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黄河的古诗范文1
北街小学 五年级一班 文雪
大约二百万年前的一天，碧空万里无云，太阳炙烤着大地，小草和小花都轻轻地低下了头。远处，几棵栎树呆立不动，一群一群的羚羊和鸵鸟走来走去。一条弯弯的小河缓缓地向东南方流去。
突然，传来一阵巨响。啊！原来是两头大公象正在进行一次长跑比赛。这两头大公象的名字分别叫哈果和哈里，他俩是一对双胞胎，都很爱跑步，而且很喜欢比赛。看，他俩又开始了。
他们跑了好一阵子后，哈里跑到了终点——那条弯弯的小河边。这时哈果才跑到离起点8米的地方。
黄河的古诗范文2
牛磺酸是一种氨基酸，对胎儿，婴幼儿中枢神经系统和视网膜的发育有重要的生理作用。它能促进脑细胞的增殖，提高脑细胞的活性，增强记忆力。还能维持眼睛的各项正常功能。
母乳是婴儿体内牛磺酸的主要来源，人工喂养的婴儿，存在牛磺酸缺乏的可能。若缺乏牛磺酸，将影响婴幼儿神经系统的正常发育，出现智力发育迟缓；缺乏牛磺酸的饮食还会使视网膜产生病理变化，最后导致失明。
此外。牛磺酸还有强肝利胆，消炎解热作用。
牛磺酸的食物来源
由于人体只能有限地合成牛磺酸，因此膳食中牛磺酸含量非常重要。以下食物中含牛磺酸较丰富(每100克食物中所含的牛磺酸毫克数)：扇贝827，淡菜655，鱿鱼356，乌鸡肉169，瘦猪肉61，牛肉43。
故事之外的知识链接
认识动物
陆上动物黑熊
讲故事前收集好黑熊的图片，教宝宝认图认字，告诉宝宝黑熊主要生活在森林中，会爬树、游泳。黑熊还有冬眠习惯，整个冬天都躺在洞里，不吃不动，第二年春天才出洞活动。
海底动物扇贝
准备好扇贝的图片，和宝宝讲讲扇贝的知识：扇贝生活在浅海海底，平时不大活动，当感到环境不舒服时，就只做小范围的游动。不过小扇贝的游泳速度很快哦。扇贝的贝壳色彩多样，是制做贝雕工艺品的好材料。
巧手妈妈的营养食谱
五彩扇贝
食材：扇贝六只，胡萝卜半根，茄子半根，洋葱半只，芦笋一支
调料：油、精盐、白糖、料酒、葱花、姜，蒜蓉，湿淀粉各适量
DIY：
1、扇贝去壳后洗净，切成小碎块用湿淀粉勾芡；
2、胡萝卜、茄子，洋葱、芦笋切成菱形小块，分别在沸水中焯熟备用；
3、起油锅，姜蒜炝锅，加料酒，倒入扇贝，胡萝卜、茄子，洋葱。芦笋翻炒：
4、加白糖、精盐，用湿淀粉勾芡，撒上葱花即可。
营养指南：
本款菜肴红、黄、绿、白、紫，五色俱全，符合宝宝的视觉审美，更符合营养学提出食用多彩食物的营养原则。扇贝不仅味道鲜美，更是富含牛磺酸及多种维生素、矿物质等营养，是宝宝餐桌上一道不可多得的海鲜菜!
