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胃蛋白酶范文1
关键词：鲤鱼鳞；胶原肽；酶解；特性
中图分类号：Q593 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-04-0076-2
在中国，渔业是发展较快的产业之一。目前，我国水产品产量占世界水产总量的70%左右。虽然我国的水产养殖业发展很快，但在水产加工和利用方面还相当落后。每年水产品加工过程中的下脚料达到100万吨，少部分用于加工鱼粉，大部分被废弃。不仅对环境造成严重的污染，而且对于资源也是极大的浪费 [1]。
鱼鳞是鱼类的皮肤经长期进化形成的，起到保护作用。鱼鳞占鱼体重量的1-5%[2]。一般分为骨鳞，硬鳞和鳞[3]。鲤鱼鳞属于骨鳞。主要由灰分和蛋白质组成，与骨的成分相似。蛋白质占鱼鳞质量的50-70%[4]，以胶原蛋白为主，还含有少量杂蛋白。
胶原蛋白又称胶原，起到保护机体、支持器官的作用，是一种重要的结构蛋白。胶原蛋白的分子量为300KDa，是大分子蛋白质，不能被人体和皮肤直接吸收，将其直接应用于食品、医药等方面效果不好。而胶原蛋白肽分子量较小，呈线性结构, 在小肠中吸收率高达95-100%[5]，且与皮肤有很好的亲和性。本文以鲤鱼鳞为原料，确定鱼鳞胶原肽的水解工艺，并对其特性进行初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲤鱼鱼鳞（购于本地市场）；胃蛋白酶中国惠世生化试剂公司其他试剂均为分析纯的常见实验室药品。
1.2 仪器与设备
电子天秤，SHIMADZU corp oration JAPAN；低速自动平衡离心机，北京雷勃尔离心机公司；79-2型双向磁力搅拌器，江苏省金坛市荣华仪器制造公司；电子恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器公司；pH计，上海精密科学仪器公司；冷冻干燥机FD-IC-50，北京博医康仪器公司；紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器公司。
1.3 试验方法
1.3.1 鱼鳞前处理 （1）浸酸的工艺流程：鱼鳞清洗加20倍体积0.4mol/L盐酸浸泡36h（搅拌）蒸馏水冲洗干燥备用。
（2）浸碱的工艺流程：浸酸后的鱼鳞加15倍体积0.2mol/L氢氧化钠溶液浸泡12h（搅拌）蒸馏水冲洗干燥备用。
1.3.2 鱼鳞酶解工艺流程 处理后鱼鳞胃蛋白酶水解灭活离心取上清液离子去除冷冻干燥成品。
1.3.3 胶原肽的酶解工艺研究 根据使用说明胃蛋白酶的最适条件和预试验结果采用L16(44)正交试验，确定最佳的水解条件。如表1所示
表1 胃蛋白酶水解鱼鳞粗胶原正交试验因素水平表
1.3.4 水解度的测定 选用pH-Start法[6]，水解度表示水解的效果以及进程，并能确定酶解终点。
向水解液中滴加已知浓度的氢氧化钠溶液，保持pH值不变，记录下消耗碱液的体积，即可求得。水解度的公式为：DH(%)=（B×Nb）÷（α×Mp×htot）×100%。式中：DH―水解度；Nb―NaOH的摩尔浓度（mol/L）；B―消耗碱量（ml）；MP―底物蛋白的质量（g）；htot―每克蛋白质底物具有的肽键毫摩尔数，胶原蛋白取8.41；α―α-氨基的平均解离度，公式为：α=10pH-pK÷(1+10pH-Pk)，pH―水解液的酸碱度，pK―-NH3的解离常数。
1.3.5 分子量的分布的测定 采用SDS-PAGE凝胶电泳的方法[7]。
制胶：采用不连续凝胶系统，将15%的分离胶配置好后离心10min，滴加到玻璃板中间，高约8cm，用水封，30min后吸干水，再滴入4%的浓缩胶，至距顶部0.5cm，用水封，30min后吸干水，放置30min待胶体内部全部凝固。倒入电泳缓冲液，没过胶板0.5cm以上。
加样：固体样品1g与样品溶解液3mL混合，离心后取上清液，取样量为25μL。
通电：开始时18mA，进入分离胶后加至30mA，样液距底部1cm时停止。
染色：用考马斯亮蓝染色液进行染色4-6h。
脱色：用冰醋酸、甲醇混合溶液脱色10-20h。
1.3.6 特性的研究 （1）抗氧化能力的测定：采用邻苯三酚自动氧化法进行测定[8]。
样品氧化速率的测定：取0.2mL10mg/mL样品溶液与5 mL0.05mol/LpH为8.20的Tris-HCl缓冲溶液混合，25℃保温10min，与25℃0.1mL2.5mmol/L的邻苯三酚混合，在321nm处每隔30s测一次吸光值，连续测定3min。
空白样品氧化速率的测定：蒸馏水0.2mL与5mLTris-HCl缓冲溶液混合，25℃保温10min同样与0.1mL2.5mmol/L邻苯三酚混合在325nm处连续测定3min[16]。
抑制率计算公式如下：SA%=（V0-VS）÷V0×100%
V0，VS表示空白组和样品组的邻苯三酚自动氧化速率。
（2）羟基自由基的清除能力测定：采用分光光度法[9]。取三支试管加入1mL9mmol/L水杨酸-乙醇溶液和1mL 9mmol/L的FeSO4混合，向其中两支试管中分别加入1mL10mg/mL的样品液体和1mL蒸馏水，再分别加入1mL的8.8mmol/L的H2O2，37℃反应30min。在510nm测吸光度记做AX和A0。第三支试管中加入除H2O2以外所有试剂和1mL蒸馏水，并在同条件下测定吸光度，结果记做AX0。计算公式为：
清除率（%）= [A0-（AX- AX0）]÷A0×100%
