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凝胶色谱范文1
【关键词】凝胶渗透色谱；农药残留分析；全球经济一体化；监测系统
1 引言
随着经济的不断发展和人民生活水平的不断提高，健康问题已得到社会各界的广泛关注，食品安全问题也提上记事议程，环境的破坏和食品农药残留问题不断涌现，逐渐成为阻碍我国出口贸易发展的屏障。农药是一种农业生产不可或缺的生产资料，在适量的条件下，对生存与农业、林业和畜牧业之间的害虫和细菌有积极的预防作用，也能在一定程度上促进动植物的生长，预防各种虫害，为农业的创收增产和预防传染病方面有不可磨灭的突出作用。在有限的科技手段中，农药仍是预防疾病、增产创收、缓解粮食压力的最快捷、最便利、最廉价、最有效的方法之一。可是，农药也不是面面俱到，农药的使用本身存在着巨大的隐患，由于我国是农业大国，农药的大量长期使用不仅污染土地和大气，还造成生态环境的严重失衡，更严重的是，农药可残留于食物中，使牲畜和人类中毒，产生严重的后果。然而，农药残留的原因复杂繁多：使用了价格低廉，不易分解的农药；使用农药过量；畜牧业药浴；在动物即将宰杀前仍使用农药；饲养牲畜的饲料为受过农药污染的产品等。近日，农药残留分析方法及检测技术得到了突飞猛进的发展，但食品分类复杂以及农药品种的化学性质千差万别，为农药残留分析检测带来了更大的挑战。其中，农药残留分析的样品前处理技术包含先进的固相萃取技术、基质固相分散萃取技术、凝胶渗透色谱技术以及加速溶剂萃取技术等等。这些技术的功能特点不尽相同，有的是专门分析水源和土壤的，有的是分析果蔬的，有的是分析生物样品的，而本文讨论的凝胶渗透色谱技术在大分子样品分离净化脂肪、色素等方面有显著效果。
2 凝胶渗透色谱技术
前处理和测定是农药残留分析处理的主要手段，而分析的关键是样品的前处理问题。凝胶渗透色谱技术大部分使用的是XAD系列的凝胶，其洗脱剂是配比不同的乙酸乙酯和环乙烷，将大小分子不同的多孔凝胶分离，把油脂、叶绿素、聚合物和生物碱等大分子物质首先淋洗处理，分子质小的后淋洗处理。然后将洗脱液收集起来再次进行分析。凝胶渗透色谱分离的关键因素是柱填料，它分为有机凝胶和无机凝胶，这要求其必须具备强韧的机械强度和化学惰性，还要有流动性小，分离广等特点。一般的分离方法有机溶剂消耗量极大，误差也大，从而操作繁琐，而凝胶渗透色谱技术分离样品运用物理方法分离蛋白质脂肪，并且过程简单，误差小。
2.1 凝胶渗透色谱技术的应用原理
检验农药残留的方法颇多，目前主要有两种____生化法和色谱法。生化法操作简单，测速快效率高。色谱法是使用色谱分离技术，选取合适的仪器测定农药残留的方法，也是农药残留检测的常见方法。凝胶渗透色谱技术是根据溶质分子的大小进行分离的技术，它可用于分析化学性质相同但分子体积有差异的同系物质。先用洗脱机把注射进色谱柱中的预处理浓缩样品洗脱分离完成，使样品的形状和分子大小各异，在通过固定凝胶直径使大分子样品首先被洗脱出来，小分子随之被洗脱出来。凝胶渗透色谱是一项十分有发展前景的分子量测量方式的课题，从一开始的生物学向生化、高分子化学、无机化学等广泛扩展领域，可见其应用范围之广泛，渗透领域之普遍，是农药残留分析的关键性的净化方法。
2.2 凝胶渗透色谱技术在农药残留分析中的应用
农药残留分析同时需要灵敏度极高的检测技术和操作精良的方式方法，其难点就是在除掉杂质的时候保持较高的回收率。提取液的选择要根据农药的极性来判断，即极性弱的提取液配备极性小的有机氯农药。，而极性强的农药配备丙酮提取液。对于特殊的复杂基质，如油脂较高的物质常常不能使用较为普遍的液态萃取或者柱层净化萃取法，使用凝胶渗透色谱技术则可以在柱填料和被分离式样无相互作用的情况下按自身大小进行自动分离。值得欣慰的是，此技术完全可以在常温下进行，没有可逆吸附，能使每一个凝胶渗透色谱技术的分离样品完全洗脱。并且凝胶渗透色谱净化法能够排除大分子的干涉，对各种形态大小复杂的基质都适用。
随着科技的进步，农药品种不断增多，溶剂体系也不断加强完善，Bio-Beads SX-3作为凝胶渗透体系的柱填材料也有迅猛发展。我们对凝胶渗透色谱技术在粮食中的应用为例做简要的分析。粮食中包含脂肪，蛋白质，淀粉等多种材料，这位提取农药残留时排除干扰物进入溶剂增加了困难，因此必须用合适的净化手段对基质的干扰进行解除。将研究人员分为ABCD四个小组，A组用凝胶渗透色谱技术对糙米进行净化，对糙米中的有机氯农药和多氯联苯农药进行分析时采用气相色谱技术，测出的平均回收率约为80%-92%。B组还引用了新的气质联用技术，分析检验了玉米中的三唑醇和三唑酮，结果为农药回收率大约为96%-115%。而C组使用凝胶渗透色谱技术净化糙米，对其中可能存在的60多种有机磷农药进行残留分析，其中35种农药回收率在65%-110%之间。D组用词技术净化和气相色谱技术建立大豆中8种二硝基苯胺类除草剂的残留分析方法，去除量很高。又如，运用凝胶渗透色谱技术同样能对水果蔬菜的农药残留净化起到积极作用。实验表明，运用凝胶渗透色谱技术对果蔬进行抽样净化，其中有机磷农药进行分析的结果为回收率67%～105%。
2.3 凝胶渗透色谱技术的缺陷
运用凝胶渗透色谱技术净化的方法是利用分离大分子干扰杂质，最终可将农药从基质中脱离出来，其最终效果的如何与分子大小、形状和阻碍情况有关。但其中也包含一些不可避免的问题。首先，分子分离可能不彻底，这是由于小分子可以被洗脱到农药里，可大分子极可能跟随油脂先流出去，这时便需要使用柱色谱来净化。其次，GPC所耗费的溶剂量很大，这样当柱色谱内直径比较大时，处理较多样品时速度就会减慢，消耗的能量也多。为了避免这一弊端，科学家研制出了自动化的凝胶渗透色谱净化仪，让净化柱更加趋向柱内直径小，载荷量大和体积小的进样发展，使其分离度得到改善，应用范围得以拓宽。第三，其限制的条件较多。基质的选择和情况对化合物的准确定性和定量有较强的影响力，当从事食品样品的残留分析时，必须考虑多种因素才能得到精确的结果，这要求我们既要对基质反复评估又要通过有效途径进行消除和补偿。
