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黄河的古诗范文1
北街小学 五年级一班 文雪
大约二百万年前的一天，碧空万里无云，太阳炙烤着大地，小草和小花都轻轻地低下了头。远处，几棵栎树呆立不动，一群一群的羚羊和鸵鸟走来走去。一条弯弯的小河缓缓地向东南方流去。
突然，传来一阵巨响。啊！原来是两头大公象正在进行一次长跑比赛。这两头大公象的名字分别叫哈果和哈里，他俩是一对双胞胎，都很爱跑步，而且很喜欢比赛。看，他俩又开始了。
他们跑了好一阵子后，哈里跑到了终点——那条弯弯的小河边。这时哈果才跑到离起点8米的地方。
黄河的古诗范文2
他两岁多，坐在窗台上。
爷爷在他两个月大的时候从北京回来，见到这个长孙，当着全家人说，这孩子“近乎丑”！
不是随便谁敢说这句话的。妈妈是本县最高学府，女子小学校长，爸爸是男子小学校长。
晚上，妈妈把爷爷的话告诉爸爸。“嗳！无所谓。”爸爸说。
孩子肿眼泡，扁鼻子，嘴大，凸脑门，扇风耳，幸好长得胖，一胖遮百丑。
他坐在窗台上。
前房九十五岁的瞎眼太婆（爸爸的祖母）坐在火炉膛边的矮靠椅上：
“狗狗！”
没有回答。
“狗狗！狗狗你在吗？”
“在。”
“在，为哪样不答应我？”
“我怕跌，我下不来。”
“下不来，也好答应嘛。”
“喔！”
“那你在做哪样？”
“我没做哪样，我坐着。”
“嗳！你乖，等响午炮爸妈就放学了――你想屙尿吗？想就叫婆，婆在灶房。”
“我没想屙尿。”
“那好！想讲话吗？想，就和我讲……”
“讲过了。”
太婆笑了。
一个太婆，一个婆，和狗狗。屋里就剩下他们三人。
太婆自己跟自己说：“都讲过，喜喜和沅沅要来……”（喜喜是她大孙子的儿子，十二岁；沅沅是她嫁到面门上倪家药铺的孙女的第六个孩子，七岁。）“讲来又不来，……唔，也该快了……”
狗狗有很多表姐表哥、堂姐堂哥，还有年轻的表叔堂叔，都轮着陪他玩。
他们不来，狗狗不能乱动。
窗台木头又厚又老，好多代孩子把它磨得滑溜滑溜了。一道雕花栏杆围着，像个阳台。三四个孩子在上头也不挤。窗台后面是张大写字台，两头各放着一张靠背椅。孩子玩腻了，便一层一层沿着下到地上。
写字台上有口放桃源石的玻璃缸子，一个小自鸣钟，一个插鸡毛掸子的瓷筒，婆的铜水烟袋。孩子顽得尽兴，却是从不碰倒摆设。
楼上楼下八间房带前后堂屋，只有楼下四间房装有栏杆供观赏的大窗子。万字、寿字格窗门内开，糊着素净的白“夹帘纸”。夏天冬天都显得宁馨。
四扇窗子，以太婆的后房、婆房间的窗子最招孩子喜欢。大清早就有太阳。长到鼻子跟前的树丛直漫到城墙那头。过了城墙，绿草坡一层又一层，由绿渐渐变成的灰蓝，跟云和天混在一起。
多少多少代的孩子都爱上这里来坐，像候鸟一样。
狗狗坐在窗台上。眼前的那些红、绿、香味、声音、雨点、太阳，只是母体内子宫生活的延续。他什么也分辨不出。他吃饱了，他安全……他还需要一些时间才能“醒悟”，他没想过要从窗台上下来自己各处走走。即使想也不可能。要爬越后堂屋的门坎，绕过上楼大梯的梯脚，再翻更高的门槛才进入堂屋。堂屋两边各有四张太师椅和一张茶几，当中还有一个大方桌，底下藏着一张吃家常饭的小方桌。靠墙一口大神柜。处处埋伏的尖角很容易在脑门碰肿一个包。他小，他真的没有想过。像出壳小鸟根本不晓得蛋壳对他曾经有过什么贡献和限制。
两只鸡娘在厨房后头吵起来。鸡娘特别像不高明的作家，稍微出两本书就大喊大叫，弄得左邻右舍心烦。不过鸡蛋比那些大作要实际得多。