（3）DPPH•清除能力的测定：采用分光光度法[10]，室温下放置30min，在516nm处测定以下样品配比的吸光度。
2.0mL70%的乙醇溶液与2.0mL 2mmol/L的DPPH•乙醇溶液混合，测吸光度记做A1。
2.0mL的10mg/mL样品与2.0mL70%的乙醇溶液混合，测得的吸光值为A2。
2.0mL的10mg/mL样品与2mmol/L的DPPH•乙醇溶液2.0mL混合，测得的吸光值记做A3，计算公式为：清除率（%）=[1-( A3-A2)÷A1]×100%。
2 结果与分析
2.1 胶原肽最佳条件的确定
表2 胃蛋白酶水解鱼鳞粗胶原参数正交试验设计与结果
由表2可知，影响胃蛋白酶水解工艺因素的主次顺序为B>C>A>D,即酶添加量>酶解时间>底物浓度>酶解温度。最优条件为A4B4C4D3,即底物浓度8%，加酶量8%，酶解时间48h，酶解温度35℃。在此条件下水解度为47.06%。
2.2 胶原肽的分子量分布
为验证水解产物为胶原肽，选用购买的鱼鳞胶原蛋白（记做1）作对照，并将其胃蛋白酶水解产物作为胶原肽（记做2），鲤鱼鱼鳞胶原肽(记做3)，进行SDS-PAGE凝胶电泳试验，结果如图1所示：
从图1可看出（1）的分子量在105KD-50KD之间，（2）与 （3）的分子量分布基本一致，都集中在16KD-2KD之间。图1可以说明本实验中的水解物（3）是胶原肽。
2.3 特性的研究的结果
将制备的胶原肽进行1.3.6中的测定，并与0.05mg/mL的VC进行比较结果如下：鲤鱼鱼鳞胶原肽的抗氧化率为31.41%，羟自由基的清除率34.44%，DPPH•的清除率31.63%；VC的抗氧化率为37.18%，羟自由基的清除率99.72%，DPPH•的清除率92.04%；
3 结论
鲤鱼鱼鳞是制备胶原肽的理想原料，采用胃蛋白酶水解鲤鱼鱼鳞，水解条温和，水解产物的分子量分布比较集中，且水解产物具有一定的抗氧化性、清除羟自由基能力以及清除DPPH•的能力。但与VC比较效果相差较远。
参考文献
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胃蛋白酶范文2
【关键词】癌前病变；胃肿瘤；胃蛋白酶原类；老年人
The diagnostic significance of serum pepsinogens in elder patients with gastric cancer and precancerous changes CHEN Guo-bing,HUANG Wei,CAI Mei-zhu.Putuo District Liqun Hospital,Shang hai200333,China
【Abstract】 Objective To explore the diagnostic significance of serum pepsinogen(PG) Ⅰ,PGⅡlevels in detection of gastric cancer and precancerous changes in elder patients. Methods 118 subjects were selected in the study including 31 cases of chronic non-atrophic gastritis, 33 cases of atrophic gastritis, 30 cases of gastric cancer and 24 cases of gastric ulcer. Serum PGⅠand PGⅡlevels were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Results PGⅠand PGR( PGⅠ/PGⅡ ratio) values decreased significantly in both atrophic gastritis and gastric cancer groups(P＜0．05).But there were no obvious different of PGⅠ and PGR values between gastric cancer and atrophic gastritis((P＞0．05).If PGⅠ＜70 μg/L， PGR＜3 were used as positive indexes, accurate diagnostic ratio conforming to the two indexes was 23.3 %,and distinctive property was 93．3 %.But if PGⅠ＜70 μg/L or PGR＜3 were used as positive indexes, accurate diagnostic ratio and distinctive property were 73．3% and 76．7% respectively. Conclution Lower PGⅠand PGR levels are biomarkers of atrophic gastritis and gastric cancer in elder patients.They can be used as serum risk markers in monitoring gastric atrophy and carcingogenesis in elder patients.