椰香乌鸡雪耳汤
食材：乌鸡一只，银耳6～8朵，椰子汁500毫升
调料：精盐，姜片适量
DIY：
1、乌鸡洗净切成小块，银耳用冷水泡发好备用；
2、锅内加适量水烧开，加乌鸡，姜片，水沸后转为小火；
3、加椰子汁，加精盐，煲1.5小时左右，加入银耳，再煲半小时即可。
黄河的古诗范文3
我不知道自己天生就喜欢狗狗还是，从小时候或者长大之后才开始渐渐对这些物种开始感兴趣。大概是因为房子位置比较偏僻，在我很小的时候妈妈就养了一条大黄狗，从此我便和大黄成了形影不离的好朋友。
当然，大黄初来的时候还是一条只有喵星人大小的小狗崽，经过我们大家不断努力营养搭配喂养一个月左右，大黄在体型上逐渐有所变化，灰黄色柔软绒毛开始变得深黄质硬并且垂直着想上面长，两双灰溜溜大眼睛滴溜溜乱转，好像有敌人随时准备进攻一样想。看到我们尾巴就会不停的左右摇摆，时不时的把头伸过来往我们身上乱蹭与此同时我们就会张开手握住它的前脚，而大黄也会很配合的伸出它的前脚，真的是太萌太可爱了！大黄它最大一个有点就是“大人不计小人过，宰相肚里能撑船”，有一次，它和奶奶家猫星人大家结果被喵星人抓的满脸瘀血，气的老妈拿着扫把朝喵星人走过去，那喵星人也不是任人摆布的主，看见老妈手里的扫把，感觉形式不太对于是就三十六计走为上计逃跑了，老妈也只好作罢。第二天吃过晚饭，我把狗粮端到大黄面前示意它开始吃吧，但它蹲在地下纹丝不动，我心里面还一直纳闷：这大黄是怎么啦，难道是生病了？还是在生喵星人的气？正仔细想着，就听见“噗噗噗”声音，一转身就看见大黄和喵星人已经吃上了，哎呦我去，感情这大黄不吃食物是为了等喵星人一块吃，真的是让我又惊又喜。惊的我替猫星人捏了一把汗，欣喜的是他们又和好如初了
如果人类社会交往之间也能像大黄他们一样就好了，少一些争端与战争，多一点和平与安宁；少一些猜疑和嫉妒，多一点体谅与关心；少一些冷漠与歧视，多一点关怀和平等…我想只有这样我们的社会才会变得更加繁荣昌盛民主和谐，人类才会繁衍不息，代代相传！
黄河的古诗范文4
一、工程设计概况
黄河下游放淤固堤工程设计水平年为2000年，防洪标准为防御花园口洪峰流量22000m3／s，相应高村、孙口站的设防流量分别为20000m3／s、17500m3／s。
根据大堤概化断面，淤区顶部高程为堤背侧浸润线出逸点高程加1．5m，浸润线坡度为：险工段1∶10，平工段1∶8。2001年以来，凡新设计的放淤固堤工程，不论平工段、险工段，淤区顶部高程全部改为与2000年设防水位齐平。
淤区宽度按大堤概化断面推算为100m，边坡1∶3，村庄相对密集的堤段，根据实际情况按100m、80m、60m设计。
淤区沿堤线布置在背河侧，淤区周围布置围堤，围堤外侧布设截渗沟及退水渠，淤沙完成后，进行包边盖顶，在顶部沿外侧修筑纵向围堤，淤区内每隔100m修筑格堤一道，在淤区顶面与堤坡交汇处沿淤区纵向布设排水沟1条，淤区边坡每隔100m设1条横向排水沟。
二、工程设计及施工中存在的问题
1．渗水严重
淤区土质主要是粉质细沙，颗粒较粗，渗水严重，一般浸润范围30～50m，渗水引起附近土地盐碱化，影响农业生产，为阻止浸渗，虽然在淤区外挖了截渗沟，并与退水渠连通，但由于堤根地势低洼，截渗沟内常年积水，渗水浸渗问题仍没有得到彻底解决，有些工程淤沙完成后，较长一段时间仍然有渗水排出。
2．围格堤修筑困难
设计中围格堤分两期修筑，一期围堤采用推土机从淤区内推土填筑，二期围堤采用淤区沙土用推土机修筑，工程量根据淤区顶宽分别为淤沙土方量10％～15％，但是凡大堤背河大多地势低洼，地下水位高，利用淤区内的土修筑围堤极为困难，二期围堤采用淤区沙土修筑，渗水将更加严重。
3．因渗水、退水引起的各项费用严重不足
工程设计中，只考虑了截渗沟、退水渠开挖土方和退水渠占地补偿，但是实际施工中，工程渗水影响达30～50m宽，渗水在工程完成后较长一段时间内仍然存在，退水渠两侧也存在渗水问题，加之因迁占问题造成工期延长较为普遍，造成退水渠占地补偿费增加，另外施工期间还需对截渗沟和退水渠进行清淤，工程完成后进行回填平整。
4．清基费用偏低
设计中清基费按工程长度计算为1万元／km，按照施工规范要求进行清基施工，该费用远远不够，特别是有房屋搬迁的段落，淤区内建筑垃圾及杂物较多，此时费用更高。
