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流式细胞仪范文1
1 材料与方法
1.1 外周血造血干细胞 APBSC采集自经环磷酰胺（CTX）＋重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）动员后的实体瘤患者（淋巴瘤、乳腺癌），采集使用 CS3000- Plus血细胞分离机（Baxter公司，美国）。
1.2 CD34+细胞的标记 对10份 APBSC分别进行2种不同再处理与CD34标记。
1.2.1 溶血法 APBSC与CD34-PE荧光单克隆抗体（Immunotec，法国）室温暗处反应15 min，然后用细胞裂解液溶解红细胞，待测。
1.2.2 分离单个核细胞法 经Ficoll（相对密度1.007）梯度离心，收集界面层单个核细胞，与CD34-PE标记的单抗室温孵育15 min，待测。
1.3 FACS检测CD34+细胞 上述标记细胞悬液分为2管，其中一管 6 h内使用流式细胞仪（EPICS ELITE ESP， COULTER公司）测定CD34+细胞占单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的百分率，另一管经 1％多聚甲醛固定， 4℃冰箱保存72 h后， FACS测定CD34+ 细胞数。
1.4 荧光标记的CD34单克隆抗体 33份 APBSC同时分别用表达第2类抗原表位QBEnd 10（ClassⅡ，Immunotec）和表达第3类抗原表位 8G12（ HPCA2，classⅢ，Becton Dickinson）的单抗进行标记，比较2组 CD34+细胞百分率之间的差异。
1.5 双标记CD34/CD45 APBSC中同时加入抗CD45-FITC（J33）和抗CD34-PE（HPCA2），用溶血法处理细胞， FACS测定CD34+细胞。
1.6 统计学处理 用 t检验。
2 结果
2.1 溶血法与单个核细胞标记法测得CD34+ 细胞百分率无显著性差异（P＞0.50）。
2.2 同一样品经 1％多聚甲醛固定72 h后的测定值与 6 h内的测定值相比，CD34+细胞荧光强度降低，非特异吸附增加，变异系数范围在 9.9％～49.5％之间，平均CV值为 32.2％。
2.3 APBSC标本分别用2种CD34单体标记，CD34+细胞百分率无显著性差异（P＞0.05）。
2.4 CD34-PE／CD45-FITC双标记测定 APBSC中CD34+细胞的百分率为 4.5％，而同一组样品进行CD34+细胞单色标记为5.3％。
3 讨论
FACS虽然对CD34+细胞的检测具有决定性意义，但早期造血干细胞表面CD34抗原表达弱且少，标本保存（冷冻）、不同标记方法及固定剂的使用均会影响CD34+细胞结果［1］。本研究对样品固定前、后测定，CV值明显大于批内变异，应在 1％～ 6％，批间变异＜20％的国际质控标准［2］。样品的2种不同处理方法间虽无显著性差异，但溶血法较分离单个核细胞法简单，避免了细胞损伤，使细胞回收率提高［2］，更适于临床应用。CD34抗原表位可分为3类，其抗原表达亦有差异，应用针对不同表位的抗体测定CD 34+细胞，结果是否有差异，则报道不一［3，4］。本研究的结果表明无显著性差异。
各实验室对CD34+细胞标记与测定目前尚无统一的标准方法，必然会产生较大的室间差异，Lowdell 等对28份 APBSC在15个实验室进行室间分析，结果差异很大，CD34+细胞为∶ 0.08％～19.31％，CV值为100.1％～136.6％［1］。1995年初，国际血液治疗与移植工程协会（ISHAGE）成立了干细胞计数委员会，建立了一种简单、快速、灵敏的计数CD34+细胞的方法［5］，建议双标记CD34-PE／CD45-FITC计数CD45+细胞中CD34+细胞的百分率，因为白细胞共同抗原CD45在造血干／祖细胞上的表达明显减弱，CD45和侧向散射光（SSC）一起可以较好地把CD34+细胞和淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、死细胞、细胞碎片、血小板团块及有核细胞区分开［4］。此外还可以同时结合第3种荧光抗体，测定CD34+细胞亚群［5］。
应用 FACS测定CD34+细胞应遵循以下原则∶选用特异性及敏感性高的单体，CD34单抗结合PE效果要强于 FITC［6］；由于CD34+细胞表达很少，应计数尽可能多的细胞，以提高结果的准确性［7］；标本应新鲜测定；同时标记CD45，可提高检测CD34+细胞的准确性。
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关键词：病毒性心肌炎，急性；T淋巴细胞亚群；NK细胞；流式细胞术
中图分类号：R542.2 R256.2 文献标识码：B 文章编号：1672―1349(2007)04―0348―02
急性病毒性心肌炎(acute viral myocarditis，AVMC)的发病机制至今未完全清楚，最近，病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)与细胞免疫功能的关系颇受关注。有资料认为，病毒性心肌炎心肌病变的形成，除病毒直接作用外，还与自身免疫反应有关[1]。利用流式细胞仪对成人急性病毒性心肌炎病人淋巴细胞亚群的CD3、CD4、CD8、自然杀伤(NK)细胞等进行了检测，现将结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料选择2005年1月―2006年9月诊断为急性病毒性心肌炎病人23例(观察组)，均符合诊断急性病毒性心肌炎的标准[2]。其中男9例，女14例，年龄(16～45)岁，平均27.5岁，监测前未接受激素及免疫调节剂治疗。对照组选取健康志愿献血者20名，其中女10名，男10名，年龄(24～39)岁，平均31.1岁
