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免疫组化技术范文1
【摘要】目的,探讨液基细胞学薄层涂片技术在体液免疫组化中的应用。方法对经巴氏涂片检查发现癌细胞的胸腹水36例分别采用液基细胞学涂片技术和传统涂片方法涂片，然后进行免疫组织化学检查。结果,采用液基细胞学薄层涂片技术制作36片，优质片36片，其优片率100%；采用传统涂片方法制片36片，优质片30例，其优片率83.3%，两者间差异显著。结合免疫组化结果有助于诊断和鉴别诊断间皮瘤和腺癌，结论,采用液基薄层细胞学涂片技术制片提高了制片的质量，对间皮瘤和腺癌的诊断和鉴别诊断提供了有效的方法，提高了脱落细胞学对间皮瘤和腺癌的诊断价值。
【关键词】活组织检查；细胞学技术；免疫组织化学；间皮瘤/诊断；腺癌/诊断
在体液细胞学检查与诊断研究中，涂片及染色质量的好坏直接影响到病理诊断及研究结果的正确判断，而免疫组化结果有助于诊断和鉴别诊断间皮瘤和腺癌。传统的巴氏涂片在免疫组化质量上不能令人满意，如细胞重叠，色调不正、杂质多等，而我科在工作中经过不断的摸索，发现了液基细胞学薄层涂片技术应用于免疫组化中，获得了较满意的效果。
1、材料与方法
1.1材料来源：我科2010—2011年间以经巴氏涂片检查发现癌细胞的胸腹水36例，其中男20例，女16例，年龄35～80岁。所有病例都有手术标本的组织学对照，排除了肿瘤者为阴性病例。
1.2方法：新鲜胸、腹水250～500ml，留置时间复季＜2h，冬季＜4h。
1.2.1胸、腹水沉淀与固定将胸、腹水置于2个50ml的离心管中，每管50ml，2000～2500r/min离心10min，弃上清液，吸出部分沉积物常规涂片，剩余沉积物稀释后直接加入装有低浓度乙醇细胞保存液的保存瓶内备用，在保存瓶内至少放置15min以上。然后经thinprep-2000系统进行电脑程序化处理，制成直往为13mm的薄层细胞涂片（制作免疫组化涂片时，液基薄层制片机的染料临时用95%的无水乙醇代替），自然干片后，按常规免疫组织化学染色，封片、读片诊断。
1.2.2免疫组化用ElivisionTMPlus法。抗体有CEA、Calretinin、Cytokeratin5/6、CD68，均购自福州迈新生物技术开发有限公司。
2、结果
采用液基细胞学薄层涂片技术制片36片，优质片36片，其优片率100%；采用传统涂片方法制片36例，优质片30例，其优片率83.3%，两者间差异显著。
3、讨论
液基细胞学检测是90年展起来的一项制片新技术，已成功的应用于妇科细胞学，并取得了成熟的经验。目前已经广泛用于宫颈癌的筛查，但在体液免疫组化中应用甚少。胸腹腔积液在常规细胞学检查中仍然是目前临床常用的诊断方法之一，传统的巴氏涂片法在体液的肿瘤细胞筛查上应用已超过半个世纪，但容易出现漏诊或误诊，主要原因是其标本的制作往往受到体腔积液的新鲜程度、细胞数量、退变程度、血细胞含量或炎细胞干扰、黏液过多涂片厚薄，固定状态等多方面因素的影响，造成涂片质量差，导致较高比例的假阴性率，假阳性率出现或干扰因素多导致免疫组化结果无法准确判读［1]，有作者认为背景中血细胞的多少与涂片质量有明显的关系，血细胞越多，往往有核细胞成分则少见，癌细胞也稀少，单个存在或不典型［2]。本文选用的液基细胞学薄层涂片技术对标本采集，制片技术及程序比传统涂片具有以下优点［3]：（1）通过离心，细胞均匀涂布形成一个直径13mm的细胞薄层，结构清晰，背景干净，改变手工涂片细胞拥挤、重叠，形态特点不易观察的缺点；（2）避免了细胞过度干燥造成的假象；（3）可以同时处理1～48份标本，并在全自动制片过程中同时完成细胞染色，也减少技术员对标本的接触。
传统的制片方法是将体腔积液离心后直接涂在普通的玻片上。这种涂片质量常不稳定，涂片厚薄不均匀，细胞重叠较重，而背景中又有较多的蛋白黏液，红细胞和各类炎细胞及间皮细胞相混杂在一起，影响细胞的观察，有些异常细胞甚至被遮盖，这些都容易影响诊断的准确性［4]。而液基细胞学薄层涂片几乎保留了离心后的所有细胞,并均匀分布于玻片上，去除了黏液、红细胞、炎细胞的干扰，肿瘤细胞形态保存完整、细胞核、核质、核仁更清楚，获得了三维立体结构。此外，标本储存在保存液中，可重复制片，抗原性不受影响，也可用来作特殊染色，采用液基薄层细胞学涂片技术制片提高了制片的质量，对腺癌和间皮瘤的诊断和鉴别诊断提供了有效的方法，提高了脱落细胞学对腺癌和间皮瘤的诊断价值,与传统制片方法相比，液基细胞学薄层涂片用于免疫组化中还节约抗体量，从而节约成本,值得推广应用［5]。
参考文献
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免疫组化技术范文2
【关键词】 黄芪 肝损伤 小鼠
Abstract：Objective To investigate the protective effects of Compound Astragalus Extract (CAE) on liver injury in mice. Methods The acute liver injury models were induced by D-galactosamine (D-GalN， 800 mg/kg， ip) and Bacillus Calmette Guerin (BCG，1×107/0.2 mL， iv) plus Lipopolysaccharide (LPS 7.5 μg/0.2 mL， iv) in mice. ALT， AST， MDA content in liver homogenate were assayed by sepctrophotometry. IL-1 activity and ConA-induced splenocytes proliferation were detected by [3H] TdR incorporation assay. TNF-α activity was determined by assay of cytotoxicity against L929 cell. Results CAE (60， 120， 240 mg/kg) could obviously lower the elevated liver index， ALT level in serum and MDA content in liver homogenate in D-GalN mice and in the immunological liver injury mice. It also decreased ALT， AST level in serum， recovered ConA-induced splenocytes proliferation. It had inhibitory effect on inflammatory factors TNF， IL-1 secreted by PMφs. Conclusion CAE showed significant protective effects on chemical and immunological liver injury in mice.
