灭菌好的海藻酸钠溶液中，一边加一边搅匀（因中性蛋白酶在海藻酸钠溶液中极易结成颗粒状，不搅匀会导致酶的分布不均匀，而且会引起后面用注射器制备海藻酸钠凝胶珠过程中堵塞注射器）。混合均匀后，用注射器逐滴滴入灭菌好的5%（w/v）CaCl2溶液中进行凝胶化反应，于4oC冰箱中钙化2-3h，制备成直径约为3mm的海藻酸钠凝胶珠，用无菌水洗涤3次以洗去附在表面的CaCl2溶液，即得球状固定化颗粒。
图2 用注射器滴入CaCl2中
图3 包埋法固定化酶模式
2.2.2 自制固定床的安装
取固定化酶填充至反应柱, 将一定量一定浓度的大豆蛋白溶液倒入1500mL三口烧瓶中，并置于恒温水浴锅保温,然后用皮管将固定床、泵和三口烧瓶连成一个密封的循环，以恒流泵控制较缓和的系统流速, 循环反应。皮管中间连一段玻璃管，以便运行过程中观察循环是否正常，而且留一个取样口，平时用夹子夹住以维持无菌状态。此固定床下口为进口，上口为出口，如图1 所示。固定床在使用前要在净化工作台紫外线杀菌15min,装固定化酶过程中，手及皮管要用75%的乙醇杀菌。
2.2.3 游离氨基酸的测定方法
游离氨基氮的测量用双指示剂甲醛滴定法。
水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。甲醛可与氨基酸上的—N+H3结合，使N+H3上的H+游离出来，与甲醛的反应：用过量的中性甲醛与氨基酸反应，可游离出氢离子，然后用NaOH滴定，从消耗的碱量可以计算出氨基氮的含量。
(1) 具体测量步骤
用10.00mL移液管精确吸取10.00mL样品水解液放入250mL烧杯中用于氨基氮的测量，加入蒸馏水80.00mL及3滴1%酚酞指示剂，用标定好的NaOH标准溶液滴定至刚显微红色（与未滴定的一瓶对照），所耗用的NaOH标准溶液毫升数即总酸滴定数。然后吸取甲醛10.00mL加入其中，摇匀，马上再用标定好的NaOH标准溶液滴定至粉红色（颜色与第一次相比，红色更深），记下加入甲醛后所耗的NaOH标准溶液毫升数（V），同时做空白实验，用蒸馏水代替样品液在同一条件下，作一空白滴定，记下所耗的NaOH标准溶液毫升数（V1）。
(2) 游离氨基氮计算：
氨基酸氮（g/100mL）=
式中V——加入甲醛后所耗用的已标定好的NaOH标准溶液毫升数
V1——空白滴定所耗用的已标定好的NaOH标准溶液毫升数
N——所用标定好的NaOH标准溶液的当量浓度
0.014——氮的毫克当量
10——吸取样品水解液10.00mL
2.2.4 实验流程
配海藻酸钠、CaCl2溶液→灭菌→将酶加入海藻酸钠中→酶的固定化
↓
大豆浸泡→大豆磨浆→调大豆蛋白液PH值→灭菌 →在无菌条件下放
入摇床(或者固定床)→每12小时测游离氨基值
3. 结果与讨论
3.1 NaOH标准溶液的浓度
经过3次标定，得值：10.19，10.21，10.23，取平均值10.21代入CNaOHVNaOH=2C草酸V草酸计算得NaOH浓度：
CNaOH=0.098mol/L
3.2空白滴定的结果
经滴定得空白对照：V1=1.09mL
3.3 固定化酶与游离酶的性能比较
固定化酶和游离酶对大豆蛋白的水解效果有较大的差别。取底物浓度（大豆：水）为1：7，固定化时间为2.5h，酶浓度（酶量：海藻酸钠溶液体积）为1%，海藻酸钠浓度（w/v）为3%，进行对比实验，实验结果如图4所示。
图4 游离酶和固定化酶的活性比较
由图4可看出：水解刚刚开始后，游离酶的水解效果要明显好于固定化酶。因为酶固定化后，酶与底物的接触受到了一定程度的阻碍，固定化酶与底物的接触明显没有游离酶与底物的接触充分。因此，游离酶在水解刚开始时得水解效果要好得多，并比固定化酶早12h到达峰值。
然而，游离酶与底物极难分离，如果要从中分离出游离酶则要付出较大的成本。
3.4 单因素实验确定最佳固定化条件
3.4.1 海藻酸钠浓度对酶固定化的影响
海藻酸钠浓度不但影响到凝胶珠的机械强度，而且还影响着底物及产物的扩散，进而影响带固定化酶的生物活性。当海藻酸钠浓度为2.0%时，形成的凝胶珠的机械强度较弱，有明显的拖尾现象，且凝珠脆弱，易破壁；当海藻酸钠浓度为4.0%时，由于溶液粘度较高，固定化时不易成球。
取底物浓度（大豆：水）为1：7，固定化时间为2.5h，酶浓度（酶量：海藻酸钠溶液体积）为1%，海藻酸钠浓度（w/v）分别为2.0%、3.0%、4.0%，进行单因素实验，实验结果如表1和图5所示。
表1 不同海藻酸钠浓度对酶固定化效果的影响
海藻酸钠浓度 凝胶珠强弱 凝胶珠形状 使用时间 游离氨基峰值（g/100mL） 成球难易度