5．堤身裂缝问题普遍存在
凡是放淤固堤工程施工的堤段，背河堤身均出现不同程度的纵向裂缝，造成裂缝的原因，笔者认为堤身经过长期浸泡，加之随着淤沙土方的加载，造成背河地面沉陷，引起堤身裂缝，处理裂缝的费用设计中没有考虑，管理单位的工程岁修费非常紧张，因此处理裂缝的经费没有着落。
三、几点建议
1．围堤的设计与施工
设计应为施工创造条件，围堤是工程施工的关键工序，其质量好坏直接影响施工安全和施工进度，因围堤质量不好而造成决口的事故时有发生，笔者认为围堤的设计标准及施工方式不能搞一刀切，应根据工程实际情况进行设计和施工，应考虑以下几个方面：
（1）符合防渗要求，围堤土质应为壤土并分层碾压，干密度应在1．5t／m3以上，堤身断面符合稳定要求。一期围堤尽量在淤区内取土，因淤区内地势低洼不能取土的，应考虑远调土，二期及三期围堤不宜采用淤区内的沙土，实践证明，淤区渗水和坍塌最严重的部位就是在用沙土修做的二期或三期围堤上，因此二、三期围堤应全部使用远调土，并层层碾压，干密度在1．5t／m3以上。
（2）淤沙施工前，在围堤内坡辅设防渗塑料薄膜，根据施工进度向上搭接，经实践证明，该方法的防渗效果较好。
（3）围堤修建费用应根据工程实际确定，工程量、运距及工程单价应根据具体情况分别计算、分析，确定工程费用。
2．截渗沟设计与施工
目前，截渗沟修建在柳荫地内，因地势低洼常年积水，造成附近30～50m内的农田减产，有居民的段落，房屋和庭院内长期潮湿，引起当地群众的不满，进而阻挠施工、影响进度。解决上述问题的途径有两个：一是在截渗沟外侧辅设防渗塑料薄膜，并压土防晒；二是给受损群众一定的补偿费，按30～50m宽计算，每年每亩补偿两季青苗费，两者可选其一；另外还要定期对截渗沟进行清淤，保证出水畅通。
3．退水渠设计与施工
施工退水也是放淤固堤工程的重要工序之一，直接影响施工进度，从近几年的设计和施工情况来看，设计部门对退水排放设计重视不够，只列入少量退水渠占地补偿和开挖土方，与实际施工情况不符。下游堤防普遍存在堤根地势低洼，因此退水较为困难，设计时应考虑以下几点：选好排水口，进行实地测量，根据实际地形绘制断面图，进行退水渠工程量计算，确定施工方法，根据实际计算工程费用。应考虑防渗费用，具体办法同截渗沟。解决好因退水渠开挖引起的生产、交通等问题。
4．背河生产辅道设计
黄河下游堤防近堤村庄和生产辅道密集，放淤固堤工程的施工，对近堤群众的生产、生活影响较大，对这一问题设计中考虑较少。因工程施工打乱了当地群众生产交通体系，应根据实际情况，适度增加生产辅道，对原有的生产辅道，须考虑远调土加高、帮宽、延长，同时考虑因帮宽、延长引起的地面附着物拆迁。
5．设计施工应为工程管理和土地开发创造条件
考虑到今后工程管理和土地开发，设计中列入了包边盖顶和排水沟及植草、植树，为更好地进行土地开发，笔者认为还应增列以下项目：（1）淤区水利配套，包括水利设施、机械、电力等。（2）管理房屋、上堤道路（需硬化）等管理设施。
6．裂缝处理
黄河的古诗范文5
关键词：霜脲氰；喹啉铜；黄瓜；残留；风险评估
中图分类号：TQ450.2+63文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）05-0122-05
霜脲氰（cymoxanil），化学名称2-氰基-N-[（乙酰基）羧基]-2-（甲氧基亚胺基）乙酰胺，是20 世纪70 年代美国杜邦公司研制的一种杀菌剂，主要用于防治黄瓜、葡萄、马铃薯等的霜霉病[1～5]。喹啉铜（oxine-copper）是一种广谱、高效、低残留的内吸性钳合态有机螯合铜杀菌剂，对真菌、细菌性病毒具有良好的预防和治疗作用[6，7]。它与霜脲氰结合使用可以有效防治黄瓜霜霉病，降低霜霉病带来的经济损失，具有很好的市场潜力和广泛的应用前景，但长期、大量使用该农药会对食品和环境带来潜在的危害。