【Key words】 Gastric precancerous changes；Stomach neoplasms； Pepsinogens； Elder patients
胃癌是我国最常见肿瘤之一，其死亡率居消化道肿瘤之首。众所周知，胃癌的有效普查是降低死亡率的关键措施之一。萎缩性胃炎是主要癌前病变，目前萎缩性胃炎和胃癌的诊断仍需通过胃镜及病理组织学检查才能确诊。尤其在老年患者中，由于伴有心肺功能不全，对侵入性检查的耐受性差，导致延误诊断和治疗。近年来日本学者研究发现，血清胃蛋白酶原可以作为胃癌和癌前病变高危人群的血清筛查指标[1]。老年人作为胃癌和萎缩性胃炎的高危人群，胃蛋白酶原在老年患者中的变化情况目前国内研究较少。本研究通过定量测定老年正常人及患者血清胃蛋白酶原亚群水平（PGⅠ、PGⅡ），探讨其在老年胃黏膜病变中的诊断意义。
1 材料和方法
1．1 研究对象 研究对象为我院2006年3月至2007年8月期间因“上消化道症状”行胃镜检查及经病理确诊的门诊和住院患者118例，男59 例，女59例，平均年龄（71．27±7．08）岁。在纳入本研究前1周内无特殊用药史（包括质子泵抑制剂和H2受体拮抗剂），并排除急性上消化道出血需立即治疗者。
1．2 方法 所有受检者在行血清学检查前均行胃镜检查，在胃窦和胃体各取2块组织做病理学诊断。根据我国慢性胃炎研讨会共识意见的诊断[2]和悉尼系统标准[3]，将患者分为4组，①非萎缩性胃炎组（n＝31）：胃黏膜正常或示轻度非萎缩性胃炎；②萎缩性胃炎组（n＝33）③胃癌组（n＝30）④胃溃疡糜烂组（n＝24）（见表1）。
所有受检者清晨空腹采集静脉血，分离血清后-20℃保存待测。以酶联免疫吸附法（ELISA）定量检测血清PGⅠ和PGⅡ水平。试剂盒由芬兰BIOHIT公司提供，严格按说明书中的步骤进行操作，反应结束后测吸光度（A，波长450 nm），根据已知标定物作标准曲线计算样本血清PGⅠ、PGⅡ的浓度。仪器采用personal LAB全自动酶标仪。各疾病组PGⅠ、PGⅡ浓度用均数±标准差（x±s）表示，单位为ng/L和pmol/L，PGR＝ PGⅠ/PGⅡ比值。各疾病组PGR值用均数±标准差（x±s）表示。
1．3 统计学分析 利用SPSS11．5统计软件对数据进行分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，两组间数据行独立样本t检验，多组间数据行方差分析。P＜0．05为差异有统计学意义。
2 结果
2．1 各组血清PGⅠ、PGⅡ、PGR水平测定结果（见表2）。与非萎缩性胃炎组相比，萎缩性胃炎和胃癌患者血清PGⅠ水平明显下降，差异均有统计学意义（P＜0．05）。胃溃疡糜烂组PGⅠ水平高于非萎缩性胃炎组，但两组无统计学差异(P＞0．05)。PGⅡ水平在4组间均无统计学意义（P＝0．457）。萎缩性胃炎组和胃癌组PGR值与非萎缩性胃炎组相比差异有统计学意义（P＜0．05）。但萎缩性胃炎和胃癌两组间PGⅠ、PGR比较无统计学差异(P＞0．05)。