2.0% 较弱 偏圆形 10d 0.129 较难
3.0% 适中 圆形 25d 0.120 易
4.0% - 不成球 - - -
图5 不同海藻酸钠浓度下水解效果
从表1和图5可知：海藻酸钠浓度过低，虽然游离氨基的峰值，可以达到较高水平，但是其可使用时间稍短，不利于固定化酶的反复使用，如2%浓度下，游离氨基峰值要高于3%浓度，这可能是因为在酶促反应期间底物和产物易通过凝珠微孔，反应速度较快。但其可是使用时间太少；海藻酸钠浓度过高，使用时间可以达到比较理想的状态，但是与外界的能量和物质的传递都受到了不小的障碍，酶的活性受阻，其游离氨基的峰值并不理想；而且当海藻酸钠浓度为4.0%时，由于溶液粘度较高，固定化时不易成球。当海藻酸钠浓度为3.0%时，虽然游离氨基的峰值有少许的降低，但是其可利用时间可达25d，符合反复使用的特性，凝珠的机械强度适宜，反应速度也较快。
3.4.2 固定化时间对酶固定化的影响
海藻酸钠的固定化过程是一个化学反应过程：CaCl2溶液中的Ca2+通过海藻酸钠凝胶珠由外向内置换Na+而形成海藻酸钙，而置换反应是需要一定时间的。不同固定化时间对大豆蛋白水解效果有所影响。取底物浓度（大豆：水）为1：7，酶浓度（酶量：海藻酸钠溶液体积）为1%，海藻酸钠浓度（w/v）为3.0%，固定化时间分别为2h、2.5h、3h，进行单因素实验，实验结果如表2和图6所示。
表2 不同固定化时间下水解大豆蛋白的峰值
固定化时间 游离氨基峰值（g/100mL）
2h 0.107
2.5h 0.119
3h 0.088
图6 不同固定化时间下水解效果
由表2和图6可以看出，固定化时间较短时，固定化酶的活性较低；固定化时间2.5h时效果最好，游离氨基峰值可达0.119g/100mL；当固定化时间继续增加，固定化酶的活性又降低，这主要是因为固定化时间较长，交联程度高，高分子链结较致密，底物扩散阻力增加，固定化酶活性降低[13]。
3.4.3 固定化酶浓度对水解效果的影响
固定化酶量直接关系到固定化酶的活性。酶液浓度越高，反应所需时间越短，反应速度越快。取底物浓度（大豆：水）为1：7，固定化时间为2.5h，海藻酸钠浓度（w/v）为3.0%，将酶浓度（固定化酶量：海藻酸钠溶液体积）调整为0.5%，1%，1.5%进行固定化后，进行单因素实验，测定固定化酶的活性，实验结果如表3所示。
表3 不同酶量下水解大豆蛋白的峰值水解大豆蛋白的峰值
固定化酶浓度 游离氨基峰值（g/100mL）
0.5% 0.105
1% 0.123
1.5% 0.124
由表3可以看出，在其他条件不变时，随着酶液量的增加，酶的活性有所提高。当酶液量与海藻酸钠用量比从0.5%增加到1%时，固定化酶活性极显著提高，之后酶液量与海藻酸钠用量从1%增加到1.5%，固定化酶活性变化不大。而酶的价钱是比较昂贵的，因此酶液量与海藻酸钠用量比为1%较为合适。
3.4.4 底物浓度对水解效果的影响
不同底物浓度对固定化酶水解大豆蛋白液效果有重要的影响。取固定化时间为2.5h，酶浓度（酶量：海藻酸钠溶液浓度）为1%，海藻酸钠浓度（w/v）为3%，改变最佳底物浓度（大豆：水）分别为1:5、1:6、1:7、1:8，进行单因素实验，实验结果如表4和图7所示。
表4 不同底物浓度下水解大豆蛋白的峰值
大豆：水 游离氨基峰值（g/100mL）
1:5 0.098
1:6 0.100
1:7 0.129
1:8 0.121
图7 不同大豆蛋白液浓度下水解效果
从表4和图7可以看出，当大豆蛋白稀释较小时，底物浓度过高，而固定化凝胶珠与底物接触不良，很容易覆盖固定化凝胶珠，从而影响水解效果［14］；而当大豆蛋白稀释较大时，底物浓度过低，底物中含有大量的水，在不断的使用中，固定化凝胶珠会吸水胀破，影响固定化酶的使用时间。由图可知：大豆：水=1：7时水解效果最好。
3.5 固定化酶在固定床与摇床中的比较实验
取最适固定化时间为2.5h，最适酶浓度（酶量：海藻酸钠溶液体积）为1%，最适海藻酸钠浓度（w/v）为3%，最佳底物浓度（大豆：水）为1:7，其比较实验结果如表5和图8所示。
3.5.1固定化酶在固定床与摇床中的性能比较
表5 固定化酶在固定床与摇床中对水解效果的影响
使用时间（d） 嗅觉 游离氨基峰值（g/100mL）
固定床 〉40 轻微异味 0.122
摇床 25 强烈异味
0.118
从表5中可知，固定化酶在摇床和固定床中对水解效果的影响有一定影响:对游离氨基峰值影响不大，但在使用时间和嗅觉方面有较大的差异。固定化酶在固定床中可以反复使用的时间大大高于在摇床中，这主要是因为摇床的不断摇动使得固定化酶珠之间、酶珠与三角烧瓶壁之间不断的发生摩擦，酶珠与大豆蛋白液之间的剧烈冲洗，从而使固定化酶在使用一段时间以后破裂，导致仍具剩余活性的酶不能实现再利用，减少了固定化酶重复使用次数，降低了酶活性的利用率。