刘明洋等[14]建立了利用高效液相色谱测定葡萄及其土壤中霜脲氰残留量的分析方法；郭利丰等[11]采用气相色谱法对33.5%喹啉铜悬浮剂进行了分析研究；李国平等[13]采用高效液相色谱法测定了混剂中的喹啉铜；周梦春等[7]建立了喹啉铜在番茄中的残留分析方法。虽然关于霜脲氰和喹啉铜在农作物中的残留已有报道[8～14]，但全面系统的研究报道少见，而有关同时测定霜脲氰和喹啉铜在黄瓜中的残留情况尚未见报道。本试验采用高效液相色谱法对40%霜脲氰・喹啉铜悬浮剂在黄瓜及土壤中的残留动态和最终残留展开研究，以探明其在黄瓜上的残留规律，并为其合理使用提供科学依据。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
Waters 2695高效液相色谱仪，紫外检测器（Waters公司）；超声波清洗仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；电子天平（METTLER）。
40%霜脲氰・喹啉铜悬浮剂（霜脲氰10%，喹啉铜30%，青岛东生药业有限公司提供）；霜脲氰、喹啉铜标准品（纯度分别为99.0%、98.5%，由青岛东生药业有限公司提供）；乙腈、甲醇为色谱纯；氯化钠、氢氧化钠、盐酸均为分析纯。
供试作物：津选优1号、津春4号黄瓜。
1.2田间试验方法
参照农业部农药检定所制定的《农药残留试验准则》[15]和《农药登记残留田间试验标准操作规程》[16]，于2012～2013年分别在山东、河北、安徽三地进行了消解动态试验及最终残留试验。
1.2.1消解动态试验在黄瓜幼果期施药，施药时应保证用于动态试验的黄瓜均匀着药。施药剂量为40%霜脲氰・喹啉铜悬浮剂540 g a.i./hm2，施药后2 h、1、3、5、7、14、21、30、45 d采集黄瓜样品。在试验小区内随机取样，每个小区不同方向及上下不同部位采集6条以上（不少于2 kg）生长正常、无病害、成熟的黄瓜，用不锈钢刀切成1 cm大小的碎块，在不锈钢盆中充分混匀，用四分法切分样品，分取两份150 g的样品，分别装入封口样品容器中并进行标记，于-20℃冰柜中保存。
1.2.2最终残留量试验设两个施药剂量：低剂量为360 g a.i./hm2，高剂量为540 g a.i./hm2。各设3、4次施药，施药间隔期7 d，每处理设3次重复。最后一次施药后1、2、3、5 d采集黄瓜样品及土壤样品。另设空白对照，处理间设保护隔离带。黄瓜样本的采集方法同动态试验。
1.3分析方法
1.3.1样品提取、净化将切碎的黄瓜样品混匀，称取10.0 g于匀浆机中，加入40 mL乙腈，高速匀浆 2 min，过滤至装有7 g氯化钠的具塞量筒中，剧烈振荡2 min，静置20 min，取20 mL上层有机相于平底烧瓶中，减压浓缩至近干，用甲醇定容至5 mL，待测。
1.3.2仪器条件检测器： Waters 2695高效液相色谱仪，紫外检测器；检测波长：250 nm；色谱柱：VP-ODS C18柱，250 mm×4.6 mm；流动相：甲醇-水（V∶V=40∶60）；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL；柱温：30℃。
1.3.3结果计算采用外标法峰面积定量。一定范围内峰面积响应值（Y）和进样量（X）有良好线性关系。用霜脲氰标准品配制0.05、0.1、0.5、1.0、10.0 μg/mL标准溶液，在上述仪器条件下检测，霜脲氰进样量在1×10-9～2×10-7 g之间有良好的线性关系，直线回归式为：Y=3444.5X-1459.2，R2=1.0000。用喹啉铜标准品配制0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 μg/mL标准溶液，在上述仪器条件下检测，喹啉铜进样量在10-9～10-7 g之间有良好的线性关系，直线回归式为：Y=3949X-5120.5，R2=0.9993。
1.3.4方法灵敏度、准确度及精密度在上述色谱条件下，霜脲氰、喹啉铜的最低检出量为10-9 g。霜脲氰和喹啉铜在黄瓜中的最低检出浓度均为0.05 mg/kg。用未施药的黄瓜空白样品进行3个浓度的添加回收试验，霜脲氰添加量分别为0.05、0.5、1.0 mg/kg，喹啉铜添加量分别为0.05、1.0、2.0 mg/kg，每个添加浓度进行5次平行测定，设空白对照。霜脲氰和喹啉铜在黄瓜中的添加回收率分别为95.8%～110.9%和108.3%～110.9%，相对标准偏差分别为3.6%～4.5%和3.9%～5.1%。本方法有较好的准确度及精密度，符合农药残留检测要求（色谱图见图1）。