3 总结
凝胶渗透色谱技术目前已日臻成熟，其提取和净化方法的研究和实验已十分常见，此方法除了农药外，还被广泛运用到药材、甘蓝、蜂蜜等成分的分析中，其在农药残留方面的贡献还要远大的发展前景。
参考文献：
[1]赵子刚，王建，贾斌.凝胶渗透色谱-气相色谱法检测小麦中的24种农药残留[J].河南工业大学学报（自然科学版），2010（3）.
凝胶色谱范文2
关键词：凝胶渗透色谱（GPC）；食品安全；应用
中图分类号： TS213.4 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/ki.jlny.2017.15.053
随着我国经济的发展和生活水平不断提高，人们对于食品安全问题也日益重视。国家对食品安全检测工作也极为重视。食品安全检测工作最重要的就是样品前处理，样品前处理的好坏直接影响到检测结果的正确性。因此，在食品检测中使用正确的前处理方法，可以提高工作效率和检测结果的准确性。
凝胶渗透色谱是最近十几年迅速发展起来的一种样品前处理方法，因其对分子量大的杂质净化效率高，可重复使用，适用范围广，自动化程度高等特点，在食品检测中应用广泛。
凝胶渗透色谱基于体积排阻的分离机理，通过具有分子筛性质的固定相，来分离分子质量不同的物质。凝胶渗透色谱还可以用于分析化学性质相同而体积不同的高分子同系物[1]。
1 凝胶渗透色谱（GPC）在食品检测中的应用研究新进展
1.1 GPC技术在食品检测中的应用研究新进展
GPC技术常用在食品检测中的样品净化，宋鑫等在检测螃蟹中19种有机氯农药残留时应用全自动GPC-SPE联合净化，样品用乙腈提取，凝胶渗透色谱和氨基固相萃取柱联合净化。用Bio-Beads S-X3凝胶为填料的净化柱，以环己烷―乙酸乙酯（1∶1）为流动相，泵流速为4.7 毫升/分钟，检测波长为254纳米。收集9.0分钟和15.5分钟的流出液，并转至SPE净化。在实验中，对经GPC净化的有机氯农药的收集时间进行了优化，在单独使用GPC时样品净化不完全，与SPE联合使用后净化效果和回收率较好[2]。马杰等建立在线凝胶渗透色谱――气相色谱质谱联用法测定蔬菜、水果中有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯类农药，GPC 弥补了QuEChERS 方法净化干扰物质不彻底的问题， 从而降低分析背景， 改善峰形， 提高分析结果的准确性 [3]。黄武等在检测大豆中异丙甲草胺残留量时用在线凝胶渗透色谱法，进行前处理，简化了样品前处理过程，且对环境污染较少，具有高效、经济、快速及简便等优点，显著提高前处理效率，减少分析时间，提高农药残留分析的速度和灵敏度[4]。
1.2 GPC技术在食品检测研究中存在的问题
GPC技术在国外已经普遍应用于样品的前处理，但在我国应用领域较少。GPC作为食品检测中的一种全新的样品前处理技术，能分离大分子类干扰杂质，有效地将大分子类物质从复杂的基质中提取出来。GPC技术优势是可大大降低大分子基质干扰，自动化和标准化程度高，且可以自动浓缩和定容，减少了人工带来的误差，显著提高方法的精密度和重现性。
但GPC技术作为一种新兴技术，在实际应用中还存在一些问题，需要在今后的工作中解决。由于GPC柱子内径比较大，连续处理样品的能力较慢，所需要的溶剂量较大。又因为所收集的样品体积大，对于实验室的浓缩装置要求较高，这大大减慢了实验分析的速度。此外，由于不同物质分子大小、形状以及凝胶阻滞作用的差异，可能会导致样品分离不完全，较大分子量的物质会提前流出不被收集而影响回收率，一些小分子干扰物会夹杂在样品中而影响净化效果。
2 凝胶渗透色谱（GPC）条件的选择
利用GPC技术进行样品前处理时，所需选择及优化的条件主要是色谱柱的选择，流速的选取以及收集时间的选择，溶剂的选取等。孙磊丽等在测定甘草中16种农药残留时选用填料为中性、多孔的聚苯乙烯二乙烯基苯微球体的S-X3玻璃柱作为GPC净化柱，体积比为1∶1的乙酸乙酯―环己烷溶液作为流动相，流速为5毫升/分钟，前7 分钟收集1份样品，之后每1分钟收集1份样品，共收集28份样品溶液，分别进行质谱检测[5]。吕飞等在检测动物源性食品中17种农药残留时，在线凝胶渗透色谱：色谱柱为Shodex CL NpakEV-200 柱；流动相：丙酮―环己烷（ 3∶7，V/V） ，流速0. 1毫升/分钟，柱温40 ℃，进样量10微升，检测波长210纳米，农药残留组分在线收集时间段：4.35 ～ 6.35分钟[6]。
3 展望
凝胶渗透色谱技术作为一种前处理技术已经普遍应用于样品的净化，S着GPC技术的不断优化应用范围越来越大，国外已经研究出很多种成熟的GPC前处理方法。随着国际形势发展，我国也应该对GPC技术进行研究开发。目前有很多研究都将GPC技术与QuEchERS 前处理等联合使用，使得现在的前处理可以联合处理较为复杂的样品，提高了工作效率和准确度。现在的检测仪器的精密度较高，对样品处理较严格，GPC技术与其他前处理技术联合使用可以去除杂质的干扰，对于精密仪器是一种保护。如在线GPC与QuEchERS联合串联质谱检测可以去除样品里的干扰和基质效应，对样品分析更准确。因此，发展和研究凝胶渗透色谱技术在食品检测方面有广阔的发展前景。
参考文献
[1]栾玉静.凝胶渗透色谱在不同样本检验中的应用和进展[J].刑事技术，2014（04）：41-44.
[2]宋鑫，杭学宇，等.检测螃蟹中有机氯类农药残留的全自动GPC-SPE联合净化气相色谱法[J].职业与健康，2016，32（04）：483-486.