1.2 试剂与仪器 流式细胞仪为BD公司生产的FACSCal-ibur，离心机为法国JUNAN生产的CR422，检测淋巴细胞亚群的CD3、CD4、CD8、NK细胞的荧光标记抗体、红细胞溶解素均为BD提供。
1.3 检测方法利用流式细胞分析技术进行检测。对照组和观察组分别于早晨抽取空腹外周血2 mL，EDTA－K2抗凝，于采血2 h内检测。取6个试管分别加入FITC－CD45/PE－CD14、FITC－IgGl/PE－IgGl、FITC－CD/PE－CD19、FITC－CD3/PE－CD4、FITC－CD3/PE－CDk、FITC－CD3/PE－CD16＋56各20 uL，加EDTA－K2抗凝全血100 uL，混匀置室温暗处20 min，然后加入红细胞溶解素2 mL溶解红细胞8min，300 r/min离心5 min，用PBS洗涤2次后，加0.5 mL含1％多聚甲醛PBS固定，待测。仪器调整良好后测标本，以FITC－IgGl/PE～IgGl作为同型对照，计数1×104个细胞。
l.4 统计学处理采用SPSS 10.0统计学软件，数据以均数±标准差
表示，两组比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
与对照组相比，观察组CD3的变化不明显(P＞0.05)。CD4、Th/Tc比值明显低于对照组(P＜0.01)，CD8、NK细胞明显高于对照组(P＜0.01)。详见表1。
3 讨 论
病毒性心肌炎是病毒侵犯心脏引起的心肌实质或间质、局限性或弥漫性病变，其病理变化主要是广泛或散在的心肌细胞坏死及周围间质细胞浸润[3]。近年来此病发病率有增高趋势，大多数病人可完全恢复正常心功能，少数病人临床症状可改善，但会遗留心功能不全，极少数病人进行性心脏扩大，可能转化为扩张性心肌病、慢性心力衰竭、死亡或需心脏移植[4]，而该疾病至今仍无特效疗法，从病理生理学角度来看，早期以心肌细胞的直接损伤为主，后期以免疫介导心肌细胞损伤为主，对其免疫机制及感染因素研究，对治疗病毒性心肌炎有很大帮助。
通过分子模拟的原理证实了T细胞在心肌炎中的重要作用[5]。T细胞通过识别宿主和微生物的抗原表位而促进自身免疫反应的发生和发展。心肌损伤时，作为隐蔽抗原的肌凝蛋白就会释放出来与免疫系统接触，激活对它有交叉反应的T细胞，从而引发自身免疫反应。
本组研究显示病毒性心肌炎发病过程中，病人细胞免疫检测指标下降。细胞免疫主要包括T淋巴细胞、NK细胞和巨噬细胞等，T淋巴细胞是重要的免疫细胞，在自身免疫性炎症中起重要作用。在胸腺中发育成熟后进人外周血中。CD为细胞分化抗原，是细胞表面的一种标记。根据T细胞不同的表面标记和功能可分为CD3、CD8和CD8亚群。本研究中的CD4、Th/TcCD4/CD8比值明显低于照组(P
在本研究中，观察到NK细胞明显增殖活跃。Deguchi等[7]发现，在急性病毒性心肌炎阶段，炎性细胞浸润可分为两个时相：第一时相即病毒感染后(3～9)d，主要为NK细胞和巨噬细胞浸润心肌并达到高峰；第二时相在病毒感染后(7～14)d，T细胞替代NK细胞和巨噬细胞成为主要浸润细胞。NK细胞是VMC早期最主要的炎性浸润细胞，因其不受主要组织相容复合物分子限制，可直接作用于病毒感染心肌细胞，主要通过释放穿孔素途径溶解细胞，达到清除病毒的作用，并通过分泌γ干扰素(INF－γ)等细胞因子，进一步扩大反应。NK细胞的杀伤作用虽然参与了VMC的病理损害，但因其主要杀灭病毒感染心肌细胞，是VMC早期主要的抗病毒屏障，所以对心肌的病理损害是有限的。
由于利用流式细胞仪检测淋巴细胞亚群对病毒性心肌炎研究时间较短，且本研究的样本量比较小，是本研究的不足之处，这有待在后续进一步的研究中改进提高。
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流式细胞仪范文3
【关键词】 树突状细胞 骨肉瘤 融合瘤苗 免疫治疗
0 引 言
瘤苗作为肿瘤特异性主动免疫治疗方式，目的是激发启动、调节增强机体固有的免疫功能和抗癌能力以维护机体生理平衡。它具有使机体由被动抗癌向主动抗癌转变的特点。目前瘤苗制备中抗原负载的方法种类繁多，其中通过细胞融合技术将肿瘤细胞与抗原呈递细胞（Antigen presenting cells， APCs）穿孔融合制成的融合瘤苗，被认为是最具可行性及临床应用价值的一类。在当前瘤苗的临床应用中，自体瘤苗的成功制备通常会受到疾病本身的困绕。而异体的树突状细胞可以从储备的健康志愿者外周血单核细胞获得，又可避免使所有肿瘤患者在接受免疫治疗前都必须提供相当量的自身外周血的缺陷，避免了“雪上加霜”[13]。本研究中，作者应用Wistar大鼠骨髓来源的DCs与SD大鼠来源的骨肉瘤细胞UMR106通过电融合的方法进行细胞融合，制备异体融合瘤苗（DC/osteosarcom fusion cells， DOF），诱导T淋巴细胞增殖及骨肉瘤特异性CTLs。
1 材料与方法
1.1 材料 4～6周龄雄性SD、Wistar大鼠由第四军医大学实验动物中心提供（合格证号SCXK军2002005），并在无特定病原体（Specific pathogenfree conditions， SPF）条件下饲养；SD大鼠来源的骨肉瘤细胞系UMR106购自美国ATCC（American Tissue Culture Collection）。
1.2 主要仪器和试剂 MiniMACS磁性分离仪为德国Miltenyi Biotec GmbH公司产品；流式细胞仪为美国BD Phar Mingen公司产品；细胞融合仪为美国BTX公司的2001型产品；酶联免疫分析仪为芬兰Labsystem公司产品；rGMCSF、rIL4、rTNFα购自R＆D公司；FITC标记抗大鼠MHCⅠ、MHCⅡ、FITC标记抗大鼠CD4、CD8、FITC标记抗大鼠CD44、PE标记抗大鼠OX62、PE标记抗大鼠CD80、CD86购自英国Serotec公司；小牛血清和RPMI1640培养基为美国HyClone公司产品；淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司。
