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液相色谱范文1
中图分类号O657.7+2 文献标识码A 文章编号 1674-6708（2011）35-0084-02
0 引言
液质联用技术是20世纪90年展起来的一门综合性技术，液相色谱仪的高分离效能与质谱仪的高灵敏度、高选择性使之成为科学研究与检测领域强有力分析工具。液相色谱―质谱联用仪广泛应用于食品安全、药品检测和开发，农药残留、水质分析和蛋白质生物标志物的发现和验证等工作。而液相色谱―质谱联用仪的准确可靠是利用仪器进行科学试验的前提；判断仪器是否准确可靠就需要建立一套科学有效并且可行的校准方法。
目前，实验室用液相色谱―质谱联用仪主要由液相色谱和质谱仪两部分组分；与液相色谱连接质谱计有单极，多极两种。其中，液相色谱的作用是将分析样品通过色谱柱进行分离；质谱仪的作用是将分离出的样品转化为运动的带电气态离子碎片，引入磁场并按质荷比（m/z）大小分离并记录，其过程为可简单描述为：
其中，z为电荷数，e为电子电荷，U为加速电压，m为碎片质量，V为电子运动速度。质谱仪一般由进样系统、电离源、质量分析器、真空系统和检测系统构成。
1 计量特性
液相色谱―质谱联用仪各项技术指标见表1：
2 校准条件
2.1 实验室环境
1）仪器室内无强烈的机械振动和电磁干扰，不得存放与实验无关的易燃、易爆和强腐蚀性气体或试剂；
2）实验室温度：15℃~27℃；
3）实验室湿度：75%RH。
2.2 标准物质和试剂
1）利血平（reserpine）：标准物质；
2）氯霉素（chloramphenicol）：标准物质；
3）乙腈（acetonitrile）：液相色谱级或同级别；
4）甲醇（methol）：液相色谱级或同级别；
5）聚乙二醇（polyehtylene glycols，缩写为PEG）：色谱级或同级别；
6）乙酸铵（ammolun acetate）：色谱级或同级别。
2.3 校准设备
数字温度计：测量范围0℃~100℃，最小分度不大于0.1℃。
3 校准项目和校准方法
3.1 分辨力
仪器稳定后，执行Autotune命令进行自动调谐，检查仪器质量偏差、分辨力及离子强度的变化是否达到规定的要求，直到调谐通过，打印调谐报告，得到半峰宽FWHM。
注：1）调谐液常见种类有PPG（聚丙烯醇）、PEG（聚乙二醇）和NaI（碘化钠）等溶液，不同仪器厂商有不同的规定：同时，正负离子模式调谐可用不同配制的PPG溶液或PEG溶液等，具体调谐时可根据各仪器规定的要求执行；2）也可以采用手动调谐
3.2 质量范围
在正离子模式下，以PEG（根据仪器规定的浓度配制）溶液为调谐校准物质，对仪器的+Q1（一级质谱正离子）、+Q3（三级质谱正离子）进行调谐，质量数设定达到2000以上，观察仪器是否出现2000以上（含2000）的质谱峰。在负离子模式下，以NaI（根据仪器规定的浓度配制）溶液为调谐校正物质，对仪器的―Q1（一级质谱正离子）、―Q3（三级质谱负离子）进行调谐，质量数设定达到2000以上，观察仪器是否出现2000以上（含2000）的质谱峰。
3.3 信噪比
3.3.1 ESI+源（ESI的正离子模式）
仪器调谐优化后，以200μL/min速度注入5μL浓度为1pg/μL的利血平溶液（溶剂为70:30的乙腈/水），采用MRM扫描方式，选择离子对609-195（母离子为609，子离子为195）作为监测对象，连续测量3次，根据公式（1）计算其S/N，取平均值作为其信噪比。
S/N=H（609-195）/H噪声 （1）
式中：H（609-195）为离子对609-195的峰高；
H噪声为基线噪声。
3.3.2 ESI-源（ESI的负离子模式）
参照2.3.1的条件，注入5μL浓度为0.5pg/μL的氯霉素溶液（溶剂为70:30的乙腈/水），采用MRM方式，选择离子对321-152（母离子为321，子离子为152）连续测试3次，根据公式（1）计算S/N，取平均值作为其信噪比。
3.4 质量准确性
仪器调谐通过后，采用针泵进样方式，以10μL/min速度注入5μL浓度为100ng/μLPEG1000溶液（溶剂为70：30的乙腈/水，溶剂含有2mmol/L 乙酸铵），通过离子扫描检测出碎片离子1004.622u±0.05u准确质量数。每隔5min测量1次，测量6次，根据公式（2）计算其质量数的实测值与理论值之差，根据公式（3）计算标准偏差，以此评价质量准确性。
式中： ΔM为质量准确性，单位u；
Mi为离子质量数实测值，单位u；
为离子质量数测量平均值，单位u；
为离子质量数理论值，单位u；
S为离子质量数测量标准偏差，单位u。
3.5 测量重复性
3.5.1 ESI+源（ESI的正离子模式）
仪器优化后，选择泵流速为200μL/min，色谱柱为C18，流动相为70：30的乙腈/水，注入5μL浓度为20pg/μL的利血平溶液（溶剂为70：30的乙腈/水，且溶剂含有2mmol/L乙酸铵），通过MRM扫描方式，选择检测对象为609-195离子对，测量6次，按质量色谱峰进行面积积分，根据公式（4）计算其RSD，以此评价重复性。
式中： RSD为相对标准偏差，%；
xi为第i次测量的峰面积；
为6次测量峰面积的算数平均值；
i为测量序号。
3.5.2 ESI-源（ESI的负离子模式）
仪器优化后，选择泵流速为200μL/min，色谱柱为C18，流动相为70：30的乙腈/水，注入5μL浓度为20pg/μL的氯霉素溶液（溶剂为70：30的乙腈/水，且溶剂含有2mmol/L氯化铵），通过MRM扫描方式，选择检测对象为321-152离子对，测量6次，按质量色谱峰进行面积积分，根据公式（4）计算其RSD，以此评价重复性。
3.6 柱温箱温度控制
将数字温度计探头固定在柱温箱内，选择35℃和45℃（也可以根据用户使用温度设定）进行校准，按仪器说明书操作，通电升温，待温度稳定后，记下温度计读数并开始计时，以后没每隔10min记录一次读数，共计7次，求出平均值。平均值与设定值之差为ΔTs，7次读数最大值与最小值之差为控温稳定性Tc。
4 校准的意义和周期
通过对液相色谱―质谱联用仪的校准可以很好的控制在实验分析过程中因使用的液相色谱―质谱联用仪的精度误差而带来的分析误差。提高实验数据的真实性和准确性。
台式液相色谱―质谱联用仪的校准一般委托有相应资质的第三方校准机构进行校准。一般校准周期不超过2年。仪器使用维护人员可根据实际使用情况对周期进行调整。在更换重要部件、维修或对仪器性能有怀疑时，应随时校准。
参考文献
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[2]JJF1005-2005 标准物质常用术语和定义.