2．2 各组病例中PGⅠ＜70μg/L和 PGR＜3的百分比（见表3）。与正常组相比，萎缩性胃炎组和胃癌组PGⅠ＜70 μg/L， PGR＜3的病例出现比例明显增高。其中胃癌组同时符合这两个指标的确诊率为23．3%，特异性较高，为93．3%。如以PGⅠ＜70 μg/L或 PGR＜3作为指标，确诊率73．3%，特异性76．7%。
3 讨论
胃蛋白酶原（PG）是由胃主细胞分泌的一种门冬氨酸蛋白酶前体，在胃内转变为具有活性的胃蛋白酶、水解蛋白质和多肽。PG有PGⅠ、PGⅡ两个亚群，均可在血液中检出。由于胃几乎是胃蛋白酶原的唯一来源，所以其变化能够反映出胃黏膜的功能变化。目前国内外研究都表明，胃黏膜不同部位的病变和严重程度，包括胃黏膜萎缩、肠上皮化生、异型增生及恶变均与血清PGⅠ含量，PGⅠ/PGⅡ的比值变化相关 [4-5 ]。
萎缩性胃炎是胃癌的主要癌前病变，国外研究表明，胃窦为主的萎缩性胃炎患者发生胃癌的危险性高于正常人18倍，而如果胃窦和胃体均有萎缩则其危险性高达正常人90倍。由于黏膜萎缩，正常腺体功能丧失，被幽门腺或肠上皮化生代替，腺体和主细胞数量减少，酶原的产生受到影响，故血清PGⅠ水平下降。本研究发现，在萎缩性胃炎组和胃癌组，血清PGⅠ水平均呈下降趋势，两组间比较无统计学差异。可能与老年人萎缩性胃炎发病率高，易引起肠上皮化生和主细胞减少有关。在胃黏膜发生癌变后，致癌因子使胚细胞中的胃蛋白酶原基因受损突变，从而失去分泌PGⅠ的能力，基因突变胚细胞又更新黏膜腺细胞，使PGⅠ分泌持续性下降。但各组血清PGⅡ水平无明显变化，这可能是因为分泌PGⅡ的胃黏膜细胞分布较广以及幽门腺化生使PGⅡ产生增多。萎缩性胃炎和胃癌组由于PGⅠ下降，PGⅡ变化不大，最终导致PGⅠ/PGⅡ的比值下降，与国内文献结果一致[6]。消化性溃疡由于主细胞及壁细胞数量增加，胃酸和胃蛋白酶原大量分泌，导致PGⅠ、PGⅡ进入血循环的机会增加。本研究亦得到相同结果，胃溃疡糜烂组PGⅠ、PGⅡ水平均高于非萎缩性胃炎组。
在日本，PGⅠ＜70 μg/L和 PGR＜3．0已被广为接受作为胃癌的筛查界值。国内学者于1997～1999在中国胃癌高发区辽宁庄河利用两轮筛查法（钡剂-X线双对比造影，血清PG含量检测+胃镜及黏膜活检），对4 036例进行筛查，也认为PGⅠ＜70 μg/L并 PGR＜3．0更适合作为中国人胃癌的初筛标准。所以笔者以此为诊断标准，发现萎缩性胃炎和胃癌组符合诊断者比例明显高于非萎缩性胃炎组和胃溃疡糜烂组。PGⅠ单项检测胃癌的诊断率为53．5%，与PGR联合检测诊断率可达73．3%，显著提高了胃癌的检出率。因此笔者认为血清胃蛋白酶原亚群数值及比值改变，是与老年胃癌发生密切相关的高危因素，可以作为老年胃癌普查筛选的一项血清学诊断指标，具有一定的临床价值。
参考文献
1 Miki K.Gastric cancer screening using the serum pepsinogen test method.Gasric Cancer.2006;9(4):245-253.
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4 王平,杨力.胃癌与幽门螺杆菌和胃蛋白酶原的关系（综述）.宁夏医学杂志，2003，25（12）:786-788.