1.3 细胞培养与融合
1.3.1 Wistar大鼠骨髓细胞的制备 取健康雄性4～6周龄Wistar大鼠，断颈处死，浸入750mol/L的乙醇中10min，无菌手术取出双侧股骨和胫骨，剥净肌肉组织，用PBS洗涤2遍，剪去骨两端，再洗涤2遍；用无菌注射器抽取5ml无血清RPMI1640，将其针头分别从两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓直至骨变白，收入50ml离心管中，1 500r/min离心收集骨髓细胞，弃上清，沉淀细胞用5ml 无血清RPMI1640重悬，再经淋巴细胞分离液密度梯度离心，初步纯化单个核细胞(Bone marrow mononuclear cells，BMMCs)，离心洗涤2次，收集沉淀的骨髓细胞。
1.3.2 DCs的培养扩增及鉴定方法 见文献[4]。
1.3.3 骨肉瘤细胞的培养和融合 SD大鼠骨肉瘤细胞系UMR106培养在含100mol/L的小牛血清的RPMI1640培养液中，呈单层生长。分别收集培养的DCs和骨肉瘤细胞，用细胞融合仪融合，操作按说明书进行。
1.3.4 DOF的筛选 经过融合的细胞在培养瓶中生长24h后，弃去悬浮的细胞，收集贴壁生长的细胞。应用标记抗大鼠OX62单抗免疫磁珠MiniMACS分离柱筛选，标记细胞在通过置于磁场中的分离柱时，去除膜表面不表达OX62的细胞，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集OX62＋细胞，去除其中未融合的肿瘤细胞，具体操作按说明书进行。
1.3.5 DOF的表型检测 DOF培养扩增后，采用双色荧光标记流式细胞术测定DOF表面antirat CD44（FITC）和antirat OX62（PE）的表达水平。1×106个DOF悬液用PBS洗涤2遍，采用FITC标记抗大鼠CD44染色30min，再用PBS洗涤1次，然后用PE标记抗大鼠OX62染色30min。用PBS洗涤1遍后，制成1×109个/ml浓度的细胞悬液，采用流式细胞仪进行检测。
1.4 DOF诱导的T淋巴细胞增殖效应及其亚群分析
1.4.1 T淋巴细胞的制备 按照培养DCs的方法制备SD或Wistar大鼠的BMMCs，采用尼龙毛柱法分离T淋巴细胞。将尼龙毛柱高压灭菌，以温PBS洗柱，将柱内气泡排出，置37℃、5%CO2孵箱1h。然后将BMMCs细胞悬液加至柱的上端，待柱内PBS被完全排出时，关闭下端口，再放入孵箱中60min。用温PBS洗柱，收集洗脱液，得到富含T细胞的细胞悬液。用完全RPMI1640液、含rhIL2（100u/ml）的完全RPMI1640培养基将T细胞调整为2×106/ml， 于37℃、5%CO2、100%湿度条件孵箱培养3天，期间半量换液1次，培养液成分同前。
1.4.2 以DOF作为刺激细胞（分别将未经融合处理的DCs和UMR106作为对照），经60Co（30Gy）照射灭活，分别以空白/孔、1×103/孔、5×103/孔、2×104/孔接种于96孔培养板，每组设3个复孔，每孔再加入1×105个SD或Wistar大鼠的T细胞，终体积为200μl。在37℃、5% CO2、100%湿度条件下进行T淋巴细胞增殖；68h后，每孔加入新制MTT溶液，使其终浓度为2g/L，继续孵育4h，终止培养；离心（1 000r/min，5min）后弃去上清，加入DMSO 150μl/孔，震荡10min；酶联免疫分析仪于波长490nm处检测OD值，结果以3孔均值表示。刺激指数（Stimulating index， SI）=加刺激细胞孔OD值/不加刺激细胞孔OD值。
1.4.3 T细胞亚群分析 采用流式细胞术分别对SD和Wistar大鼠来源的T细胞，在DOF刺激增殖前后CD8+和CD4+细胞比例进行检测。
1.5 DOF诱导的特异性抗骨肉瘤CTLs效应
1.5.1 瘤苗特异性CTLs的体外培养 调整T细胞密度为1×106/ml，接种于24孔细胞培养板，每孔1ml。DOF经30Gy的60Co射线照射后作为刺激细胞，调整DOF和未经融合处理的DCs密度为5×104/ml，分别加入上述24孔板，每孔1ml，置37℃、5% CO2、100%湿度条件下孵育7天，隔日半量换液；以DOF刺激的SD和Wistar大鼠的T细胞（DOFT）作为效应细胞，未经融合处理的DC刺激的T细胞（DCT）和单纯T细胞（T）为对照组。
1.5.2 CTLs杀伤活性的MTT法检测 收集效应细胞（DOFT、DCT和T），调整细胞密度为2×106/ml，接种于96孔培养板，每孔100μl（2×105/孔）；按不同效靶比例（E∶T分别为5∶1、10∶1、20∶1、40∶1），加入靶细胞UMR106；另设单独效应细胞组、单独靶细胞组和培养液空白对照组；每组设3个复孔，置37℃、5% CO2、100%湿度条件下培养48h后，每孔加入新制MTT溶液，使其终浓度为2g/L，继续孵育4h，终止培养；离心（1 000r/min，5min）后弃，去上清，加入DMSO 150μl/孔，震荡10min；酶联免疫分析仪于波长490nm处检测OD值，结果以3孔均值表示。杀伤率计算如下：
杀伤率（%）=（1-试验组OD值-效应细胞组OD值靶细胞组OD值-空白对照组OD值）×100%
1.6 统计学处理 全部数据用计算机SPSS 11.0统计软件处理，T细胞增殖效应、T细胞亚群分析和CTLs杀伤活性比较均采用成组t检验，P
2 结果
2.1 DCs的体外培养扩增及鉴定 倒置显微镜下可见，前3天大部分细胞呈贴壁生长，体积小、形圆，细胞边界光滑；4～8天悬浮细胞数量增多，体积增大，细胞边界渐趋粗糙；9～12天大部分细胞呈悬浮生长，细胞数量进一步增多，体积进一步增大，边界可见明显的毛刺样突起。透射电镜下可见细胞表面存在大量褶皱和典型的不规则突起，呈典型的DCs状态。体外诱导后的DCs各种表型分子的表达水平：OX62为62.19％，MHC ClassⅠ为70.40％，MHC ClassⅡ为78.28％，CD80为55.58％， CD86为68.38％。