婆进房了。她和太婆都是小脚，地方熟，“定！定！定”走得一点也不困难。
“狗狗！快！婆抱你，捡蛋去！捡蛋给太看！”
“噢！”狗狗让婆抱下地，再抱过两重门坎，来到厨房。
鸡窝是用几个旧箩筐抹上黄泥谷糠做的，土砖砌的平台，各挖一个洞，里头垫上厚厚的稻草，夜间顶上一块板子防黄鼠狼，样子十分之大方，“岂止大方！简直是庄严嘛！像个北京的天安门！”客人见了不免夸谈。
这是孩子们的手笔。他们还计划修一座长城咧！
“狗狗摸这里，啊！一个，是一个吧！狗狗别拿，热！婆给你拿，热蛋伢崽拿多了会脸红――再摸这边，进一点，啊！呸！呸！小手手一手鸡屎，啊！不怕不怕！婆给狗狗洗――来来，过来这边，哪！看看狗狗手手没有鸡屎了罢！还不行，还有臭臭，看婆给狗狗抹点皂角荚水，搓！搓！搓！搓！搓！搓！好，狗狗不动，等婆舀水来冲手手，狗狗搓手手啦！好，抹干净手手，闻闻！不臭了！不是臭狗狗了！――歪尾巴鸡娘不乖，屙屎不屙蛋，骗狗狗，等哪天婆宰了它，让狗狗吃霸腿。”
婆婆捏着蛋，抱狗狗跨过两道门坎进了堂屋。右手边就是太婆的房门，还没进房，太婆就说话了：
“狗狗告诉太，捡了几个蛋？”
“蛋！太！太！蛋！”狗狗让太婆拉近身边。
婆把蛋递给太婆：
“就一个，那只歪尾巴陪着吵，没有蛋！”
“奥，臭，太，臭，臭！”狗狗叫着。
“晤！太哪里臭臭？太婆不臭臭！哦！妹崽，你把窗子关上算了，外头花熏得我头昏，你看，房里进来十只蜂子也不止，嗡里嗡咙在耳边闹，莫叮着我狗狗。”
“等伢崽们来，你躲进帐子里，让他们给扑了。”婆说。
“扑也莫扑，赶出去就是，做个蜂子也不容易，让它们回窝吧！”
婆是太婆娘家的侄女，所以都姓邓。婆没念过书，太婆书读得多，记性又好，后来嫁到张家，太公是个“拔贡”，县志的主编，出版过诗集，所以濡染了一些冷隽的气质，至老年守寡瞎了眼睛，性情脾气就更是十分之通达。
婆不爱讲话，爷爷回来也没有几句话好说。有了狗狗这个孙子，有了伴；孙子没生的时候，鸡公、鸡娘、鸡崽，泡菜坛、酸菜坛、霉豆腐坛，就是她的伴。有时跟人去“赶场”，上山摘做粑粑的蒿菜、做“社饭”的社菜、煮蛋的“地地菜”、凉拌的“荠菜”、炒来吃的蕨菜，腌腊八豆豉，晒菜干；过年的时候指挥杀猪，招呼帮忙打粑粑的苗族汉子喝米酒。留辫子做妹崽家的时候，正是“长毛”作乱，杀人放火抢东西。热天的晚上，坐在院坝里，兴致来了，给孩子们讲“长毛”故事；她不喜欢民国。她说她小时，一个“通眼钱”可以下一碗牛肉面。她也不喜欢孩子们买书，买玩意儿，让她见了，就会嗫嚅地表示不满：
“一点用也没有，买个东西吃在肚里实在！”
她已经六十多岁了，太婆还叫她“妹崽”，做了婆，还伸不起腰。
关窗时她伸头看了一下院子：
“姑！今年花开得也实在放肆，连墙都贴上了。”
太婆没笑，“都是镜民做的好事，你看你那个镜民！”镜民是爷爷的名字，婆的丈夫。
爷爷年轻时候外出多年，偶然回家逢到春天兴致好，便约了一帮朋友城外踏青。一路出东门，过大桥，下沙湾，左边是“诸葛亮”，右边是“回龙阁”，正对的“万寿宫”，沿河吊脚楼前后左右、高低上下伸出许多花树，忍不住见一棵爱一棵；加上大桥二十八间玲珑剔透小屋子窗格里伸出的竹竿晾着五彩衣物，一齐影在太阳下，映在水面上，荡漾出条条彩色亮光。