胃蛋白酶范文3
【关键词】 小儿肺炎；继发性腹泻；乳酸菌片；复方胃蛋白酶散
文章编号：1004-7484（2013）-12-7539-01
小儿肺炎（Pediatric pneumonia）是儿科常见疾病之一，这种疾病一年四季均会发生，3岁以下的幼儿在冬、春季节发病率更高。该病的临床表现为发热、咳嗽、气促、呼吸困难和肺部细湿音等[1]；研究发现25.0%-43.4%的小儿肺炎患者在发病的同时，或者治疗好转后出现继发性腹泻的临床症状。笔者为探究小儿肺炎继发性腹泻治疗方法，随机抽取我院儿科自2010年3月至2011年3月之间接收诊治的80例小儿肺炎继发性腹泻患者，对其中的40例患者采用乳酸菌片联合复方胃蛋白酶散进行治疗，疗效显著，相关资料现报道如下：
1 资料与方法
1.1 一般资料 本研究选取的研究对象为我院自2010年3月至2011年3月之间接收诊治的80例小儿肺炎继发性腹泻患者，所有患儿均符合《诸福棠实用儿科学》的相关诊断标准[2]，其中观察组男性患儿26例，女性患儿14例，患儿年龄3个月-5岁，平均（2.7±1.1）岁，腹泻4-13次/d，平均（7.4±1.1）次/d；对照组男性患儿28例，女性患儿12例，患儿年龄3个月-6岁，平均（3.7±1.1）岁，腹泻3-12次/d，平均（6.4±1.7）次/d。
1.2 治疗方法 对照组患者给予单纯乳酸菌片治疗，根据患儿年龄确定剂量为1-2岁儿童1片/两次。2-3岁，1片/一次，每天分早中晚三次服用，疗程为一周。研究组在对照组治疗基础上联用复方胃蛋白酶进行治疗，根据患儿年龄确定剂量为1-2岁儿童0.7g/一次。2-3岁，1.5g/一次，每天分早晚两次服用，疗程为一周[3]。两组患者同时进行抗生素对症治疗，治疗期间根据不同患儿的症状灵活给予母乳、米汤一类易于消化的食物，根据病情变化增减治疗时间，腹泻稳定3d后考虑停止用药。
1.3 疗效评定 治疗后3d对患儿开展疗效评价，显效：患儿临床症状恢复正常，治疗后患儿大便性状以及大便次数均回落到正常水平；有效：患儿临床症状恢复正常，大便次数大大减少，鼻塞与流涕症状减轻，大便性状有所好转；无效：患儿腹泻次数未下降，甚至出现恶化[4]。
1.4 统计学方法 运用SPSS13.0（Solutions Statistical Package for the Social Sciences）统计学软件对两组患儿治疗疗效进行对比，结果进行t检验，计数资料进行χ2检验与相对数描述，P
2 结 果
观察组显效30例，有效9例，无效1例，治愈率为97.5%；对照组显效18例，有效13例，无效9例，治愈率为77.5%；观察组平均疗程（3.6±0.7）d，对照组平均疗程（4.9±1.6）d，无患儿出现不良反应症状，研究组患儿治疗效果显著优于对照组患儿，相关数据具有统计学意义（P
3 讨 论
服用乳酸菌片（Lactic acid bacteria piece）后，该药可以在人体肠道内形成一层保护膜，从而阻止病原细菌和病毒对人体的侵袭；另一方面该药还可以刺激肠道分泌出抗体，进一步提高人体肠道的免疫力，保护促进有益菌的生长，从而达到缓颊腹泻的效果。虽然该药可以用于治疗腹泻，但是对该药品会出现过敏者应该禁止使用，此外患者服用过后出现严重不良反应，应立即停药及时就医。
复方胃蛋白酶散（Compound pepsin）能抑制人体胃排空和肠蠕动，具有调整胃肠功能的作用。当临床医学中使用乳酸菌片联合复方胃蛋白酶散后，对于治疗小儿肺炎继发性腹泻有较好的疗效，两种药品联合使用后，可以达到优势互补的效果，患儿服用时口感也比以往好，容易被他们接受。
综上所述，乳酸菌片联合复方胃蛋白酶散治疗小儿肺炎继发性腹泻取得了显著疗效，患儿疗程大大缩短，治疗后无不良反应，总体治疗效果满意，这种治疗方法值得临床应广泛推广应用。
参考文献
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胃蛋白酶范文4
1 迎香穴
穴位：在鼻翼旁的鼻唇沟凹陷处、鼻翼外缘的法令纹处。
功效：促进眼部血液循环、防黑色素沉淀。
2 丝竹空穴
穴位：两眉眉梢外端凹陷处。
效果：促进血液循环，减淡黑眼圈，紧致脸部皮肤。
3 睛明穴
穴位：位于鼻梁两侧距内眼角半分的地方。
功效：促进血液循环，通经活络，消除眼部浮肿。