1.4膳食暴露和风险评估
霜脲氰和喹啉铜在黄瓜中的长期膳食风险评估分别由公式（1）、（2）计算得出。
国家估算每日摄入量（NEDI）[17，18]：
式中：Fi为我国一般人群对某一农产品或食品的日摄入量，kg/d；STMRi为规范残留试验中值，本文中采用黄瓜残留试验数据的平均值；Ei和Pi分别为食品的可食部分因子和食品加工因子，本文中不考虑区别，均设为1；ADI为每日允许摄入量，mg/kg bw；bw为体重，kg，我国人均体重一般按63 kg计。当RQ>1时，表示存在不可接受的风险，数值越大，风险越大；RQ
2结果与分析
2.1霜脲氰和喹啉铜在黄瓜中的残留消解动态
2012～2013年在山东、河北、安徽进行了40%霜脲氰・喹啉铜悬浮剂在黄瓜中的残留消解规律试验研究，其消解规律均符合一级动力学方程式Ct=C0e-kt。式中：Ct为施药后7 d的残留农药浓度，C0为施药后的原始沉积量，k为消解速率常数，t为施药后的天数。从试验结果看出（表1、表2），霜脲氰在黄瓜中的半衰期为1.8～2.5 d，药后7 d残留量未检出（
2.2霜脲氰和喹啉铜在黄瓜中的最终残留量
40%霜脲氰・喹啉铜悬浮剂360 g a.i./hm2 3次药后1、2 d黄瓜中霜脲氰残留量为0.0551～0.127 mg/kg，药后3、5 d未检出；4次药后1、2 d残留量为0.0682～0.167 mg/kg，药后3、5 d未检表1霜脲氰在黄瓜中
出。40%霜脲氰・喹啉铜悬浮剂540 g a.i./hm2 3次施用后1、2、3 d黄瓜中霜脲氰残留量为0.0578～0.222 mg/kg，药后5 d未检出；4次药后1、2、3 d残留量为0.0761～0.256 mg/kg，药后5 d未检出。所有检出样品残留量均低于最大残留限量0.5 mg/kg。对照区样品霜脲氰残留量均未检出（表3）。
由表4可以看出，40%霜脲氰・喹啉铜悬浮剂360 g a.i./hm2，3次药后1、2、3、5 d黄瓜中喹啉铜残留量为0.0539～0.316 mg/kg；4次药后1、2、3、5 d残留量为0.0604～0.437 mg/kg。40%霜脲氰・喹啉铜悬浮剂540 g a.i./hm2，3次药后1、2、3、5 d黄瓜中喹啉铜残留量为0.0598～0.528 mg/kg；4次药后1、2、3、5 d残留量为0.0969～0.563 mg/kg。所有检出样品残留量均低于最大残留限量2.0 mg/kg。对照区黄瓜样品中均未检出喹啉铜残留（
根据我国国家相关标准的规定，霜脲氰和喹啉铜人体每千克体重每日允许摄入量（ADI）为0.013 mg和0.02 mg，根据《中国居民膳食指南》（2011年修订），我国人均膳食结构中黄瓜（深色蔬菜）每日摄入量一般为0.0915 kg。基于规范残留试验数据进行的国家估算每日摄入量（NEDI）评估结果见表5。由此计算得出，霜脲氰暴露摄入量不超过其ADI的0.62%，喹啉铜暴露摄入量不超过其ADI的0.40%，处于极低的水平，无明显膳食风险。
3结论与讨论
建立了同时测定霜脲氰和喹啉铜在黄瓜中残留的分析方法。其前处理操作简便、省时，便于掌握，进样量在10-9～10-7 g之间有良好的线性关系，霜脲氰、喹啉铜的最低检出量均为10-9 g。
本试验结果表明，霜脲氰在黄瓜中的半衰期为1.8～2.5 d，药后7 d残留量未检出；喹啉铜在黄瓜中的半衰期为2.6～4.1 d，药后14 d消解90%以上或未检出。霜脲氰、喹啉铜在黄瓜中的半衰期短，消解速度较快。根据残留情况推荐40%霜脲氰・喹啉铜悬浮剂用于防治黄瓜霜霉病，最高用药量360 g a.i./hm2，最多施药3次，在黄瓜上的安全间隔期为1 d。
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黄河的古诗范文6
[关键词] 骨髓间充质干细胞 视网膜色素上皮细胞 全反视黄酸 共培养 诱导分化