岩鹰在天上打团团嘤嘤叫，铁匠弄得周围同声叮哨，卖“叶子粑粑”老太太的女中音，“霉――豆腐”和“盐――豆腐――干咧！”的男低音，以及呼狗吃伢崽屎的高亢女高音，都引出远游还乡人的特殊情绪。便认为那样好看。便学着人家一棵棵树苗买回来栽在院子里。院子说大也大，七分地容得下三四十棵树苗，桃、李、梨、杏、橘、抽一应俱全，年年次第开花。爷爷开初按着李笠翁的经验这边一剪刀，那边一斧子，享受了三两回田园之乐，后来人在北京做事，儿子们也北京、奉天、上海、杭州、武汉、长沙四处跑，剩下两位老太婆媳俩，何况其中一个还是瞎子，李笠翁兴趣变成龚定庵的“病梅馆”，只好放手那些花木爱怎么长就怎么长了。院子已经不成其为院子，树混在一起也分不出树名，当中一条碎石板铺成二尺多宽通向大门的路之外，不见一尺空地。
满院子十来种果子杂花交垒一起，加上千千万万蜜蜂轰成一团。亲戚晚辈时不时来看太婆，太婆就会说：“男人不在家，看这些花好欺侮人。”
“妹崽！有人敲门！”太婆说。
黄河的古诗范文3
我不知道自己天生就喜欢狗狗还是，从小时候或者长大之后才开始渐渐对这些物种开始感兴趣。大概是因为房子位置比较偏僻，在我很小的时候妈妈就养了一条大黄狗，从此我便和大黄成了形影不离的好朋友。
当然，大黄初来的时候还是一条只有喵星人大小的小狗崽，经过我们大家不断努力营养搭配喂养一个月左右，大黄在体型上逐渐有所变化，灰黄色柔软绒毛开始变得深黄质硬并且垂直着想上面长，两双灰溜溜大眼睛滴溜溜乱转，好像有敌人随时准备进攻一样想。看到我们尾巴就会不停的左右摇摆，时不时的把头伸过来往我们身上乱蹭与此同时我们就会张开手握住它的前脚，而大黄也会很配合的伸出它的前脚，真的是太萌太可爱了！大黄它最大一个有点就是“大人不计小人过，宰相肚里能撑船”，有一次，它和奶奶家猫星人大家结果被喵星人抓的满脸瘀血，气的老妈拿着扫把朝喵星人走过去，那喵星人也不是任人摆布的主，看见老妈手里的扫把，感觉形式不太对于是就三十六计走为上计逃跑了，老妈也只好作罢。第二天吃过晚饭，我把狗粮端到大黄面前示意它开始吃吧，但它蹲在地下纹丝不动，我心里面还一直纳闷：这大黄是怎么啦，难道是生病了？还是在生喵星人的气？正仔细想着，就听见“噗噗噗”声音，一转身就看见大黄和喵星人已经吃上了，哎呦我去，感情这大黄不吃食物是为了等喵星人一块吃，真的是让我又惊又喜。惊的我替猫星人捏了一把汗，欣喜的是他们又和好如初了
如果人类社会交往之间也能像大黄他们一样就好了，少一些争端与战争，多一点和平与安宁；少一些猜疑和嫉妒，多一点体谅与关心；少一些冷漠与歧视，多一点关怀和平等…我想只有这样我们的社会才会变得更加繁荣昌盛民主和谐，人类才会繁衍不息，代代相传！
黄河的古诗范文4
一、工程设计概况
黄河下游放淤固堤工程设计水平年为2000年，防洪标准为防御花园口洪峰流量22000m3／s，相应高村、孙口站的设防流量分别为20000m3／s、17500m3／s。
根据大堤概化断面，淤区顶部高程为堤背侧浸润线出逸点高程加1．5m，浸润线坡度为：险工段1∶10，平工段1∶8。2001年以来，凡新设计的放淤固堤工程，不论平工段、险工段，淤区顶部高程全部改为与2000年设防水位齐平。
淤区宽度按大堤概化断面推算为100m，边坡1∶3，村庄相对密集的堤段，根据实际情况按100m、80m、60m设计。
淤区沿堤线布置在背河侧，淤区周围布置围堤，围堤外侧布设截渗沟及退水渠，淤沙完成后，进行包边盖顶，在顶部沿外侧修筑纵向围堤，淤区内每隔100m修筑格堤一道，在淤区顶面与堤坡交汇处沿淤区纵向布设排水沟1条，淤区边坡每隔100m设1条横向排水沟。