[3]马杰.QuEChERS前处理技术与在线凝胶渗透色谱――气相色谱质谱联用法测定蔬菜水果中20种农药残留[J].食品安全质量检测学报，2016，7（01）：21-26.
[4]黄武. 在线凝胶渗透色谱――气相色谱――质谱联用法检测大豆中异丙甲草胺残留量[J].食品安全导刊，2016，64（03）：126-128.
[5]孙磊丽.凝胶渗透色谱―― 气相色谱串联质谱法同时测定甘草中16 种农药残留[J].分析测试学报，2012，31（12）：136-143.
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【关键词】 高效液相色谱； 薄层色谱； 心可宁胶囊
心可宁胶囊为卫生部药品标准中药成方制剂第九册（WS3B171494）收载的中成药，由丹参、三七、冰片、蟾酥等8味中药组成，主要用于治疗冠心病、心绞痛、胸闷、心悸、眩晕等症［1，2］。为了更好地控制产品质量，保证用药安全、有效，本实验采用薄层色谱法对本品进行质量研究，为心可宁胶囊的质量控制奠定基础。结果如下。
1 仪器与试剂
CAMAG REPROSTAR 3数码成相系统和半自动进样器（CAMAG），Sartorius BP211D电子分析天平（德国），电热恒温水浴锅（北京医疗设备厂），超声清洗器（北京市医疗设备二厂），硅胶G和GF254薄层预制板（浙江台州）。
对照品：华蟾酥毒基（8039202）、丹酚酸B（111562200403）、冰片对照品（110743200504）、胆酸对照品（100078200414）、去氧胆酸对照品（07242000207）均由中国药品生物制品检定所提供，甲醇、乙醚、醋酸乙酯等试剂均为分析纯，水为三蒸水。
2 方法与结果
2.1 冰片的鉴别取本品10粒，倾出内容物，加乙醚10 ml，超声处理5 min，滤过，药渣备用，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯2 ml使溶解，作为供试品溶液。取缺冰片的阴性对照品按供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液。另取冰片对照品，加醋酸乙酯制成每毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。再取冰片药材， 加醋酸乙酯制成每毫升含0.5 mg的溶液， 作为原药材对照溶液。按照薄层色谱法［2］试验，吸取上述4种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以V苯V醋酸乙酯（19∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，在110℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与冰片对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。而空白对照品在与对照品相应位置上，无相同颜色的斑点。结果见图1。
2.2 丹参的鉴别取［鉴别］（1）项下的药渣，加甲醇100 ml超声提取15 min，滤过，滤液作为供试品溶液。取缺丹参阴性对照品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液。另取丹参药材1 g，加甲醇10 ml，同法制成，作为原药材对照溶液。再取丹酚酸B对照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法［2］试验，吸取上述4种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以V甲苯V醋酸乙酯V甲醇V甲酸V水（4∶8∶1∶4∶6）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，于紫外波长254nm下观察后，再喷以1%三氯化铁乙醇溶液显色，于可见光下观察供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。而空白对照品在与对照品相应位置上，无相同颜色的斑点。结果见图2。
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2.3 蟾酥的鉴别取本品10粒，倾出内容物，加氯仿30 ml超声提取15 min，滤过，滤液置分液漏斗中，加氢氧化钠液（0.1 mol/L）20 ml。轻轻振摇，弃去氢氧化钠液；氯仿液用水20 ml洗涤，弃去水洗液，氯仿液用无水硫酸钠脱水，回收氯仿，残渣加乙醇0.5 ml使溶解，作为供试溶液。取缺蟾酥的阴性对照品按供试品溶液的的制备方法制备阴性对照品溶液。另取蟾酥0.2 g，磨细，用氯仿30 ml超声提取15 min，滤过，滤液回收氯仿， 残渣用乙醇10 ml使溶解，作为原药材对照溶液。再取华蟾酥毒基对照品，加乙醇制成每毫升含0.05 mg的溶液，作为对照品溶液。 照薄层色谱法［2］试验，吸取供试品溶液5 μl，对照品溶液3 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以V氯仿V丙酮-V环已烷（3∶3∶5）为展开剂，二次展开，展距分别为8 cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色，于可见光下观察。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。而空白对照液在与对照品相应位置上，无相同的斑点。结果见图3。
1.冰片对照品 2.冰片原药材 3和4.供试品 5.阴性样品