而在嗅觉方面的差异，主要是由于染菌引起的，因反应时间较长，反应温度为50 oC，比较适合一些菌种的生长。实验过程中，固定床取样是从事先设计好的取样口取样的，不易染菌；而从摇床中的锥形瓶中取样测量时，虽然在净化工作台中进行，手与相关器皿也都用75%乙醇杀菌，但其染菌的概率仍然大大高于在固定床中。
3.5.2固定化酶在固定床与摇床中水解效果的比较
图8 摇床和固定床 中水解效果
从图8可以看出，在反应之初，固定化酶在摇床中的水解效果要略微好于在固定床中，这主要是因为在摇床中，底物与固定化酶之间的接触要比在固定床中更充分。但随着时间的推移，在摇床中的水解效果反而不如在固定床中。这主要是因为，在多次取样测量游离氨基以后，摇床中染菌造成的。细菌消耗了一部份产物或者尚未被完全水解的蛋白质，从而降低了游离氨基的值。
3.6 实验中注意点
(1) 滴定完毕后,尖嘴外不应留有液滴, 尖嘴内不应留有气泡。
(2) 由于空气中CO2影响，已达终点的溶液放久后仍会褪色，这并不说明中和反应没有
完全，而是因为溶液中的NaOH与空气中的CO2反应成中性的Na2CO3，从而使溶液成中性而褪色。
(3) 因本实验过程需要3-4d，并且反应温度为50OC，大豆蛋白液极易染菌变质，所以实验中的各步骤都尽量应在净化工作台中进行，如取样测值等操作。
(4) 本次实验中取样测值的次数较多，所以应尽量减少取样对水解反应的影响，应采取的措施：减少取样次数，或者以相同的比例增加反应所需的各溶液量。
4.总结与展望
4.1 总结
经过这段时间的实验，我学到了很多知识与技能。通过查阅文献，我巩固了文献检索的方法，进一步学习了固定化酶的研究进展、应用、优点和水解蛋白的相关知识，还探索了固定床在固定化酶水解植物蛋白方面应用的可能性。而实验中，我更将理论知识应用到实际中去，提高了动手能力：学会了海藻酸钠固定化酶的具体操作步骤、水解植物蛋白的条件控制，并在导师的指导下，参与固定床的自制和安装。
经过实验，我得出：
(1) 固定化酶水解植物蛋白最佳参数：最佳底物浓度（大豆：水）为1：7；最适固定化时间为2.5h；最适酶浓度（酶量：海藻酸钠溶液体积）为1%；最适海藻酸钠浓度（w/v）为3%。
(2) 并在此最佳参数基础上，进行在固定床与摇床条件下的对比实验，得出：在固定床中，固定化酶使用次数和时间方面有很大的改善，从而使得酶的利用率更高；而且实现批量或连续操作模型的可能，更适于产业化、连续化、自动化生产。
由于客观条件所限制和关于固定化酶在固定床中水解植物蛋白的研究寥寥无几，本实验尚有诸多不足之处，比如:蛋白水解液仍有染菌几率，对实验有些许影响；实验中所用的自制固定床比较容易堵塞，且会发生泄漏现象，从而要经常检查；因时间紧迫，酶的固定化条件除了本实验所研究的4个参数外，还有pH、温度等因素的影响没有研究，而是经过查询相关文献取最佳参数的。
4.2 展望
展望未来，固定化技术作为一项新兴技术有着不可限量的活力,引起了酶工业极大的变化。固定化酶作为第二代酶制剂正日益成为酶应用方面的主力军。可以预期,今后最引人注目的进展将会是优良菌株固定化技术和连续反应器的巧妙结合。 毫无疑问,这将在工业生产中将发挥越来越重要的作用。
致 谢
首先我要感谢我的导师王克明教授。本课题在选题及研究过程中得到王克明教授的悉心指导。王克明教授在百忙之中，仍对我们的实验进行细心的指导，多次询问研究进程，并为我指点迷津，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。王老师一丝不苟的作风，严谨求实的态度，踏踏实实的精神，不仅授我以文，而且教我做人，给予我终生受益之道。在此，学生谨向导师表示衷心的感谢！
其次，我要感谢生化学院的全体老师和学校，是你们让我在大学的四年里，不但学到了知识，更学会了做人；是你们为我提供了良好的研究条件。
再次，我要感谢我的同学。在我迷茫时，你们鼓励我；在我困难时，你们帮助我。并在实验过程中不断地对我伸出援助之手。
最后，我要衷心感谢审阅此文的各位老师。
程 慧
2007年6月17日
参考文献
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水解蛋白范文3
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