2.2 异体融合细胞DOF的表型检测 Wistar大鼠DCs与UMR106骨肉瘤细胞以5∶1的比例混合后，加入细胞融合仪的电击槽，细胞在融合电压作用下发生了细胞膜之间的融合。MiniMACS分离柱筛选后的DOF，经双色荧光标记流式细胞术检测，CD44（FITC）和OX62（PE）双阳性细胞比例为49.43％，见图1。
UMR106（左），DCs （中），和DOF （右）表面antirat CD44（FITC）和antirat OX62（PE）检测结果
图1 双色荧光标记流式细胞术对
UMR106，DCs和DOF进行表型检测
2.3 DOF刺激T淋巴细胞增殖效应 以未加刺激细胞组作为空白对照。结果显示，DOF具有较强的刺激T淋巴细胞增殖的功能。在SD大鼠骨髓来源的T细胞组，DOF在各浓度的刺激指数（SI=加刺激细胞孔OD值/不加刺激细胞孔OD值）均高于未融合的DCs和UMR106，具有显著性差异（P0.05），各浓度DOF和UMR106的SI均显著高于DCs的SI（P
UMR106：大鼠骨肉瘤细胞系；DCs：未加抗原致敏的树突状细胞；DOF：骨肉瘤细胞UMR106与 DCs经电融合获得的异体融合细胞
图2 DOF刺激SD大鼠T淋巴细胞增殖能力
UMR106：大鼠骨肉瘤细胞系；DCs：未加抗原致敏的树突状细胞；DOF：骨肉瘤细胞UMR106与 DCs经电融合获得的异体融合细胞
图3 DOF刺激Wistar大鼠T淋巴细胞增殖能力
2.4 T细胞亚群分析 见图4。
2.5 DOF诱导的特异性抗骨肉瘤CTLs效应 MTT法检测不同效靶比效应细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，结果显示：在SD大鼠骨髓来源的T细胞
SD大鼠的T细胞组，CD8+细胞比例由诱导前的34.16%升高到74.85%；CD4+细胞比例由诱导前的59.19%降低到19.05%（左）；Wistar大鼠的T细胞组，CD8+细胞比例由诱导前的32.35%降低到25.09%；CD4+细胞比例由诱导前的63.35%升高到71.75%（右）。
组，不同效靶比条件下，DOFT组均显示对UMR106高效特异的杀伤活性，其杀伤能力与效应细胞数量成正比，显著高于DCT组和单纯T细胞组（P0.05），见图5。而在Wistar大鼠的T细胞组，DOFT对UMR106的杀伤活性同样高于DCT组和单纯T细胞组（P
3 讨论
目前异体瘤苗的制备存在以下两种主要策略：第一、肿瘤细胞取自患者自体，DCs来源于健康志愿者；第二、采用患者外周血来源的树突状细胞与已经建系的肿瘤细胞（异体）相融合。这两种策略的优点都是显而易见的，却也都存在自身缺陷。本研究制备的异体融合瘤苗DOF，其肿瘤细胞UMR106来自SD大鼠，而其抗原呈递细胞源于Wistar大鼠的骨髓组织，那么针对后面制备的两种来源的T淋巴细胞而言，SD大鼠的T细胞与肿瘤细胞具有相同的遗传背景，而Wistar大鼠的T细胞将视DCs为“自身”成分。为了保证DOF的融合效率，作者对先前的实验技术[4]进行了改进，采用双色荧光标记流式细胞术测定DOF表面antirat CD44（FITC）和antirat OX62（PE）的表达水平。尽管antirat CD44并非大鼠骨肉瘤细胞特异性单抗，但其在骨肉瘤细胞和树突状细胞表面的显著表达差异[5，6]，足以在本研究中发挥有效的鉴别和标志作用。
研究结果显示，DOF在刺激两类T淋巴细胞增殖效应过程中均发挥了显著作用，但亦不难看出，在以Wistar大鼠T细胞为反应细胞的实验组，UMR106和DOF的SI之间没有统计学差异。通过对T细胞亚群变化进行分析发现，在该增殖过程中，本该发挥主要抗肿瘤免疫效应的细胞毒性T细胞，即CD8+细胞，并未占据预期的增殖比重；而在排斥反应中处于中心地位的CD4+的效应T细胞发生了相当大幅度的增殖，而且该增殖效应必定是在克服了肿瘤抗原和同种异体抗原对CD8+细胞的刺激作用下产生的。因此，尽管CTLs效应的研究结果显示在以Wistar大鼠T细胞为效应细胞的实验组，DOFT对UMR106的杀伤活性仍然高于对照组，作者还是有理由推测，该组DOF诱导的CTLs效应在很大程度上缺乏抗骨肉瘤的“特异性”，取而代之的是针对同种异体抗原的排斥反应，该反应在机体内部将获得更多效应细胞的参与，如B细胞、NK细胞和巨噬细胞等，排斥效应显然无法与针对性地杀骨肉瘤作用紧密关联。
在机体免疫系统功能健全的情况下，肿瘤细胞仍然能够躲避被识别和杀灭，其中最主要的机制包括以下两个方面：一、主要组织相容性抗原复合体（MHC）分子异常；二、第二信号系统障碍。瘤苗的制备就是试图通过对肿瘤细胞的人为改造，来纠正机体在自体肿瘤细胞面前的此种无奈。由于MHC限制性机制的存在，CD8+T细胞只能识别靶细胞表面与自身相同的MHCⅠ类分子和抗原肽段形成的复合物，而CD4+T细胞只能识别靶细胞表面与自身相同的MHCⅡ类分子和抗原肽段形成的复合物，尽管有研究强调两类MHC分子之间的交叉呈递作用[7]和肿瘤细胞之间所谓“共同抗原”（common antigens）的存在[8]，本研究仍然不主张在不同个体之间对提供靶抗原的肿瘤细胞作交叉使用；而以B7、ICAM为代表的共刺激分子和其他一些在活化T细胞中发挥作用的表型抗原，是人类免疫系统活化过程中一类通用的信号分子，即使其来源于异体组织，仍然不会泯灭其功效。
那么在选择异体瘤苗制备方案时，本研究结果支持最佳候选细胞为患者自身肿瘤细胞，而抗原呈递细胞（例如树突状细胞）可以来源于健康志愿者。尽管该方案仍将不可避免地面临前面所提到的以原代肿瘤细胞培养为例的诸多困难，但从免疫治疗功效本身来衡量，该方案显然具有更好的应用前景和开拓价值。
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流式细胞仪范文4