Key words：CAE；liver injury；mice
黄芪始载于《神农本草经》，具有补气升阳、固表止汗等功效[1]。现代临床研究认为，黄芪粗制剂对慢性肝炎均有较好的疗效，使大鼠肝纤维化程度明显减轻[2]。我们多年的研究还发现，黄芪总苷有抗炎、抗氧化、免疫调节、诱导肝癌细胞凋亡以及抗肝纤维化等作用[3-6]。由此，根据临床经验并结合中医理论，提取与分离了黄芪有效部位群(黄芪多糖、皂苷、酮及酚)，再依据体外正交实验结果首次组成黄芪多部位组合(compound astragalus extract，CAE)。本实验进一步对其抗小鼠肝损伤进行研究。
1 实验材料
1.1 动物与细胞株
昆明种小鼠，雄性，6～8周，体重(18±2)g；C57BL/6J小鼠，雄性，6～8 周，体重(20±2)g；均购于安徽医科大学实验动物中心(合格证号：皖医实动准字01号)。小鼠成纤维细胞瘤(L929)细胞株：南京军事医学研究所朱敏生教授惠赠。
1.2 药物与试剂
CAE，合肥恒星医药研究所提供，批号20030508；研钵碾为细粉，0.5%羧甲基纤维素钠溶液(CMC-Na)混悬。护肝片，黑龙江五常葵花药业有限公司产品，批号20041016；卡介苗(BCG)，上海生物制品有限公司产品，用前以灭菌生理盐水配成所需浓度；D-氨基半乳糖胺(D-GalN)重庆医科大学生物医学工程研究室，批号020327；硫代巴比妥酸(TBA)，上海化学试剂公司；谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)试剂盒，上海荣盛生物技术有限公司产品；[3H]TdR比放射性为37 MBq/mL，中国原子能研究院同位素研究所产品；新生小牛血清(NBS)，杭州四季清生物制品公司产品；RPMI-1640培养粉，美国Gibco公司产品；脂多糖(LPS)、Hepes、刀豆蛋白A(ConA)均为美国Sigma公司产品。
1.3 仪器
Napco-6100型CO2培养箱，美国杜邦公司产品；YJ-1450型医用净化工作台，苏净集团安泰公司制造；LDR4-8.4低温离心机，北京医用离心机厂生产；XSZ-D倒置显微镜，重庆光学仪器厂产品；GL20A全自动高速冷冻离心机，湖南仪器仪表总厂离心机厂；LS-6500型液体闪烁计数仪，美国Beckman公司产品；内切式组织匀浆机，浙江机械厂产品。
2 实验方法
2.1 D氨基半乳糖胺诱导小鼠急性肝损伤模型的建立及处理[7]
昆明种小鼠60只，随机平均分组：正常组、模型组、CAE 3个剂量组(60，120，240 mg/kg)和护肝片组(800 mg/kg)。灌胃给药或溶媒，1次/d，共7 d，腹腔注射D-GalN 800 mg/kg，给药容积0.1 mL/10 g，正常对照组腹腔注射等量的生理盐水。造模后24 h眼眶采血、摘取肝脏，进行血清ALT、肝匀浆丙二醛(MDA)的测定。
2.2 卡介苗＋脂多糖诱导小鼠免疫性肝损伤模型的建立及处理[8]
昆明种小鼠60只，随机平均分组(同上)。造模第1天每鼠尾静脉注射给予BCG 2.5 mg/0.2 mL(5×107菌体)。正常鼠尾静脉注射0.2 mL生理盐水，2 h后灌胃给药或溶媒，连续12 d。第12天每鼠静脉注射LPS 7.5 μg/0.2 mL，禁食12 h。眼眶采血供ALT、AST的测定；同时进行ConA诱导的脾细胞增殖反应检测及腹腔巨噬细胞的培养，收上清供肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与白细胞介素-1(IL-1)的检测。
2.3 指标检测
2.3.1 血清ALT、AST检测
采用赖氏法，按试剂盒说明书步骤操作。
2.3.2 肝匀浆MDA测定[9]
采用TBA比色法。由标准曲线计算样本含量，结果以nmol/g表示。
2.3.3 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的测定[10]
采用[3H]TdR掺入法。常规制备1×1010/L C57BL/6J小鼠脾细胞悬液，加入96孔板，每孔100 μL；再加含ConA(终浓度5 mg/L)的10%小牛血清RPMI 1640培养液100 μL。设3个复孔，37 ℃、5% CO2培养48 h。终止培养前6 h，加[3H]TdR 20 μL(终浓度370 bq/mL)，培养结束后，收集细胞，液闪计数仪测dpm值。
2.3.4 小鼠腹腔巨噬细胞(PMΦs)分泌TNF-α及IL-1活性的检测
参照文献[11-12]方法，分别采用小鼠L929杀伤法和小鼠[3H]TdR掺入法。
2.4 统计学方法
各组数据均以—x±s表示，组间比较用SPSS11.5软件进行t检验。
3 结果
(见表1～表3)表1 CAE对D-GalN诱导的小鼠肝损伤血清ALT、肝匀浆MDA及肝指数的影响(略)注：与正常组比较，##P
4 讨论