[3]JJF1059-1999 测量不确定度评定与表示.
[4]JJF1094-20002 测量仪器特性评定.
[5]JJF1164-2006 台式气相色谱仪-质谱联用仪校准规范.
[6]JJG705-2002 液相色谱仪检定规程.
液相色谱范文2
液相色谱检测技术在食品营养检测中的作用
食品营养检测是食品检验的一个重要部分，其中，对食品糖分、氨基酸以及维生素含量的检测尤为重要。首先，糖分作为食品所含有的三大营养成分之一，能够为人类活动提供很多能量，也是食品营养的一项主要指标。根据种类的不同，食品中含有的糖分种类和量也会有所不同，在食品营养检测内容中，可以分为葡萄糖、果糖、蔗糖以及淀粉。糖分具有一定的还原性，且大多易溶于水，因此在进行食品糖分检测时，某些参数常常无法保证准确性。而液相色谱检测技术的应用，则能够以其高灵敏度，将食品中碳水化合物的相关参数有效的测量出来，并对糖分质量评价提供准确依据。其二，氨基酸是生物生存必须具备的物质，氨基酸在人体内主要发展成的基础性物质是蛋白质和酶。然而，由于蛋白质和酶的稳定性很差，容易因环境的改变而发生变化，所以对蛋白质和酶的有效检测需要应用先进可靠的技术手段。液相色谱检测技术流动相的范围很广泛，同时还具备良好的灵敏性，因此能够在蛋白质和酶的参数检测中起到很好的作用。其三，维生素不仅能够为人体生产活动提供能量，还能在人体健康方面起到重要作用。人体的正常活动需要持续补充维生素，否则很容易导致人体个别功能发生异常，甚至引起器官的病变。食品是人类获取维生素的重要来源，可是过去对食品中维生素的检验手段却非常落后，只能将食品中的维生素提取出来再进行检验，在这一过程中食品质量很容易发生变化，进而导致检验结果与实际不符。液相色谱检测技术的应用则能够比较精确地进行维生素检测，不仅检测流程大大简化，还能有效排除各种干扰因素。
液相色谱检测技术在食品添加剂检测中的作用
在食品添加剂检测中，对甜味剂和食用级色素的检测是非常重要的组成部分。甜味剂一般是指提高食品甜味的添加剂，根据来源的不同，甜味剂可以分为天然甜味剂和人工合成甜味剂；根据其中包含的营养价值，可以分为营养型甜味剂和非营养型甜味剂；根据化学本质的不同，可以分为糖类甜味剂和非糖类甜味剂。甜味剂的种类很多，其中成本最低、使用方法最简单的甜味剂是糖精钠，在各种食品的制作中有非常广泛的使用。但是，糖精钠的摄入量如果过大，就会对人体造成不利影响。液相色谱检测技术的应用，能够将食品中糖精钠等各类甜味剂的含量准确的测量出来，从而保证食品的质量安全。食用级色素是用于改变食品颜色的添加剂，并且人体可以适量摄入。食用级色素的化学本质与食用香精比较类似，既可以天然获取，也能人工合成。天然食用色素提取自动植物，大多对人体没有伤害。人工合成食用色素则是主要以苯胺燃料为原料制作而成，苯胺燃料分离自煤焦油，不仅能够引发人体中毒，还有可能导致细胞的癌变，对人体的伤害很大。因此，液相色谱检测技术的应用是非常有意义的，通过检测，保证食品中的色素无害，保证食品安全。
液相色谱检测技术在食品药物残留检测中的作用
人们在种植农作物时，为了提高农作物的产量，会使用各类有机化学物质和农药。这些化学物质和农药在促进农作物生长方面能够起到一定作用，不仅可以保证农作物的生长质量，还能有效提高农作物的产量。然而，这些化学物质和农药在带来好处的同时，还为食品安全带来了一定的威胁。农药是一种分子量大的一种有机化合物，而且难以降解，在使用后，会残留在土壤、水以及植物体中，人们在食用相关的食品之后，农药会逐渐在人体中累积，达到一定量后就会对人体的健康造成巨大危害。在食品农药残留量的检测中，可以将液相色谱检测与气相色谱法相结合，不仅能够定性的检测出农药的种类，还能定性的精确测量出农药含量。在农作物的种植过程中，人们会使用农药，而在动物的养殖中，则会使用兽药。与农药对农作物生长的作用类似，兽药也能够在一定程度上促进动物的生长发育，甚至缩短动物的生长周期。使用过兽药的动物体内一般都会残留有兽药成分或者相关的代谢产物，这些物质都是对人体健康不利的，因此，对于动物食品中的兽药检测同样是非常重要的。液相色谱检测技术能够有效检测出诺氟沙星、环丙沙星以及恩诺沙星等多种抗生素药物的存在，并精确的测量出药物的残留量。
液相色谱范文3
【关键词】液相色谱法；葡萄酒；日落黄；胭脂红
doi：10.3969j.issn.1004-7484（x.2013.10.758文章编号：1004-7484（2013-10-6195-01