图1 冰片鉴别图谱（略）
2.4 牛黄的鉴别取本品10粒，倾出内容物，加10 ml乙醇超声提取10 min，加少量活性炭脱色，滤过，置水浴 上浓缩至约1 ml，作为供试品溶液。取缺牛黄的阴性对照品按供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液。取牛黄原药材0.1 g，同法制备原药材对照溶液。取胆酸和去氧胆酸对照品各2 mg，置5 ml量瓶中，加乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。按照薄层色谱法［2］试验，吸取上述4种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以V氯仿V醋酸乙酯V甲酸（16∶9∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热10～15 min，于紫外光灯365 nm下观察。供试品色谱中，在与对照品、原药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而空白对照液在与对照品相应位置上，无相同颜色的斑点。结果见图4。
图2 丹参鉴别图谱（略）
图3 蟾酥鉴别图谱（略）
图4 紫外光灯365 nm下牛黄鉴别图谱（略）
3 讨论
本研究在原部颁标准的基础上在提取方法和指标以及展开系统等因素的选择上进行改进提高。丹参的鉴别，由于制备工艺只采用了水提，故参照2005年版《中国药典》Ⅰ部中丹参项下的鉴别要求，对丹参的水溶性活性成分丹酚酸B进行鉴别研究，蟾酥鉴别增加了华蟾酥毒基对照品为指标进行分析；冰片的鉴别在原来理化鉴别的基础上增加了薄层色谱鉴别，牛黄鉴别增加了去氧胆酸对照，并对展开条件进行优化，色谱更加稳定、清晰。这些都进一步完善了心可宁胶囊的定性鉴别。
本文方法操作简易，重现性好，专属性强，为心可宁胶囊的质量标准进一步完善奠定了良好的基础，如能建立相应的含量控制指标，则会更加完善，这有待进一步研究。
参考文献
凝胶色谱范文4
关键词： 凝胶色谱法；凝胶电泳法； 血红蛋白
G633.91
DNA和蛋白质技术包括DNA的粗提取与鉴定、PCR技术和血红蛋白的提取和分离等，是开展分子生物学研究的基本技术。蛋白质是生命活动不可或缺的物质。血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中的氧气和二氧化碳的运输。
一、 血红蛋白蛋白质提取和分离的原理
血红蛋白蛋白质提取和分离的原理是根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以分离不同种类的蛋白质。
二、 血红蛋白蛋白质提取和分离技术方法有凝胶色谱法和电泳法。
凝胶色谱法是根据分子量的大小来分离蛋白质的，而电泳法是根据各种分子带电性质的差异以及分子本身形状、大小的不同来把蛋白质分离开的。
1. 凝胶色谱法
凝胶色谱法分离蛋白质的原理：在多孔球体的凝胶内，蛋白质相对分子质量的大小不同，大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子通过凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。相对分子质量的不同蛋白质因此得以分离。凝胶材料是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。
2.凝胶电泳法
电泳法是带电颗粒在电场中向电荷相反的电极移动的现象。凝胶电泳法原理是：不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向和阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同，因而可聚集形成不同的条带，因而达到分离的目的。影响蛋白质分子运动速度的因素中，蛋白质的电荷性质决定蛋白质运动方向，蛋白质带电荷量的多少决定电场作用力的大小，分子形状和大小形成阻力大小，蛋白质的运动速率由电荷量、分子形状和分子大小共同决定。
实验探究 蛋白质为什么带有带电荷？
蛋白质是由氨基酸组成的，还有一个羧基和一个氨基，在一定的PH下，蛋白质可解离的基因会带上电荷。
三、实验操作步骤
蛋白质的提取和操作一般分为五个阶段：材料的选择和预处理、粗分离（细胞的破碎）、提取、纯化（包括盐析，层析，有机溶剂提取，有机溶剂沉淀等）和浓缩干燥及保存。我们取哺乳动物红细胞（猪的新鲜血液）为材料，来进行血红蛋白的分离方法。
1.样品处理及粗分离
⑴ 样品前处理 包括细胞的破碎有机械方法、物理方法和化学及生物化学方法。
⑵ 细胞器的分离 从样品水溶液中提取、用有机溶剂提取、利用表面活性剂提取和对提取物进行保护。
①样品分离器材：离心机，0.9%的NaCl溶液和20mmol/L的磷酸缓冲液。