BMSCs是来源于骨髓的非造血干细胞，具有多潜能分化特性。与存在伦理学争议的胚胎干细胞及增殖能力有限的视网膜祖细胞相比，BMSCs以其具有自体同源性、易分离和操作简单等显著优势，成为视网膜细胞移植治疗的理想供体。已有研究表明，视网膜细胞培养上清液能够体外诱导胚胎干细胞向神经细胞分化[1]。本研究旨在探讨BMSCs诱导分化的条件培养基。
1 材料和方法
1.1 主要仪器
THERMO FORMA 3111 CO2培养箱（美国）；AIR-TECH BCM-1000A型生物洁净工作台（苏州）；OLYMPUS 1×70荧光倒置式相差显微镜（日本）；OLYMPUS PMCB20摄影器材（日本）；OLYMPUS BH-2型光学显微镜（日本）。
1.2 试剂
DMEM/F12培养基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶（均为Gibco公司）、PBS粉（Sigma）、实验用体重为80g清洁级sD大鼠。培养基（DMEM、DMEM／F12）、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；抗体为鼠抗人角蛋白-18单克隆抗体（北京中杉公司），小鼠抗大鼠神经元特异性标志烯醇化酶（NSE），星形胶质细胞特异性标志小鼠抗大鼠单克隆抗体神经胶质酸性蛋白(GFAP)，光感受器特异性标志小鼠抗大鼠单克隆抗体视紫质(Rhodopsin)，(均为Thermo Fisher Scientific公司)。
1.3 试验方法
1.3.1 hRPE细胞的取材、原代、传代培养及鉴定
采用眼杯消化法[2]，沿角巩缘后3.5mm环形剖开眼球，弃除眼前节、玻璃体及神经视网膜获得眼杯，用0.25%胰酶消化获取HRPE细胞、15％胎牛血清的DMEM/F12培养液培养，细胞接近融合状态时进行传代培养。将第二代hRPE细胞置入六孔板中，孔板中放入18×18盖玻片，利用免疫细胞化学EnVision法检测角蛋白表达。
1.3.2 BMSCs的分离培养，传代培养及鉴定
清洁级SD大鼠，无菌条件下取出双侧股骨，从股骨干和胫骨干中间剪断，用10mLDMEM/F12培养液+20%FBS+肝素反复冲洗骨髓腔，冲洗液经200目不锈钢标准筛过滤掉大的团块后充分吹打混匀获取细胞悬液，接种于25cm2培养瓶中，置于37℃ 5%CO2的培养箱内培养。3d后首次换液，换液时倒除旧的培养液，加入含0.04%EDTA的PBS 4mL，37℃孵育10min，倒除PBS，加入新的完全培养液。当第3代MMSC细胞融合达80%~90%时，利用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD44和CD90表达对细胞纯度进行鉴定[3]。
1.4 实验分组
1.4.1 hRPE培养上清液+BMSCs+RA组：取二代hRPE细胞悬浮液含2000个细胞接种在transwell六孔双层培养板的上层，将BMSCs接种于下层培养板中，接种密度2.0×103个细胞/孔，在双层六孔板的每孔中加入终浓度为1μmol/L的RA，同时在下层放入18mm×18mm盖玻片进行细胞爬片，隔天换液。（还是每日半定量换液）倒置相差显微镜下观察细胞形态。
1.4.2 hRPE培养上清液+BMSCs组：取二代HRPE细胞悬浮液含2000个细胞接种在六孔transwell六孔双层培养板的上层，将MSC接种于下层培养板中，接种密度2000个细胞/孔，同时在下层放入18 mm×18mm盖玻片进行细胞爬片，隔天换液。倒置相差显微镜下观察细胞形态。
1.4.3 单独BMSc置于六孔板中爬片
2周后取出盖玻片进行GFAP，NSE， Rhodopsin，细胞化学染色。
1.5 免疫细胞化学染色
将双层六孔板中爬有HRPE和诱导前、后的BMSCs的玻片取出。
PBS润洗3min×3次；
4％多聚甲醛室温下固定20min，PBS冲洗3min ×3次；
0.1％TritonX.100室温下处理l0min，PBS冲洗3min ×3次；
3%H2O2去离子水孵育10min，阻断内源性过氧化物酶PBS冲洗3min ×3次；
羊血清孵育20min，封闭非特异性结合，勿洗；