日落黄与胭脂红是人工合成的可食用色素，常被添加至各类饮品中以提高其色泽的鲜艳度与观赏性。由于人工合成色素多用煤焦油作为原料制备而成，且制备工艺与水平参差不齐，导致其安全性普遍较差[1]。人工合成色素中的苯环、蒽环等对于人体具有毒害作用，长期使用会严重影响消费者的健康，因此我国对于人工合成色素的用量有严格的限制。葡萄酒中日落黄与胭脂红的使用较为常见，对于含乙醇的饮品中日落黄与胭脂红的含量测定主要采用液相色谱法[2]。本文通过液相色谱法对葡萄酒中的这两种色素进行测定，具备准确、高效、灵敏、简便等优点，最终取得了满意的结果。
1资料与方法
1.1仪器与试剂本文所用高效液相色谱仪为岛津公司生产的LC-20AT系列高效液相色谱仪，BT224s电子天平（德国赛多利斯公司，NeXpower1000超纯水仪（韩国公司，日落黄（中科院：GBW（E100003a，胭脂红（中科院：GBW（E100004a，甲醇（中国天津市康科德公司为色谱纯，乙酸铵（中国天津市科密欧公司为分析纯，水为超纯水。
1.2色谱条件与标液的配制本文色谱柱为岛津公司生产的C18柱（5um，150×4.6mm，流动相为甲醇-乙酸铵（0.02molL，流速为1.0mlmin，柱温为32℃，检测波长为509nm，洗脱方式如下：
标准溶液的配制方法为：准确称取日落黄与胭脂红各0.1000g，采用超纯水溶解，定容至100ml，获得1.0mgml的标准溶液。工作溶液为取上述标液进行稀释，获得1ugml、5ugml、10ugml、20ugml以及50ugml的工作液。
1.3样品的前处理与测定准确称取样品5.00g，置于50ml烧杯中加热以除去乙醇，将其转移至25ml容量瓶中定容，过0.45um水系滤膜后，常规注入进样瓶中准备进样。根据保留时间定性，峰面积定量，定量方法采用外标法。
2结果
2.1线性与检出限通过对混标工作液进行测试可得，在1.00-50.0uml范围内，日落黄与胭脂红的线性关系良好，日落黄回归方程为y=59.032x-8.6513，线性相关系数为0.9999，胭脂红的回归方程为y=44.733x-6.452，线性相关系数为0.9999。以信噪比为SN=3计算检出限可得，日落黄的检出限为0.20mgkg，胭脂红的检出限为0.25mgkg。
2.2精密度与回收率取6份葡萄酒样品，加入st1进行上机检测可得，6次进样结果的精密度分别为日落黄2.2%，胭脂红1.5%，符合相关要求。选取高（st5、中（st3、低（st1三种浓度进行加样回收可得，回收率为92.0%-98.8%，见表2。
3讨论
3.1前处理方法的选择本文选用水作为提取溶剂，其原因在于日落黄与胭脂红均为水溶性色素，因此采用水提取即可获得较高回收率。有研究显示采取聚酰胺吸附法进行提取能够获得更好的回收率，且基质干扰较小[3]，但本文认为葡萄酒中所含基质较少，对于色谱柱的影响较小，因此采用一步提取法即可达到满意的结果。
3.2色谱条件的优化本文检测的两种色素：日落黄与胭脂红均属于水溶性色素，具有较强的极性，因此在选择色谱柱时采用反相色谱柱，以达到较好的分离效果[4]。在选择流动相时，本文最初选择了3对流动相：甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙酸铵，通过平行操作后，最终获得甲醇-乙酸铵作为流动相的分离效果最佳。检测波长最初设定为483nm，因为日落黄在481、483、486nm处均有最大吸收，但由于胭脂红在509nm处的吸收较大，因此选择509nm能够完全满足日落黄与胭脂红均具有较大吸收。
3.3光谱优化本文所采用的紫外检测器理论上可以采集波长为190-700nm的光谱图，对于色谱峰的定性具有可靠性，且能够有效避免单纯凭借保留时间对待测物质进行定性的不准确性。本文选择509nm的目的在于避开254nm以下波长，降低杂质的干扰，使得待测物质在低浓度的情况下仍能够获得良好匹配度。
4小结
本文认为该方法采用一步提取法对样品进行前处理，能够达到操作简便、处理快速的优点。利用梯度洗脱的方式能够使得检测方法灵敏度更高，受杂质干扰更小。采用本法对葡萄酒中的色素进行分析，能够使色谱峰良好分离，结果准确性高、可靠性佳、分析速度快。因此对于葡萄酒中的色素分析可以采用该方法，对于其他液体食品中人工合成色素的测定，该方法也具有一定的指导意义
参考文献
[1]谷岩，曲明.高效液相色谱法测定饮料的食用色素[J].化学分析量，2004，13（1：42-43.
[2]欧阳燕玲，谢唯平，陈春祝.高效液相色谱法检测葡萄酒中5种人工合成色素的方法探讨[J].中国卫生检验杂志，2005，15（10：1218-1220.