我们前期体外研究结果表明，黄芪多糖、皂苷、酮及酚等4个有效部位均能不同程度的抑制LPS诱导的大鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1、TNF-α及NO的水平。依据体外实验(正交设计)组成的CAE在11.3～90 mg/L浓度范围内同样对LPS诱导的大鼠腹腔巨噬细胞产生上述炎症因子有明显的抑制作用[13]。但CAE对急性肝损伤小鼠有无作用？本实验首先采用了类似人类病毒性肝炎的D-GalN化学性肝损伤模型[7]，结果表明，口服不同剂量CAE(60、120、240 mg/kg)均能明显降低D-GalN升高的血清ALT的水平、肝脏指数及肝匀浆MDA的含量，表明CAE对D-GalN性肝损伤有保护作用，提示CAE的抗氧化和抗炎作用可能是其抗肝损伤作用的机制之一。
早期的研究发现，许多慢性肝炎患者存在诸多抗体，从而认为病变迁延不愈的本质可能与免疫有关，于是人们采取了多种方法建立了免疫性肝损伤模型[14]。BCG＋LPS是常用的免疫性肝损伤模型。BCG可使多形核中性细胞、单核巨噬细胞聚集于肝脏，其后用低剂量LPS攻击，可激发这些细胞释放一些对肝细胞有毒性作用的炎症介质如氧自由基、白三烯和细胞因子TNF-α、IL-1等，从而造成类似人类肝病免疫性肝损伤[8，15]。它是筛选保肝药物的一种可靠的免疫性肝损伤模型。本实验成功地复制了BCG＋LPS免疫性肝损伤模型。研究表明，CAE使小鼠升高的血清ALT、AST水平降低，而且明显上调脾淋巴细胞增殖反应，恢复低下的免疫功能，表明CAE对小鼠免疫性肝损伤有明显的保护作用和免疫调节作用，并提示CAE对小鼠免疫性肝损伤的保护作用可能与其免疫调节作用有关。
TNF-α主要是由激活的单核巨噬细胞产生的一种内源性细胞因子，具有广泛而重要的生物学作用，肝脏中大量枯否细胞(KC)的增生活跃是TNF-α水平增加的基础。国内外学者认为，TNF-α与病毒性肝炎关系密切，是引发急性肝坏死的重要介质[16]。TNF-α又可作为肝损伤的第一介质，引起许多与肝损伤有关的第二介质的出现，如IL-1、IL-6、IL-8及蛋白酶的产生[17]。而IL-1也是由激活的单核巨噬细胞产生的另一种内源性细胞因子，它加强TNF-α的肝损伤程度[18]，因此，本实验检测了PMΦs分泌TNF-α和IL-1的含量。结果表明CAE对BCG＋LPS过度激活的小鼠PMΦs产生TNF-α、IL-1有明显的下调作用。结合体外CAE直接抑制PMΦs分泌TNF-α、IL-1研究结果，推测CAE抗免疫性肝损伤作用可能与其抑制TNF-α、IL-1等炎症因子有关。但CAE是否直接抑制肝中的KC分泌TNF-α、IL-1等炎性因子，值得进一步深入研究。
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免疫组化技术范文3
[关键词] 免疫组化；质量控制；标准化管理
[中图分类号] R446.8 [文献标识码] C [文章编号] 1673-9701（2013）31-0134-03
免疫组化染色技术在现代病理诊断中的应用日益广泛， 对各类肿瘤的确诊及鉴别诊断具有重要意义，而且在肿瘤患者个体化治疗、靶向治疗方案的选择及预后判断方面越来越受到临床医生的青睐，已经成为病理诊断中不可或缺的辅助手段[1]。因而很多单位，包括基层医院也开展了这个项目。随之而来的是，免疫组化质量控制问题也凸显出来了。这其中有实验员操作不当的因素，也有其他的因素，如组织固定不好、试剂效价和试剂盒质量问题等等，各免疫组化实验室质量管理水平参差不齐[2，3]。目前国内尚无免疫组化标准化管理的统一标准，因而在众多繁杂的条件中，探索找到一个相对稳定的免疫组化质量控制的条件，即所谓的标准化管理方法具有重要意义。笔者根据本科室的实际情况，总结免疫组化室内质控管理的一点心得体会，从实验前、实验中、实验后三方面浅谈免疫组化室内质量控制如何实现标准化管理。
1实验前的标准化管理
1.1 组织处理的标准化
组织处理得当是成功制片的关键，对免疫组化染色结果的影响尤其重要，主要包括取材、固定、脱水等环节。如果组织处理不良，那么在其后的任何阶段均难以补救。组织或细胞固定的目的是使细胞内蛋白质凝固，终止或减少外源性或内源性酶的反应，防止细胞自溶，以保持组织细胞的固有形态和结构，更重要的是保存组织或细胞的抗原性，防止抗原的丢失或弥散。因此，标本应尽可能保持新鲜并及时进行固定。我们科室积极与临床一线沟通，宣传固定的意义、方法和要求，拟定以下标准：手术标本离体后30分钟内，用10%中性缓冲福尔马林固定。固定时间为小标本6～12 h，大标本12～24 h。组织取材厚度为3～4 mm，放入全自动脱水机进行脱水[4]。组织处理不好对抗原修复也产生影响，热修复时脱片的概率将会增大。
1.2 免疫组化切片的标准化
1.2.1 玻片处理及切片厚度 用于免疫组化的玻片一般都需要进行防脱片涂胶处理，目前常用的有氨丙基三乙氧基硅烷和L-多聚赖氨酸，防脱片的效果对比其他粘附剂都要好[5]。我们采用的是L-多聚赖氨酸，效果很好。采用3～4 μm连续切片[6]，切片厚度不能过于求薄，太薄由于抗原的减少，会导致抗体阳性表达的减弱，也不宜太厚，太厚在热修复过程中容易导致脱片。
1.2.2 抗原修复方法 福尔马林固定组织导致组织中抗原决定簇封闭，也就是组织细胞经福尔马林固定后，导致抗原决定簇的三维结构发生异常改变，使抗原决定簇被掩盖或原来位于表面的一些抗原决定簇因折叠而形成隐蔽的抗原决定簇，因此抗原的理化性质发生了显著的变化，表位空间结构改变导致许多抗原免疫活性丢失。但这一变化是可逆的，可通过抗原修复。目前抗原修复有两种方法：酶消化法和热修复法。
