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纤维素水解范文1
关键词：小麦秸秆；糖化发酵；NaOH预处理
中图分类号：TQ353 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）18-4355-04
第二代生物质乙醇是利用不同的原料如木材、农业或者森林废弃物来生产，纤维素乙醇作为一种重要的可再生能源，具有能够支撑全球能源消耗20%～100%的潜力。在纤维素乙醇的生产过程中非常重要的一步就是将半纤维素和纤维素水解为单糖，目前最具发展前景的水解方法为纤维素酶水解。为了使纤维素酶能够与纤维素有效接触，需要在水解之前对木质纤维素材料进行预处理，解除木质素、半纤维素等对纤维素的保护作用，同时破坏纤维素的结晶结构，增加其比表面积[1]，从而提高纤维素的水解糖化效率。
NaOH溶液的润涨处理是发现最早、应用最广的预处理手段之一，其处理温度和压力都低于其他预处理手段[2]。NaOH预处理打开了交联木质素和木聚糖的酯键，能够部分溶解原料中的木质素、半纤维素，降低纤维素的结晶度，同时增大了木质素材料的比表面积，能够得到较高的酶解糖化率，是一种较为有效的预处理方法[3]。
本试验使用NaOH溶液对小麦秸秆进行预处理，分别研究了NaOH质量分数、小麦秸秆固体含量、预处理时间等因素对小麦秸秆纤维素酶水解过程的影响，得到了最佳的NaOH预处理条件，之后对经最佳条件预处理后的小麦秸秆进行了同步糖化发酵试验，并在电子显微镜下观察了预处理前后的秸秆结构变化，进一步明确了NaOH预处理的效果。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料 小麦秸秆取自太湖农村，机器收割，不含秸秆根部和麦穗。
1.1.2 酶制剂 纤维素酶购自Sigma公司，为淡黄色液体纤维素酶。
1.1.3 酵母菌 试验所用酵母为酿酒酵母BY4742， 于4 ℃下保存。
1.2 方法
1.2.1 小麦秸秆预处理 小麦秸秆粉碎后过80目筛，烘箱中55 ℃干燥，设置不同质量分数的NaOH、小麦秸秆固体含量及预处理时间，在121 ℃、0.2 MPa的条件下在高压灭菌锅中进行预处理。预处理结束后冷却至室温，加入适量的稀盐酸调节pH至中性，之后使用高速离心机进行离心并清洗3～5次。预处理后的小麦秸秆于105 ℃烘干，保存于干燥皿中备用。
1.2.2 纤维素酶水解 分别取未经预处理以及经NaOH预处理的秸秆各4.0 g，定容至100 mL，根据本课题组前期研究结果[4]，选取纤维素酶投加量为30 FPU/g秸秆，温度40 ℃，柠檬酸盐调节pH为4.8，共水解120 h，每隔24 h取样1次，离心后取上清液进行HPLC分析。
1.2.3 同步糖化发酵 根据本课题组关于同步糖化发酵条件的研究，分别取未经预处理以及最优条件下NaOH预处理后的秸秆各1.6 g，确定固体含量为0.16 g/mL，纤维素酶投加量为35 FPU/g秸秆，酵母菌浓度8 g/L，柠檬酸盐调节pH为4.0，温度设置为38 ℃，同步糖化发酵120 h，每隔24 h取样分析。
1.3 分析方法
1.3.1 小麦秸秆成分分析 小麦秸秆纤维素、半纤维素和木质素含量的测定采用NREL实验室提供的方法[5]。
1.3.2 还原糖及乙醇含量测定 样品中纤维二糖、葡萄糖、木糖、乙醇浓度采用Shimadzu高效液相色谱分析仪检测，检测器为示差折光检测器，色谱柱为Aminex HPX-87P Column。检测条件：柱温65 ℃，检测器温度60 ℃，流动相为超纯水，流速0.8 mL/min，进样量20 μL。
1.3.3 小麦秸秆结构分析 采用电镜扫描观察。样品在室温风干之后平铺于导电胶上，进行离子溅射金处理45 s，用JSM-7401F场发射扫描电子显微镜观察。
1.3.4 计算公式 纤维素水解产生葡萄糖的化学方程式如方程式（1）所示，理论上，100 g纤维素水解可产生111.1 g葡萄糖。葡萄糖发酵产乙醇的化学方程式如方程式（2）所示，理论上，100 g葡萄糖发酵可产生51.1 g乙醇和48.9 g CO2。由此可知，100 g纤维素理论上可产生56.8 g乙醇。
2 结果与分析
2.1 不同NaOH预处理条件对小麦秸秆酶解效果的影响
2.1.1 NaOH对小麦秸秆酶解效果的影响 本试验首先考察了不同质量分数的NaOH预处理条件下，纤维素酶水解小麦秸秆的效果。分别以0.25%、0.50%、1.00%、2.00%和4.00%的NaOH溶液预处理已粉碎干燥的小麦秸秆，之后进行120 h的水解试验，并每隔24 h取样进行还原糖含量分析。经不同NaOH溶液预处理后小麦秸秆水解产物中还原糖情况如图1所示。预处理过的小麦秸秆经过酶解后，主要产生了纤维二糖、葡萄糖、木糖3种还原糖，由图1可以看出，随预处理NaOH质量分数的增加，酶解液的还原糖含量逐渐升高，其产量均在NaOH质量分数为1.00%时达到最高，其中葡萄糖含量在酶水解48 h时达到最高，为14.13 g/L。之后NaOH质量分数继续增大时，还原糖产量开始下降，可能因为在预处理过程中NaOH溶解半纤维素和木质素的同时也水解了部分纤维素，还原糖进入了液相，在进行固液分离时损失[6-8]。
2.1.2 固体含量对小麦秸秆酶解效果的影响 本试验设置预处理时的小麦秸秆固体含量分别为0.025、0.050、0.100、0.150和0.200 g/mL，采用在“2.1.1”方法中确定的NaOH预处理最佳质量分数1.00%对小麦秸秆进行预处理，之后进行120 h的酶解试验，每24 h取样测定其还原糖含量。不同固体含量下NaOH预处理产物中还原糖含量如图2所示。由图2可见，预处理过程中在小麦秸秆固体含量提高到0.050 g/mL时，酶解液中的3种还原糖含量均达到最高。其中葡萄糖在纤维素酶水解48 h时其浓度达到最大值14.13 g/L。之后固体含量继续增大时，其还原糖产量下降。分析其原因可能是预处理过程中固体含量对预处理强度产生影响，固体含量过高时，因NaOH溶液的量相对减少，难以与秸秆充分接触，从而影响了预处理效果[9，10]。
2.1.3 预处理时间对小麦秸秆酶解效果的影响 本试验设置预处理时间分别为15、30、50、60和90 min，采用“2.1.1”方法得到的预处理最佳NaOH质量分数1.00%和“2.1.2”方法得到的最佳固体含量0.050 g/mL对小麦秸秆进行预处理，之后进行120 h酶解，每隔24 h取样测定其还原糖产量。不同预处理时间下3种还原糖的产量如图3所示。
由图3可见，随着预处理时间的增加，小麦秸秆酶解液3种还原糖含量在60 min时达到最大。其中葡萄糖浓度在酶水解24 h后达到最大值15.30 g/L。预处理50 min以上时，NaOH溶液对木质素和半纤维素的溶解基本完成，纤维素充分暴露出来，预处理时间增加到60、90 min时，酶解产生还原糖的浓度变化不大，考虑到增加预处理时间会显著增加能耗，故将60 min确定为最佳预处理时间。
2.2 NaOH预处理对小麦秸秆酶解效果的影响
通过上述试验可以得到NaOH预处理小麦秸秆的最佳条件为NaOH质量分数1.00%，小麦秸秆固体含量0.050 g/mL，预处理时间60 min。将经过预处理的小麦秸秆残渣酶解120 h，其反应进程见图4。
由图4可知，在最佳预处理条件下，酶解24 h时，酶解液总还原糖产量达到最大，为34.65 g/L，其产率为86.61%。而未经预处理的小麦秸秆在酶解刚开始时总还原糖产量便开始下降，最高仅为4.80 g/L，其产率仅为12.01%。最佳预处理条件下的总还原糖产率也明显高于常规的稀碱预处理的总还原糖产率[3]。这是因为NaOH预处理对半纤维素和木质素均有较好的去除效果，解除了木质素和半纤维素对纤维素的保护作用，同时破坏纤维素大分子之间的结晶结构，增大了小麦秸秆的比表面积，改善了底物与纤维素酶的接触效果，同时也有效减少了木质素对纤维素酶的特异性吸附，使纤维素酶可以充分作用于底物，有效提高了小麦秸秆的酶解效果[11，12]。
2.3 小麦秸秆成分分析
使用NREL实验室的方法分别测定未经NaOH预处理的小麦秸秆与经过最优条件预处理过的小麦秸秆成分，结果如表1所示。由表1可见，小麦秸秆在经过了最优条件预处理后，木质素的含量由25.73%降低至11.75%，同时纤维素的含量由39.31%升高至58.84%。表明NaOH能够提高纤维素在底物中所占比例，同时降低木质素等所占比例[13]，有利于后续酶解进程。
2.4 同步糖化发酵结果
未经NaOH预处理的小麦秸秆与经过最佳条件预处理的小麦秸秆经同步糖化发酵后上清液成分如表2所示。