目的: 建立流式微球载体技术（FMA）检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清抗HFRS 病毒特异性抗体IgM和IgG及细胞因子含量的新方法。方法: 选择28例临床确诊的HFRS患者及20例健康人血清标本， FMA定量检测抗HFRS 病毒IgM和IgG; 定量检测细胞因子IL6和TNFα。检测结果与ELISA法进行比较。结果: FMA检测HFRS患者抗HFRS病毒IgM和IgG的阳性率分别为92.85%和71.43%， 健康对照组的抗体阳性率（假阳性率）为0; HFRS患者血清IL6和TNFα的含量分别为(532.62±397.19) ng/L和(392.68±177.68) ng/L， 明显高于健康对照组（38.77±20.32）ng/L（P
【关键词】 肾综合征出血热; IL6; TNFα; 流式细胞术; 免疫酶技术
［Abstract］AIM: To establish a flow microbeads assay (FMA) to examine the level of hemorrhagic fever with renal syndrome virus (HFRS V.) specific IgM， IgG and cytokines in HFRS patients. METHODS: Serum samples from 28 cases of HFRS and 20 healthy controls were studied. Serum levels of antiHFRS V. antibodies were qualified and inflammatory cytokines IL6 and TNFα were quantified by FMA. The results were compared with the results by ELISA. RESULTS: FMA showed that the positivity rates for antiHFRS V. IgM and IgG were 92.85% and 71.43%， respectively. None was detected positive in healthy control group. The serum level of IL6 and TNFα in HFRS group were (532.62±397.19) ng/L and (392.68±177.68)ng/L， respectively， which were significantly higher than that in healthy control group (38.77±20.32 ng/L and 15.91±6.91 ng/L， P
［Keywords］hemorrhagic fever with renal syndrome; IL6; TNFα; Flow cytometry; immunoenzyme technology
肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome， HFRS）是由HFRS病毒引起的自然疫源性急性病毒性传染病。临床上， 检测特异性IgM、 IgG和细胞因子的方法仍以ELISA法为主， 该技术是以包被在酶板上的抗原(或抗体)与标本中的抗体（或抗原）反应， 形成抗原抗体复合物， 再用酶标二抗和酶底物显色， 通过酶标仪检测。该方法的灵敏度存在缺陷， 并且是一种非均相法检测， 必需将未结合的抗体和酶标二抗分离出去后才能进行读数， 因而增加了操作时间、 操作步骤和系统误差。
流式微球载体技术 (flow microbeads assay， FMA) 是利用流式细胞术（FCM）和高聚分子微球载体技术检测可溶性生物分子的新技术。原理是在聚苯乙烯微球上进行抗原抗体反应， 用荧光物质标记的二抗为示踪剂， 通过流式细胞仪进行检测。该方法灵敏度高， 可作均相法分析， 减少了操作步骤和时间。我们采用FMA检测HFRS患者血清异性IgM、 IgG及细胞因子含量， 并与ELISA方法进行了比较。
1 材料和方法
1.1 材料
陕西省疾病预防控制中心病毒研究室提供的HFRS患者血清28例， 其中男18例， 女10例， 年龄17～52岁， 平均年龄30.6岁。FACSCalibur流式细胞仪、荧光校准微球（Flow check）购自美国BD公司。FMA 试剂盒由比利时鲁汶大学医学院馈赠。HFRS病毒抗体定性检测试剂盒主要成分包括: 基因工程重组汉滩病毒抗原包被聚苯乙烯微球， 荧光素（FITC）标记羊抗人IgM和IgG， 阴性对照血清和阳性对照血清。人IL6和TNFα试剂盒主要成分包括: 鼠抗人IL6或TNFα抗体包被聚苯乙烯微球， 荧光素（FITC）标记鼠抗人IL6和TNFα抗体， 不同浓度梯度的IL6和TNFα标准品。肾综合征出血热病毒 IgM、 IgG检测试剂盒购自北方生物技术研究所， IL6、TNFα生物素亲和素酶联免疫技术法检测试剂盒购自晶美生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 FMA检测血清特异性抗体
（1）血样采集: 空腹抽取HFRS病人和健康人静脉血2 mL， 分离血清，-20℃保存。（2）检验方法: ①管1空白对照: 只加微球载体。管2零标准管: 加微球载体和标记抗体。管3 阴性对照。管4 阳性对照。管5此管开始为待测样本管。②加微球载体: 各管加样本稀释液100 μL。所有管加微球载体10μL/管 ， 轻柔震荡混匀。③加待测样本: 管3加阴性对照10μL、 管4加阳性对照10μL。待测样本管加待侧样本10μL， 轻柔震荡混匀， 置2～8℃孵育 20 min。④清洗离心: 加PBS 4 mL/管， 3 000 g离心6 min。弃上清， 存留管底微球沉淀约100 μL。⑤标记从管2开始， 各管加标记抗体10μL， 震荡混匀， 置2～8℃ 、 避光20 min。⑥分析每管加PBS 0.4 mL， 轻柔震荡混匀后上流式细胞仪分析: 上机检测前， 用荧光校准微球校正流式细胞仪光路和流路， 使变异系数值（CV）在2.0之内。依次上样， 计数>500， 得到每个测定样本荧光强度。（3）结果判定: ① 临界值（cutoff值）计算: 临界值=阴性对照荧光强度值×2.1。②阳/阴性结果判定: 测定样本荧光强度值≥临界值为抗体阳性。测定样本荧光强度值