脱脂蚕蛹蛋白购自南通福尔生物制品有限公司，碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶购自诺维信（中国）生物技术有限公司，其他试剂为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 复合酶水解脱脂蚕蛹蛋白
准确称取50g脱脂蚕蛹蛋白置于1000mL烧杯中，加入纯水定容至500ml，搅拌均匀，水浴加热至90℃维持10min使蛋白质变性，然后冷却至55℃并维持，加入5%的复合蛋白酶自然pH值酶解10小时。
1.2.2 水解度的测定方法
蛋白水解度（DH）是指蛋白质水解过程中被裂解的肽键数与给定蛋白质的总肽键数之比[3]。蛋白质的肽键断裂后α-氨基氮含量增加，因此可以根据水解过程中生成的α-氨基氮的含量来计算DH。使用甲醛滴定法测定水解后α-氨基氮的量，使用凯氏定氮法测定样品的总氮量[4]，计算DH的公式如下：
1.2.3 响应面优化试验
使用中心组合Central Composite Design （CCD）响应面试验设计法[5]，对复合蛋白酶组成中的碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶的配比进行优化。以碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶在复合酶组成中的百分比为考察因素，分别以A、B、C表示，则C=100%-A-B，因此以A和B为因素水平、DH为考察指标进行响应面试验设计优化。采用Design-Expert（Version 8.05b）软件对响应面试验得到的数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 响应面优化试验
设定碱性蛋白酶A、中性蛋白酶B的因素水平见表1所示，采用CCD响应面设计法进行优化，试验安排与结果如表2所示。
2.2 回归方程与方差分析
由表3 回归模型的方差分析中可以看出，通过Design-Expert软件计算得到的多元回归方程模型p值=0.0343显著，而失拟项p值=0.9035不显著，说明模型的拟合度较好，能够反映试验的具体水平结果。
2.3 响应因子水平优化
使用Design-Expert软件做出回归模型响应值与因素水平间的响应曲面和等高线图，见图1。
从图1中可以看出，各因素水平对响应值的影响变化趋势及因素水平之间交互作用。从图中可以看出，两个因素水平的响应值对应的曲面和等高线具有最优的响应区域。使用Design-Expert软件进行岭脊分析及回归方程计算，可以得到最优的响应值相对应的因素水平为：碱性蛋白酶48.40%、中性蛋白酶32.09%，计算出风味蛋白酶为19.51%。使用该最优的复合酶配方，DH的最大预测值为38.4%。以此试验得到的最优配方进行3次平行验证试验，得到的DH平均值为38.7%，与预测值吻合度较高，说明该响应面模型能够较好的反映实际试验情况，并能准确预测正常的试验结果。
水解蛋白范文4
关键词：全丝胶蚕品种 风味蛋白酶 抗氧化能力
自由基引发氧化作用，人体体外发生氧化，光和空气容易产生活性氧化酶和促进酪氨酸活性化活性，使皮肤发皱、产生斑点、变黑老化、引发皮肤癌变的可能。人体皮肤体内发生氧化，由于活性氧化酶作用，会引起精神紧张、心累、苦痛、寒冷、感染等极其普遍的刺激，而产生身体机能的变化，与癌、动脉硬化、糖尿病等具有密切关系。人类的食品发生氧化，人体本身是产生活性氧化酶和促进酪氨酸活性化活性的良好环境，食品的氧化是酶的褐变和黑色素的积累过程，使食品变质，营养破坏，导致一系列的食品制造、安全保鲜、营养吸收等恶劣后果。各种自由基所引发的氧化作用，是导致身体中各组织和器官损伤、病变的重要原因之一。人的衰老、动脉硬化、心脏病、肿瘤、肾病、肝病、糖尿病、白内障等近百种疾病的发生和发展均与自由基所引发氧化有关。
诸多专家研究结果说明丝胶蛋白质本身不具有去除自由基的作用，而丝胶蛋白质水解物对去除羟基、超氧自由基的能力较强。但不同水解酶的短肽丝胶蛋白物的抗氧化能力不同，水解条件也较大程度影响抗氧化能力。本文对多种水解酶对全天然丝胶蛋白质的抗氧能力的结果进行比较，认为风味蛋白酶水解的全天然丝胶蛋白质抗氧化能力较强；对风味蛋白酶水解的条件进行了统计分析，认为风味蛋白酶浓度为0.1g／ml，反应温度为50℃，水解时间为2h溶液，pH为中性，丝胶蛋白浓度为0.1g／ml，抗氧化能力最强。为食品、化妆品、医药功能及医学生物材料等的研发提供良好的依据。
一 材料与方法
1 供试材料
1.1 供试品种蚕茧壳