由表2可见，未经NaOH预处理的小麦秸秆由于结晶以及木质结构的保护，酶解过程受到抑制，进而影响了酵母菌对还原糖的发酵。而经过最佳NaOH预处理条件处理后，乙醇的产量大幅上升，由处理前的7.98 g/L上升到38.32 g/L，乙醇产率由22.40%上升至71.70%，无法被酵母菌利用的木糖含量也由处理前的0.80 g/L上升到了12.94 g/L。
由此可见，NaOH预处理不仅能够有效去除木质素，而且基本不影响纤维素[14]，纤维素可以进一步水解并发酵产生乙醇，NaOH预处理是一种高效的木质纤维素产乙醇的预处理方法。
2.5 NaOH预处理前后小麦秸秆结构分析
小麦秸秆粉末在NaOH溶液质量分数为1.00%、固体含量0.050 g/mL、121 ℃、0.2 MPa的条件下预处理60 min，恢复至室温干燥后备用。同时准备一份未经预处理的小麦秸秆粉末，干燥后备用。样品平铺在导电胶上，喷金45 s后用扫描电镜观察，其SEM结果如图5所示。
由图5可见，未经NaOH预处理的小麦秸秆表面光滑，纤维排列比较整齐，没有明显的破损和孔隙，结构致密。经过NaOH预处理后的小麦秸秆的半纤维素、纤维素和木质素的部分结构遭到破坏、分离，纤维和纤维束出现卷曲和折叠，变得柔软疏松，排列凌乱；秸秆表面由预处理前的致密变得疏松，有序排列变得杂乱无章；原来光滑的表面上出现了片状的物质，这可能是溶出的半纤维素和木质素[15]。经过预处理的小麦秸秆的比表面积大大增加，这更有利于纤维素酶的吸附，有利于水解，从而提高了酶水解液中还原糖的得率。
3 结论
1）NaOH预处理小麦秸秆的最佳条件为：NaOH质量分数1.00%，小麦秸秆固体含量0.050 g/mL，预处理时间60 min。
2）经过NaOH预处理的小麦秸秆水解液还原糖得率可提升74.60个百分点。
3）通过SEM观察发现，经过NaOH预处理后，秸秆表面变得粗糙，有利于纤维素酶的吸附及进一步水解。
4）经过最佳条件NaOH预处理的小麦秸秆进行同步糖化发酵其乙醇产率提高了49.30个百分点。
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纤维素水解范文2
关键词：木质纤维素；纤维素酶；纤维素酶解
DOI：10.16640/ki.37-1222/t.2017.10.185
1 引言
木质纤维素原料来源十分广泛，是储量丰富的可再生资源[1]。据统计，全球每年生产该类物质约200×109吨，其中有90%以上是木质纤维素类物质，而它们当中有8～20×109仍具有潜在的可利用性[2]。包括农业废弃物（秸秆、蔗渣等）如何处理，对环境压力以及可再生能源的利用具有现实意义。因此，在生物燃料、生物基化学品、分子材料、食品等领域这些廉价及丰富的木质纤维素，都具有广泛的应用空间。
纤维素的结构单位时D-葡萄糖，其分子式为：（C6H10O5）n，式中n为葡萄糖基数目，称为聚合度。经长期研究，已证实天然纤维素中D-葡萄糖基以吡喃环的形式存在，并且相互以β-1，4糖苷键构成分子链，因为这对吡喃式D-葡萄糖具有最低的能态，这也是其二聚物（纤维二糖）及共衍生物的真正形式。由于葡萄糖上带有多个羟基，因此纤维素分子间容易形成氢键，进而使得链与链之间氢键紧密连接易于聚集成结晶性的原纤结构。如图1所见，大量氢键网状结构中存在着相对规则的结晶区，其阻碍了纤维素分子的进一步利用，故纤维素水解前需进行预处理，破坏它的氢键及结晶区，以便更好地水解纤维素，从而增加它的酶可及面积。
2 纤维素酶作用机理
纤维素酶是指能够水解纤维素β-1，4-糖苷键，进而生成葡萄糖的一类酶的总称，它是由几种酶共同协同作用，而不是单一的酶，其中主要包括外切葡聚糖酶（CBH，C1）、内切葡聚糖酶（EG，Cx）和β-葡萄糖苷酶（CB，纤维二糖酶）。长期的研究表明，结晶纤维素的彻底降解至少需要这3组纤维素酶的协同作用，如图2所示，Cx能容易地降解接近类型的纤维素或衍生物，Cx只有和C1组分结合时才可以利用晶形式的纤维素。C1酶首先作用于结晶纤维素表面，使其形成结晶构的纤维素键断开，长链分子末端游离，从而其转化成可被Cx酶作用的形式，Cx酶水解非结晶或纤维素、可溶性纤维素转化为纤维二糖，最后由β-葡萄糖苷酶将纤维二糖、三水解为葡萄糖。
3 单一纤维素组分作用机理
（1）内切葡聚糖酶（EG或Cx）。Cx酶作用于纤维素的β-1，4葡萄糖苷键，随机切割，产生大量纤维素的还原性末端。测定Cx酶活力方法较多，通用的方法是利用羧甲基纤维素钠（CMC）作为底物测其酶活，由于它是一种高聚合度的可溶性纤维素衍生物，还原性所占比例较少，纤维素酶易于作用β-1，4葡萄糖苷键。
（2）外切葡聚糖酶（CBH，C1）。C1酶是指切割有Cx酶所产生的纤维素分子还原性末端，能够是纤维素长链释放出葡萄糖及小分子的寡糖。
有研究表明，已知外切葡聚糖酶具有2个独立的活性结构域：其一是指具有催化纤维素功能的结构域CD，其二是指具有结合纤维素功能的结合于CBD，二者由高度糖基化链相连接。查阅大量文献指出，C1对纤维素结晶区破坏作用极大，能够产生纤维二糖。其原因是首先是利用CBD把C1吸附在纤维素结晶区表面，其次再由单根葡聚糖链（纤维素）快速准确地进入CD中带底物结合和催化部位的“隧道”，纤维二糖被准确地从葡聚糖链上切割下来并被释放出来的同时，C1分子沿着葡聚糖链向前滑动2个葡萄糖单位[3]。
（3）β-葡萄糖苷酶（CB，纤维二糖）。CB酶又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能够作用于结合在末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，水解生成部分β-D-葡萄糖以及相应的配基。在水相系统中，CB酶能水解纤维二糖及一些聚合度小于6的纤维糊精为葡萄糖，随着聚合度的增加，水解效果显著下降。
4 总结
木质纤维素广泛的来源，如农业废弃物、餐厨垃圾以及部分工业残余物等，可通过预处理和水解发酵转化为能源物质。在此基础上，需要在理论研究做出深入解释，以便更好的应用于实践。
参考文献：
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纤维素水解范文3
关键词：羧甲基纤维素酶；滤纸酶；β-葡萄糖苷酶；曲霉A25
中图分类号 S154 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）08-22-04
Abstract：67 strains of soil bacteria were isolated form farmland，from which a high-yielding cellulase strain was screened.These strains were inoculated on the cellulose medium，and a preliminary screening was conducted，in which we measured hydrolysis transparent circle and the ratio of the size of the colony under pH5.5 and 28℃ conditions by using the Congo Red staining.Furthermore，these selected strains were cultured，and a crude enzyme liquid was extracted for analyzing the activities of carboxymethyl cellulose（CMC），filter paper enzyme（FP）and β-glucosidase（BG）.Under different temperature conditions，the activity of cellulase was determined，and ultimately this one strain of Aspergillus A25 was obtained.Its great activity is under the condition of optimum temperature for 50 ℃.Producing cellulose enzyme activity was as following：CMC amounted to 2 340.92 U/mL，FP activity amounted to 2.66 U/mL，and BG activity amounted to 164.72 U/mL.