液相色谱范文4
【摘要】
目的建立鲜壁虎的高效液相色谱指纹图谱，探讨不同壁虎间的相似程度。方法采用高效液相色谱法分析鲜壁虎提取液中相关物质的保留时间和吸收强度，对6种壁虎样品共有峰峰面积进行聚类。结果选定的色谱条件给出了较好的保留时间分布和吸收强度，建立起鲜壁虎的hplc指纹图谱，聚类分析给出了相应结果。结论该hplc指纹图谱可用于鉴定鲜壁虎，壁虎所含化学成分的多寡等因素与其品种相关。
【关键词】 鲜无蹼壁虎 指纹图谱 高效液相色谱法 聚类分析
abstract：objectiveto establish an hplc fingerprint of fresh gekko, and to discuss the similarity among gekkos. methodsthe retention time and absorption intensity of extracts of gekko were determined by hplc,peak area of six kinds of gekko samples’mutual peaks were applied to grade by hierarchical cluster analysis. resultsbetter distribution of retention time and absorption intensity were shown under the given chromatographic condition, the hplc fingerprint was established and the result of hierarchical cluster analysis was got. conclusionthe fresh gekko can be identified effectively and the chemical constituents of different gekko are related to the kinds.
key words：fresh gekko; fingerprint; hplc; hierarchical cluster analysis
壁虎（gekko）属隶爬行纲有磷目蜥蜴亚目。我国现知有壁虎属动物11种［1］。其性味咸、寒，有小毒，能够祛风、定惊、散结、解毒，治中风瘫痪、历节风痛、风痰惊痫、瘰疬、恶疮、破伤风、痈疮、胃嗝气等症。 现代 医学认为壁虎对肿瘤、结核等疾病有确切疗效［2～5］。近年来对壁虎抗肿瘤作用的基础研究也有所报道［6，7］。笔者应用“壁虎散” 治疗 肺癌等肿瘤疗效显著，且副作用很小，是潜在的可开发利用的抗肿瘤中药品种。由于壁虎种类较多，它们体内所含的有效药物成分的种类及含量的多寡均会有所不同。为保证研究中所用壁虎的种属纯正，建立壁虎的高效液相色谱指纹图谱，用于对壁虎的鉴定具有重要的意义。
1 仪器与材料
1.1 仪器与试剂黄金系列通用ⅰ型高效液相色谱仪（126型泵，166型紫外-可见光检测器，gold软件；美国bechman公司）；ds-1高速组织捣碎机（上海标本模型厂）。色谱纯乙腈（美国tedia公司），分析纯95%乙醇。
1.2 药材实验所用壁虎的物种及来源见表1。壁虎均于9月从产地购买，并经当地药检所鉴定。表1 6种壁虎的种类及来源（略）
2 方法和结果
2.1 色谱条件层析柱：购自大连江申分离 科学 技术公司（瑞士 spherigel c18填料）， 4.6 mm×250 mm，5 μm粒度。流动相：a，亚沸水；b，乙腈。梯度洗脱：0～5 min，100% a，流速0.7ml/min ；5～ 6 min流速由0.7 ml/min升至1 ml/min；6～16 min，0～10% b；16～21 min，10～40% b；21～31 min，40 ～ 60% b；31～46 min，60～100% b；46～60 min，100% b。进样量10 μl；检测波长205 nm；室温。
2.2 供试品的制备购买秋季捕捉的活壁虎，随机选取14～15只（约50 g），在容器内放置72 h，以消化、排空壁虎体内的食物，蒸馏水清洗晾干后准确称重，置入95％酒精致死，用捣碎机粉碎匀浆（转速：10 000/ min），50 ml 95％酒精分两次涮洗捣碎机，合并涮洗液以浸泡匀浆后的壁虎，不时摇动，浸泡24 h后抽滤；滤渣用50 ml 95％酒精再次浸泡提取，抽滤；合并两次的提取液，定容于100 ml；置-2℃冰箱内保存；使用时，取一定量的样品液经0.45 μm微孔滤膜过滤；当其温度转变为室温后，以10 μl进样分析。
潍坊干壁虎的处理：将捕捉到的潍坊活壁虎按常规方法制成干品；取15只干壁虎，用100ml 95％酒精浸泡1 d（软化），用捣碎机粉碎匀浆（转速：10000 r·min-1），用原酒继续浸泡2 d，提取，抽滤；滤液经0.45μm微孔滤膜过滤，以10μl进样分析。
2.3 方法学考察
2.3.1 检测波长的确定由于业界对壁虎所含的有效药物成分尚无系统的研究和分析，其有效药物成分组成和结构尚不得而知，为了使壁虎乙醇提取液中所含有的物质能在紫外光检测波长下被最大限度地检出，宜选择短波长进行检测。在选用205，210，215，220 nm进行色谱分析后，对比所得色谱图发现：除色谱吸收的强度随波长增大而依次降低外，吸收峰的数量多寡无明显改变，据此而确定205 nm为色谱参数，用于色谱检测。
2.3.2 流动相及柱温的确定实验表明使用空调控制室温，在22～26℃的温度条件下，色谱峰的保留时间没有明显的变化，经5次在该温度范围内的测试，结果显示色谱峰的保留时间、峰高、峰面积数据的rsd均小于1.2%，在室温条件下的测试结果是可靠的。经采用不同的流动相梯度洗脱，方法中所述的梯度是最佳方案，尤其是方法开始的最初5 min以0.7 ml/min的流速进行洗脱可使保留时间较短（3～8 min）的物质得到较好的分离，满足测试的需要。
2.3.3 稳定性考察取鲜无蹼壁虎的乙醇溶液测试品分别在0，6，12，24，36，48 h不同时间进行测试，考察色谱峰保留时间与吸收强度的一致性，如图1中所标示的各指纹峰的保留时间与吸收强度的rsd均小于1.1%。
2.3.4 仪器精密度实验在空调的设定温度为24℃时，取测试品连续五次进样，图1中各指纹峰的保留时间、峰高及峰面积的rsd均小于0.6%。
2.3.5 重复性实验取壁虎分4次制作供试品，分别进样。结果显示各指纹峰的保留时间、峰高及峰面积的rsd均小于1.6%。
2.4 色谱图中选作指纹峰的保留时间区间范围的确定