二、工程设计及施工中存在的问题
1．渗水严重
淤区土质主要是粉质细沙，颗粒较粗，渗水严重，一般浸润范围30～50m，渗水引起附近土地盐碱化，影响农业生产，为阻止浸渗，虽然在淤区外挖了截渗沟，并与退水渠连通，但由于堤根地势低洼，截渗沟内常年积水，渗水浸渗问题仍没有得到彻底解决，有些工程淤沙完成后，较长一段时间仍然有渗水排出。
2．围格堤修筑困难
设计中围格堤分两期修筑，一期围堤采用推土机从淤区内推土填筑，二期围堤采用淤区沙土用推土机修筑，工程量根据淤区顶宽分别为淤沙土方量10％～15％，但是凡大堤背河大多地势低洼，地下水位高，利用淤区内的土修筑围堤极为困难，二期围堤采用淤区沙土修筑，渗水将更加严重。
3．因渗水、退水引起的各项费用严重不足
工程设计中，只考虑了截渗沟、退水渠开挖土方和退水渠占地补偿，但是实际施工中，工程渗水影响达30～50m宽，渗水在工程完成后较长一段时间内仍然存在，退水渠两侧也存在渗水问题，加之因迁占问题造成工期延长较为普遍，造成退水渠占地补偿费增加，另外施工期间还需对截渗沟和退水渠进行清淤，工程完成后进行回填平整。
4．清基费用偏低
设计中清基费按工程长度计算为1万元／km，按照施工规范要求进行清基施工，该费用远远不够，特别是有房屋搬迁的段落，淤区内建筑垃圾及杂物较多，此时费用更高。
5．堤身裂缝问题普遍存在
凡是放淤固堤工程施工的堤段，背河堤身均出现不同程度的纵向裂缝，造成裂缝的原因，笔者认为堤身经过长期浸泡，加之随着淤沙土方的加载，造成背河地面沉陷，引起堤身裂缝，处理裂缝的费用设计中没有考虑，管理单位的工程岁修费非常紧张，因此处理裂缝的经费没有着落。
三、几点建议
1．围堤的设计与施工
设计应为施工创造条件，围堤是工程施工的关键工序，其质量好坏直接影响施工安全和施工进度，因围堤质量不好而造成决口的事故时有发生，笔者认为围堤的设计标准及施工方式不能搞一刀切，应根据工程实际情况进行设计和施工，应考虑以下几个方面：
（1）符合防渗要求，围堤土质应为壤土并分层碾压，干密度应在1．5t／m3以上，堤身断面符合稳定要求。一期围堤尽量在淤区内取土，因淤区内地势低洼不能取土的，应考虑远调土，二期及三期围堤不宜采用淤区内的沙土，实践证明，淤区渗水和坍塌最严重的部位就是在用沙土修做的二期或三期围堤上，因此二、三期围堤应全部使用远调土，并层层碾压，干密度在1．5t／m3以上。
（2）淤沙施工前，在围堤内坡辅设防渗塑料薄膜，根据施工进度向上搭接，经实践证明，该方法的防渗效果较好。
（3）围堤修建费用应根据工程实际确定，工程量、运距及工程单价应根据具体情况分别计算、分析，确定工程费用。
2．截渗沟设计与施工
目前，截渗沟修建在柳荫地内，因地势低洼常年积水，造成附近30～50m内的农田减产，有居民的段落，房屋和庭院内长期潮湿，引起当地群众的不满，进而阻挠施工、影响进度。解决上述问题的途径有两个：一是在截渗沟外侧辅设防渗塑料薄膜，并压土防晒；二是给受损群众一定的补偿费，按30～50m宽计算，每年每亩补偿两季青苗费，两者可选其一；另外还要定期对截渗沟进行清淤，保证出水畅通。
3．退水渠设计与施工