Key words：Cerboxymethl cellulose；Filter paper enzyme；β- glucosidase；Aspergillus A25
纤维素物质是地球上含量最丰富的碳水化合物[1]，而目前人类对纤维素的开发与利用还非常有限，因此如何更有效地开发和利用纤维素资源已成为当今世界的热门课题之一。目前，对纤维素的降解利用主要是用酸碱处理等化学手段，以及汽爆及蒸汽加热等物理手段[2]。生物法由于对设备要求低，分解后的产物易回收利用，以及对环境污染较小等特点而备受重视。纤维素是一个复杂酶系，根据其功能的不同可分为3类：作用于纤维素非结晶区的内切葡聚糖酶（CMC）；作用于无定型区切割糖苷键的外切葡聚糖酶（FP）；以及作用于纤维二糖的β-葡萄糖苷酶（BG）[3-5]。协同作用才能将结构复杂的天然纤维降解。纤维素酶在食品、洗涤、纺织、饲料、造纸等方面具有广泛的应用和发展前景[5]。通过对本实验室保存的67株菌株进行初筛和复筛，A25这一株菌株是本次实验所筛选的，具有较高降解纤维素活力的菌株，本文对其纤维素酶的生产培养特性进行研究，对于了解其降解机制以及实际应用都有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料 从农田土壤中分离得到67株土壤细菌。
1.2 实验方法
1.2.1 DNS法标准曲线的制备 称0.05g经105℃烘干至恒重的葡萄糖溶于少量蒸馏水中，用蒸馏水定溶至500mL配制成浓度为50μg/mL的葡萄糖溶液。取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL和1.2mL葡萄糖溶液再加入蒸馏水将体积配制至10mL。再分别从中取2mL，再加蒸馏水1.0mL再加DNS试剂2.0mL摇匀，置于沸水中煮沸5min，取出置与冷水中冷却到室温，测其OD530值。根据OD值，以葡萄糖浓度为纵坐标，吸光值为横坐标，列出直线回归方程（Y=aX+b）。
1.2.2 产纤维素酶菌株的培养 在无菌条件下，将67株菌株接种到纤维素培养基中，放在培养箱里温度为28℃，培养48h。
1.2.3 刚果红染色 把培养好的霉菌用刚果红染色剂覆盖培养皿一层进行染色30min。然后用0.9%生理盐水冲洗2～3次，观察其透明圈的大小，并计算出H/C的比值即酶活，（酶活性=透明圈直径的值与菌落直径的比值）。根据比值的大小进行初步筛选。
1.2.4 粗纤维酶液的制备 在无菌操作下，将初步筛选的7株霉菌分别接种到液体发酵培养基中，摇瓶培养3～4d，温度为28℃，转速为160r。
1.2.5 纤维素酶发酵液的处理 纤维素酶霉菌摇瓶培养好后，用循环水式抽滤机进行抽滤。将滤液转入到原三角烧瓶中，放入冰箱备用。
1.2.6 酶活力的测定 采用DNS法（3，5-二硝基水杨酸比色法）[6-7]。
1.2.7 羧甲基纤维素钠（CMC-Na）酶活力测定 以2.0mL 20%（w/v）羧甲基纤维素钠溶液为底物，用pH5.0柠檬酸缓冲液配制）。加1mL稀释酶液于50℃，恒温水浴反应30min，然后加入2mL DNS显色液，终止反应，煮沸5min，再放入冰水中冷却至室温。用722S分光光度计在530nm处测定光密度OD值，同时相同条件作空白样调零。
1.2.8 滤纸（FP）酶活力测定 精确吸取4.0mL稀释酶液和1.0mL pH4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，置于试管中，加入新华5号滤纸条（1×3cm）一条，滴入甲苯2～3滴防腐。40℃反应24h。吸取上述滤纸酶液2.0mL加入蒸馏水1.0mL，2.0mL DNS显色液，终止反应。沸水煮沸5min，然后再放入冷水中冷却至室温。在530nm处测定光密度OD值，同时相同条件下作空白调零。
1.2.9 β-葡萄糖酶（BG）活法测定 取1.0mL稀释酶液加2.0mL pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液配制的1%的水杨酸溶液，50℃酶解30min，加入2.0mL DNS显色液，终止反应，于沸水中水浴5min，用冷水冷却至室温，在530nm处测定其OD值，同时相同条件下作空白调零。
1.4 滤纸崩溃实验 取稀释酶液4.0mL和1.0mL pH4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液置于试管中。（15×50cm）加入新华5号滤纸条（1×3cm）一条，滴入甲苯2～3滴（防腐），于恒温箱内40℃保温24h。观察滤纸崩溃情况，观测标准如下：+++表示滤纸完全沉在底部，摇动试管后滤纸呈糊状；++表示滤纸完全下沉，摇后呈小片状；+表示滤纸沿底部呈毛状，摇后部分溶化；-表示滤纸直立完整无缺，摇后不溶化。
1.5 还原糖含量的测定 采用DNS法[9]测还原糖。
2 结果与分析
2.1 高产纤维素酶菌株的初筛 将67株菌株接种到羧甲基固体培养基中进行培养48h，用刚果红染色静止30min后测其H/C的比值，结果见表2。
从本实验室保存的67株菌株中，将各菌株分别采用纤维素固体培养基进行富集培养并进行筛选，从中筛选出高产纤维素酶菌株。从表2这些菌株的透明圈的直径与菌落的直径比值大小可以看出，A25、A5、O7、O8O9、D2、H7、HD的H/C比值较高，这7株产纤维素酶能力较强，红色水解透明圈较明显、较大，具有较高的纤维素酶活力。H/C是透明圈与菌落的比值，比值越大酶活越强。根据红色水解透明圈出现的快慢、大小可大致得出该菌株的产纤维素酶情况，这可作为初次判断的依据。通过表2的结果说明A25、A5、O7、O8O9、D2、H7、HD7株菌株具有较高的酶活力。
2.2 葡萄糖标准曲线的绘制 参照1.2.1所描述的方法制备出标准葡萄糖曲线（图1），根据标准葡萄糖曲线求出直线回归方程y=0.003 4x-0.505，R2=0.996 8（y：葡萄糖浓度，x：OD530的值），通过直线回归方程可以计算纤维素酶酶促反应中产生葡萄糖的浓度，从而根据酶活力单位定义算出酶活。
2.3 高产纤维素酶菌株的复筛 挑选上述试验中滤纸酶活性较高的7个菌株进行进一步试验，将所获得的菌株A25、A5、O7、0809、D2、H7、HD菌株接到液体发酵培养基中进行摇床发酵培养后，在获得发酵液的基础上制得粗酶液。测定其滤纸酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活。各菌株均设3个处理，取其平均值，如表3。
2.4 温度对酶促反应的影响 温度对酶促反影响的原因主要有以下2个方面，一是温度对酶蛋白稳定性的影响，即对酶热变性失活作用，二是温度对酶促反应本身的影响，其中可能包括影响酶和底物的结合，影响Vmax，影响酶和底物分子解离基团的pK，影响酶与抑制剂、激活剂或辅酶的结合等[8]。吸粗酶液2mL和2mL DNS和1mL蒸馏水加入试管分别于40℃、50℃、60℃、70℃和80℃不同水浴锅中处理30min后，对菌体的酶活进行检测，其结果见图2。由图2可见，反应温度对菌株A25的酶活有显著影响，其最适酶活温度为50℃，当水浴处理温度高于50℃或低于50℃时，该菌株A25酶活减弱，但是培养液仍具有较高的纤维素酶活力；同时也表明该菌株所产的纤维素酶具有较高热稳定性。可见，50℃所测得的酶活力最高，即此酶的最适酶活温度为50℃。
3 讨论
3.1 高产纤维素酶菌株的初筛 纤维素在纤维素酶的作用下水解成纤维二糖和葡萄糖，水解后的糖类与刚果红染料形成红色沉淀，使产酶菌株的菌落周围出现清晰的红色水解圈，根据水解圈的大小可粗略的估计菌株产酶的情况，然后选取透明圈较大的菌株进行接种。刚果红是对纤维素酶进行初步筛选的试验方法，实验方法比较简单。通过它可以使纤维素固体培养基上的菌种的代谢产物形成浅红色水解透明圈。用刚果红染液覆盖培养皿一层静止染色30min，纤维素酶菌株产纤维素酶越多，产生的红色水解透明圈越大，产纤维素酶速度越快，浅红色水解透明圈出现的越早。虽然水解透明圈H/C的比值大小直接反映了酶活水平的高低，但不能完全代表菌株产酶能力，不能定量说明该菌株产纤维素酶的能力。也有研究表明液体样品的酶浓度与透明圈的直径（下转127页）（上接24页）成线性关系，可以对酶活进行初步定量[10]。