适当稀释度的一抗（角蛋白 1:300），GFAP 1:100，NSE 1:10，Rhodopsin 1:25，4℃孵育过夜，PBS冲洗3min ×3次；阴性对照片为用PBS 代替一抗；
二抗（生物素标记的羊抗鼠IgG抗体）37℃ 湿盒孵育30min，PBS冲洗；
DAB显色6min；
苏木素复染；
中性树胶封片。
1.6 统计学分析
将三种培养条件下所表达的阳性细胞进行定量分析。利用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对GFAP、NSE、Rhodopsin表达进行定量分析，每个标本随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度，以每个5个视野的平均光密度的平均值作为该例的测量值；同时选取至少10个随机视野，每个视野在200倍物镜下统计阳性细胞数和整个视野细胞总数，计算阳性细胞率，测量值均以 表示，统计数据采用SPSS13.0统计软件处理。组间差异采用ANOVA分析。以P
2 结果
2.1 hRPE以及BMSCs的取材和原代、传代培养参照文献[2]、[3]报告的方法
2.2 诱导分化的细胞形态学观察及鉴定
hRPE培养上清液+BMSCs+RA组共培养3d后原来梭行的BMSCs 胞体已发生收缩，呈锥形，细胞边缘变得不规整，有零星的细的突起（图1A）。在诱导后14d后，BMSCs 呈渐进性的向神经元样细胞转化，有较多的长突起，有些长突起末端形成生长锥样的膨大及丝性伪足呈典型的核周体形态，多极状（图1B）； 同时BMSC在诱导7D后，部分细胞发生迁移并相互之间建立突触联系(图1C)。与hRPE培养上清液+BMSCs+RA组相比，不加RA则分化细胞明显减少，也少有建立突触联系的细胞（图1D）。
A：3d×400；B:14d×400；C:7d×400；单独BMSCs:D:×400；
GFAP免疫细胞化学染色 E：×400; NSE免疫细胞化学染色F:×400；Rhodopsin免疫细胞化学染色G:×400；BMSCs+RA共培养:H:7d×400。
图1 RPE培养上清液+BMSCs+RA共培养
2.3 统计学结果分析
利用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统分别对两种诱导条件下GFAP、NSE、Rhodopsin表达进行定量分析。
3 讨论
BMSCs是目前备受关注的一群具有多向分化潜能的成体干细胞。具有高度可塑性，在一定诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞以及基质细胞等中胚层细胞分化的能力。近年来，BMSCs 向神经细胞的分化研究受到了极大的关注。本试验所用到的RA是一种维生素A的代谢产物，它可以影响脊椎动物的发育和许多类型细胞的分化。RA常被用来进行诱导多潜能干细胞向神经细胞分化的研究，但机制尚不明确。RPE 细胞可分泌多种细胞因子这些细胞因子, 包括PEDF、FGF、 TGF2β、IL21 等。其中PEDF是一种多效的神经营养因子。对中枢及外周神经系统的许多部位的神经元具有神经营养、神经保护和神经分化作用；bFGF能诱导体内视网膜的重建，刺激所有源自中胚层的细胞以及许多源自神经外胚层和内胚层细胞的增生；bFGF可介导神经元的分化、对光感受器具有重要的保护作用；TGF2β可在正常RPE 细胞中表达。可调控细胞生长、分化、细胞外基质合成。本试验将三者共培养两周，结果显示：BMSCs可以高表达神经胶质细胞及神经元细胞特异性标志GFAP和NSE，同时我们还惊喜地发现诱导分化后的BMSCs表达光感受器细胞特异性标志Rhodopsin。这进一步证明了，BMSCs不仅可以向非间充质细胞转化，还可以跨胚层由起始的中胚层向外胚层发育，这为临床上进一步治疗视网膜和视神经疾病奠定了基础。
参考文献：
[1] Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons[J]. Journal of Neuroscience Research, 2000, 61( 4 ): 364 370.