抗原修复方法的选择关系到组织抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色结果有很大影响。有很多文献比较了各种抗原修复方法的优劣，目前，被认为效果最好、最常用的修复方式为高压加热修复[7-9]。我们将微波加热与高压加热的方法进行比较，发现阳性定位于细胞核的抗体，如P53、Ki-67等的核表达，在高压修复后明显强于微波修复，因此我们选择高压加热修复，抗原修复液为柠檬酸盐，修复时间为高压锅出气后2 min自然冷却，时间过短，抗原暴露不够，时间过长，导致背景过深。
1.2.3 抗原修复液的选择 加热抗原修复缓冲液有多种如柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）、Tris（pH7～8）、EDTA（pH8.0）等，目前首选柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），优点是染色背景清晰， 适合于大多数抗体。Tris和EDTA两种修复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同时加深，如使用不当易造成假阳性结果。值得注意的是，没有一种抗原修复液能适合于所有的抗体，柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）可作为免疫组化常规使用的抗原修复缓冲液，但也不能除外某些抗体适于用EDTA和Tris缓冲修复液。一般抗原比较难于表达的抗体多选择后两者。
1.3 试剂管理的标准化
1.3.1 试剂清单及使用记录的管理 试剂的种类、公司有很多，为了方便管理，我们创建了一个“免疫组化试剂登记表”Excel电子表格，进行试剂清单的管理，简洁又规范（图1）。登记表的内容包括抗体名称、类型、稀释度、是否修复、克隆号、编号、批号、公司名称、库存量、有效期、接收日期、启用日期、用完日期等，也可以根据各单位实际情况自己添加内容。所有试剂应保证在有效期内使用，只有这样才能确保抗体的效价。因此，登记表中有效期、用完日期的记录要求完整准确，过期试剂或者失效试剂应丢弃不用，并备注原因。每种试剂的使用情况都要记录在案（图2），与图1表格建立超链接。下图1为本科室免疫组化试剂登记表部分的截图，利用Excel条件格式将不同字体颜色显示不同指代意义，如红色提示超过有效期等。
图1 免疫组化试剂登记表（部分）
图2 试剂盒使用记录表（图1中超链接）
1.3.2 冰箱温度控制及试剂的摆放 所有的试剂均应在试剂公司建议的温度下保存，储存试剂的冰箱应每天检查，建立一个冷藏冰箱温度监测表，并按时记录温度值。不管是浓缩型还是即用型试剂，如果是一堆地放在冰箱里，要用或配置的时候找起来比较麻烦费事，我们自己设计制做了几个试剂摆放的木架子，将免疫组化试剂按首字母AZ排列，同系列的按数字从小到大依次排列，如Actin、AFP、Bcl-2、CA125、CD10、CD117等依次排列（如图3所示），这样找试剂比原来方便许多，节省时间，看起来也比较整洁。
图3 试剂的摆放
图4 阳性与阴性对照
1.3.3试剂配置 免疫组化的试剂分为即用型和浓缩型两种，浓缩试剂的配置，需要对抗体滴度（稀释比）进行评估。我们参考公司推荐的抗体滴度，在其前后各增加一个实验滴度，如公司推荐1∶200，我们配置1∶100、1∶200、1∶400三种滴度，进行预实验，以观察阳性细胞染色强度及非特异性染色，验证试剂的可靠滴度，然后才能在常规的实验中应用。
2实验中的标准化管理
2.1 检测方法的选择
免疫组化的检测方法有很多种，大致分为生物素型和非生物素型两大类。因组织中含有内源性生物素，所以会干扰免疫组化的染色结果，在生物素型检测方法的操作过程中，要阻断内源性生物素干扰。非生物素型聚合物检测，可以有效地防止内源性生物素的影响，并且灵敏度高，操作简便，为很多实验室采用，是目前免疫组化标准化染色的首选方法。我们采用的是非生物素型EliVision二步法，检测方法比较稳定，效果也好。
2.2 免疫组化染色操作标准化
目前，免疫组化染色分手工操作和全自动免疫组化仪操作。在手工染色过程中，或多或少要受到实验员个人因素的干扰。全自动免疫组化仪的出现，避免了操作过程中人为因素的干扰，增加了染色结果的可靠性，有助于免疫组化质量控制的标准化管理。我们采用全自动免疫组化仪进行染色，与手工染色相比，具有以下技术优势：①精确的抗体孵育时间控制，确保染色质量，避免背景非特异性着色。②精确的抗体浓度以及量的控制，避免因实验员手法不同而导致抗体浓度被稀释，影响染色强度的表达，还可以避免交叉污染和非特异性染色的产生。③二维码的识别，可以使滴加试剂的时候不会产生滴错的现象，避免人工滴加错误，导致假阴性或假阳性结果的发生。④可根据实验员的工作需要，统筹安排，能更加合理高效地利用时间。⑤程序结束后可以保存整个进程，如果出现问题，可以在实验结束后复审，以便查找出问题的原因[10]。
2.3 阳性与阴性对照