1.2.2 FMA检测血清IL6和TNFα的含量
设置空白对照: 只加微球载体。零标准管: 加微球载体和标记抗体和标准品管。标准品管最终浓度分别为800、 400、 200、 100、 50 ng/L， 用Weitongcount制作标准曲线。操作步骤详见产品说明书。
1.2.3 ELISA法检测血清特异性抗体及IL6和TNFα的含量
按照试剂盒说明操作。血清IgM和IgG检测结果判断采用目测法， 根据显色深浅判阳性或阴性。IL6和TNFα检测结果: 在酶标仪上检测吸光度值， 用CurveExpert1.3统计软件， 绘制标准曲线， 并计算标本中细胞因子含量， 其IL6和TNFα浓度以ng/L表示。
1.2.4 统计学分析
应用SPSS10.0统计软件包进行统计分析。IgM、IgG、IL6和TNFα的表达水平， 符合正态分布以x±s表示。两组样本间均数的比较， 采用t检验; IgM和IgG阳性率比较采用χ2检验; 将IL6和TNFα做相关分析， 计算相关系数（r）和P值， P
2 结果
2.1 FMA与ELISA方法检测血清特异性抗体
结果见表1、 2。经χ2检验， 两种方法的阳性率比较差异无统计学意义（χ2=1.33， P>0.05）， 两种方法符合率IgM和IgG均为11/14=78.6% ， 两种方法高度相关。FMA检测血清抗体结果见图1， 其中IgM两组比较P
2.2 FMA与ELISA方法检测血清IL6和TNFα的含量
ELISA法结果见表3， FMA法结果见表4， 图2。患者和健康人比较P0.05）; IL6 的r值为0.215， P值为0.461（P>0.05）， 两种方法比较均无相关关系， 提示二者无明显统计学意义。表3 ELISA方法检测血清 IL6和TNFα的含量（略）表4 流式微球载体法检测血清 IL6和TNFα的含量（略）
3 讨论
研究表明， 人群感染HFRS病毒后仅少数人发病， 大部分人呈隐性感染状态， 患者感染后抗体出现早， 发热1～2 d即可检测出lgM抗体， 第7～10天达高峰; 第5～7天可检测出lgG抗体， 第14～20天达高峰。
在不同的抗体成份中， 对机体起免疫保护作用的主要是由汉滩病毒G1和G2糖蛋白刺激产生的中和抗体和血凝抑制抗体。细胞免疫在对HFRS病毒感染的免疫保护中同样起重要作用。一些细胞因子的水平在HFRS的不同病期也有明显变化［1］。
ELISA法常被用于IgM、IgG及细胞因子等检测， 但因所需样品量大、精确度小、费时等， 并且一次只能检测一种成分， 这些都限制了方法的检测范围与前景。传统的FCM因只能检测颗粒性物质， 因而限制了流式细胞术的使用。FMA法有机地整合了有色微球、激光技术、流体力学、高速数字信号处理器和计算机运算法则， 在各种应用中的检测结果与传统的ELISA基本一致， 但有着ELISA无法比拟的优越性: ①通量大; ②标本利用率高; ③特异性强; ④敏感度高， 动力学范围宽; ⑤液相反应; ⑥节约人力资源; ⑦重复性好。此外， 吴煦等采用流式免疫微球芯片技术分析特异性血小板自身抗体及其他物质， 与微孔板改进抗原捕获ELISA（MACE）进行比较， 两种试验结果高度相关［2］、稳定性和重复性较好［3］、精确度较ELISA 要好， 能同时进行多个成分的分析［4］。
我们将FMA应用到HFRS患者血清异性IgM、IgG及细胞因子含量的检测， 采用间接免疫荧光FMA定量检测人血清中HFRS病毒抗体IgM和IgG; 采用双抗体夹心免疫荧光FMA定量检测人IL6和TNFα， 检测结果与ELISA法进行比较， FMA检测HFRS患者抗HFRS病毒IgM和IgG的阳性率分别为92.85%和71.43%， 健康对照组的抗体阳性率（假阳性率）为0; HFRS患者血清IL6和TNFα的含量分别为（532.62±397.19）ng/L和（392.68±177.68）ng/L， 明显高于健康对照组（38.77±20.32） ng/L（P
在我们检测的患者中， 两种方法检测IgM的检出时间均为发病第2天， 高峰均出现在发病第4～7天， IgG检出时间均为发病第4天， 高峰均出现在发病第7～14天， 而这与以往的研究结果不完全相同。两种方法不同的是FMA法检测IgM、IgG可以定量， 而ELISA法不行。两种方法检测血清IL6和TNFα的含量比较， IL6显著增高时间均为发病第4天， 高峰均出现在发病第4～7天， TNFα显著增高时间均为发病第2天， 高峰均出现在发病第2～4天， 且IL6和TNFα的浓度呈正相关。这与江振友等［5］实验结果趋势相同。细胞因子在HFRS发病机制中所起的重要作用在国内外研究中多有论述。但采用FMA法于以上指标的检测尚未见报道。本实验结果HFRS患者血清中IL6和TNFα含量较健康对照组明显升高， 推测HFRS患者发热、 出血和肾脏损害等病理表现与细胞因子大量产生密切相关。
综上所述， 利用FMA对HFRS病人血清异性IgM、IgG及细胞因子含量的检测， 克服了以往ELISA法检测技术的缺陷， 提高了HFRS检测的准确度和重复性， 该方法可以更好的用于临床， 推动HFRS检测的研究与应用。并在HFRS发病机制的探讨、 诊断及预后评价中有一定意义。
参考文献
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［2］吴煦， 王建中， 李传保， 等. 流式免疫微球芯片技术分析特异性血小板自身抗体［J］. 中华检验医学杂志， 2008， 31（1）: 32-38.
