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sip协议范文1
关键词：软交换 sip
中图分类号：TP302.1 文献标识码：A 文章编号：1007-9416（2013）02-0051-01
当今社会是信息爆炸的社会，随着网络业务的飞速发展，电信网中的数据业务量越来越大。而目前许多的数据业务还在传统的公众交换电话网（PSTN）上传送，这些数据量很大的数据业务给并不适合传送数据业务的电话网造成了巨大的压力。因此，基于分组技术的数据网与电路交换网最终必将走向融合，产生下一代由业务驱动的网络即下一代网络。软交换是下一代网络交换的核心，如果说传统电信网络是基于程控交换机的网络，而下一代网络则是基于软交换的网络。
1 软交换
软交换的概念最早起源于美国。当时在企业网络环境下，用户采用基于以太网的电话，通过一套基于PC服务器的呼叫控制软件（Call Manager、Call Server），实现PBX（Private Branch eXchange，用户级交换机）功能（IP PBX）。对于这样一套设备，系统不需单独铺设网络，而只通过与局域网共享就可实现管理与维护的统一，综合成本远低于传统的PBX。由于企业网环境对设备的可靠性、计费和管理要求不高，主要用于满足通信需求，设备门槛低，许多设备商都可提供此类解决方案，因此IP PBX应用获得了巨大成功。受到IP PBX成功的启发，为了提高网络综合运营效益，网络的发展更加趋于合理、开放，更好的服务于用户。业界提出了这样一种思想：将传统的交换设备部件化，分为呼叫控制与媒体处理，二者之间采用标准协议（MGCP、H248）且主要使用纯软件进行处理，于是，Soft Switch（软交换）技术应运而生。软交换概念一经提出，很快便得到了业界的广泛认同和重视，ISC（International Soft Switch Consortium）的成立更加快了软交换技术的发展步伐，软交换相关标准和协议得到了IETF、ITU-T等国际标准化组织的重视。
2 SIP协议介绍
会话初始化协议SIP（Session Initiation Protocol）是一个面向Internet 会议和电话的简单信令协议。SIP协议是应用层信令协议，定义了用户间交互式媒体会话的发起，修改和终止过程，它的主要目的是为了解决IP网中的信令控制，以及同软交换机的通信，从而构成新一代的通信平台。SIP协议最早由是由MMUSIC IETF工作组在1995年研究的，由IETF组织在1999年提议成为的一个标准。 SIP主要借鉴了Web网的HTTP和SMTP两个协议。目前仍在不断的发展之中。
SIP协议可用于发起会话，也可以用于邀请成员加入已经用其它方式建立的会话，同时SIP协议的编码采用的是最基本的文本编码，使得它的通用性和保密性得到了很大的提升。同时SIP协议在信息交互时采用事务机制，每一个请求触发Server的操作方法，请求和响应构成一个事务，事务间彼此独立。在传输方面SIP协议承载在IP网，网络层协议为IP，传输层协议可用TCP或UDP，推荐首选UDP。
用SIP来建立通讯通常需要有六个步骤（如图1所示）：
（1）登记，发起和定位用户；
（2）进行媒体协商--通常采用SDP方式来携带媒体参数；
（3）由被叫方来决定是否接纳该呼叫；
（4）呼叫媒体流建立并交互；
（5）呼叫更改或处理；
（6）呼叫终止。
这六个步骤需要会话发起者A与服务器，服务器与会话接受者B之间进行11次会话协商，分别为：
（1）用户摘机发起一路呼叫，终端A向该区域的服务器发起lnvitc请求；
（2）服务器通过认证/计费中心确认用户认证已通过后，检查请求消息中的Via头域中是否已包含其地址。若已包含，说明发生环回，返回指示错误的应答；如果没有问题，服务器在请求消息的Via头域插入自身地址，并向lnvitc消息的To域所指示的被叫终端B转送lnvitc请求；
（3）服务器向终端A送呼叫处理中的应答消息，100Trying；
（4）终端B向服务器送呼叫处理中的应答消息，100Trying；
（5）终端B指示被叫用户振铃，用户振铃后，向服务器发送180Ringing振铃信息；
（6）服务器向终端A转发被叫用户振铃信息；
（7）被叫用户摘机，终端B向服务器返回表示连接成功的应答（2000K）；
（8）服务器向终端A转发该成功指示（2000K）；
（9）终端A收到消息后，向服务器发ACK消息进行确认；
（10）服务器将ACK确认消息转发给终端B；
（11）主被叫用户之间建立通信连接，开始通话。
3 结语