每一次免疫组化染色必须严格设立阳性对照和阴性对照[11]。我们的方法是，每个抗体都备有一个阳性对照的小蜡块，阳性对照小蜡块的准备：取材的同时，从大体标本中重新取材，制作成大小约为0.4 cm×0.3 cm×0.3 cm的组织块，一起脱水包埋。时间应控制在48 h之内，用以保存组织抗原；常规HE切片染色，镜下观察有癌组织后，进行所需抗体表达测定，评估适合作为阳性对照后放置备用。阳性对照小蜡块主要目的针对试剂的不同批次、重新配置、滴度预试验等，用来评估试剂的可靠度。在实验过程中将待测组织与阳性对照小蜡块组织裱于同一张切片（图4），PBS代替一抗作为阴性对照，然后进行染色，实验结果更可靠、更节约成本，这一方法值得推广应用。
3实验后的标准化管理
3.1 染色结果判断的标准化
免疫组化切片应是阳性标记强而非特异性染色淡或无，两者形成鲜明的对比，阳性表达必须在细胞或组织特定的部位，细胞边界清楚；每批染色都要有阳性对照、阴性对照和自身对照才能对染色结果作出正确判断。判断标准常根据阳性细胞的百分比或阳性细胞的染色深度来判断，其颜色深浅反映抗原量的多少。免疫组化染色结果还要结合组织形态学判断是真正的阳性染色而非其他着色。阳性反应分布总是有规律、局限、定位准确和一定形态特征的，如细胞膜着色呈圆形；典型的细胞核着色为均质状，核仁和染色质呈颗粒状着色。细胞浆呈颗粒状（位于细胞器）或纤维状（中间丝或微丝）或弥漫片状（细胞内液、病毒颗粒及吸收蛋白）着色；细胞间质呈纤维条块状着色；若阳性结果定位异常象征着疾病过程。非特异性着色为无规律、无界线、定位不准确且不能重复；结缔组织受染和内源性生物素干扰是最常见的非特异性着色，镜下为均匀细颗粒状的浅棕色，但不会出现在细胞膜或细胞核。
由于免疫组化染色结果是定性指标，不能定量，染色结果判断受到诊断医师的主观因素影响而导致结果差异。为了减少这种差异的发生，我们科室内部采用统一的免疫组化染色结果判定标准，严格按照公认的分级标准进行判定，如乳腺癌ER、PR采用Bessley分级法[12]，C-erbB-2采用美国临床肿瘤协会（ASCO）/美国病理学家学院（CAP）HER2检测指南等[13]。
3.2 实验结果的跟踪、记录
每批次的免疫组化结果，进行质量跟踪记录，对于特别异常的结果，应该分析原因。是新购试剂，还是新配试剂，或者是操作过程中有无异常；全自动免疫组化仪染色的可以把程序调出来复审，然后备注分析的原因，重新设立阳性对照再染色，观察效果，直到问题解决为止。对于一些单位来说，配置的浓缩试剂，在经过一段时间后，也要进行阳性强度的评测，以防止配置时间过长后效价的降低，导致阳性强度的减弱。
3.3 试剂的库存管理
实验结束后，需要在“免疫组化试剂登记表”中，对于使用的试剂进行数据的更新，以便及时更换采购试剂。
3.4 实验室的清洁、整理
清洁工作场所内的脏污，必要的东西分门别类以一定的顺序放置，保持工作场所干净、整洁。对于使用过的仪器，做好仪器的日常维护，记录使用情况。另外，实验室的卫生对于实验人员也有一定的安全保护作用。
4 讨论
免疫组化质量的好坏影响的因素方方面面。要确保免疫组化结果的可靠性和稳定性，加强免疫组化室内质量控制管理，制定相应质控标准尤其重要。笔者结合本科室的实际情况，对实验前、实验中和实验后三个层面可能影响免疫组化染色结果的因素进行分析、总结，制定本科室免疫组化室内质控管理相关细则，在日常工作实践中得到检验。我们发现，标本及时用10%中尔马林固定，取材大小适当，组织良好的脱水，切片的厚度适宜并做防脱片处理，选择高压热修复，抗体效价的评估，采用全自动免疫组化仪代替手工操作，并做阳性与阴性对照，依照公认的免疫组化判断标准等因素，是一个相对稳定的免疫组化室内质量控制的条件。各个环节制定相应的质控标准，以达到标准化管理目标。另外每个实验室应当建有本实验室免疫组化检测的SOP文件，所谓的SOP是指 Standard Operation Procedure三个单词中首字母的大写，即标准作业程序，就是将某一事件的标准操作步骤和要求以统一的格式描述出来，用来指导和规范日常的工作。定期做好实验室室内质量控制，真正把SOP文件应用到实际工作中去。每一个实验人员在进行免疫组化操作的时候，也应该有严肃的态度和高度的责任心，才能在制片过程中做到一丝不苟，才能做出优秀的切片。制度化、规范化操作是实现标准化操作的前提条件[14，15]，全自动免疫组化仪器的使用是必要手段，阳性和阴性对照的设立是结果可信的可靠保证，稳定良好的染色质量和可靠的结果判读才是免疫组化质控标准化管理的最终目的。
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免疫组化技术范文4
【关键词】 西双版纳地区； 热带雨林气候； 免疫组化； 影响
doi：10.14033/ki.cfmr.2017.2.027 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2017）02-0053-02