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流式细胞仪范文5
去年的七月刚刚毕业的我来到了自己工作的地方唐山中厚板材有限公司。带着对学校的恋恋不舍，对自己未来的梦想和满腔的热血来到了公司。在劳资科人员的帮助下，我签完了合同，并领了自己的行李，住进了我们的职工宿舍，工作人员非常热心的帮助我们，使我感觉自己不是在异地他乡，好像是在自己的家，同宿舍的人都是我们学校的，有的还认识，我们都心情非常的激动，马上就能自己挣钱了，也可以让父母放心了。
今天是我成为正式职工的第一天，早上起来自己转了转厂区，厂区还真大，各种设备都在运行着，我也不知道都是什么车间。我心想新厂子就是不一样，看看干净的厂房和厂区街道，感觉不像是在钢铁企业，在我的印象中钢铁厂都是粉尘多、噪音大、漫天的红烟，在这你根本看不见那些情况。下午劳资的工作人员给我打电话说要给我们分派工作，就是实习岗位，我们还很纳闷，昨天还说不知道什么时间才能给我们安排，怎么今天就安排了，而且听语气很着急，我们就去开会了。
首先，对我们实行了安全培训，我们公司实行的是三级安全教育，就是公司先进行安全培训，陪训结束了进行安全考试，通过了才派到各个部门，进行二级安全教育。各部门在进行安全培训，考试通过了派到车间，车间进行三级教育，通过了才可以上岗。我们就是走的这样的程序，公司的安全教育机制很好，这样使职工安全得到了保障，什么危险什么不危险自己心中都有了底，工作时也不会犯安全的错误。无论是公司的安全陪训还是车间的陪训，给我们讲解的都非常的详细。还用各种例子增加我们对安全的认识，安全陪训结束了，为我们发了劳动保护用品、手套、衣服、鞋等。并给我们分配了实习岗位，我被分到了炼钢部的精整工段，我开始还不知道精整是干什么的，以前也去过钢铁厂，可也没听说有这个工段呀。反正明天上班就知道是做什么的了，先好好的休息，为明天的工作养足精神，也给同事一个好的印象，也给自己一个好的开始。
早上由工作人员把我们领到工作的地方，安全陪训结束之后，带我们熟悉了一下场地和工作。上了两天白班，我们就被分到了各个班组和他们一起工作，我先学习喷号，就是往铸坯上喷上炉号、型号、定尺等；等熟练了之后，班长交我外售、上账、发坯子等，在这我实习了三个月，学到了很多东西，这里属于连铸和轧钢之间，是连接两部非常重要的地方，这主要是对连铸出来的坯子记上炉号、定尺、型号等，对需要修理的铸坯进行修理，需要缓冷的进行缓冷，连铸出的坯头、坯尾进行切割。轧钢需要什么坯子我们就给他找什么样的，其实我们就是为轧钢服务的。这段时间我们发现了很多问题，我们外售的坯子，有一段时间返回来了好几块，我看了看，这些坯子不是纵裂就是横裂，有的甚至直接断了，铸坯怎么会这样。想了很久也没想明白，如果原因不找出来，生产的成本就会增加，就会影响经济效益，如果发到各户手里，对以后也会早成影响。还好公司很快解决了这个问题，具体怎么解决的我就不知道了，后来出的坯子很少出现那种情况了。其实在精整喷号的工人挺辛苦的，刚出来的坯子有六七百度，非常的热，喷号的时候非常的烤，戴面照都热，公司给我们发冰棍，冰箱里每天都有，公司为工人想的可真周到。我在这里了解了各个型号的船板钢，lrah36、ab/a、ldh36、q235、q345等等，我知道我们公司主要生产船板钢，由于轧钢二期还没有建成，卖一部分铸坯，主要是卖到上海，有些卖到国外。我发现这里有一点小问题，接的坯子是一个数目，往轧钢发的又是一个数目，有的坯子找不到，有的坯子还多。一些不够尺寸的坯子轧钢不要，很大一部分就切废品了，这不是浪费吗？可以卖给一些小企业，我想怎么也比作废强。还有一些有裂纹的坯子，他们就化点钢水添上，打平了就发给轧钢，能压出合格的板子吗？我都不知道他们在糊弄谁。三个月的时期到了，我被调到铁区了，离开了我工作三个月的地方，又来到了一个新的地方。
实习快结束的时候，公司为我们新来的100多名大学生开了个迎新晚会，公司的各位领导对我们非常的重视，特意抽出时间为我们举办晚会，我们感到很温馨，领导为我们搭建了平台，该是我们展示自己的时候了，用好我们学的专业知识，给中厚板注入新的活力，使公司上一个新的台阶，这是领导对我们的期待，也是我们的奋斗的目标。公司还为单身青年举行了联谊会，以解决职工的个人问题，这样的公司谁不愿意付出，处处想的工人，是企业的未来。我能签到这样的公司感到很高兴。