施工退水也是放淤固堤工程的重要工序之一，直接影响施工进度，从近几年的设计和施工情况来看，设计部门对退水排放设计重视不够，只列入少量退水渠占地补偿和开挖土方，与实际施工情况不符。下游堤防普遍存在堤根地势低洼，因此退水较为困难，设计时应考虑以下几点：选好排水口，进行实地测量，根据实际地形绘制断面图，进行退水渠工程量计算，确定施工方法，根据实际计算工程费用。应考虑防渗费用，具体办法同截渗沟。解决好因退水渠开挖引起的生产、交通等问题。
4．背河生产辅道设计
黄河下游堤防近堤村庄和生产辅道密集，放淤固堤工程的施工，对近堤群众的生产、生活影响较大，对这一问题设计中考虑较少。因工程施工打乱了当地群众生产交通体系，应根据实际情况，适度增加生产辅道，对原有的生产辅道，须考虑远调土加高、帮宽、延长，同时考虑因帮宽、延长引起的地面附着物拆迁。
5．设计施工应为工程管理和土地开发创造条件
考虑到今后工程管理和土地开发，设计中列入了包边盖顶和排水沟及植草、植树，为更好地进行土地开发，笔者认为还应增列以下项目：（1）淤区水利配套，包括水利设施、机械、电力等。（2）管理房屋、上堤道路（需硬化）等管理设施。
6．裂缝处理
黄河的古诗范文5
【关键词】复合地基；加固；黄土高速；湿陷性
湿陷性黄土地基承载力低，不能具备工程施工的相关要求，在施工前，需要对其进行处理，保证其满足高速铁路路基施工设计要求。
1 湿陷性黄土介绍
湿陷性黄土根据湿陷的形式不同可以分为自重湿陷性黄土以及非自重湿陷性黄土。根据我国地质相关文件标准，可以根据黄土的湿陷系数将湿陷系数大于0.015的称之为湿陷性黄土。其中，根据实地测量或者计算得到的湿陷量小于7厘米，则为非自重湿陷性黄土；大于7厘米则为自重湿陷性黄土。根据黄土湿陷量大小，可以将其分为四个等级，及轻微湿陷、中等湿陷、严重湿陷、很严重湿陷。
在湿陷性黄土地区实施建筑施工，往往会给工程建设造成严重的影响，并且会增加工程建设的成本。在湿陷性黄土地区，在工程建设的勘察阶段，需要进行相应的室内湿陷性实验，测量以及计算出工程现场黄土的湿陷系数以及湿陷等级，为工程建设的设计人员提供有力的依据。在工程设计阶段，相关的人员需要对黄土的湿陷性进行综合考虑，设计地基处理等相关的事项，大大增加了工作量，提高了工程设计成本。如果工程建设没有考虑黄土湿陷性、或者对其重视程度不够，随着地下水位变化以及工程建设施工的深入，土体汇总的含水量会会不断的增加，土体就会逐渐的变大，最后导致工程结构受到破坏，造成不可挽回的损失。
2 复合地基加固处理技术在湿陷性黄土高铁路基中的应用
2.1 湿陷性黄土铁路路基复合地基加固处理方案
针对湿陷性黄土地基的危害性，为了保证高速铁路建设的安全，需要对地基实施有效的处理。首先，要采取有效的措施消除地基的湿陷性，控制湿陷性地基的压缩变形；然后，利用综合加固处理技术，不断的提高黄土的承载力，减小铁路路基的沉降量，确保铁路工程安全运营。对湿陷性黄土地基的处理，可以采用强夯法与CFG桩复合加固方案。其中CFG桩呈三角形分布，合理的设置桩间距、桩长，并铺设半米厚的碎石褥垫层，并用二八灰土做封闭层。另外，必须严格的控制桩体以及褥垫层的铺设强度，桩体混凝土的强度应该满足C10。
2.2 强夯施工处理
强夯施工法也被称为动力固结法，就是通过重物的自由落体运动，对土体进行夯实的过程，以提高土体的强度，降低土体的压缩性。本方法不用太多的设备，在操作方面也极为简单，原理直观，所以得到了广泛的应用，利用这种方法对非饱和土体加固效果更为明显。另外，强夯法对地基进行加固，具有速度快、见效快、投资小等优点，是目前最为实用的地基加固方法之一。