病理诊断的金标准发展至今，其辅助手段也随之得到了良好的发展，如免疫组化就是最好的辅助手段，但免疫组化很娇嫩，对地域的要求因海拔的不同而有所改变，所以要根据不同的地域控制时间的长短，不断提高其质量，使它更好地为诊断服务[1]。免疫组织化学技术的原理是对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究的技术[2]。已有研究表明：修复液的温度和作用时间对修复效果有决定性的作用，温度越高修复时间越短，在昆明地区（海拔为1800 m左右）修复时间为30 min，但在低海拔地区西双版纳州景洪市就只为21 min[3]。
1 材料与方法
1.1 实验地气候
本实验在海拔550 m、大气压为94.29 kPa、水沸点97 ℃～98 ℃、西双版纳景洪市进行。西双版纳位于北纬21°10'～22°40'，东经99°55'～101°50'，最高海拔2429.7 m，最低海拔477 m，相对高差1952.7 m。是世界上北回归线附近保存最为完好、面积最大的热带雨林。景洪市属于低海拔（约500 m），年平均气温（18 ℃～21 ℃）高，湿润（年降雨1100～1900 mm）的地区，笔者率先在西双版纳州成功开展了第1例免疫组化，并通过笔者所在科2013年至今开展的200多例免疫组化结果对照，并与其他地区进行比较。
1.2 材料
10%中性甲醛固定，酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，组织分别为鼻咽鳞状细胞癌、甲状腺状癌、胃神经内分泌癌、淋巴结反应性增生。各蜡块分别切片5 μm，按照免疫组化步骤（Elivision法，试剂来源于Dakota公司）。
1.3 免疫组化操作过程
（1）石蜡涂片脱蜡和水化后，用PBS（PH714）冲洗3次，每次3 min。（2）根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。（3）每张涂片加50 μl 3%过氧化氢溶液，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3 min。（4）每张涂片根据需要加50 μl的第一抗体（如CD20、CD3、CD45RO、CD45RB、TdT，MPO、CD5、CD56、CD79a、CD43、CD5、CD10），室温下孵育60 min。（5）除去PBS液，每张涂片加50 μl聚合物（polymer enhancer），室温下孵育20 min，PBS冲洗3次，每次3 min。（6）除去PBS液，每张涂片加50 μl酶标抗鼠/兔聚合物（polymerized HRP-AntiMs/RbIgG），室温下孵育30 min PBS冲洗3次，每次3 min。（7）除去PBS液，每张涂片加50 μl新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3～10 min。（8）自来水冲洗，苏木紫复染，盐酸分化，自来水冲洗，PBS返蓝。（9）涂片经过梯度酒精脱水干燥，用DAE显色，中性树胶封固。
2 结果
修复时间20 min时（此时间为Dakota公司在其他地区用的传统时间），组织着色，阳性结果不显著，背景清晰；修复时间19 min时（比传统时间少1 min）组织已经着色，阳性结果不肯定，背景清晰；修复时间21 min时（比传统时间多1 min），组织着色，阳性结果显著，背景清晰，而且组织无脱落，修复时间22 min时（比传统时间多2 min），组织着色，阳性结果显著，背景清晰，但组织已部分脱落，具体见表1。镜下表现如下，
图1：胃神经内分泌癌SYN免疫组化染色，pH 9.0，1 mmol/L EDTA中煮沸30 min，胞浆强阳性染色，部分区域组织脱落（×200）。图2：
淋巴结反应性增生CD20免疫组化染色，pH 6.0，0.01 mmol/L在柠檬酸修复液中高压煮沸20 min，胞膜强阳性染色，背景清晰（×200），图3：鼻咽低分化鳞癌HCK免疫组化染色，pH 6.0，0.11 mmol/L柠檬酸修复液中煮沸20 min，胞浆强阳性染色，部分区域组织脱落（×200），图4：甲状腺状癌免疫组化染色，pH 6.0，0.01 mmol/L在柠檬酸修复液中高压煮沸20 min，胞膜强阳性染色，背景清晰（×200）。
3 讨论
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性[4]。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色DAB显示为棕黄色颗粒）[5]。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量[6]。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测[7]。抗原的修复通常有物理修复及化学修复，目前的国内根据不同的抗体主要的修复方法有：高温高压.胰酶修复、胃蛋白酶修复、EDTA修复，免疫组化技术都要求在高温高压下进行的[8]。随着精准医疗的理念，免疫组化也走进了大大小小的医院，成为诊断的好朋友。目前市场上的试剂很多，选择适合自己的很重要，也要根据自己地区的实际情况探索最佳方法。
本验结果显示，高温高压修复法是一种比较实用的抗原修复方法，特别是对于标本数不是特别多的基层医院。只是要根据本地区的海拔不同有所不同，要找到适合时间才能有好的效果。在低海拔地区西双版纳州景洪市就只为21 min，可以推广运用。