3.2 高产纤维素酶菌株的复筛 已知纤维素酶的作用方式：CO酶是使天然纤维素晶体分链，起一个分离和水合作用，从而使天然纤维素裂解成为直链纤维素；而C0酶虽不能水解天然纤维素，但能水解直链纤维素的β-l，4-葡萄糖苷键生成纤维二糖，纤维二糖再经β-葡萄糖苷酶水解成为葡萄糖。前人研究认为，纤维素的降解关键是滤纸酶活的高低，再结合β-葡萄糖苷酶活，而CMC酶活只作参考。通过对7个菌株发酵液的滤纸酶活、CMC酶活、β-葡萄糖苷酶活进行测定，初步筛选出产纤维素酶活力较高的A25菌株。初步试验表明，在50℃反应时间30min，pH5.5时A25菌株产生的纤维素酶的活性有较大提高。建议对A25进行进一步的优化试验，以探明其最适的产酶条件，或对其进行进一步的诱变，以提高其酶活性应用于生产实践。
3.3 温度对纤维素酶活性的影响 从粗酶液中吸粗酶液2mL和2mL DNS和1mL蒸馏水加入试管中，在不同的水浴温度下水浴处理30min后，对菌体的产酶量进行检测。为了确定酶活的最适温度，通过测40～80℃不同温度下的实验确定酶活，不同培养温度对纤维素酶有不同的影响，结果表明，曲霉A25水浴处理在40℃时酶活力表现较低，50℃时酶活力达到最大值，水浴处理温度超出50℃时酶活力逐渐变小。对于纤维素酶活的最适温度为50℃，即纤维素酶产量的最适温度在50℃。
参考文献
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纤维素水解范文4
关键词：生物乙醇 纤维素酶 工程菌株
The study and development progress of Bio-ethanol and cellulase production
Liping Yang1 Shuiwen Cai1 Ling Luo1 Hui Liu1，2
1. Changsha Environmental Protection and Professional technique College, 410004 2 Hunan
2. Agricultural university, 410128, Changsha, China
Abstract: With the fossil fuels from shortage to exhaustibility, the humanity is facing toward a common problem in energy crisis. Finding new energy sources is important to sustainable economic development and even human survival. Bio-ethanol, as an energy source that is renewable, affordable, and environmentally safe, will become a substitute for oil. Elevation of cellulase production and reduction of the cellulase production cost are the key factor for enhancing the market competitiveness of cellulosic bioethanol. In this paper, we discussed the development progress of bio-ethanol and cellulose industry to provide a basis for the future upgrading of bio-ethanol production industry and the development of gene engineering strain.
Keywords: bio-ethanol cellulose engineering strain
随着石化燃料由短缺变成枯竭，能源危机是人类面临的共同问题。1998年，Campbell和Laherrere对石油储备和未开发的石油进行评估后认为，天然油在2010年前的产量就开始下降，到2050年全球每年石油供应量将从目前的25亿桶下降到5亿桶[1]。随着石化燃料供应的减少，寻找新的能量来源关系到经济的可持续发展乃至人类的生存问题。生物乙醇作为一种可再生的、经济上可承受的，并且对环境安全的能源物质将逐渐成为石油的替代品[2]。生物乙醇的生产经历了以1代淀粉原料生产乙醇和以木质纤维素为代表的非淀粉原料的2代生物乙醇工业。2代生物乙醇生产克服不与食品的供应之间存在竞争，但是纤维素酶产量低、不稳定、难以工业化导致2代生物乙醇的生产成本大大提高。本文从生物乙醇产业发展过程、木质纤维质物质生产生物乙醇的市场前景及纤维素降解酶的研究进展进行综述，为生物乙醇生产产业的提升、纤维素工程菌的研发提供基础。
生物乙醇产业发展过程
从上世纪80年代开始，人们就开始以谷物为原料来生产乙醇用作供氧燃料，这些被业内称为第1代燃料乙醇的原料。在一些国家，如美国、加拿大、巴西、中国等，乙醇已经被广泛地掺入到汽油中来代替纯汽油使用，其中乙醇的体积含量可达到10%。最近美国正在实施一项混合燃油计划E85，即汽车制造商生产一种可使用乙醇混合物E85（85% 的乙醇和15% 的汽油按体积比混合）的汽车[3]。巴西早在1929年就建立了一项利用乙醇作为发动机燃料的计划，并在接下来几年里安装了第一个使用乙醇作为燃料的发动机。1984年，巴西要求新生产的汽车能使用水化生物乙醇（96%的生物乙醇+4%的水）作为燃料[3]。混合燃料的使用不仅可以减少汽油的使用量，还可以降低温室效应气体以及有毒气体的释放。
但是随着世界人口的不断增长，以谷物等第1代淀粉原料生产乙醇就与食品的供应之间存在竞争，这些谷物为原料生产乙醇就不能满足全球的需求。中国在过去三十年中GDP的年平均增长量为10%，这使得中国成为世界上最大的燃料消费国之一，同时也成为世界上造成空气污染最严重的国家。由于大部分的能源由燃烧化石燃料提供，中国政府正努力解决诸如国内因迅速枯竭的石油和天然气资源而越来越依赖进口石油来满足国内一半的实际需求[4]，以及严重的环境污染等问题。为了改善现状，中国政府决定增加使用能源的种类，尤其提倡使用可再生的、排放更少温室气体的燃料，如乙醇这样的生物燃料和生物柴油。由于生物燃料从诸如玉米、木薯、大豆这样的农产品中提取而来，这对改善中国农村人口的经济状况有积极影响。除了向乙醇生产者发放津贴以鼓励乙醇的生产之外，中国政府近年来也强制要求中国十个省份必须销售浓度为10%的乙醇汽油，这些措施使得中国2008年的乙醇产量迅速达到14.6亿升且在2010年达到21.5亿升，一举成为继美国和巴西之后的世界第三乙醇生产大国。尽管中国政府之前要求到2020年国内乙醇的年消费量要达到100亿升，然而由于担心乙醇生产可能与食物生产行业形成竞争，且考虑到国内农村可用耕地数量有限，以及水资源供应短缺的问题，中国政府于2007年宣布暂停国内谷物乙醇的生产。
为了解决这个矛盾，以木质纤维素为代表的非淀粉原料成为生物乙醇生产的重要原料物质。木质纤维素，其结构复杂，有三种：纤维素35%～37%、半纤维(23-25%)和木质素(18-22%)组成。每年光合可产生大于1，500亿吨的植物干物质，其中一半以上是纤维素和半纤维素[5]。另外，人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素，如农业废物( 稻草、稻壳、麦秆、花生壳、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣等)、食品加工废物(果皮、果渣等)、木材废物(木屑、树皮)以及城市废弃物(40%~60% 固体废物是垃圾和废纸)等。如果能有效地利用生物转化技术将这些纤维素转化成简单糖，再发酵产生乙醇等能源物质，不仅可以变废为宝，而且还可以避免由于化石燃料燃烧所带来的环境污染，更重要的是可以缓解或解决石化能源短缺乃至枯竭所带来世界性能源危机。
木质纤维质物质生产生物乙醇的市场前景