2.2.1 强夯法施工工艺
强夯法施工首先需要确定强夯的等级，对于湿陷性黄土来说，实用1000kn.m的单击能，能够加固的深度为4到5米。在利用强夯法实施前，需要进行提前试夯，根据试夯的资料，并结合工程实际要求，确定强夯的能级。
在确定强夯能级后，需要确定强夯的点数以及夯实的遍数，每遍夯击的总数确定需要遵循压缩量竖向位移最小的原则，并且最后两次强夯的夯沉量要小于50毫米，保证夯坑的周围没有明显的隆起。
具体的施工措施为：用专用的步履式吊车将强夯锤吊到设计的高度，然后使其自由下落，这样就会对地面进行夯击，实现对土体的加固处理效果，根据设计的夯击能级以及夯击点，反复进行夯击，直到符合设计要求。在每一遍夯击完成后，需要用推土机将夯坑推平，然后从新放样夯实。
2.2.2 强夯法施工检测与控制
在开夯前需要对场地六米深处的原状土进行室内试验，检验土质中的含水量、可塑性、土里组成等等，并进行固结重力试验、抗剪强度实验以及湿陷性实验等等，这样能够得到强夯前土质的物性、承载力等原始数据。对强夯夯锤的重量以及落距进行检查，保证单击能级负荷设计要求。经过强夯后的地基，会随着时间的推移慢慢的恢复，在强夯结束后每隔一段时间要对地基的质量进行检验。并进行相关的实验，将实验数据与强夯前的进行对比，确定湿陷性地基的加固处理效果。
2.3 CFG桩施工
CFG桩是在碎石桩的基础上发展起来的地基加固措施，有被称为水泥粉煤灰碎石桩，有效的改善了散集材料的刚性，能够充分的发挥桩的侧阻作用，并且能够充分发挥全桩的端阻效果，在提高地基的承载力方面具有良好的效果，具有经济、社会等多种效益。
2.3.1 CFG桩施工工艺
用长螺旋钻机进行钻孔，钻至持力层，在孔中用碎石、石屑、水泥、水等进行搅拌混合，制成一定强度的高粘结性桩，与桩间的土层以及褥垫层一同组成复合地基。其中褥垫层与基础施工使用的混凝土不一样，主要是由粒状材料组成，褥垫层可以保证桩土一起承担地基荷载，并能够对桩土水平荷载分量进行适当的调整，同时还能够减小基础底面的应力。
在桩施工前，需要在施工场地上选择一块地方进行试桩，根据试桩的相关数据资料，确定合理的施工工艺，并按照相关的设计，进行承载力、地基模量等试验，并根据实验的结果进行复核，优化设计。
2.3.2 CFG桩施工检测与控制
湿陷性黄土地基CFG桩施工完成后，需要根据国家相关路基检验标准以及规定进行检测，对路基混凝土抗压强度进行实验，检测桩的应变动力；进行单桩静载试验以及复合地基静载试验。
为了保证CFG桩的施工质量，需要在施工过程中采取以下几个方面的措施：
（1）对进场的施工原材料进行严格把关，将不合格的原材料清理出场；
（2）进行CFG施工应该从路基中心线向两侧推进，这样能够有效的避免发生桩断裂等问题；
（3）控制混合填料的坍落度，满足工程实际设计要求；
（4）在桩施工拔管过程中，要避免发生停留振动以及反插。
3 总结
在湿陷性黄土地质上建设高速铁路，首先需要对地基进行加固处理，使其满足工程建设的相关要求，提高地基的承载力。本文介绍了强夯法+CFG桩复合地基加固处理技术，并分析其施工工艺与质量控制。
参考文献：
[1]薄绍学.复合地基加固处理措施在湿陷性黄土高速铁路路基中的应用[J].科技资讯，2010（3）.