2.4.1 壁虎95％酒精提取液的后续处理采用潍坊壁虎作抗肿瘤药用效果研究，匀浆后的壁虎用95％酒精连续浸泡提取5次，抽滤后，合并5次提取的抽滤液，在30℃下减压蒸馏浓缩，除去其中的乙醇，获得带黄色固体沉淀以及脂肪物的水液；添加一倍体积的蒸馏水后，水液经正己烷和二氯甲烷分别各萃取4次，得黄色水溶液。水溶液在30℃下减压蒸馏浓缩，冻干，得棕色浸膏状物。浸膏状物用95％酒精溶解，作硅胶柱层析，得各层析后样品。
2.4.2 各水溶性样品的抗肿瘤效果用各样品以mtt法对hepg2和ct-26肿瘤细胞作体外抑瘤率实验。其中棕色浸膏状物浓度为5 mg/ml时，抑瘤率最高可达37%，硅胶柱层析得到的4#样品，浓度为1 mg/ml时，抑瘤率最高可达49%，棕色浸膏状物对小鼠作体内抑瘤实验，通过肿瘤实体称重对比，抑瘤率可达63%。体内、外抑瘤实验均表明壁虎含活性较高的抗肿瘤有效药物成分。
2.4.3 确定指纹峰的保留时间区间范围通过上述各水溶性样品进行相同色谱条件下的色谱分析，发现各色谱图中的吸收峰的保留时间均在20 min以内，考虑到抗肿瘤有效成分是水溶性的（谢爽、王学美的研究也有同样的结论［6，7］），故将保留时间在20 min以内作为选取指纹峰的时间界限。
2.5 聚类分析为进行各种壁虎所含抗肿瘤成分的比较，对各壁虎色谱数据进行了聚类分析。聚类分析使用各壁虎保留时间在20 min以内共有的12个吸收峰，以每个壁虎的12个吸收峰的总面积除各吸收峰的峰面积，得到如表2所示的各吸收峰的相对峰面积，以此进行聚类分析。聚类分析使用spss统计软件，采用离差平方和法（ward’s method）及欧氏距离（euclidean distance）。表2 各壁虎共有吸收峰的相对峰面积（略）
2.6 结果
测试所得各壁虎的hplc色谱图，其中潍坊壁虎的色谱图如图1所示。
实验发现潍坊壁虎干品的色谱图（图2）与鲜品的有很大的差异，故鲜品的指纹图谱不适用于干品。
以各鲜壁虎色谱图中保留时间作标记的各吸收峰为指纹峰。取其中吸收强度最大的（保留时间分别为5.234，5.263，5.273，5.246，5.259，5.250）吸收峰为 参考 峰，确定其它指纹峰的相对保留时间和相对峰高，以归一化法（rai=ai/σai）确定各指纹峰的相对峰面积。由色谱中各指纹峰的相对保留时间、相对峰高及相对峰面积（ra），即可构建起样品的hplc指纹图谱。各鲜壁虎色谱图中吸收峰的保留时间见表3。表3 各壁虎hplc指纹峰的保留时间（略）
聚类分析所得的树状关系图见图3。
3 讨论
壁虎和乙醇的选择:为尽可能全面地研究分析壁虎体内所含物质的抗肿瘤活性，需要尽可能多地将壁虎所含物质提取出来。选用乙醇是考虑到乙醇与水的互溶性，选择鲜壁虎是因为鲜壁虎自身含水。在第一遍用乙醇浸泡壁虎匀浆物时，壁虎体内所含的水溶性好的物质可借助于壁虎体液与乙醇的互溶而被提取出来，当抽滤分离后，滤渣中含水甚少，再次用乙醇浸泡滤渣时，可保证其中脂溶性良好的物质也被提取出来。若对壁虎干品进行同样的处理，则干壁虎所含有的水溶性物质就不可能被很好地提取出来。从干、鲜壁虎的色谱图中可以看到，在梯度洗脱的前半段时间，干壁虎的吸收峰数少、吸收强度低，而在后半段时间内，干、鲜壁虎的吸收峰数基本相等，但干壁虎的吸收强度要显著大于鲜壁虎的。
关于壁虎的hplc色谱图：鲜壁虎的乙醇提取液中所含物质种类繁多，在某一特定色谱条件下，不可能使所有的吸收峰都得到良好的分离，尽管在样品洗脱的初始阶段（前20min）吸收峰的分离状况不甚理想，峰的重叠相对较为严重；但色谱数据的稳定性良好，可以满足作为指纹图谱的需要。
关于相似度分析：仅从各壁虎在20 min以内的吸收峰的保留时间就可发现，在各吸收峰的保留时间序列中，各种壁虎均有峰的缺失。按时间序列，吸收峰的总数有20个，但六种壁虎的共有峰只有12个；因此从图谱的直观上就可以区分出不同的壁虎。为不同壁虎的鉴定提供了依据。
聚类分析的结果表明6种壁虎中，g.sw和g.a最为相似，相似度可达98.61%，当聚为五类时，两者为一类，其他壁虎各自为一类；当聚为四类时，g.sw和g.a为一类，g.h和g.j为第二类，g.su 和g.t各自为一类；当聚为两类时，g.sw、g.a、g.t和g.su为一类，而g.h和g.j为另一类。尽管在目前这12个共有峰尚未归属为某个确定的化合物，但随着研究的深入，各吸收峰的化合物名称及分子结构将一一确定；聚类分析将提供壁虎间相互替代的思路。
尚需解决的问题：拟通过后续的进一步分离纯化，以获得抗肿瘤活性成分的纯品及其抗肿瘤效果，并解决指纹图谱中各吸收峰的归属问题。
本文所介绍的壁虎hplc指纹图谱可用于壁虎的鉴定，聚类分析的结果给出了不同壁虎间的相似程度。
【参考 文献 】
液相色谱范文5
【摘要】
目的采用高效液相色谱（HPLC）法测定不同白芍药材中芍药苷含量，确定哪种白芍含芍药苷最高。方法采用色谱柱：Hypersil C18柱（4.6 mm×200 mm，5μm）；流动相：乙腈-0.05%磷酸水（14：86）；检测：UV 230 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：25℃。结果2年生、10月份采收贮存期短的亳州白芍芍药苷含量最高。结论该方法简便准确可靠、重复性好。
【关键词】 白芍 芍药苷 高效液相色谱 质量
Abstract:ObjectiveTo compare the quality of different Radix Raeoniae Alba with HPLC methods. MethodsThe separation was carried out on Hypersil C18 column（4.6 mm×200 mm，5μm）； the mobile phase was acetonitrile-H2O (acidified to 0.05% with phosphoric acid)（14∶86）；the flow-rate was 1.0mml/min； the column temperature was 25℃. ResultsThere was the highest content of paeoniflorin in Radix Paeoniae Alba of two -year-growing time harvested in October with short storage time.ConclusionThe method is simple， rapid with good reproducibility.