4 合谷穴
穴位：左手的拇指指关节横纹对准张开的虎口弧线，当拇指尖到达的地方就是合谷穴。
功效：可增强颈部以上的血液循环、防黑色素沉淀，消除脸部浮肿。
5 曲池穴
穴位：从手叁里穴上2寸、以手拱胸屈肘，横纹头陷处即为曲池穴。
功效：清热解毒，调理皮肤疾病，使肤色均匀、美白皮肤。
6 童子醪
穴位：位于眼眶外缘1厘米处。
功效：促进眼部血液循环，治疗常见的眼部疾病，去除眼角皱纹。
7 四白穴
最后，重点介绍有“美白穴”和“养颜穴”之称的四白穴，位于面部双眼平视时，瞳孔正中央下约2厘米处。每天坚持用手指按压，然后轻轻地揉3分钟，你会惊喜地发现脸上的皮肤开始变得细腻白皙。与此同时，配合指压“人迎穴”(位于前喉外侧3厘米处，能摸到动脉的搏动在这里)，一面吐气一面指压6秒钟，如此重复30次。每天坚持，经过一段时间后，脸部血液循环顺畅了，小皱纹就会消失，皮肤自然有光泽。
胃蛋白酶范文5
关键词 糜蛋白酶 微生物限度检查法 回收率
中图分类号：R927.11 文献标识码：B 文章编号：1006-1533（2014）19-0078-03
Validation of microbial limit test method for chymotrypsin
WANG Qi*
（Shanghai NO.1 Biochemical Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）
ABSTRACT Objective： To establish a method for microbial limit tests of chymotrypsin. Methods： An appropriate diluent was selected to dissolve chymotrypsin. The microbial limit were tested by both plate and film methods. Results： Microbial recoveries in two methods were≥70%， which showed that no inhibition of chymotrypsin to microbial growth. Microbial detection rate was higher in the film method than in the plate method since the sampling volume in the film method was 10 times larger than that in the plate method. Conclusion： The film method is suitable for the microbial limit test of chymotrypsin.
KEY WORDS chymotrypsin； microbial limit test； recovery
糜蛋白酶系自牛或猪胰中提取的一种蛋白水解酶，能迅速分解变性蛋白质。作用、用途与胰蛋白酶相似，但比胰蛋白酶分解能力强、毒性低、不良反应小。可使黏稠的痰液稀化，便于咳出，对脓性和非脓性痰液均有效。临床上常用于创伤或手术后伤口愈合等。对糜蛋白酶进行微生物限度检查，能有效发现样品中的微生物污染水平，从而进行微生物风险评估，保证用药安全。
材料和方法
仪器
恒温培养箱（Sanyo MIR253），电子天平（JY-5002型），高压蒸汽灭菌锅（新华XG1.D型、Sanyo MLS-3750），医用电动吸引器（YX940D），生物安全柜（Esco Class II BSC），电热恒温水浴锅（HSY2-SP）。
药品、培养基和试剂
糜蛋白酶原料药（白色或类白色结晶性粉末或无定型粉末，上海第一生化药业有限公司）；营养琼脂培养基（批号：111222）和玫瑰红钠琼脂培养基（批号：110809）购自上海中科昆虫生物技术开发有限公司；硫乙醇酸盐流体培养基（批号：1109262）和改良马丁培养基（批号：111121）购自北京三药科技开发公司；0.9%无菌氯化钠溶液；pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。培养基在使用前按厂方说明书要求高压灭菌，试剂在使用前于121 ℃灭菌30 min。