②步骤包括：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液和透析。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心（500r/min离心2min），然后用胶头吸管吸上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的0.9%的NaCl溶液，缓慢搅拌10min，低速短时离心，如此重复洗涤三次，直至上清液不再呈现黄色为止。将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。然后转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min，就可以明显看到试管中溶液分四层，从上往下数，第一层为无色透明的甲苯层，第二层为白色波层固体，是脂溶性物质沉淀层，第三层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第四层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的分层液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，静置后分出下层的红色透明液体。取1mL血红蛋白溶液装入透析袋子中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度20%mmol/L的磷酸缓冲液中（PH为7.0），透析12h即可。
⒉ 凝胶色谱操作
⑴凝胶色谱柱的制作 取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端磨平。玻璃管两端色上合适的橡皮塞，中间打孔，孔径为0.5mL插入移液管，在色V柱下端用移液管头部作出口部位，连接一细的尼龙管，用螺旋塞控制尼龙管的打开与关闭，尼龙管的另一端放入收集色谱液的收集器内。
⑵ 凝胶色谱柱的装填凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成配成凝胶悬浮液，在于下端连接的
尼龙管打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，轻轻敲动色谱柱使凝胶装填均匀。并立即用20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤，使凝胶装填紧密。
⑶血红蛋白样品的加入和洗脱 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平，关闭出口。用吸管小心地将透析后的样品加到色谱柱的顶端，并打开下端出口，是样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，并加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当的高度，连接洗脱瓶，打开下边出口，进行洗脱。待红谱柱接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，连续收集。
⒊ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
⑴原理 蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。
聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。
⑵具体操作包括：①红细胞的洗涤 ；②色谱柱填料的处理；③凝胶色谱柱的装填；④蛋白质的分离。
凝胶色谱范文5
【关键词】：中药材 色谱法
【中图分类号】R45;R96【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2008)4-0044-04
我国中药材品种繁多､资源丰富药用动植物达1万余种，在当今世界“回归自然”思潮影响下，寻找天然药物的呼声日渐高涨，因而对于我国这样的中药材大国首要任务是建立一套切实可行的鉴别方法和质量保障体系。很多中药材形态相似，加工处理后形态结构易发生改变，目前采用的经典植物鉴定，性状鉴定和显微鉴定等研究方法由于鉴定标识建立在个体形态和客观观测水平上，因而存在主观性强､重现性和稳定性差等不足[1]。而分子标记技术又存在方法不够完善，资料不丰富，成本偏高无法推广到生产第一线的缺点[2]。相比之下，色普法已成为中药材鉴定中不可缺少的常规而有效的方法，尤其是对成分复杂的中药材有分离分析鉴定的双重优势。随着化学分析色谱技术的成熟和广泛应用，20世纪70年代，人们将中药中的化学成分展开于由各种不同载体制成的薄层板､纸片､胶片等物体上，不同的生药成分显现出不形状，颜色的斑点或条纹等，人们可根据斑点或条纹的位置(Rf值)､颜色､数目等特征来鉴别生药真伪和质量，从而创立了色谱法。目前常用的色谱法有薄层色谱法､气相色谱法､纸色谱法､高效液相色谱法､毛细管电泳和凝胶电泳等。
1 薄层色谱法(TLC)
薄层色谱(TLC)由于操作简单､直观､经济､适用范围广阔，在中药鉴别中应用频率最高。目前，常用的薄层色谱法有高效薄层层析法､薄层扫描法和反相薄层色谱法等[3]。
1.高效薄层层析法(HPTLC)：HPTLC的薄板采用更加细致均匀的吸附剂用喷雾法制成，提高了分离效果，增强了重现性。张虹将榧属植物叶的提取物经TLC法初步分离，再用HPTLC法测定紫杉酸的含量，具有良好的回收率，可用于定量检测[4];米莉莉等用高效薄层色谱扫描法对天然虫草与人工虫草菌丝体中核苷类有效成分进行含量测定，同时建立了不同虫草样品的荧光淬灭薄层色谱图谱[5];伍庆等用HPTLC法建立了快速测定知母药材中菝琪皂苷元的方法[6];曾长青等用高效硅胶薄层板对动物药不同蛇胆胆汁酸的14种组分进行测定，发现有相似组成[7]。
1.薄层扫描法(TLCS)：应用薄层扫描仪将薄层板转换成薄层图谱的方法叫做薄层扫描法(TLCS)[8]。TLCS所得到的图谱比目测的层析图谱更为客观准确。张尊听等以高效薄层色谱扫描法测定野葛根中游离葛根素和总葛根素含量[9];苏淑分等使用薄层扫描法测定不同品种和产地化甘草并建立了指纹图谱，可以快速的对药材品质作出评判[10];颜玉贞等完成了黄连的指纹图谱研究[11];苏微微等完成了黄参的薄层扫描指纹图谱[12]。