黄河的古诗范文6
[关键词] 骨髓间充质干细胞 视网膜色素上皮细胞 全反视黄酸 共培养 诱导分化
BMSCs是来源于骨髓的非造血干细胞，具有多潜能分化特性。与存在伦理学争议的胚胎干细胞及增殖能力有限的视网膜祖细胞相比，BMSCs以其具有自体同源性、易分离和操作简单等显著优势，成为视网膜细胞移植治疗的理想供体。已有研究表明，视网膜细胞培养上清液能够体外诱导胚胎干细胞向神经细胞分化[1]。本研究旨在探讨BMSCs诱导分化的条件培养基。
1 材料和方法
1.1 主要仪器
THERMO FORMA 3111 CO2培养箱（美国）；AIR-TECH BCM-1000A型生物洁净工作台（苏州）；OLYMPUS 1×70荧光倒置式相差显微镜（日本）；OLYMPUS PMCB20摄影器材（日本）；OLYMPUS BH-2型光学显微镜（日本）。
1.2 试剂
DMEM/F12培养基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶（均为Gibco公司）、PBS粉（Sigma）、实验用体重为80g清洁级sD大鼠。培养基（DMEM、DMEM／F12）、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；抗体为鼠抗人角蛋白-18单克隆抗体（北京中杉公司），小鼠抗大鼠神经元特异性标志烯醇化酶（NSE），星形胶质细胞特异性标志小鼠抗大鼠单克隆抗体神经胶质酸性蛋白(GFAP)，光感受器特异性标志小鼠抗大鼠单克隆抗体视紫质(Rhodopsin)，(均为Thermo Fisher Scientific公司)。
1.3 试验方法
1.3.1 hRPE细胞的取材、原代、传代培养及鉴定
采用眼杯消化法[2]，沿角巩缘后3.5mm环形剖开眼球，弃除眼前节、玻璃体及神经视网膜获得眼杯，用0.25%胰酶消化获取HRPE细胞、15％胎牛血清的DMEM/F12培养液培养，细胞接近融合状态时进行传代培养。将第二代hRPE细胞置入六孔板中，孔板中放入18×18盖玻片，利用免疫细胞化学EnVision法检测角蛋白表达。
1.3.2 BMSCs的分离培养，传代培养及鉴定
清洁级SD大鼠，无菌条件下取出双侧股骨，从股骨干和胫骨干中间剪断，用10mLDMEM/F12培养液+20%FBS+肝素反复冲洗骨髓腔，冲洗液经200目不锈钢标准筛过滤掉大的团块后充分吹打混匀获取细胞悬液，接种于25cm2培养瓶中，置于37℃ 5%CO2的培养箱内培养。3d后首次换液，换液时倒除旧的培养液，加入含0.04%EDTA的PBS 4mL，37℃孵育10min，倒除PBS，加入新的完全培养液。当第3代MMSC细胞融合达80%~90%时，利用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD44和CD90表达对细胞纯度进行鉴定[3]。
1.4 实验分组
1.4.1 hRPE培养上清液+BMSCs+RA组：取二代hRPE细胞悬浮液含2000个细胞接种在transwell六孔双层培养板的上层，将BMSCs接种于下层培养板中，接种密度2.0×103个细胞/孔，在双层六孔板的每孔中加入终浓度为1μmol/L的RA，同时在下层放入18mm×18mm盖玻片进行细胞爬片，隔天换液。（还是每日半定量换液）倒置相差显微镜下观察细胞形态。
1.4.2 hRPE培养上清液+BMSCs组：取二代HRPE细胞悬浮液含2000个细胞接种在六孔transwell六孔双层培养板的上层，将MSC接种于下层培养板中，接种密度2000个细胞/孔，同时在下层放入18 mm×18mm盖玻片进行细胞爬片，隔天换液。倒置相差显微镜下观察细胞形态。
1.4.3 单独BMSc置于六孔板中爬片
2周后取出盖玻片进行GFAP，NSE， Rhodopsin，细胞化学染色。
1.5 免疫细胞化学染色
将双层六孔板中爬有HRPE和诱导前、后的BMSCs的玻片取出。
PBS润洗3min×3次；
4％多聚甲醛室温下固定20min，PBS冲洗3min ×3次；
0.1％TritonX.100室温下处理l0min，PBS冲洗3min ×3次；
3%H2O2去离子水孵育10min，阻断内源性过氧化物酶PBS冲洗3min ×3次；