Key words:Radix Paeoniae Alba； Paeontflorin； HPLC； Quality
白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall的干燥根，其主要成分为芍药苷（Paeoniflorin）、芍药内脂苷（Albiflorin）、氧化芍药苷（Oxypaeoniflorin）、苯甲酰芍药苷（Benzoylpaeoniflorin），通称芍药总苷（total glucosides of paeony， TGP）。具有抗炎、抗病毒、解痉镇痛、护肝等多种药理活性。白芍药材及各种制剂均以芍药苷含量为质量控制标准。
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪（四元泵、柱温箱、MVD检测器、Agilent1100 色谱工作站）、电子分析天平AE240 （十万分之一，瑞士，METTLER-TOLEDO Co.）、CQ250超声波清洗器（上海超声波仪器厂）、UV-3300（日本日立公司）。
1.2 试药
芍药苷对照品（编号：0900-200102，含量测定用，中国药品生物制品检定所购），白芍药材经江西中医学院药用植物学科组鉴定符合2000年版《中国药典》白芍项下标准。乙腈为色谱纯（Merk Co.），水为双蒸水，其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液制备
精密称取白芍对照品适量，加50%乙醇制成每毫升含60 mg的溶液，摇匀，即得。
2.2 供试品溶液的制备
精密称取本品干燥的粉末0.5 g，置50 ml容量瓶中，精密加入50%乙醇35 ml，超声提取30 min，冷却，加50%乙醇至刻度，摇匀，滤过，再过0.45 μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
2.3 色谱条件
色谱柱： Hypersil C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）（大连Elite公司）；流动相：乙腈-0.05%磷酸水（14∶86）；检测：UV 230 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：25℃。理论塔板数以芍药苷峰计算不得低于2 000。在上述色谱条件下，取对照品溶液、供试品溶液各进样10 μl进行HPLC测定，结果见图1～2。由图中可见供试品中芍药苷与芍药苷对照品峰保留时间一致，并且与样品中其它组分达到了很好的分离。
2.4 线性关系
考察精密称取芍药苷对照品0.024 80 g，置50 ml容量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，即得到2.48 mg/ml的芍药苷对照品溶液，从中分别精密吸取0.25，0.5，2.5，5.0，10.0和15.0 ml的对照品溶液，分别置6个25 ml的容量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各10 μl，绘制标准曲线，得回归方程Y=1 809.398 4X+2.213 5，r=0.999 99。
2.5 提取方法的确定
本实验对提取溶剂、提取溶剂的浓度、提取时间、提取方法等进行综合考察，最后确定供试品溶液的制备方法为：用50%乙醇超声提取30 min即可。
2.6 精密度实验
精密吸取同一份供试品溶液10 μl，重复进样6次，测定芍药苷峰面积积分值，RSD为0.80%。
2.7 重现性实验
按“供试品溶液的制备”方法，对同一批样品分别制备6份供试品溶液，各吸取10 μl进样测定，测得芍药苷含量RSD为0.72%。
2.8 稳定性实验
取同一份供试品溶液在上述色谱条件下，分别在0，6，12，24，36，72 h各进样10 μl，测定芍药苷峰面积积分值RSD为0.64%。
2.9 回收率实验
采用加样回收测定法。分别精密称取已知含量（芍药苷1.778%）的样品约0.25 g，共6份，分别加入一定量的对照品（浓度为0. 88 mg/ml，精密加入5 ml），按“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，进行HPLC测定，测得芍药苷的平均回收率为99.92%，RSD为1.36%；结果见表1。结果表明，本法回收率高。表1 回收率实验结果（略）
2.10 样品含量测定
精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μl进样测定，结果见表2。表2 13批样品的芍药苷含量测定结果（略）
3 讨论
3.1 不同产地芍药苷含量差异 从芍药苷含量测定结果看，不同产地的白芍芍药苷含量各不相同。其主要成分芍药苷含量以亳州产白芍最高；本实验所用亳州白芍为带皮的根，与文献［1］报道的未去皮白芍药材中芍药苷含量最高相符。
3.2 不同采收期芍药苷量差异从芍药苷含量测定结果看，以四川白芍为例，采收期8月份，9月份，10月份芍药苷含量不同，采收期在10月份芍药苷含量最高，与文献［2］报道的采收期在10月份芍药苷含量最高相符。
3.3 贮存期对芍药苷含量的影响从白芍饮片1（贮存1年）、白芍饮片3（贮存2年）、白芍饮片4（贮存3年）芍药苷含量测定结果看，随贮存期的延长，白芍中芍药苷的含量呈下降趋势，所以白芍的贮存期不宜太长。
3.4 不同生长年限对芍药苷含量的影响不同生长期亳州白芍中芍药苷的含量不同，以2年生者含量最高，随着生长期的延长，芍药苷的含量呈下降趋势。据有关文献报道可能因为生长期长，淀粉含量增加，芍药苷在体内转化分解。这提示合理利用亳州白芍资源，可缩短生长期，增加芍药苷含量，即经济又有效。
总之，根据上述测定结果，可见本法操作简单，重现性好，可作为白芍质量控制的有效方法。
参考文献
［1］施大文，董欣，何婉霞．白芍的品质评价［J］.中药材，1988， 11(4)：39.