到2020年，全世界从木质纤维素物质生产生物乙醇的产量大约是165亿加仑（合计约625亿升），美国将占有63.9%的市场，欧洲和中国分别将占有10.4%和11.5%的市场[3]。目前，生物乙醇的产业，尤其是非淀粉类的生物乙醇产业主要在于政府的补贴和维持，其原因在于利用木质纤维生产生物乙醇的生产成本较高。第1代淀粉类原料与第2代非淀粉类原料发酵生产生物乙醇不同之处在于前面的预处理和酶解糖化过程。淀粉类原料很容易被酶接触到，就被淀粉酶和糖化酶酶解为葡萄糖(C6糖)，然后葡萄糖再被普通的酵母发酵生产出乙醇，这样，生产工艺环节少，流程短，成本就非常低。但是木质纤维素物质经过自然选择和漫长进化，木质素将半纤维素和纤维素紧密包裹在内部，形成紧密结构，被天然“设计”成可以抵御酶进攻的分子结构。因此与淀粉乙醇不同的是首先要有高温高压蒸汽或结合加酸碱等化学品的预处理技术将紧密结构打开，让酶能够接触到纤维素和半纤维素。纤维素和半纤维素酶解后发酵可以生产出乙醇[6]。纤维素酶解后可得到葡萄糖(C6糖)，半纤维素酶解后可得到木糖(C5糖)，淀粉类和纤维素都是由葡萄糖聚合成的长链结构，只是结合的方式不同而已，因此酶解过程需要的酶是不同的；而半纤维素是由C5糖聚合而成的长链结构，也需要特定的酶。纤维素及半纤维酶的成本更高，这也是导致木质纤维素乙醇成本比淀粉乙醇高的重要原因之一。在每加仑生物乙醇的生产中，利用木质纤维生产，纤维素酶的成本大约是15-20美分，而利用淀粉类生产，淀粉酶的费用仅仅只占到了2－4美分[7]。因此要想提高纤维素生产生物乙醇的市场的竞争力，提高纤维素酶的产量，降低纤维素酶的成本成为解决问题的关键因素。我国是纤维素酶的需求大国，由于纤维素酶的广泛应用，我国市场需求量将以每年25%～35%的速度上升，用纤维素酶产业化生产生物乙醇的关键技术将在未来几年内得到解决，那时我国纤维素酶年需求量将增加到25-40万吨，每年将为我国节省生产燃料乙醇用粮500-1，000万吨[8]。由于产酶菌种落后，产率低，成本高，严重影响我国纤维素酶工业发展，从而阻碍了以木质纤维素为原料的2代生物乙醇工业的发展。
木质纤维素及纤维素降解酶
木质纤维素，其结构复杂，有三种：纤维素(35%～37%)、半纤维(23%-25%)和木质素(18%-22%)组成[9]。纤维素属于可再生自然资源，是生物界最重要的碳源物质，每年由光合作用产生的植物干质量约1，500亿吨，其中纤维素占850亿吨[5]。
纤维素酶(cellulase)是指能够水解纤维素β-1，4-D-葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称。纤维素酶是一种具有很高活力的木聚糖酶，是一种复合酶，属生物催化剂[10]。纤维素酶主要是指三类关键酶:（1）外切型纤维素酶，系统命名为外切β-1，4-D-葡聚糖酶，又称纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91，也称Cl酶)。这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β-1，4-糖苷键，每回依次从纤维素分子中切下一个纤维二糖分子，所以又称纤维二糖水解酶(简称CBH)。（2）内切型纤维素酶，系统命名为内切β-l，4-D-葡聚糖酶(EC3.2.1.4，也称Cx酶或CMCase)。这类酶是纤维素酶中最重要的酶，它作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带有非还原末端的小分子纤维素。（3）纤维二糖酶，系统命名为β-葡萄糖苷酶(EC2.1.21，也称CB酶)，这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。当以上三种纤维素酶的关键酶的活性比例适当时，就能协同作用完成对纤维素的降解，但各个酶组分单独作用时效果极差。所以说纤维素酶降解纤维素时一个协同表达和作用的过程[11-12]。
不同来源的纤维素酶分子特征和催化活性都不尽相同。细菌产生的纤维素酶量少，主要是内切酶，大多数对结晶纤维素没有活性，而且不能分泌到细菌细胞外，常常聚集形成多酶复合体[13]。真菌能产生大量的纤维素酶，产生的酶组分，能分泌到菌体外，一般不聚集成多酶复合体，但可以相互发生强烈的协同作用。纤维素酶分子的大小因来源不同也有明显的差异，变化范围很广。多数真菌和少数细菌的纤维素酶都受到糖基化，所含碳水化合物的比率不同在很大程度上决定了酶的多型性，表现为分子量的差别[14]。纤维素酶的酶活力一般都很低，因而酶生产成本高。据报道，纤维素水解成葡萄糖所需的酶蛋白要比淀粉相应水解所需的大100倍，这是影响纤维素酶实际应用的重要原因之一[3]。
迄今为止，人们已从40多种细菌和数种真菌中克隆到了多种纤维素酶基因，有一百多种基因可在大肠杆菌中表达，大多数克隆的纤维素酶基因能产生信号肽，从而使表达产物部分或全部转移至E.coli的细胞质间隙[15]。虽然克隆到大肠杆菌的基因，不需要载体的启动子就可表达，但表达水平很低，推测可能是其启动子不能完全被识别的缘故。但在大肠杆菌中表达纤维素酶基因存在两个主要问题:一是提取有很大困难，二是表达水平低、酶蛋白不能分泌，离工业化应用的目标还有一定的距离，所以在纤维素酶基因的表达方面人们将目光转向了真核表达系统[16]。
木霉属是研究最广泛的纤维素酶产生菌[6]，世界纤维素酶市场中的纤维素酶20%是来自木霉属和曲霉属[17]。绿色木霉是一种在各种气候带的土壤中能够普遍存在的一种多细胞丝状真菌，能够分泌完全的纤维素酶系，其中产量较高并且稳定，是目前纤维素酶商业化生产的主要生产菌株[18]。对于绿色木霉的研究直到九十年代初仅有CBHⅠ基因克隆的报道，王建荣、张曼夫利用里氏木霉的基因序列同源片段做探针，构建了绿色木霉基因文库，并克隆了CBHⅠ、CBHⅡ基因，并对其基因结构进行了研究[19]。
纤维素酶的合成一般受纤维素诱导及葡萄糖降解物的阻遏，多数菌株纤维素酶的合成既受纤维二糖、山梨糖等的诱导，又为葡萄糖、甘油等易利用碳源的阻遏，还受菌体生长速度的影响[6]。在绿色木霉中，纤维素酶属诱导型酶类，其多个酶组分的表达经过严密的调控。在绿色木霉中能产生分泌型的纤维素酶，当CBHⅡ基因缺失时，会影响纤维素酶系其他酶的表达，而缺失其他基因时，只单独影响自身的表达。另有研究表明CBHⅡ是纤维素酶系统中最先表达的酶，其表达产物进一步诱导其他纤维素酶基因的表达，但CBHⅡ基因的表达受纤维素降解产物葡萄糖的抑制[20]。
随着基因工程技术的发展，定点突变和基因重排技术在纤维素酶的生产工业中的应用越来越广泛。在里氏木霉 (T.reesei) 中，需要产生至少14种酶协同作用才能水解未经化学处理过的植物干物质。为了降低纤维素酶的复杂性，将里氏木霉的CBH1、嗜酸耐热菌的葡聚糖内切酶EI 以及曲霉(Aspergillus niger)的β- 葡萄糖苷酶以90∶9∶1(质量比)混合形成一个三元复合物，此三元复合物在120 小时内水解预处理过的纤维素的能力与李氏木霉中纤维素酶体的水解能力相当。为了提高此三元复合物水解纤维素的活力，利用定点突变的方法对葡聚糖内切酶EI的活性位点进行修饰，结果与突变前的三元复合物相比，其水解纤维素的活性提高了12%[21]。Zinnia R等在里氏木霉菌中应用同源重组技术将外切β－葡萄糖苷酶整合到egl3和xyn3基因启动子的下游，增强了纤维素酶的表达量4倍到7.5倍，这些重组菌株能有效的降解纤维素物质[22]。
生物乙醇及纤维素降解酶的未来发展趋势
随着石化燃料供应的减少，寻找新的能量来源关系到经济的可持续发展乃至人类的生存问题。生物乙醇作为一种可再生的、经济上可承受的，并且对环境安全的能源物质将逐渐成为石油的替代品[2]。由于产酶菌种落后，产率低，成本高，严重影响我国纤维素酶工业发展，从而阻碍了以木质纤维素为原料的2代生物乙醇工业的发展。因此要想提高纤维素生产生物乙醇的市场的竞争力，提高纤维素酶的产量，降低纤维素酶的成本成为解决问题的关键因素。目前纤维素酶工程菌株中不稳定、产酶量不高、难应用于大规模产业化大规模生产等三大难题。利用基因工程技术改造菌种，尤其是纤维素酶基因启动子的改造，在发酵过程中其酶形成过程不受主要代谢产物葡萄糖的抑制，促进其他纤维素酶基因的协同表达，大幅度提高菌株在发酵过程中的产纤维素酶的能力，将是工程菌柱构建的方向，构建不受葡萄糖抑制、稳定、高效的表达纤维素酶工程菌。可以解决本项目的实施将会大大提高纤维素酶的产量，降低木质纤维素生产生物乙醇时纤维素降解成本，从而促进木质纤维素生产生物乙醇产业的发展。
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纤维素水解范文5
关键词：纤维素酶；菌种筛选；鉴定；酶活力