羊血清孵育20min，封闭非特异性结合，勿洗；
适当稀释度的一抗（角蛋白 1:300），GFAP 1:100，NSE 1:10，Rhodopsin 1:25，4℃孵育过夜，PBS冲洗3min ×3次；阴性对照片为用PBS 代替一抗；
二抗（生物素标记的羊抗鼠IgG抗体）37℃ 湿盒孵育30min，PBS冲洗；
DAB显色6min；
苏木素复染；
中性树胶封片。
1.6 统计学分析
将三种培养条件下所表达的阳性细胞进行定量分析。利用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对GFAP、NSE、Rhodopsin表达进行定量分析，每个标本随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度，以每个5个视野的平均光密度的平均值作为该例的测量值；同时选取至少10个随机视野，每个视野在200倍物镜下统计阳性细胞数和整个视野细胞总数，计算阳性细胞率，测量值均以 表示，统计数据采用SPSS13.0统计软件处理。组间差异采用ANOVA分析。以P
2 结果
2.1 hRPE以及BMSCs的取材和原代、传代培养参照文献[2]、[3]报告的方法
2.2 诱导分化的细胞形态学观察及鉴定
hRPE培养上清液+BMSCs+RA组共培养3d后原来梭行的BMSCs 胞体已发生收缩，呈锥形，细胞边缘变得不规整，有零星的细的突起（图1A）。在诱导后14d后，BMSCs 呈渐进性的向神经元样细胞转化，有较多的长突起，有些长突起末端形成生长锥样的膨大及丝性伪足呈典型的核周体形态，多极状（图1B）； 同时BMSC在诱导7D后，部分细胞发生迁移并相互之间建立突触联系(图1C)。与hRPE培养上清液+BMSCs+RA组相比，不加RA则分化细胞明显减少，也少有建立突触联系的细胞（图1D）。
A：3d×400；B:14d×400；C:7d×400；单独BMSCs:D:×400；
GFAP免疫细胞化学染色 E：×400; NSE免疫细胞化学染色F:×400；Rhodopsin免疫细胞化学染色G:×400；BMSCs+RA共培养:H:7d×400。
图1 RPE培养上清液+BMSCs+RA共培养
2.3 统计学结果分析
利用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统分别对两种诱导条件下GFAP、NSE、Rhodopsin表达进行定量分析。
3 讨论
BMSCs是目前备受关注的一群具有多向分化潜能的成体干细胞。具有高度可塑性，在一定诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞以及基质细胞等中胚层细胞分化的能力。近年来，BMSCs 向神经细胞的分化研究受到了极大的关注。本试验所用到的RA是一种维生素A的代谢产物，它可以影响脊椎动物的发育和许多类型细胞的分化。RA常被用来进行诱导多潜能干细胞向神经细胞分化的研究，但机制尚不明确。RPE 细胞可分泌多种细胞因子这些细胞因子, 包括PEDF、FGF、 TGF2β、IL21 等。其中PEDF是一种多效的神经营养因子。对中枢及外周神经系统的许多部位的神经元具有神经营养、神经保护和神经分化作用；bFGF能诱导体内视网膜的重建，刺激所有源自中胚层的细胞以及许多源自神经外胚层和内胚层细胞的增生；bFGF可介导神经元的分化、对光感受器具有重要的保护作用；TGF2β可在正常RPE 细胞中表达。可调控细胞生长、分化、细胞外基质合成。本试验将三者共培养两周，结果显示：BMSCs可以高表达神经胶质细胞及神经元细胞特异性标志GFAP和NSE，同时我们还惊喜地发现诱导分化后的BMSCs表达光感受器细胞特异性标志Rhodopsin。这进一步证明了，BMSCs不仅可以向非间充质细胞转化，还可以跨胚层由起始的中胚层向外胚层发育，这为临床上进一步治疗视网膜和视神经疾病奠定了基础。
参考文献：
[1] Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons[J]. Journal of Neuroscience Research, 2000, 61( 4 ): 364 370.