菌种与菌液制备
细菌计数验证用菌株为：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B）26003，大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B）44102，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63501；霉菌、酵母菌计数验证用菌株为：白色假丝酵母（Candida albicans） CMCC（F）98001，黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98003。以上菌种均由上海市食品药品检验所提供。参照中国药典方法培养菌种，制备菌悬液或孢子悬液[1]。
验证方法
供试液的制备
共取3个不同批号产品对微生物限度检查方法进行平行试验。
取供试品10 g加入到100 ml pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中[1]附录104，混匀后，作为1∶10供试液。
平皿法
取供试液1 ml，分别加入上述5种50～100 CFU/ml的试验菌株1 ml，分别倾注15～20 ml营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，平行制备2个平皿，按文献[1-2]规定的温度和时间培养作为试验组；同法测定相应加入的试验菌菌落数，作为菌液组；测定供试液本底菌菌落数，作为供试液对照组。培养后对菌落计数。回收率（%）=[（试验组平均菌落数-供试液对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数]×100%）[2-3]。
薄膜过滤法
取供试液10 ml，微孔滤膜（混合纤维素酯膜，孔径0.45 mm，直径50 mm，上海半岛实业有限公司）过滤，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液50 ml冲洗玻璃壁上残留的供试液，分别加入上述5种50～100 CFU/ml的试验菌1 ml，抽滤，取膜，贴于相应的培养基上，按中国药典2010版规定的温度和时间培养[1-2，5]，平行制备2个平皿。培养后对菌落计数，并计算回收率。
结果
平皿法检测
平皿法检测结果见表1。
由表1可知，采用平皿法进行验证时，5种试验菌的回收率为97.2%～103.2%，均大于药典规定（70%），表明糜蛋白酶对其无抑制作用。但由于3批糜蛋白酶采用平皿法检验时均未检出微生物，考虑到供试液取样量的多少可能影响微生物的检出率[4]，所以扩大取样量，采用薄膜过滤法进行验证。
薄膜过滤法检测
薄膜过滤法检测结果见表2。
试验结果表明，同样3批糜蛋白酶分别采用平皿法和薄膜过滤法进行方法验证，试验组的细菌回收率为92.1%～108.4%，但由于取样量的不同，本底样品的微生物检出率有明显的差异。采用平皿法时，3批糜蛋白酶均未检出微生物，但采用薄膜过滤法时，3批糜蛋白酶均有一定量的微生物生长[6-7]。
样品测定
采用经过验证的薄膜过滤法对5批糜蛋白酶进行微生物限度检查，结果见表3。
讨论
对糜蛋白酶进行微生物限度检查法的验证，有助于对其原料药进行微生物风险评估。由试验结果表明，两种检测方法中糜蛋白酶均无抑菌作用。
两种方法的检测结果表明薄膜过滤法的微生物检出率明显高于平皿法，其原因是两种方法的取样体积不同（平皿法1 ml，薄膜过滤法10 ml）。考虑到微生物在糜蛋白酶样品中可能是不均匀分布的，故采用薄膜过滤法能较为准确、有效地反映出糜蛋白酶样品中污染的微生物数。
之所以对糜蛋白酶样品进行微生物限度检查，主要考虑到原料药也是导致微生物污染的主要途径之一。要满足成品的微生物污染控制，还需要结合更多生产过程的控制来进一步保证产品的质量。
参考文献
国家药典委员会. 中华人民共和国药典2010年版（二部）[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2010： 附录108-109.