拿到调令之后，我来到了铁区，铁区有两座高炉，我安全陪训完之后，分到了1#高炉。1#高炉是1500m3,是XX建成并投产的。我被分到了运转，运转是高炉生产的重要保障，所以我们要在这进行岗位实习，运转主要有上料、热风炉、矿槽。我在矿槽实习，带我的师傅是一个年纪和我差不多的人，他对我非常的负责，给我讲各个设备的用处，还有注意事项，出现问题怎么解决。有这样的师傅带我，我很高兴。我也学到了很多知识，谁说他的学历不如我，但在这里我是绝对的不如人家。他一直都是这里的骨干，我们领导也是为了我们能尽快的学会，特意安排他带我，我也知道领导这样都是为我们好。公司各个部门都有这样的好领导，公司会越来越好的。有好师傅带我，我很快就熟悉了设备，一些事情也能处理了，不懂的地方我就问他，矿槽主要是为高炉运料，这里有两个矿石料仓，四个烧结料仓，还有六个杂矿料仓，五个焦炭料仓，还有对应的称斗。一条主皮带，一条运矿皮带，一条运焦皮带，两条返矿皮带，两条返焦皮带。这里我知道了高炉是如何称料的，是如何上料的，在学校的时候只知道焦炭和矿石分批上，但并不知道具体是怎么上的，这回我知道了，把学的知识和实际联系了起来，好多以前不懂的现在好像开窍了似的，都明白是怎么回事了。老师讲的有些东西也想起来了，如果不是在这实习，估计我不会想起来。
流式细胞仪范文6
关键词 贞芪酪蛋白肽 神经胶质瘤 C6细胞 凋亡
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.15.149
资料与方法
材料:C6细胞系大鼠胶质母细胞瘤。LACP,纯度>99%,用二甲亚砜溶解,配成200mmol/L的储备液,-4℃保存。试验前用含10%小牛血清的1640培养液稀释成不同浓度。四甲基偶氮唑蓝(MTT),二甲亚砜(DMSO),流式细胞仪(XL)。
方法:①细胞培养:C6细胞接种于1640培养液培养,隔日用0.25%胰酶消化传代。②MTT法检测LACP对C6细胞作用的时效及量效关系取对数生长期C6细胞,按1×105/ml接种于96孔板内,分24、48、72小时三大组,各组细胞培养24小时。将培养液换成含不同浓度LACP的培养液,继续培养24、48、72小时后各取出一块培养板,观察细胞生长状态并拍照。随后检测490nm波长处的光密度(OD)值。③流式细胞仪检测细胞周期分布收集对数生长期C6细胞,接种于6孔板中,设4组,每组设复孔培养24小时后,将培养液换成含不同浓度LACP继续培养24小时。收集细胞,上流式细胞仪检测细胞周期。④流式细胞仪检测细胞凋亡收集对数生长期C6细胞,接种于6孔板中,设4组,每组设复孔,培养24小时将培养液换成含不同浓度LACP继续培养24小时,流式细胞仪进行检测,分析用药后细胞凋亡的百分比。
统计学处理:实验结果以均数±标准差表示,应用SPSS13.0统计软件分析,根据资料性质应用方差分析或t检验,检验水准α=0.05。
结 果
LACP作用于C6细胞后的倒置显微镜观察:不同浓度LACP作用于C6细胞24、48、72小时后,倒置显微镜下观察可见C6细胞随着时间的延长及浓度的增大,细胞失去了正常的贴壁生长状态,脱壁现象越加明显。细胞形态发生了明显变化,细胞变圆,细胞核固缩,核染色质致密,形状不一、大小不等的团块边集于核膜,最终可见坏死细胞增多。
LACP作用于C6细胞后的生长抑制试验在一定时间范围内,随着LACP浓度的增加,OD值相应减少。细胞的OD值与LACP浓度呈明显的负相关关系,24、48、72小时时OD值与LACP浓度负相关系数分别为-0.91、-0.92、-0.96。经多因素方差分析,LACP在不同浓度(P
流式细胞仪检测细胞周期分布随LACP浓度的增加,C6细胞的G1期细胞明显增加,而S期比例减低(P0.05),并且这种作用呈剂量依赖性,说明了LACP可引起C6细胞G1期阻滞。
流式细胞仪检测细胞凋亡:经流式细胞仪分别检测0、50、100及150mol/L浓度LACP作用于C6细胞24小时后凋亡细胞在总细胞数中所占比例分别为0.08%、0.30%、2.31%及18.26%。说明随着LACP浓度的增大,凋亡细胞明显增多,凋亡细胞在细胞总数中所占的比例增加。
讨 论
研究表明LACP对多种肿瘤均具有抑制作用[1]。肿瘤细胞的基本生物学特征为增殖与分化的平衡失调,恶性肿瘤细胞由正常细胞分化障碍、恶变而来,表现为失控的增殖和去分化,许多恶性肿瘤细胞分化程度差,呈现胚胎细胞特征[2]。LACP在肿瘤启动、促进及发展3个阶段都显示抗肿瘤功效。本实验显示随着LACP浓度的增加,它对C6细胞的抑制程度增大,细胞存活率减少。鉴于过度增殖是肿瘤细胞的一大特性,因而细胞周期与肿瘤的关系一直是生命科学研究中的热门课题[3]。我们的研究显示LACP可引起C6细胞G1期阻滞。细胞凋亡对于保持多细胞机体的完整性及动态平衡起重要作用。如果细胞凋亡受抑,结果细胞死亡率下降,则细胞数目不断增加,即表现出生长优势,这是肿瘤形成的一个重要基础。因而促进细胞凋亡对于肿瘤治疗以及抗增生性疾病等具有重要的意义。
本研究表明:LACP能抑制体外培养的C6细胞生长,这种作用呈时间浓度依耐性;LACP能使C6细胞周期阻滞于G1期,阻断细胞由G1期向S期的进程,而这种作用呈剂量依耐性;LACP可以诱导C6细胞发生凋亡的改变。LACP作为一种广泛存在于自然界的植物补体,已被证实具有较为肯定和广泛的抗肿瘤活性,是一种很有希望治疗脑胶质瘤的天然化学防癌剂和化学治疗药物。
参考文献
1 张延英,朱建坤,吴建军,等.贞芪酪蛋白肽药物血清诱导Bel-7402细胞分化的体外实验研究.中国实验方剂学杂志,2008,14(9):47-50.