中图分类号： Q936 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20151132001
纤维素是农作物秸秆的主要成分之一，也是地球上含量最为丰富的可降解生物质，其为葡萄糖聚合物，以β-1，4糖苷键聚合。它的降解与转化是生物圈碳素循环与生物能传递的重要环节。利用微生物对纤维素进行降解，对于自然界生物能源的利用具有重要意义。世界各国均积极开展对纤维素降解菌的研究[1]。东北地区作为我国的粮食主产区，每年产生大量富含纤维素的农业秸秆，传统的焚烧污染环境且造成大量生物质浪费。
本试验从吉林市左家林地土壤中分离出一株纤维素降解菌，由菌丝、菌落形态以及16S rDNA初步鉴定为散囊菌纲（ Uncultured Eurotiomycetes）。其具有较强纤维素酶产酶活性，对于纤维素的降解转化具有积极意义，菌种具有进一步研究价值。
1 材料与方法
1.1 试验材料与试剂
1.1.1 试验材料
土壤样品，采自吉林省吉林市左家地区林地；化学试剂均为分析纯，购于北京化学试剂厂；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）购自生工生物工程（上海）有限公司。Biospin凝胶回收试剂盒，购自BioFlux公司；
1.1.2 培养基
富集培养基：MgSO・7H2O 4 0.1g，FeSO4・7H2O 0.1g， K2HPO4 1.0g， MnSO4 5×10-4g，CMC-Na 10.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，水1000ml，自然pH，121℃灭菌30min。
刚果红筛选培养基：KNO3 2.0g，MgSO4 0.5g，KH2PO4 1.0g，NaCl 1.0g，Na2HPO4 1.0g，蒸馏水500ml，加热溶解后加入CMC-Na 20.0g、琼脂20.0g、刚果红0.2g充分溶解后，蒸馏水定容至1000ml，HCl调pH直至达到7.0～7.2，121℃灭菌30min，摇匀后倒平板。
纤维素钠筛选培养基：CMC-Na 5.0g，蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，琼脂12.0g，，水 1000ml，121℃灭菌30min，摇匀后到平板。
产酶培养基：Na2HPO4 3.0g，NH4NO3 0.8g，CaCl2 0.5g，ZnSO40.01g，FeSO4・7H2O 0.01g，MgSO4・7H2O 0.5g，MnSO4・H2O 0.01g，CMC-Na 10.0g，蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g， 水1000ml，HCl调pH值7.0～ 7.2，121℃灭菌30min，摇匀后到平板。
PDA培养基：马铃薯200g，去皮切成小块，用蒸馏水1000ml小火沸煮30min，8层纱布过滤，滤液补水至1000ml，调pH6.5。
1.2 试验方法
1.2.1 样品采集与菌种分离
于左家地区林地，取腐殖质表层土壤5g土样于三角瓶中，加入50ml无菌水，震荡5min，至分散均匀。取5ml悬液于50ml富集培养基，28℃，80r/min震荡培养5～7d。取富集培养液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5做系列稀释，涂布于刚果红筛选培养基，静置30min后，28℃倒置培养，分离有明显透明水解圈的菌落。若菌落重叠可划线分离菌株。
1.2.2 菌株纤维素降解能力测定
将分离获得的菌株，液体培养后，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5做系列稀释后涂布于刚果红筛选培养基，静置30min后，28℃倒置培养，待菌落直径1.0～5.0mm，取下培养基，于1%刚果红溶液浸泡1h，弃去刚果红溶液，于1mol/L NaCl溶液浸泡0.5h，弃去NaCl溶液，观察并测量水解圈大小。
1.2.3 纤维素酶活力测定
采用DNS法（3，5-二硝基水杨酸法）测定纤维素酶活力 [2]。酶活力定义为：1min内催化纤维素水解生成1μmol葡萄糖所需的酶量为1IU。
1.2.4 菌株表型特征鉴定
取无菌水一滴至于干净玻片，接种环挑取少许菌丝涂布，风干固定，显微观察菌株形态。
1.2.5 菌株的18S r DNA鉴定
CTAB法提取菌株基因组DNA，分析18S r DNA进行军中鉴定。PCR反应体系（50μL）：dd H2O 34.0μL，10×buffer 5.0μL，d NTP4.0μL，FP2μL，RP2μL，Taq酶 1μL，模板DNA 2μL。引物序列：FP 5'-ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG-3'；RP 3' CCCGATCCCTAGTCGGCATAG-5'。PCR反应条件：94℃，5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环； 72℃，10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，送至英潍捷基公司测序。序列于GeneBank由BLAST进行序列同源性分析，确定菌种属。
2 结果与分析
2.1 菌株的分离和纤维素降解能力初步鉴定结果
由刚果红筛选培养基水解圈初步判断，实验分离得到多种具有纤维素降解能力的菌株。其中3种疑似真菌类菌株，具有较为明显纤维素降解能力。
取这3种菌株，于刚果红筛选培养，用1%刚果红溶液浸泡后1mol/L NaCl溶液浸泡脱色，测量水解圈大小，结果见表1。由表1可知，1号菌水解圈直径/菌落直径为8.8，远高于2号菌和3号菌。初步表明，1号菌具有较明显纤维素降解能力。
2.2 菌株的纤维素酶活力测定结果
取1号菌、2号菌、3号菌，DNS法测定纤维素酶活力，结果见图1。由图1可知，在3种菌株中，1号菌纤维素酶活力最高，为2.32IU/mL。将1号菌命名为JN510。由纤维素酶活力判断，其具有进一步研究的价值。
2.3 JN510菌株表型特征鉴定结果
JN510菌株于PDA培养基28℃下培养，生长快速。3d后呈白色绒毛状气生菌丝；继续培养，菌落转为绿褐色；继而颜色逐渐加深。菌落毛绒状。镜检结果见图2。
2.4 18S rDNA序列分析结果
JN510菌株基因组 DNA进行PCR 扩增，产物进行琼脂糖电泳，结果见图3。由图可知，引物对18S r DNA 序列扩增效果良好，扩增片段约500bp。
回收片段，送英潍捷基公司测序。获得序列经GeneBank比对，该菌种与序列号为EU368286.1的Uncultured Eurotiomycetes具有99%的亲缘关系，结合文献所列形态学特征的描述，将其鉴定为散囊菌纲（Uncultured Eurotiomycetes）[3，4]。
3 讨论
吉林市左家地区林地腐殖质表层土壤中存在大量可以降解纤维素的纤维素酶产生菌。其可应用于生物化工过程，如秸秆发酵生产燃料乙醇等工艺。这些菌对于富含纤维素的的转化利用以及农业秸秆回收利用具有重要意义。
纤维素酶包括β-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶。3者协同作用降解纤维素生成葡萄糖。不同菌种产生上述3种酶的浓度与活力不同。虽然自然界中纤维素降解菌种类较多，但是秸秆等生物质中的纤维素往往与木质素、脂质等交联存在。使得自然界中纤维素降解菌的降解能力不理想，降低了秸秆等富含纤维素生物质的开发利用。因此可以考虑构建不同纤维素降解菌，以及纤维素降解菌与木质素降解菌等降解菌的混合菌系。以此来转化纤维素，提高降解效率。
本实验获得的纤维素降解菌JN510具有较强纤维素降解能力，具有良好的开发前景，值得进一步研究。
参考文献
[1]顿宝庆，吴薇，王旭静，等.一株高纤维素酶活力纤维素分解菌的分离与鉴定[J].中国农业科技导报，2008，10（1）：113-117.
[2] Ghose TK. Measurement of cellulase activities[J]. Pure Appl Chem， 1987， 59（2）： 257- 268.
[3] 魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海： 上海科学技术出版社，1979：129-135.