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胃蛋白酶范文6
【关键词】糖尿病肾病;尿微量白蛋白;胰激肽原酶
【中图分类号】R587 【文献标识码】B 【文章编号】1006-1959(2009)09-0095-01
糖尿病肾病是糖尿病严重并发症,据统计,1型糖尿病病程25年时蛋白尿的累积发病率达46%,2型糖尿病蛋白尿发生率更高达56%。近年来,糖尿病肾病导致的慢性肾功能衰竭迅速增加。在美国和欧洲,糖尿病是导致终末期肾病最常见的单一原因,占40%~50%,糖尿病肾病的终末期治疗费用也明显高于一般糖尿病患者。尿微量白蛋白检测为发现早期糖尿病肾病的有效途径,若在糖尿病肾病早期阶段进行有效干预治疗,仍有希望延缓甚至逆转糖尿病肾病的发展。笔者采用胰激肽原酶肠溶片治疗早期糖尿病肾病,结果总结如下。
1 资料与方法
1.1 病例资料:2004年3月~2004年12月,将我院符合糖尿病诊断标准,并符合Mogensen对糖尿病肾病的分期标准,即尿微量白蛋白(UMAIb)30~300mg/24小时的36例患者随机分为治疗组和对照组,治疗组1 8例,男12例,女6例,最大年龄79岁,最小年龄3 0岁,平均年龄46.3岁;对照组18例,男10例,女8例,最大年龄7 5岁,最小年龄28岁,平均年龄45.4岁。治疗组与对照组在年龄、性别方面无显著差异。全部患者均除外引起尿白蛋白排出增加的下列原因:剧烈运动、发热、泌尿系感染、心功能不全、肾炎、肾病综合征、结缔组织病、急性代谢紊乱、严重肝功能损害及近期使用肾毒性药物。
1.2 治疗方法:两组患者均给予糖尿病饮食,健康教育,进食蛋白为精蛋白,0.6~0.8g/kg•d,均采用胰岛素控制血糖,合并高血压的患者不用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)及血管紧张素II受体拮抗剂(ARB)。患者每周监测两天血糖,包括三餐前空腹及三餐后两小时血糖,根据血糖及时调整胰岛素用量,使空腹血糖控制在4.4~6.1mmol/L,早、午、晚三餐后两小时血糖控制在4.4~8.0mmol/L。治疗组在上述治疗基础上,口服胰激肽原酶肠溶片240u,每日三次,空腹口服。两组患者均治疗8周。胰激肽原酶肠溶片为常州生化千红制药有限公司生产,商品名怡开。
1.3 观察方法:分别收集每个患者24h尿液,混匀, 取样放免法测定,观察治疗前后尿微量白蛋白变化。仪器为西安核仪器厂生产的GC-911丫放射免疫计数器。
1.4 统计学方法:实验结果采用(x±s)表示,采用配对t检验进行统计学分析。
2 结果
治疗前两组比较检测结果无显著性差异(P>0.05),8周后两组分别与治疗前比较均能使尿微量白蛋白下降(P
3 讨论
糖尿病肾病是糖尿病严重并发症,1983年Mogeusen等提出糖尿病肾病分5期,其中将尿微量白蛋白30~300mg/24小时定为糖尿病肾病III期,即微量白蛋白尿期。微量白蛋白尿的出现是III期糖尿病肾病的主要特征,属于糖尿病肾病可逆期。
糖尿病诱发尿蛋白的发病机制尚未完全明确,与糖尿病长期高血糖,蛋白非酶糖化和氧化应激反应造成的微循环障碍有关;与肾小球入球小动脉扩张,肾小球滤过压升高,血小板聚集功能亢进,基底膜电荷改变及基底膜增厚有关[1,2]。
胰激肽原酶属于丝氨酸蛋白酶类,分子量26800,由18种氨基酸和4种糖所组成,可激活体内激肽系统,从而扩张血管,改善微循环,纠正组织缺氧。胰激肽原酶通过激活激肽系统,使激肽原降解为激肽,激肽是一种作用非常强烈的血管活性物质,作用于动脉壁和毛细血管壁,使其扩张,增加肾血流量,改善微循环[3],同时还可作为活化因子,激活纤溶酶原,提高纤溶系统和胶原水解酶活性,水解胶原,防止基底膜增厚[4]。此外,在提高纤溶系统活性基础上,抑制血小板聚集,降低血粘度,预防肾毛细血管球微血栓形成,从而达到减少尿蛋白,改善肾功能的作用[5]。
参考文献
[1] 叶任高,陆再英.内科学[M].第6版.北京:人民卫生出版社,2 004:8 06~8 07
[2] 胡绍文,郭瑞林.实用糖尿病学[M].第2版.北京:人民军医出版社, 2003: 335~339
[3] 姚合斌,潘长玉.激肽系统在实验性糖尿病发展中的研究[J].中国糖尿病杂志,2 000,8(6):356
[4] 史虹莉,方京冲.弹性蛋白酶片对糖尿病肾病疗效观察.中华内分泌代谢杂志[J],1998,1 4(4):196