1.3 反相薄层色谱(RPTLC)：当薄层色谱中流动相的极性大于固定相极性时，就形成了反相薄层色谱(RPTLC)，RPTLC主要用于极性成分复杂的药材样品。张子忠等对不同产地不同时间采收的蔓荆2种》荆素和对羟基苯甲酸进行了RPTLC定量分析比较考察了多种因素对结果的影响，同时优化了实验条件，用于蔓荆子中上述两种成分分析前者回收率93.9%，后者回收率91.2%[13]。
2 气相色谱法(GC)
气相色谱法(GC)以气体为流动相，适合于挥发性成分或通过衍生化后能汽化的成分的定性定量分析，有灵敏度高､操作简便､样品无须化学前处理､提供信息量大等优点。目前使用频率较高的有裂解气相色谱(适用于不挥发成分)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)等。
2.裂解气相色谱：该发将样品放入裂解器内，在一定条件下加热样品使其瞬间裂解，生成可挥发的小分子，立即被载气带入气相色谱系统分析拄上，分离后得到裂解气相色谱图。袁敏等用此法比较了不同产地连翅的气相色谱图，13种样品的色谱图近似，重叠率达89%以上[14]。
2.气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)：将气相色谱与质谱联合使用的一项技术即为GC-MS。徐勤等GC-MS对前胡中的白花前胡丙素，丁素和紫花前胡苷的含量进行研究，发现前胡两种标准药材的图谱差异显著，证实了药典前胡的2个品种化学成分不同的说法[15];魏刚等采用GC-MS法对不同产地广藿香､组织培养广藿香､超临界提取广藿香､广藿香对照品共21品种进行了组分分析，发现石牌藿香与高要海南藿香相比，11个成分相对含量均有显著差异，而高要与海南藿香无明显差异[16];徐春艳等用此法测定出黄连与肉桂配伍后桂皮醛含量下降，下降程度与黄连比例有关[17];梁永枢等在水蒸气蒸馏法提取的挥发油中，用GC-MS对其成分进行分析，分离出20个组分，鉴定出其中的6种组分，并首次从沉香挥发油中分析得到Guaiol和α-Copaen-11-ol[18]。
3 纸色谱
纸色谱(纸上层析)属于分配色谱的一种。主要用于多功能团或高极性化合物如糖､氨基酸等水溶性成分的分析分离。目前在中药材中应用较少。
4 高效液相色谱法(HPLC)
HPLC和其他分离方法相比有柱效高､灵敏度高､分离迅速性和重复性好等特点，若配以不同的检测器，可对多种药物成分进行分析，一般用于含量测定，也可根据特征色谱峰进行定性分析[19～20]。曾宪仪等用HPLC法测定枳壳､枳实中辛弗林和N-甲基酪胺的含量，结果发现枳实中辛弗林和N-甲基酪胺的含量高于枳壳[21];曹爱民等用HPLC法测定出了决明子中大黄酚含量，含量测定结果线性关系良好，平均回收率99%[22];杨国红采用HPLC法对中成药两个制剂中桂皮醛进行测量，样品量在0～0.15范围内呈线性关系，表明本法适用于对含桂皮醛成分的中成药进行质量控制[23];另有文献建立连翘､红花､刺五加等的HPLC指纹图谱，以鉴别区分不同来源､不同产地中药材[24～25]。HPLC与现代检测器相结合又产生了一些新技术：液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)，Park等用HPLC-ELSD法同时分离和测定了人参皂甙Rb､Rc､Rd､Re､Rf､Rg和Rh等[26];液相色谱-质谱(LC-MS)，Van Breemen等首次将LC-MS技术用于人参粗提取物中的人参皂甙[27];反相高效液相色谱，张丽艳等用此法测定喜树碱含量随生长月份增加而递增规律，为药材采收时间的确定提供了依据[28]。
5 高效毛细管电泳(HPCE)
HPCE是20世纪末发展起来的一种高效快速分离技术，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物[29]，有分离模式多､分离效率高､速度快和分析范围广阔的特点。王演以HPCE法对不同属群大青叶药材的理化特征进行分析，发现异地栽培的不同属群大青叶药材的化学成分和含量差异显著[30];沈阳等测定不同种类甘草药材中甘草酸的含量程良好线性关系，本法适用于甘草酸含量的测定[31];张朝晖等用高效液相色谱法测出大海马､线纹海马､刁海马､刺海马､小海马､贡氏柄颌海龙､三斑海马､粗吻海龙､海鱼､拟海龙､尖海龙和宝珈海龙12种海马海龙类药材的电泳图谱，为海马海龙类药材鉴定提供了依据[32]。等提取菟丝子种子植物蛋白用高效液相色谱法进行生药鉴定，结果表明，同属不同种菟丝子的碱溶性和酸溶性蛋白在成分和含量上均有显著差异，根据其种子植物蛋白的电泳图谱可有效鉴别菟丝子的来源[33];孙国祥等用HPCE法对射干的水提取液进行指纹图谱研究，计算出不同产地射干的CEFP的相思度(S)大于0.92，证明不同产地的射干在化学成分的分布上是十分相似的[34];王实强等采用HPCE，用外标峰面积法测定婴栗壳中可待因吗啡和婴栗碱的含量取得了满意的效果[35];丁原菊等采用高校毛细管电泳法对紫柴胡中柴胡皂甙a与d对映体进行分离和测定取得良好的结果，柴胡皂甙a与d的回收率达97.1%[36]。
6 凝胶电泳
凝胶电泳技术自20世纪80年代初传入我国，石俊英教授等率先将现代生物技术与传统的中药学科相接合，经多年潜心研究和实践，创建了“中药电泳鉴别法”新技术，并在动植物类中药材鉴别中广泛应用。目前重要的电泳鉴别多集中在蛋白质的鉴别上，蛋白质又分为贮藏蛋白和同功酶两种。