纤维素水解范文6
1木质生物质及水解液糖类组分
按照聚合度来分，糖类物质可分为：单糖、寡聚糖和多聚糖。按照糖所含的功能基团来分，可分为醛、酮、醇和它们的氧化还原衍生物，以及由糖苷键连接此类化合物的聚体。在植物中糖类物质主要是纤维素和半纤维素。纤维素糖类组分较为单一，本论文要点主要针对生物质精炼过程中的组分更为复杂的半纤维素。研究表明，半纤维素是由多种糖单元组成的，常见的有木糖基、葡萄糖基、甘露糖基、半乳糖基、阿拉伯糖基、鼠李糖基等；并且半纤维素分子中还含有糖醛酸基（如半乳糖醛酸基、葡萄糖醛酸基等）和乙酰基；分子中还常有数量不等的支链。由此可见，半纤维素是由多种糖基、糖醛酸基所组成的，并且分子中往往带有支链的复合聚糖的总称[3]。一般针叶木中半纤维素含量为15％～20％，以聚葡萄糖甘露糖为主，同时还有少量聚木糖；而阔叶木中的半纤维素一般占木材的20％～25％，也有的高达35％，主要是聚木糖类，同时还伴随有少量的聚葡萄糖甘露糖和聚鼠李糖半乳糖醛酸木糖，其中聚木糖类主要是聚O-乙酰基-(4-O-甲基葡萄糖醛酸)木糖。不同原料的半纤维素含量及组成不同。同时不同的生物质精炼过程中分离半纤维素的水解液组分也有很大差异，并且由于水解程度的不同而形成了复杂体系。但就单糖分析而言主要针对葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖的定量检测。
2生物质精炼过程糖类传统分析方法
复杂体系糖类分析在生物质精炼过程中具有重要意义。在生物质精炼的半纤维素利用过程中，由于半纤维素本身糖基和糖醛酸基种类的多样化，使得对于半纤维素利用技术的机理研究在很大程度上依赖于多种低聚糖、寡糖及单糖的定性和定量分析。传统方法由于不能对复杂体系的糖类物质进行分离而难以准确分析。传统的菲林法、DNS等化学分析方法只是对还原糖等给出定量分析。在制浆造纸检测分析中，传统化学分析的聚戊糖含量也是通过盐酸水解成戊糖并进一步脱水形成糠醛，通过糠醛含量的测定来间接表达半纤维素中的五碳糖高聚物[4]。但这些方法对于生物质精炼半纤维素水解的机理研究和产品开发不能提供更实质性的帮助。早期采用的酶分析法、纸色谱法、薄层色谱法及柱层析法等经典方法可以进行混合糖的分析，但分辨率低、时间长、定量测定困难，使得这些具有初步分离效果的传统方法也受到了限制。随着现代仪器分析技术的发展，混合体系的糖类分析也随之产生了新的分析方法。
3混合糖类组成分析方法
3.1离子色谱法(IC)应用离子色谱法是将改进后的电导检测器安装在离子交换树脂柱后，以连续检测色谱分离的离子的方法。1975年H．斯莫尔等人将经典的离子交换色谱与高效液相色谱技术相结合，创造了使用连续电导检测器的现代离子色谱法，现代离子色谱使用小粒度和低交换容量的树脂及小柱径的分离柱以及进样阀进样，泵输送洗脱液，具有迅速、连续、高效、灵敏、可同时测定多组分、不需要预先衍生化等优点，可用于分析几乎所有的单糖、大部分的寡糖及低聚糖。彭云云等[5]采用离子色谱法分析甘蔗渣半纤维素中各种糖基及糖醛酸，水解液经中和、过滤、稀释即可测定，采用色谱条件：色谱柱：淋洗液：0.001molNaOH-0.05molNaAC；CarboPaePAl(2×250mm)，保护柱：CarboPacPAl(2×50mm)；柱温：30℃；体积流量：0.650ml/min；进样体积：10μL；检测器：脉冲安培检测器，金电极。结果表明氢氧化钠和醋酸钠淋洗液梯度洗脱可以分析糖醛酸及单糖组成，灵敏度高、重现性好、结果准确。
3.2高效液相色谱法(HPLC)应用高效液相色谱(HPLC)采用高压液相泵、高效固定相和高灵敏度检测器，具有分辨率高、分离速度快、分离效果好、不破坏样品、重现性好的优点。单糖检测器有红外检测器、示差折光检测器、光散射检测器、电化学检测器和紫外检测器。由于糖类本身没有紫外吸收，若不进行衍生化只能采用蒸发光散射检测器(ELSD)或示差折光检测器(RI)。将糖类物通过衍生化转变为具有紫外吸收或可产生荧光的物质可实现高灵敏度检测和痕量分析，但操作复杂。方宏等[6]用高效液相色谱法测定甘蔗渣半纤维素水解物中的单糖含量。以HypersilNH2柱为色谱分析柱，用示差折光检测器检测，流动相是乙腈∶水(8∶20)。在此色谱条件下，甘蔗渣半纤维素水解物分离成：木糖、阿拉伯糖、果糖和葡萄糖。各单糖呈良好的线性关系。加样回收率的平均值为97.3%～98.7%，此方法简便、快速、准确，适合检测下限要求不高的生物质半纤维素水解糖液。AloiaRomaní等[7]对桉木生物质精炼过程中自催化半纤维素糖液中葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、糠醛、羧甲基糠醛等进行了高效液相色谱一次性分析，而低聚糖则采用4%硫酸水解后二次测定单糖增加量的方法，作为实验过程中的常规检测操作快捷、重现性好。利用HPLC测糖，要根据样品中的糖的种类、含量和纯度来选择合适的检测器，同时根据实验的具体需要决定是否需要较为复杂的衍生化过程及昂贵的专用糖柱。
3.3高效阴离子交换-脉冲安培检测法（HPAE-PAD）应用高效阴离子交换-脉冲安培检测法（HPAE-PAD）是一种阴离子交换色谱与脉冲安培检测器结合的新的液相色谱法，检测限量可达到几十个ug/L水平。糖类化合物是一种多羟基醛或酮，可分为单糖、低聚糖和多糖，低聚糖由2～10个单糖分子失水而成，多糖是由10个以上单糖分子失水而得，低聚糖和多糖水解后即得单糖。中性糖类为Pka在12～14之间的弱酸。在高pH值的淋洗液中，例如10～20mmol/LNaOH中，它们会部分或全部以阴离子形式存在，能在阴离子交换柱上保留并得到分离。梁立娜等[8]利用高效阴离子交换-脉冲安培检测（HPAE-PAD）同时分离测定8种单糖和2种糖醛酸。以CarboPacPA20阴离子交换柱为分离柱，以2mmol/LNaOH溶液将8种单糖从分离柱上洗脱，而后用NaAc（50～200mmol/L）梯度淋洗2种糖醛酸，淋洗液流速0.5ml/min，分析时间30min。8种单糖和2种糖醛酸的检出限为2.5～14.4μg/L。5mg/L的10种化合物的混合标准溶液连续7次进样，峰面积的相对标准偏差为0.3%～1.5%。用所建立的方法测定了多糖水解液和木材半纤维素水解液中的单糖和糖醛酸含量。刘婷[9]利用高效阴离子交换分离-脉冲安培检测分析不同茶叶多糖中的葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖。阴离子交换柱：METROSEPCARB(150×4.0mm)；淋洗液：6.0mmol/LNaOH溶液；柱温：32℃；淋洗液流速：1.0ml/min；分析时间：45min；进样体积：20μl。优化条件下4种单糖的检出限为0.125～2.0mg/L。样品测定的回收率为91.8％～99.3％。所建立的方法分析4种常见茶叶多糖快速、有效。高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAEC-PAD)的一大优点是不需要衍生化就能分析单糖、大部分的寡糖及低聚糖，节约时间和资金，避免了有毒衍生试剂的使用，对于组成结构大小上非常相近的单糖也有很好的分离效果。