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免疫组化技术范文5
免疫组织化学技术是常规病理诊断中不可缺少的重要手段，尽管试剂盒及自动免疫组化仪的使用使免疫组化结果阳性率大幅提高但由于免疫组化染色步骤繁多，不同的实验室操作程序不同，结果都有所差异。影响免疫组化切片质量控制的几个主要因素有：组织的固定、切片的制作、适宜的温度，抗原的修复。
组织固定
组织的正确固定可以防止细胞在自身溶酶体的作用下溶解破坏。用于免疫组化染色固定的重要意义是保存组织细胞的抗原性，使抗原不发生弥散和抗原性丧失。若固定不良在以后的过程中将无法纠正。通常使用4%的中性缓冲福尔马林作为固定剂，固定液量要充足，一般为组织块总体积的4～5倍。尽快固定，时间8～48小时，穿刺活检标本应尽量固定6小时以上，条件不允许的情况也不能少于1小时。
切片的制作
免疫组化切片必须用防脱片，切片厚度以3～4um为宜，薄而平整。切片摊片时组织裱在载玻片的位置非常重要，如果试剂覆盖不到组织就会出现假阳性和阴阳“脸”的现象。组织尽量裱在载玻片中位。采用60℃恒温烤片机烤片1小时以上。时间过短会造成脱片。用于脱蜡的二甲苯要经常更换，保证脱蜡彻底。滴抗体前用免疫组化笔在组织上方下方化横线，划线时不要紧靠组织，以免染色时产生边缘效应。抗体滴量设置一般80μl，组织过大或附阳性对照是抗体滴量设置比平时量多20μl即可。
保持适宜的温度和实验室温
蜡块制备时石蜡应不超过62℃，最好用熔点低的石蜡。实验室温度以25℃为基准，空气温度在40%以上。室温过低会影响抗原、抗体的结合，导致假阴性；温度太高，室内空气干燥会导致抗体孵育过程中干片，实验失败。如果实验室温度过低，可以适当延长孵育时间，温度过高，可适当缩短时间，同时增加空气温度。为防止以上现象的发生，将整个过程把切片放在湿盒中再置于37℃恒温水浴箱中进行可以防止切片干燥而导致失败，又能解决对实验室温度难以达到要求的问题。
抗原的修复
组织经福尔马林固定经常会引起蛋白质结构的改变而导致抗原决定簇被封闭，阻碍了抗原、抗体的结合。采用适合的抗原修复技术使抗原决定簇充分暴露，可以提高抗原的敏感性，染色结果要强于不修复。常用的抗原修复技术方法有微波加热修复法、高温高压修复法、酶消化法。推荐方法：微波抗原修复法，抗原修复液以柠檬酸缓冲液(PH6.0)为佳。即微波高温加热3分钟后(加热至沸腾，92℃～95℃)，勿拿出切片待20分钟后温度降至室温，用PBS液冲洗3次后进行下一步骤。
制片质量的好坏直接影响着诊断的准确性，正确的操作是病理技术质量控制的基础。因此每位病理技术工作者都应认真对待制片的每个环节。
参考文献
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免疫组化技术范文6
[关键词] 脱钙液；骨组织；免疫组化染色
[中图分类号] R446.4+1 [文献标识码] B [文章编号] 1673—9701（2012）24—0101—03
骨组织内含有大量无机钙盐，结缔组织坚硬，难以直接制片[1]。如果强制切片，在蓝色钙盐背景下，往往无法看清细胞结构，所以需要选择一种能保持骨组织形态结构和染色后有利于保持细胞结构清晰度和对比度的脱钙液。本文研究14%（体积分数）硝酸脱钙液、EDTA脱钙液、PLANK脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响，以期寻找一种效果比较理想的脱钙液，对病理诊断工作提供帮助。
1 材料与方法
1.1 标本选择
12例骨组织标本均来源于我院，切成1 cm×1 cm×0.3 cm的骨块，在福尔马林中性液内固定24 h，用于脱钙及免疫组化染色实验。
1.2 三种脱钙液
①脱钙液Ⅰ：14%（体积分数）硝酸脱钙液，配制方法为14 mL浓硝酸加入86 mL蒸馏水；②脱钙液Ⅱ：EDTA脱钙液，配制方法为EDTA10 g，蒸馏水100 mL，加NaOH充分搅拌溶解，在用10 mol/L的HCl调pH为8.0，最后加入4%甲醛15 mL。③脱钙液Ⅲ：PLANK脱钙液，配制方法为氯化铝10 g，甲酸50 mL，10%福尔马林10 mL，冰乙酸1.5 mL，加蒸馏水至总体积100 mL。
1.3试剂和仪器
硝酸、盐酸、EDTA等化学试剂均购自广州化学试剂一厂，CD3、CD68、Ki—67和TTF—1等抗体购自福建迈新公司，EnVision二步法试剂盒购自DAKO公司。切片机、染色机和切片刀购自英国shandan公司。
1.4 方法
1.4.1 脱钙处理 三组骨组织分别按以下方法进行脱钙处理：将12例骨组织标本平均分为A、B、C三组，并确定所选每份骨组织性质一样，分别将A、B、C组标本放入相对应的脱钙液中，间隔一定时间后更换脱钙液，以标本肉眼观察至半透明状，手感有弹性，大头针可顺利刺进骨组织，无砂粒感为脱钙完成，结合X射线确定脱钙终点。接着进行石蜡切片、免疫组化染色。