液相色谱范文6
【摘要】 建立了米面制品中硫脲的液相色谱串联质谱(LCMS/MS)测定方法。实验优化了样品提取方法、液相色谱条件和质谱参数。样品用80%乙醇超声波提取，离子交换色谱分离，色谱柱为NUCLEOSIL 1005SA 阳离子交换柱，流动相为乙腈(1%乙酸+0.2%乙酸铵)水溶液(30∶70)，流速0.5mL/min。采用电喷雾质谱正离子模式电离，多反应选择离子检测，检测离子对为m/z 77/60和m/z 77/43，其中m/z 77/60为定量离子对。结果表明: 本方法简便快速、准确可靠，相对标准偏差
【关键词】 硫脲， 液相色谱， 串联质谱， 面条， 米粉
1 引 言
硫脲(thiourea)又称硫代尿素，是一种纺织品的化学漂白剂，曾一度作为防腐剂，广泛用于各类需要漂白、保鲜防腐的食品。向食品中加入硫脲可阻止褐变，表观光亮，略带半透明。硫脲被人体摄入后危害健康，抑制甲状腺和造血器官的机能，引起中枢神经麻痹及呼吸和心脏功能降低等，甚至导致死亡。由于硫脲毒性大，我国已不允许其作为食品添加剂使用。近年有报道，我国东南沿海曾有用硫脲作为面条的增白剂、增筋剂，而目前我国尚无食品中硫脲测定的相关标准方法。在当今食品安全问题严峻的状况下，迫切需要尽快建立其检测方法。
目前，空气、水、土壤和生物等材料中硫脲的检测方法已有报道[1～4] ，通常采用高效液相色谱法;Raffaelli等[5]报道了用大气压化学电离质谱法测定废水中的硫脲。但至今未见食品中硫脲检测的相关报道。由于食品基质复杂，采用液相色谱法干扰很大，且灵敏度较低。本研究采用液相色谱串联质谱(LCMS/MS)法检测面条和米粉中的硫脲，考察了样品的提取方法，优化了色谱条件和质谱条件。本方法简便快速、准确可靠，检出限为0.5 mg/kg;定量下限为5 mg/kg，适用于面条、米粉等米面制品中硫脲的测定。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Agilent 1200LC/6410B MS液相色谱/串联四级杆质谱联用仪;AS 3120超声波发生器(Auto Science公司)， 功率250 W，频率33 kHz。
硫脲(Thiourea，纯度≥98.0%);硫脲标准溶液的配制：以水为溶剂配制质量浓度为1000 mg/L的标准溶液，经0.22 μm滤膜过滤后作为储备液。使用时用水逐级稀释至所需浓度;乙腈和甲醇(HPLC级);乙酸、乙酸胺、乙醇等(分析纯，广州化学试剂厂);实验用水为二次蒸馏水。
2.2 样品预处理
将样品用粉碎机粉碎，取 2.0 g 粉碎后的样品置于具塞三角瓶中，加入20.0 mL 80%乙醇溶液，盖上盖，超声波振荡提取15 min，将超声波提取后的样品混合物全部转移至离心管中，以3500 r/min离心15 min。移取上清液10.0 mL 至50 mL烧杯中，在68 ℃水浴上浓缩至约1 mL。然后转移至5 mL刻度试管中，用水洗涤烧杯多次，洗涤液合并入1.0 mL刻度的梨形瓶中，在50 ℃下吹氮浓缩定容至1.0 mL。
2.3 LCMS/MS测定
2.3.1 HPLC条件 色谱柱：NUCLEOSIL 1005SA 阳离子交换柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm); 流动相：乙腈(1% 乙酸+0.2% 乙酸铵)水溶液(30∶70， V/V)，流速0.5 mL/min。进样量5.0 μL。
2.3.2 质谱条件 电喷雾(ESI)正离子电离模式。干燥气(N2)温度350 ℃;雾化气(N2)压力276 kPa;干燥气(N2)流量9.00 L/min;电喷雾电压4000 V;检测离子对为 m/z 77/60和m/z 77/43，其中m/z 77/60为定量离子对;采集时间 200 ms;碎裂电压 80 V;碰撞能量 36 V(m/z 77/60)和48 V(m/z 77/43)。
2.3.3 测定方法 取样品溶液和标准溶液各5.0 μL注入液相色谱串联四级杆质谱仪进行分析，以其标准溶液峰的保留时间和质谱检测离子对 m/z 77/60 和 m/z 77/43 为依据进行定性分析，以定量离子对 m/z 77/60 的峰面积计算样品中硫脲的含量。
3 结果与讨论
3.1 液相色谱条件的优化
考察了C18柱、C8柱、NH2键合相柱及阳离子交换柱对硫脲分离的影响。结果表明：采用C18色谱柱时，当流动相为乙腈水体系时[4]，硫脲几乎无保留;当乙腈比例降低至10%时，硫脲仅有少许保留，保留时间为2.7 min(色谱柱规格为250 mm×4.6 mm，流速为1.0 mL/min，下同);当在流动相中添加庚烷磺酸盐离子对试剂时，硫脲的保留时间并无明显增加。采用C8色谱柱时，当流动相为乙腈庚烷磺酸盐体系时，随着乙腈比例从65%，40%至5%逐渐减少，硫脲的保留时间从2.9 min， 3.0 min至3.3 min逐步增加，但保留时间仍太短。采用NH2键合相色谱柱时，当流动相为乙腈水体系时，随着乙腈比例依次从70%， 80%， 90%增加到100%，硫脲的保留时间也从3.47 min， 3.55 min， 3.65 min延长到3.79 min，但增加幅度不大，保留时间较短，且峰形较宽。采用阳离子交换色谱柱时，当流动相为乙腈磷酸盐缓冲液和乙腈乙酸铵缓冲液体系时，乙腈比例为30%时，硫脲的保留时间为3.4 min，峰形较理想;随着乙腈比例的减少，硫脲的保留时间虽逐步增加，但增加幅度不大且色谱峰展宽严重;改变缓冲液的浓度和pH值，硫脲的保留时间并无明显改变。