6.贮藏蛋白电泳(凝胶蛋白电泳)：不同蛋白质因存在分子大小空间结构和电荷数目上的差异，可以通过电泳得到分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)与其他分析手段相比具有分辨率高､性能稳定､凝胶孔径可调等优点，是目前常用的蛋白质分离分析手段。金跃明等用缓冲叶提取样品中蛋白质，在10%连续的SDS-PAGE凝胶上进行电泳，结果鹿鞭与其主要伪品牛鞭的电泳图谱有明显区别，不同品种鹿鞭电泳图谱也有明显区别[37];赵华英等应用蛋白质电泳得出青葙子､牛膝子､鸡冠花子､皱果苋子､苋子和反枝苋子的6种种子电泳图谱，准确的鉴别出了苋科6种种子类药材[38];赵晓荣等用蛋白质电泳得出了马鹿鞭､海狗鞭､黄狗鞭和海象鞭的清晰图谱，准确的鉴别出了4种鞭类药材，还观测出黄狗鞭与马鹿鞭样品图谱极为相似，从而提出用黄狗鞭代替马鹿鞭的设想[39];李锋等用SDS-PAGE法对羚羊角山羊角､黄羊角､绵羊角和藏羚羊角急性了电泳图谱比较，发现各样品有不同的蛋白质成分，成功的区分了这5种角类药材[40]。
6.同功酶电泳研究：同功酶是指催化作用相同而分子结构不同的一组酶，它存在于同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中。同功酶的结构差异来源于基因差异，能稳定的遗传给后代。因此可以根据同功酶分子结构差异用电泳法来分离。常由于电泳法分离的同功酶有乳酸脱氢酶同功酶､过氧化物酶同功酶和酯酶同功酶等。
6.2.乳酸脱氢酶(LDH)同功酶：20世纪50年现乳酸脱氢酶以来[41]，同功酶用于动植物的分析鉴别也紧随而至。李大均采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对巨蜥的血清､脑､肾､肝､心肌､骨骼肌和小肠的乳酸脱氢酶(LDH)同工酶进行分离和测定.结果表明，LDH同工酶具有明显的组织特异性[42];任文华等采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对刺猬(Erinaceusdealbatus)及游蛇科的黑眉锦蛇 (Elaphetaeniura)､红点锦蛇(E.rufodorsata)和赤链蛇(Dinodonrufozonatum)等在冬眠期和活动期骨骼肌､心肌､肝等的乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)同工酶谱进行了分析，并用比色法测定了以上各种组织的LDH活性，结果表明：LDH同工酶的电泳图谱只有红点锦蛇的肝和骨骼肌中存在活动期和冬眠期的明显差异，在其余动物两个时期的组织中未表现出明显变化，刺猬的肝脏LDH活性在冬眠期显著地高于活动期，而其余的动物组织冬眠期LDH活性均显著低于活动期，三种蛇类组织LDH4均未见表达[43]。
6.2.过氧化物酶(POD)同工酶：在高等动植物中，过氧化物酶广泛而大量的存在着，并有较多的同工酶。李桂兰采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳对菘蓝不同器官的POD同工酶进行分析测定，发现菘蓝的POD同工酶酶谱具有一定的器官特异性和稳定性，并且同工酶变化与生物的生长发育之间具有特异性关系，可为生物生长发育的调控研究提供参考[44];于晶等用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术对不同种源黄芩过氧化物同工酶进行研究，再利用过氧化物同工酶谱带聚类分析，可为不同种源黄芩的划分提供参考[45];陈文强等采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对天麻3种变型的过氧化物酶(POD)的同工酶进行了研究结果表明，天麻3种变型的过氧化物酶的同工酶活性不同，酶谱条带数在5～7条之间，且具有特征谱带.其中乌天麻和红天麻的酶谱条带数相同，两者的酶谱条带数均多于绿天麻;绿天麻､乌天麻和红天麻的酶谱条数依次分别为5条､7条和7条;其中基本酶带有5条，Rf值分别为0.06､0.24､0.83，0.89､0.98;乌天麻与红天麻的相似度指数为0.86，说明这两个种亲缘关系近;乌天麻与绿天麻的相似度指数为0.71，反映它们之间的亲缘关系相对较远[46]。
6.2.3 酯酶同工酶：酯酶同工酶是一类水解酶，能催化分子中酯键，酯酶同工酶在动植物体内广泛分布。张丽萍等用同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳快速简便的鉴别了蒙古黄芪和膜荚黄芪种子，为蒙古黄芪种子真实性的检验提供理论依据[47]。
综上所述，色谱法在中药材分析和鉴别中的应用已达到一定水平，但仍然存在一些不足，需要我们在逐步探索中去改进，从而达到更有效､更简便的鉴别中药材的目的。
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凝胶色谱范文6
中图分类号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）02-0339-02
[Abstract]Lactoperoxidase has a natural antibacterial activity， which could be widely applied to food and had good antimicrobial antiseptic effect， such as Dairy and meat products， etc. The paper mainly reviewed the separation and pufication technology of lactoperoxidase including ？salting-out method， ultrafiltration method， coupling aqueous two-phase technology and chromatography technology.