全由安徽省农业科学院蚕桑研究所提供天然白丝胶品种“白S”。
1.2供试丝胶蛋白质
丝胶溶解、浓缩、干燥方法参照叶崇军方法获得
2 试验方法
供试丝胶蛋白质天然白丝胶品种“白s”茧壳的溶解、浓缩、干燥，参照叶崇军…方法获得。
2.2清除羟自由基(・OH)能力测定方法
2.1不同蛋白酶水解丝胶蛋白抗氧化能力比较
设置在加酶量、底物浓度、反应温度、反应时间、pH同等条件下，对风味蛋白酶、动物蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶水解液作为样品溶液进行去除羟基自由基的比较实验。酶的灭活条件为100℃水煮10min。
取0.562g丝胶蛋白溶于5.62ml蒸馏水，配成0.1g／ml的丝胶蛋白溶液；各取0.2g动物蛋白酶，木瓜蛋白酶，风味蛋白酶，碱性蛋白酶，中性蛋白酶溶于2ml蒸馏水中，调制PH为7.0。取1ml蛋白质溶液加入0.02ml酶液，调制pH值中性，50℃下反应2h。
用FeSO4+H2O2产生－OH，以－OH氧化水杨酸钠所得产物的吸光值表示－OH的多少，吸光值越大，－OH越多。反应试管中加入0.5 m19 mmol／L FeSO4、0.5m19 mmol／1水杨酸－乙醇及0.5ml不同蛋白酶水解过的丝胶蛋白溶液，最后加入10mmol／1H202 5 ml启动反应，37℃温浴1h，于536nm处测吸光值。
清除率(％)=[A3-(A1－A2)]／A3×100
式中：A3为对照，不加样品；
A1为某浓度时的吸光值；
A2为无显色剂FeSO4时的该浓度的本底值。
2.2风味蛋白酶去除羟自由基(・OH)的条件优选
分别配制2mg／ml，4mg／ml，6mg／mL,8mg／ml，10mg／ml，12mg／ml,14mg／ml的丝胶蛋白溶液；配制1mg／ml的风味蛋白酶溶液。各取1.5ml不同浓度的丝胶蛋白溶液然后分别加入0.03ml，0.06ml，0.09ml，0.12ml，0.15ml，0.18ml，0.21ml的1mg／ml的风味酶液反应时间分别设置为1、2、3h。按照正交方案实验。
清除超氧自由基(・02－)能力
采用邻苯三酚自氧化法进行测定。取0.05mol／ITris－HCI缓冲液(Ph8.2)4ml，置于25℃水浴中预热20min，分别加入经过风味蛋白酶水解过的不同浓度的待测液2ml和25mmol／1邻苯三酚溶液1ml，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入8％的HC10.1ml终止反应，在320nm处测吸光度(A)，以1ml蒸馏水作空白代替待测液作空白试验。
清除率(％)=[A3－(A1－A2)]／A3×100
式中：A1－某浓度提取液的吸光值；
A2-不加入邻苯三酚无显色时的吸光值；
A3-不加丝胶蛋白短肽的吸光值。
二 结果与分析
2.1不同蛋白酶水解丝胶蛋白抗氧化能力比较
不同的酶水解丝胶蛋白后所产生的短肽抗氧化能力不同，本实验采用单因素实验，在反应时间均为2h的条件下调查了不同的酶水解丝胶蛋白后清除・OH的能力，结果如图1所示。由表可以看出，风味蛋白酶水解丝胶蛋白后其清除OH的能力最强。
2.2风味蛋白酶水解的丝胶蛋白清除-OH的条件的优化
影响风味蛋白酶水解丝胶蛋白程度的因素主要有风味酶与蛋白的浓度比以及水解时间，本实验通过正交
试验分析了风味蛋白酶浓度、丝胶蛋白质浓度和水解时间的对・OH清除的最佳条件。
F0.05(2，4)=6.94，F0.01(2，4)=18.00
各因素的F值，A高度显著，B显著，即酶和蛋白浓度对实验结果影响高度显著，反应时间对实验结果影响显著。根据K值选择最佳浓度比(酶：蛋白)为1：100，最佳反应时间为2h。
2.3风味蛋白酶水解“白s”丝胶蛋白质清除的羟基自由基(・OH)能力
图2表明在风味蛋白质浓度为0.1g／ml条件下，不同浓度的丝胶样品均有一定的清除羟基自由基(・OH)能力，随着丝胶蛋白浓度的增加，其清除羟基自由基(・OH)能力逐渐增大，浓度为10mg／ml时清除能力最大，达到40.5％。当浓度大干10mg／m1时其对羟自由基的清除率开始降低。
2.味蛋白酶水解“白s”丝胶蛋白质清除超氧自由基(・02－)能力
图3表明，不同浓度的丝胶样品均具有一定的清除・O2－能力，其清除能力均随样品浓度的增大而增强，呈现一定的量效关系。当丝胶浓度达到10mg／ml时，清除能力达到31.08％。
三 结论