3.4气相色谱法(GC)应用气相色谱是多糖结构分析中最重要的手段之一，它与质谱联用可以得出有关单糖残基类型、键的连接方式、糖的序列和糖环形式、聚合度等多种结构信息。此外，由于大量的固定液和不同的检测器适用于糖的气相色谱分析，因而用气相色谱法测定糖类具有样品用量少、选择性好、分辨率强、灵敏度高以及可用于定性及定量分析等优点。康学军等[10]以三氟乙酸水解白芷多糖，水解产物中加入盐酸羟胺、吡啶和醋酸酐，衍生化反应生成糖腈乙酸酯衍生物，采用气相色谱法测定白芷多糖的单糖组成。用OV-101毛细管色谱柱；进样温度为210℃；检测器温度为240℃；柱温为程序升温：初始柱温110℃，维持5min，以5℃/min的升温速率升高到190℃，维持4min，以3℃/min的升温速率升高到210℃，维持20min。白芷多糖中含有木糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖等7种单糖成分，并测定计算出已知6种单糖：鼠李糖-阿拉伯糖-木糖-甘露糖-葡萄糖-半乳糖的摩尔构成比1.19∶1.19∶0.765∶1∶8.08∶3.34。气相色谱法（GC）分析糖类，主要困难在于糖类没有足够的挥发性，须在色谱分析之前预先转化成对热较稳定的、易挥发的衍生物。但在衍生物的制备过程中，由于糖的异构化会产生衍生物的异构体，使色谱分析时每种糖产生几个峰，从而影响了组分的分离和定量。
3.5薄层色谱法(TLC)应用薄层色谱法(TLC)是一种微量、快速、简便、有效的定性的半定量和定量分析方法。薄层色谱的特点是可以同时分离多个样品，分析成本低，对样品预处理要求低，对固定相、展开剂的选择自由度大，适用于含有不易从分离介质脱附或含有悬浮微粒或需要色谱后衍生化处理的样品分析。而最新的高效薄层色谱(HPTLC)采用更细、更均匀的改性硅胶和纤维素为固定相，对吸附剂进行疏水和亲水改性,可以实现正相和反相薄层色谱分离，提高了色谱的选择性。焦广玲等[11]建立了不同展开体系中薄层色谱分析单糖或寡糖的有效方法。以淀粉寡糖、右旋糖酐寡糖以及古罗糖醛酸寡糖3个系列寡糖和半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、岩藻糖、木糖和鼠李糖9种单糖为研究对象，探讨其在不同展开体系下的薄层色谱行为。在各种糖TLC分析中，若供试品中主要含有酸性寡糖，则选择甲酸展开体系；若供试品含有不同连接方式的中性寡糖，则选择氨水展开体系进行二次展开；若只对单糖进行分离鉴别，应采用三乙胺展开体系，并采用苯胺一二苯胺显色剂，根据Rf值和显色的不同，区别单糖的类型。于立芹[12]等测定红薯叶中多糖，经Sephadex-G100凝胶层析法纯化后，利用薄层色谱法结合酸水解，糖腈乙酰化气相色谱分析法测定红薯叶多糖的单糖组成和各组成的物质的量比。红薯叶多糖的单糖组分有木糖、甘露糖、葡萄糖，其量的比为0.47∶0.35∶0.18。糖腈乙酸酯衍生化方法能较好地实施红薯叶多糖水解产物的衍生化。衍生产物经干燥没有发现色谱峰明显拖尾现象，适于单糖衍生化产物GC分析前的处理。
3.6高效毛细管电泳法(HPCE)应用高效毛细管电泳法(HPCE)是近年来发展最快的分析方法之一。是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异实现分离测定的液相分离方法[13]。毛细管电泳技术分离糖必须解决电荷问题，除氨基糖、糖醛酸及一些硫酸化糖外，天然糖分子都呈电中性，不能在电场中迁移。因此糖的毛细管分离分析中要采用解离、络合、衍生技术使糖带电。汲晨锋等[14]采用水提醇沉法从新鲜芦笋中提取粗多糖，采用高效毛细管电泳法测定单糖组成，可以实现芦笋粗多糖中的木糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖的分离测定，得到其百分比分别为3.44％、7.92％、10.52％、17.15％、41.85％。研究发现其缓冲盐浓度和pH值对单糖组分的分离度影响较大，文章通过比较发现缓冲盐浓度为75mmol/L、pH10.5时，分离度最好。通过芦笋多糖和混合单糖的的毛细管电泳图谱比较，可鉴别出大部分单糖。该技术分离效果清晰、定量准确、时间短、进样量少，获得了较好的结果。汪红等[15]采用苯酚-硫酸比色法测定了丹参药材中总多糖的含量，检测波长为490nm，丹参总多糖在0.1122～0.561mg范围内其浓度与吸光度线性关系良好(r=0.9998)；以毛细管电泳法测定丹参粗多糖组成，检测波长206nm，结果显示，丹参粗多糖由鼠李糖∶木糖∶核糖∶葡萄糖∶甘露糖∶阿拉伯糖∶半乳糖以2.8∶1.0∶8.5∶12.7∶4.2∶15.3∶58.8的摩尔比组成。
3.7质谱及质谱联用技术由于组成单糖种类与数目等的不同，糖的结构十分复杂，要完全阐明一个糖的结构，需要提供以下几方面的信息：（1）分子量及组成单糖的种类与摩尔比；（2）各糖环的构象（呋喃型或吡喃型）与异头碳的构型；（3）各糖残基间的连接方式；（4）糖残基的连接顺序；（5）二级结构及空间构象等。质谱，尤其是GC-MS（EI或CI方式）用于单糖分析已有几十年的历史，现已广泛用于糖组成分析及甲基化分析以确定糖残基的连接方式。徐正华等[16]建立了气相色谱-质谱(GDMS)法同时测定乳酸和葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖、半乳糖、乳糖、1,5-脱水山梨醇、山梨醇7种糖的方法。选择核糖醇为内标，进样前先进行肟化反应再进行硅烷化反应。采用DB-5熔融石英毛细管柱，升温程序为初始温度70℃，保持4min，以8℃/min的速率升至300℃，保持3min。在优化测定条件下各对照品得到良好分离，且在测定范围内具有良好线性关系(r2>0.983)，平均加标回收率为74.5％～104.2％，该方法简便、灵敏度高。孙多志等[17]在秸秆两步稀酸水解工艺中，用气相色谱／质谱(GC/MS)法对其水解液中的单糖成分进行测定，采用2％硼氢化钠的氨溶液将稀酸水解液中的单糖还原成糖醇，然后在甲基咪唑催化剂的作用下和乙酸酐在水相中直接反应生成乙酰化的糖醇，用二氯甲烷萃取后进行GC/MS测定。研究结果表明：秸秆稀酸水解液中有五种单糖，主要是木糖和葡萄糖，其次是阿拉伯糖、半乳糖和少量的甘露糖；利用此方法测定了一批秸秆稀酸水解液，得到了该秸秆稀酸水解过程的最佳的反应时间。该方法可快速、准确测定秸秆稀酸水解液中单糖的浓度，为水解工艺的研究提供了一种有效的分析方法。
4多糖结构分析
在生物质精炼过程中伴随着多聚糖的化学变化，研究多糖结构变化对于糖平台化合物的理论研究和产品开发具有重要意义。据文献调研表明，目前该方法研究还处在起步阶段，需要借鉴其他领域的现代分析方法，并且应用到相关的基础研究工作中去，从而积累更多分析经验和方法创新。近年来多糖的结构分析的仪器设备、分析方法都有了很大的提高。目前已有应用的方法包括紫外光谱法、红外光谱法和核磁共振分析法等。例如应用1HNMR可以鉴别多糖中糖苷键位置，并进一步确认多糖结构。AshutoshMittal等[18]通过核磁共振氢谱的测定方法分析在不同温度和时间下阔叶木自催化水解半纤维素溶出物，从而评估该过程的反应机理。对残留的聚木糖、低聚木糖、木糖、葡萄糖及糖类次级衍生产品，例如糠醛、羧甲基糠醛，进行了测定分析。单糖和低聚物则采用最新的高分辨率核磁共振氢谱光谱分析法。该方法能精确定量分析水解抽提后的木料上残余的聚木糖和纤维素残留以及水解产物中的木糖和葡萄糖。研究表明，该方法具有良好的再现性并为分析碳水化合物的组成结构提供了与以往报道方法结果可比拟的新方法。Xue-MingZhang等[19]采用傅里叶红外变换、1H,13C以及2D-HSQCNMR核磁共振的分析方法，对有机溶剂提取的某白杨木品种半纤维素糖液进行全面定性和定量分析，研究了木糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖及各种糖醛酸的组成，并通过核磁共振的方法研究了特定品种半纤维素的结构特点，包括乙酰化半纤维素与葡萄糖醛酸、葡萄糖甘露聚糖的键合方式等，为进一步发酵特定产品的机理研究提供了重要参考。