乳过氧化物酶（lactoperoxidase，简称LP）是过氧化物酶的一种，是存在于动物乳中的一种天然抗菌物质，常见于哺乳动物的乳腺、唾液腺、泪腺及其分泌物中[1]。乳过氧化物酶在食品行业中应用最广泛的是乳制品，还可将其应用到医药和肉制品行业中，具有较好的抑菌防腐效果。本文主要综述了分离乳过氧化物酶的盐析法、双水相萃取技术、膜分离技术以及色谱技术等。
1.盐析法
盐析沉淀法是酶分离纯化过程中最常用的方法，其原理是在高浓度的盐溶液条件下，大量盐离子使水分子浓度相对降低，蛋白质水合作用减弱，分子间相互凝聚沉淀析出，由于蛋白质水合作用与蛋白质本身的分子量、等电点等物理化学常数有关，所以在不同盐析条件下，不同种类的蛋白质发生聚集沉淀析出程度也不同，因而达到分离目的。盐析法具有操作方法简便、无需大型昂贵设备和成本低安全性高等特点，适用范围十分广泛。通常把硫酸钠、硫酸镁、柠檬酸钠、硫酸铵等用作盐析剂，国内有报道用硫酸铵盐析法分离大豆酸沉蛋白、羔羊皱胃酶和多管藻R-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白。盐析法分离乳过氧化物酶还是较新的技术。
2.双水相萃取技术
双水相萃取体系是由两种聚合物或是一种聚合物和一种盐组成的，其原理是依据物质在两相间的具有选择性分配系数，当物质进入双水相体系后，由于生物分子量大小、电荷作用和各种力（如疏水键、氢键和离子键等）的存在和环境之间的相互影响作用，使物质在上相和下相中的分布状态不同（即分布浓度不同），形成双水相体系。提取某一物质，只需选择适宜的双水相体系，控制合适的条件（pH、双水相体系物质含量等），就可以得到适宜的分配系数，从而达到分离提取的目的[1]。与传统的提取方法比较来看，双水相萃取技术所使用的设备便捷、快速、经济，被分离物质在温和条件下进行快速分离，其获得产品的回收率和纯度较高。目前，双水相萃取技术已广泛地应用于蛋白质和核酸等生物活性产品的分离提取，并逐步走向工业化生产进程[2]。它为生物分子提供生物兼容的环境，具有连续操作空间，易于扩大生产的优点。国内有研究报道双水相法提取脂肪酶、糖化酶、淀粉酶等，但是没有应用双水相法提取乳过氧化物酶。利用双水相技术，优化提取牛乳中过氧化物酶提取的工艺条件，为双水相技术在乳过氧化物酶提取分离方面应用，提供基本的技术支撑，有很重要意义。
3.膜分离技术
膜分离技术是一项新兴的高新技术，具有能耗低、分离过程中物质不发生相变、操作简便、无二次污染、分离产物便于回收且分离效果佳等优点，已被广泛应用于工业中的产品分离、纯化等。常见的膜分离技术有微滤膜、超滤膜、纳滤膜、反渗透膜及离子交换膜[13]。膜分离技术已广泛的应用的乳品工业中，主要应用于乳清蛋白分离回收、乳清脱盐、除菌、酪蛋白浓缩、乳蛋白质分级分离等。膜技术主要是陶瓷膜技术分离酪蛋白和乳清蛋白以及超滤膜技术纯化乳过氧化物酶。
4.色谱分离
色谱分离技术又称层析技术分离，是一种用于分离成分复杂混合物中各个组分的有效方法。原理是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具备不同的分配系数，物质在两相体系作相对运动时，会随流动相一起运动，并在固相和流动相间进行多次反复的分配，从而使各物质达到分离纯化的目的。应用于乳过氧化物酶分离的色谱技术可分为离子交换层析、亲和层析、凝胶层析、吸附色谱和分配色谱等技术，此技术比较成熟，详细介绍一下。
4.1 离子交换层析分离技术
离子交换层析中，基质由带有电荷的树脂或纤维素构成，带有负电荷的为阳离子交换剂，反之为阴离子交换剂。离子交换色谱法分离蛋白质组分原理是依据不同蛋白质组分在一定条件的溶液中带有相应的电荷，根据蛋白质带电荷状态不同会与带相反电荷的离子交换剂的结合，按结合力的大小，在洗脱时从弱到强依次被洗脱下来而得以分离。
4.2 离子交换膜色谱提取乳过氧化物酶
Clovis K. Chiu等（1997）使用固定化磺酸根阳离子交换膜从乳清中分离乳过氧化物酶，此法优点是速度更快，相对于离子交换色谱柱，膜分离使用更小的尺寸；缺点是生产越多的目标物就需要越多的膜，增加生产成本，难以大量生产。Kerstin Plate等2006年提出了用带有阳离子的选择性吸附膜Sartobind S从生产酪蛋白所剩下的的乳清中来提取乳过氧化物酶，此法具有生产快的优点，适用于工业上大规模的生产。Linda Voswinkela等2011年提出使用阴阳离子交换膜色谱法（Sartobind Q and S nano），分两个步骤（先过阴离子交换膜未吸附物质再过阳离子交换膜）通过改变不同的缓冲液及pH值和洗脱液浓度从牛乳清中快速分离BSA，β-lactogloulin，ImmunoglobulinG，lactoperoxidase，lactoferrin多种蛋白，此法生产周期短，适用于工业生产。
4.3 免疫亲和层析（affinity chromatography）
将具有高度特异亲和性的二种物质之一以共价键形式结合到固定相，通过利用与固定相键合的物质具有不同程度的亲和性，将具有特异亲和性的物质成分与其他杂质分离的色谱法。1989年Bodil Langbakk等人使用一种免疫亲和色谱（配基结合免疫球蛋白G）从人乳中分离LP，其过程中LP和配基发生结合，利用含有2% SDS、pH 6.8和0.1 mol/L磷酸钠缓冲溶液，将乳过氧化物酶洗脱下来，从而分离纯化出纯度较高的乳过氧化物酶[3]。
4.4 凝胶层析
凝胶层析又称分子筛，按照分离纯化的物质是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，凝胶色谱又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。GFC主要是根据被分离样品中各组分分子质量大小的不同而进行分离洗脱的一项高效的色谱技术。1963年Peter Z首先使用离子交换色谱从牛乳中分离出LP，之后使用凝胶色谱进一步纯化分离得到纯度较高的LP[4]。2011年，Y. Morita等人以牛奶碱性蛋白为原料，将碱性蛋白溶解于磷酸钠缓冲溶液，先使用SP-Sepharose填料平衡分离，并用0-1.5M NaCl进行洗脱，将所得分离物质收集再使用HiLoad 16/60 Superdex 75 pg进一步纯化得到高回收率的乳过氧化物酶。
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