3.1风味蛋白酶通过内切方式切断多肽内部的肽键，形成短链肽，其中一些含有疏水氨基酸，使用外切酶每一次从多肽链的末端切断释放一个氨基酸，从而长链蛋白质水解为氨基酸。本文比较多种蛋白酶相对抗氧化活力，以水解物中风味蛋白酶水解物的相对抗氧化活力最大，与多篇论文的结论一致，说明风味蛋白酶不仅对植物蛋白水解物抗氧化性强，对动物蛋白水解也具有同样的作用。
水解蛋白范文5
【关键词】脑蛋白水解物不良反应
【中图分类号】R472.2【文献标示码】B【文章编号】1007-8517(2008)12（B）-0032-01
2008年9月，我们治疗1例注射用脑蛋白水解物致不良反应患者，经精心护理，效果满意。报告如下。
1病例资料
患者男，63岁。因脑出血入院，于9月20日在全麻下行右侧去骨瓣减压脑内血肿清除术，术后入我科。9月24日神志转清，双瞳孔等大等圆，直径2毫米，光反应灵敏，双肺呼吸音清，言语清晰。右侧肢体活动好，肌力六级，左侧肢体无自主活动，肌力一级。患者以前无药物过敏史。9月29日早晨七点测体温36.5摄氏度，脉搏98次/分，呼吸18次/分，血压120/80mmHg。下午一点十分开始静脉注射脑蛋白水解物60mg入生理盐水500ml液，滴速40滴/min，在滴入约50ml时，突发寒战，心悸，呼吸急促，诉胸闷.憋气，后言语不清。呼吸42次/分，测血压140/90mmHg，心率150次/min，全身皮肤未见红斑皮疹。考虑为注射脑蛋白水解物后不良反应，立即停止输入。给予氟美松10mg静推，10%葡萄糖酸钙10ml静推。测体温39.3℃，给予安通定2ml肌注。30分钟后患者胸闷.心悸症状消失，寒战停止，测体温38.4℃，血压130/80mmHg，呼吸18次/min，心率110次/min。未再输入脑蛋白水解物。
水解蛋白范文6
【关键词】 水通道蛋白1 鼻息肉 免疫组织化学
［ABSTRACT］ Objective: To explore the expression and distribution of aquaporin1(AQP1) in the formation and development of nasal polyps. Methods: Thirty cases of normal inferior turbinates and sixty cases of nasal polyps were enrolled in this study. In the nasal polyp group， there were 10 cases of type II phase 1， 15 cases of type II phase 2， 25 cases of type II phase 3， and 10 cases of type III. Expression of AQP1 in both groups was determined by the Elivision plus immunohistochemistry technique. Results: (1) Positive AQP1 cells in the epithelial cell layer of nasal polyps were significantly fewer than those of the inferior turbinate (P＜0.01) and positive AQP1 cells of nasal polyps of the type Ⅱ phase 1 were significantly more than those of the type Ⅲ or type Ⅱ phase 3 (P＜0.01). (2) Positive AQP1 cells in both the vessel endothelium and the glandular epithelium from the type Ⅲ， type Ⅱ phase 3 of nasal polyps were significantly more than those from the type Ⅱ phase 1 nasal polyps and the inferior turbinate (P＜0.01). Conclusion: AQP1 might play an important role in the formation and development of nasal polyps. Exploration of the regulation of AQP1 contributes toward evaluating the pathogenesis of nasal polyps.