以上实验表明，硫脲由于相对分子质量很小，极性较强，在各类型的色谱柱上保留时间均较小，用液相色谱紫外检测法测定实际样品时受到的干扰较严重。因此采用液相色谱串联质谱法测定。考虑到质谱法测定不能使用离子对试剂、磷酸盐缓冲液作流动相，并综合考虑保留时间和色谱峰形，故选择阳离子交换色谱柱和乙腈乙酸铵缓冲液体系。经实验本方法最终选择的色谱柱为NUCLEOSIL 1005SA 阳离子交换柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，流动相为乙腈(1%乙酸+0.2%乙酸铵)水溶液(30∶70，V/V)，流速0.5 mL/min。此条件下硫脲的保留时间为6.7 min，峰形较好。
3.2 质谱参数的优化
用0.5 mg/L硫脲标准溶液，采用ESI正离子模式进行一级质谱扫描，得到硫脲准分子离子峰m/z 77，即[M+H]+。以m/z 77为母离子作二级质谱，得到硫脲碎片离子峰m/z 60和43，即[M+H-NH3]+和[M+H-H2S]+。选择m/z 77/60和m/z 77/43离子对进行MRM模式检测，并对各质谱参数进行优化。优化后的质谱条件见2.3.2节。硫脲的(+)ESI二级质谱图见图1。优化后的硫脲标准溶液的HPLCMS/MS色谱图见图2。
3.3 样品前处理条件的优化
3.3.1 不同提取剂对硫脲提取效果的影响 比较了用氯仿、甲醇、乙醇、乙腈和水作提取剂的提取效果。在2.0 g 粉碎后的面条样品中加入11.6 mg/L硫脲标准溶液1.0 mL，待溶液完全被样品吸收后，再分别用氯仿、甲醇、乙醇、乙腈和水进行超声波振荡提取。按前述LCMS/MS方法测定硫脲的提取效率。结果表明，氯仿几乎无法提取出硫脲，甲醇、乙醇、乙腈和水的提取效率分别为 86.5%， 70.0%， 67.1%和88.3%，可见以水作提取剂的效率最高。但用水提取时，样品中的淀粉及其它添加剂也会被提取出来，导致提取液混浊且粘稠，后续处理很麻烦;而用甲醇和乙醇提取虽然效率略低，但提取液较干净，处理过程简便快捷。因此结合二者的优点，考虑用甲醇或乙醇和水的混合溶剂进行提取。分别考察了甲醇比例为20%～80%时的提取效果和乙醇比例为20%～80%时的提取效果，结果见表1。由表1可见，80%乙醇水混合溶剂的提取效果最佳。表1 不同比例的醇和水对硫脲的提取效果
3.3.2 提取时间对硫脲提取效果的影响 考察了超声波提取10， 15， 20， 25和30 min时的提取效果，其回收率分别为87.3%， 88.1%， 86.3%， 85.6%和85.8%。可见超声波提取时间对硫脲的提取效果影响不明显，超声10 min后提取率已基本稳定。本实验选择超声波提取时间为15 min，可满足分析要求。
综合以上结果，确定样品的最佳前处理条件为2.2节所述。由于采用MRM方式测定，避免了样品基体杂质的干扰，故样品提取后无需净化即可直接上机分析，简便快速，回收率较高。
3.4 线性范围、线性方程与检出限
取硫脲标准储备液逐级稀释成0.501，1.002，2.004，5.01，10.02和20.04 mg/L的系列标准溶液，进行LCMS/MS分析。以峰面积(A)和质量浓度(ρ，mg/L)作定量工作曲线，线性方程为A=1209ρ-30.91，相关系数为0.9999，在0.5～20 mg/L浓度范围内线性关系良好。当样品中的硫脲超过此线性范围时，可适当加大样品的稀释倍数。以信噪比S/N=3确定样品的检出限为0.5 mg/kg，采用标准添加法进行实测确定硫脲的定量下限为5.0 mg/kg，可满足米面制品中对硫脲的检测要求。
3.5 回收率和精密度
取不含硫脲的面条和米粉样品各3组，分别加入5.01，10.02和50.10 mg/kg硫脲标准溶液，待完全被样品吸收后，按实验方法测定硫脲的回收率，每组样品平行测定6次，结果见表2。由表2可见，面条样品中硫脲在添加水平5～50 mg/kg，其回收率为83%～89%，相对标准偏差为0.8%～4.0%;米粉样品中硫脲在添加水平5～50 mg/kg，其回收率为88%～90%，相对标准偏差为1.7%～3.3%。面条空白及加标样品的HPLCMS/MS总离子流色谱图见图3a和b。本方法回收率较难达到90%以上，可能是基质表2 标准加入样品中硫脲的回收率和相对标准偏差
参考文献
1 Stuttgart， Hirzel S， BUA (1995) Thiourea. German Chemical Society (GDCh) Advisory Committee on Existing Chemicals of Environmental Relevance (BUA). Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft(BUA Report 179)
2 Hashimoto A. Anal. Chem.， 1979， 51(3): 385～387
3 Kobayashi H， Matano O， Goto S. Journal of Chromatography， 1981， 207: 281～285