1.4.2 免疫组化染色步骤 骨组织固定、脱钙后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋及制成4 μm厚的连续切片，裱片后进行70℃烤片1 h，脱蜡至乙醇溶液，3%（体积分数）甲醇—H2O2封闭内源性过氧化酶10 min，高压锅枸橼酸缓冲液法修复2 min，加入Ⅰ抗，37℃孵育1 h，加入EnVisionⅡ抗，再于37℃孵育30 min，DAB显色1 min，苏木精复染（图像分析所用的切片未染色），脱水，透片，封片，光镜观察。
1.4.3 免疫组化染色结果判定 CD3阳性信号位于细胞膜、CD68阳性信号位于细胞浆、Ki—67和TTF—1阳性信号位于细胞核。于光镜下观察三种脱钙液脱钙骨组织免疫组化标记的结果，未复染的切片做图像定量分析，其方法为：将每种抗体免疫组化染色后的切片放在显微镜下，在同一组的每张切片相同的部位观察10个视野（4种抗体×10=40个视野），被测物质的各种信息通过摄像机将所测目标转换成数字图像，传递到计算机系统，标定组织片空白处入射光的光密度值（OD值），在监视器上用不同的分割方法和编辑功能，计算免疫组化染色阳性细胞平均OD值，其值代表了切片中相应抗原性的相对强度。
1.5 统计学分析
图像分析结果以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 13.0作方差分析。
2 结果
2.1 不同脱钙液对骨组织脱钙时间及效果比较
2.1.1脱钙时间 14%硝酸脱钙液脱钙时间最短。14%硝酸脱钙液
2.1.2脱钙效果 14%硝酸脱钙液脱钙效果最好。14%硝酸脱钙液﹥PLANK脱钙液﹥EDTA脱钙液（表1）。
2.1.3对组织损伤 EDTA脱钙液对组织损伤最小。EDTA脱钙液
2.2 不同脱钙液脱钙对骨组织免疫组化染色结果比较
见表2 。三种脱钙液免疫组化染色图像结果用方差分析进行两两比较，其结果为硝酸脱钙液和PLANK、EDTA脱钙液比较有显著性差异，EDTA脱钙液和PLANK脱钙液比较无显著差异。硝酸脱钙液对组织损伤较大，切片颜色欠鲜艳，细胞核着色弱，组织结构欠清晰。PLANK和EDTA脱钙液脱钙效果较好，显微镜下观察组织结构完整、清晰，色泽鲜艳，对比度较好。
2.3 脱钙后免疫组化染色效果
见表2。见图1～3。
3 讨论
脱钙是指用化学或物理方法将骨组织中的钙盐和胶原纤维分离，除去钙盐，获得完整的胶质纤维成分[2]。骨组织含有大量的钙盐和无机盐，需经过脱钙处理，使组织软化后才能进行切片处理。常用的脱钙剂主要包括单纯酸类、混合酸类、螯合剂等。免疫组织化学对临床病理检查非常重要，因而应选择较好的脱钙液对所选骨组织标本进行较好的脱钙处理，且不破坏细胞和组织结构，形态清楚，进而确保免疫组化染色的效果较好并合适临床需要。
14%硝酸脱钙液是常用于临床脱钙液之一，具有脱钙能力最强、脱钙时间最短等优点。但是，对骨组织脱钙程度较难把握，容易造成过度脱钙现象；同时脱钙后易出现组织肿胀及细胞结构不完整清晰的不良现象。硝酸在脱钙过程产生CO2，气泡从组织中溢出将导致结缔组织分离。另一方面，硝酸对组织进行脱钙时还酸化组织，造成细胞核着色能力下降而返蓝困难进而变成淡红色，对比度差，由于亚硝酸形成使组织变黄而影响其后的染色[3]，在室温条件下更明显。硝酸在溶解骨组织钙盐时也对抗原物质具有破坏性，因而抗原免疫活性降低，免疫组化染色效果不佳[4]。结合本实验验证硝酸脱钙液脱钙后较易影响其后的免疫组化染色效果。
EDTA是科研中常用的脱钙剂，能够与羟基磷灰石结晶的外层钙结合，同时促进内层结合钙向外转移，进而溶解钙盐，是脱钙和免疫组化染色理想的脱钙剂[5]。本实验观察到EDTA脱钙液对骨组织脱钙效果较好，能保持完整的组织结构，且不破坏抗原物质，免疫组化染色阳性细胞数量多、着色深、背景淡。然而，在室温条件下，其脱钙时间过长，脱钙后组织稍微变硬，不太适合临床电镜快速诊断的要求，且其价格较贵，综合而言不利于临床检查工作。目前认为，应用微波技术可促进EDTA的螯合作用，缩短脱钙时间[6]。使用微波技术时应注意固定实验条件、调整微波功率和时间、温度也不能超过60℃等。
本研究表明，与硝酸、EDTA脱钙液比较，PLANK脱钙液具有常温脱钙时间较短、脱钙效果较好，免疫组化染色着色鲜艳、对比度佳、阳性细胞数多等优点。PLANK脱钙液[7]是一种氯化铝、甲酸、甲醛和冰乙酸组成的混合脱钙液，其中甲酸和溶液中的铝离子对组织影响较小，免疫组化染色效果优良。甲醛可加强对组织的固定并具有抗酸浸蚀的作用。冰乙酸能较好保持染色体结构，并能减少酸对细胞核的破坏。其配制成分中，通过增加甲酸的浓度并用冰乙酸辅助，可以加快脱钙速度。常温下PLANK脱钙液快速软化组织，对组织抗原损伤较少，细胞结构清晰完整，加之其脱钙时间较短、配制简单、经济等有利条件，较适合用于临床检查工作[8]。
CD3、CD68、Ki—67和TTF—1等细胞因子多在肿瘤组织中表达，快速准确的病理诊断有利于患者的临床诊治。因而，选择合适的脱钙液成为重要工作环节之一。本实验通过比较14%硝酸脱钙液、EDTA脱钙液和PLANK脱钙液的脱钙和免疫组化染色效果，综合评价认为PLANK脱钙液较适合用于临床快速病理诊断。
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