［KEY WORDS］ Aquaporin1; Nasal polyps; Immunohistochemisty
鼻息肉是耳鼻喉科常见病，发病率较高，复发性强［1］。临床上最常见的病理类型是水肿型(约占总数的85% 90%)，其具体发生机制尚不明确［2］。现认为鼻息肉的发病是多因素、多步骤的过程，涉及众多复杂的病理机制。
AQP1是上世纪80年代末由Agre发现的第一个水通道，被称为原型水通道。AQP1在人体内分布广泛，存在于不同的组织器官中，如与液体被吸收和分泌有关的肾小管、髓袢降支薄壁段、脉络膜丛、唾液腺上皮、支气管、肺泡上皮、毛细血管内皮等。在淋巴管和黏膜下毛细血管中的AQP1能促进吸收的水迅速进入淋巴管和毛细血管床。可见AQP1参与人体内多种生理功能调节，AQP1表达和功能异常与某些疾病的分泌增多及水肿密切相关［3］。
1 材料与方法
1.1 临床资料 本组标本取自2004至2005年北京大学深圳医院及北京大学第三医院住院行鼻内镜手术的慢性鼻窦炎鼻息肉患者90例，随机分组：①鼻息肉组60例，其中男33例，女27例，17 52岁，平均35岁，其中Ⅱ型Ⅰ期10例，Ⅱ型2期15例，Ⅱ型3期25例，Ⅲ型10例；②对照组：同一时期接受鼻中隔矫正术的患者，取下鼻甲黏膜共30例，其中男20例，女10例，18 36岁，平均31岁。
排除标准：1个月前全身或鼻腔局部使用过激素、抗组胺以及抗生素药物；合并有变应性鼻炎、支气管哮喘或合并有严重全身疾病者。
1.2 实验方法
1.2.1 免疫组化染色材料 AQP1蛋白单克隆抗体，鼠抗人单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产。Elivision Plus试剂盒为福州迈新公司产。
1.2.2 方法 标本经10%福尔马林液固定，石蜡包埋，连续切片，5?μm厚，HE染色和Elivision Plus二步法免疫组化染色。脱蜡、入水，3%甲醇过氧化氢液室温处理切片，微波修复抗原，滴加一抗AQP1单克隆抗体（1∶200）于切片上，4?℃过夜，严格按照Elivision Plus二步法免疫组化染色操作，DNB显色，苏木精复染，脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜下观察。每批均以已知人肾曲小管阳性切片为阳性对照，用PBS液代替一抗同步染色作为阴性对照。
1.3 结果判断 采用双盲法，每张切片由两位病理医生分别判定计数，两人计数相差10%以上重新计数。AQP1蛋白定位于细胞浆内，棕黄色或棕红色颗粒为阳性细胞。每张切片在×200倍镜下随机选择5个视野，计数鼻息肉中的阳性细胞，取其平均数作为阳性细胞表达数（±s）。
1.4 统计学处理 应用SPSS10.0软件包，两组均数比较用t检验，多组均数比较用方差分析。
2 结 果
2.1 病理结果 阴性对照均不着色，阳性对照片中见人肾曲小管胞浆呈明显棕黄色。下鼻甲黏膜AQP1阳性表达主要位于黏膜上皮细胞和黏膜固有层腺体。在毛细血管内皮及血窦内皮表达较弱。在鼻息肉组织中AQP1蛋白多位于上皮下腺体及毛细血管、血窦内皮细胞胞浆中，染色较强，而在上皮细胞中则呈弱阳性表达或阴性表达（图1 5）。根据Kakoi分型［5］：水肿型占89%，腺囊泡型占8%，纤维型占3%。
鼻息肉Ⅲ型，黏膜上皮细胞中AQP1蛋白多阴性表达，黏膜下部分嗜酸性粒细胞AQP1表达阳性（×400）
鼻息肉Ⅲ型，AQP1蛋白在较多血管内皮细胞中呈阳性表达（×200）鼻息肉Ⅱ型3期，AQP1蛋白在较多腺样细胞中呈阳性表达（×200）
鼻息肉Ⅱ型1期，AQP1蛋白在上皮层呈阳性表达，血管腺体多呈弱阳性表达（×200）
2.2 AQP1蛋白在鼻息肉与下鼻甲黏膜中的分布 AQP1蛋白在鼻息肉与下鼻甲黏膜的表达见表1。鼻息肉组织和下鼻甲黏膜中AQP1蛋白在黏膜上皮、血管内皮以及腺体表达的阳性细胞数差异有统计学意义。
2.3 AQP1蛋白在鼻息肉不同组织类型中的表达 见表2。 水肿型鼻息肉中AQP1蛋白在血管内皮及腺体中的阳性细胞数明显高于腺囊泡型及纤维型鼻息肉， 差异有统计学意义。
2.4 AQP1蛋白在鼻息肉不同临床分型分期的表达 见表3。由表3可见，鼻息肉临床分型分期中AQP1蛋白在Ⅱ型1期血管内皮阳性细胞数明显少于Ⅱ型3期及Ⅲ型的阳性细胞数，差异有统计学意义(P＜0.01)。Ⅱ型1期腺体的阳性细胞数明显少于Ⅱ型3期，差异有统计学意义(P＜0.01)。但同Ⅲ型的阳性细胞数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。Ⅱ型1期上皮中的阳性细胞数分别大于Ⅱ型3期及Ⅲ型，差异有统计学意义(P＜0.01)。
3 讨 论
鼻息肉是一种以鼻腔局部黏膜肿胀为特征的良性病变组织，以往多认为鼻息肉的水肿是肥大细胞释放的组胺介质的作用所致［6］; 也有学者认为是鼻黏膜血管通透性增加导致了鼻息肉组织水肿［7］。鼻息肉作为一种独特的炎性水肿组织，其水肿的形成可能存在多种机制［8］。
目前在人类和哺乳动物身上共发现水通道蛋白有10个亚型，（AQP0、AQP19）分布于多个组织器官，其基本功能是介导自由水分子的跨生物膜转运，活化能较低（Ea＜5?kcal·mol/L），速度快，不受质膜分子组成、温度等的影响，只要存在渗透压梯度或流体静力压不同，就可以有水分子顺梯度通过水通道蛋白［9，10］。因而它对水转运的调节作用也愈来愈受到人们的关注。
AQP1是第一个被鉴定的水通道蛋白，基因定位于7P14，其基本结构是一个单肽链，含有6个跨膜区域和5个环，其中B、E环含有天冬酰氨一脯氨酸一丙氨酸（AsnProAla NPA）重复关联序列，显著疏水。AQP1的高级结构为一个四聚体，其以4个单体聚合，每个单体允许自由水通过，每个单体单独施行功能。这种转运也受水通道蛋白表达水平的显著影响，因此水通道蛋白的表达必然与机体的生理病理状态有密切关系［11，12］。
我们的研究表明，在正常下鼻甲组织中AQP1的阳性表达主要位于黏膜上皮细胞和黏膜固有层的腺体、粘液腺细胞胞浆中，在毛细血管内皮及血窦内皮表达较弱。鼻息肉组织中强染色多位于上皮下腺体及毛细血管、血窦内皮细胞。AQP1蛋白在鼻息肉和下鼻甲黏膜组织的表达差异有统计学意义（P＜0.01)。表明在鼻息肉组织中存在AQP1蛋白的异常表达。从蛋白质水平证明了AQP1基因的异常与鼻息肉的发生密切相关。近年的研究也发现，水通道蛋白的亚型在鼻息肉组织也有分布［13］，提示水通道蛋白可能在鼻息肉中广泛分布。与本研究相类似，Verkman等［9］发现，小鼠肺毛细血管内皮细胞或肺泡上皮缺乏AQP1时，肺泡毛细血管间水的渗透下降90%，Chanranhan等［14］也认为，AQP1参与了呼吸道黏膜下腺的液体分泌，可见AQP1蛋白的异常表达对水的转运有重要影响。
AQP1在鼻息肉腺体和血管内皮细胞的过表达可能与鼻息肉形成有关。本组资料显示，鼻息肉中水肿型AQP1蛋白在血管内皮及腺体表达的阳性细胞数显著高于腺囊泡型及纤维型（P＜0.01）。提示在不同组织类型鼻息肉的发生过程中，组织水肿愈明显，则AQP1蛋白表达阳性数越高，一定程度上反映了AQP1的基因失调与水肿型鼻息肉的产生有关。
我们在鼻息肉早期病变过程中发现，黏膜上皮多为假复层柱状上皮，随着病变加重，出现上皮排列紊乱，部分被复层鳞状上皮及无纤毛的扁平上皮取代，腺体增生分泌亢进，血管增生扩张。实验发现鼻息肉Ⅱ型3期和Ⅲ型中AQP1蛋白在血管内皮阳性细胞显著多于Ⅱ型1期的鼻息肉组织（P＜0.01），Ⅱ型3期腺体样细胞中阳性细胞显著多于Ⅱ型1期（P＜0.01），说明随着病变程度的进展，AQP1蛋白表达增加。同时也发现在黏膜上皮中随着病变的进展，AQP1表达出现下降趋势。因而推测早期AQP1蛋白在息肉黏膜上皮中的较多表达可能是细胞对所接受的内外致病因子的反应，使AQP1基因合成加速，促使AQP1蛋白高表达，加快水的跨膜转运，以尽量维持组织内外的水转运平衡，减少细胞损伤。随着致病因子继续作用，当上皮细胞数量损失到一定程度，同时随着异常增殖腺体和血管内皮细胞上AQP1蛋白的过表达，使上皮残留的AQP1无法承担超负荷水转运，使得组织间液大量积聚，息肉的逆转能力下降。而Ⅲ型腺体样细胞中AQP1蛋白的表达同Ⅱ型1期中没有显著性差异，可能是由于Ⅲ型患者由于多次手术，导致腺体破坏，构筑数目减少有关。故对AQP1蛋白动态观察可预测鼻息肉的发展趋势和程度。
AQP1在鼻息肉的发生过程中可能并非孤立地发挥作用，它有可能与Na+K+ATP酶协同，通过促进跨上皮离子的转运，形成渗透梯度，产生对渗透水转运的驱动力［15］。通过研制水通道蛋白抑制因子来抑制功能亢进及表达过多的水通道蛋白，或通过控制水通道蛋白来平衡液体的分泌和吸收，可能为鼻息肉治疗及防止术后复发提供一种新的治疗思路和手段。
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