SIP协议在软交换网络中的应用范围非常广泛。但是现在SIP对许多传统业务的支持能力还是有限，所以对SIP协议的研究也是任重而道远。由于SIP易于扩展的特性，不同厂家的实现难免有许多自己的发挥，也加大了SIP协议互通的难度。但是无论如何，SIP的诸多优点还是有目共睹的，SIP在软交换网络中的应用必然越来越广泛。
参考文献
sip协议范文2
关键词：Android系统；SIP协议；旅游信息终端；RTP
传统的旅游信息是在Web网页上的，可能存在很多缺点，比如：信息混乱，内容复杂，广告多，搜索时间长，用户界面的视觉效果差等等。用户经常花费很多时间用来搜索信息，但是通常却找不到他们想要的信息。手机对人们来说，或许已成为必不可少的一部分，因此对更多人来说其成本更低，使用更为方便快捷。目前，市面上并没有一个完整的旅游信息平台。
本文提出了一个基于Android技术的旅游信息系统应用程序。旅游信息终端的通信架构是基于SIP（会话初始协议）协议设计的，其中浏览旅游信息的音频和视频模块是基于H.264协议和RTP（实时传输协议）设计的。旅游信息是通过区域实现模块分化的，用户可以选择景点并播放关于该景点的音频或视频信息，或者阅读图片和文本信息，从而选定最感兴趣的景点游玩。
1.技术原理
旅游信息终端使用SIP协议作为基本层。SIP协议是由IETF（因特网工程任务组）制定的多媒体通信协议，广泛用于控制交流会话。它依赖于传输层，其中会话可能由音频信息和视频信息共同构成。
SIP模块分为用户，服务器和注册服务器3部分。当用户发送一个音频或视频请求，用户首先向注册服务器发送注册请求。当注册服务器通过注册请求之后，音频或视频请求则被发送到服务器响应请求，以允许播放音频或视频信息。图1显示了一个基于SIP协议的音频或视频通信过程。
2.旅游信息终端的设计
本文提出的旅游信息终端系统采用当前最热的Android技术，如图2所示。旅游信息终端的通信架构是基于SIP协议设计的，其中浏览旅游信息的音频和视频模块是基于H.264协议和RTP（实时传输协议）设计的。该系统采用信号控制层和SIP协议共同完成信号控制。音频和视频信息传输层是实现层，包含了RTP传输模块、媒体模块及其他模块等。
当用户想看多媒体的信息时，开放媒体线程的请求被发送到服务器。多媒体信息通过H.264协议编码并压缩，然后再使用RTP协议发送到响应的接收线程中。通过H.264协议进行解码处理后，用户打开音频和视频线程查看信息。图3显示了整个处理过程。
本文的旅游信息终端以天津这个城市为例。根据天津的区域分布，旅游信息终端在此基础上按照其街区进行划分景点。天津市分为16个区，比如河北区、河西区、北城区、西青区等等（见图4）。当用户打开软件时，第一次使用会提示一个新手引导页面。每个区域的景点都有完整的信息介绍。
用户可以通过使用这个程序查看周边景点信息，也可以浏览在其他区域的景点信息。这种一站式信息检索可以为游客节省大量的时间，它让用户有更多的时间来制定一个更合理的旅行计划。当用户查询景点信息时，该软件会向用户提供多样的景点介绍方式，比如文本信息、图像信息、语音信息等等。当用户不方便阅读文本信息时，多元化的信息服务为用户提供了便捷的选择，比如通过音频信息来了解景点。
打开应用程序后，用户可以看见一些天津特色景点的推荐。用户可以通过点击景点图片从而浏览任意景点，也可以在主页面搜索景点。例如，天津五大道景点，用户可以输入天津第五大道后搜索，打开相应的景点介绍页面。在景点介绍页面，用户可以看到关于第五大道的文本、图片和视频信息。这些可以让用户更加了解第五大道，并帮助用户决断是否去参观该景点，如图5所示。
sip协议范文3
关键词:SIP;IP;MPEG4;软交换;视频监控
中图分类号:TP393文献标识码:A 文章编号:1009-3044(2010)01-74-03
The Design and Implementation of Video Monitoring System Based on SIP
HUANG Lun-wen, CHENG Yong, LI Han
(Anhui Sun Create Electronics Co., Ltd, Hefei 230088, China)
Abstract: How to set up a remote network video connections, NAT penetration, efficient video stream encoding and decoding is the research in the field of video monitoring. MEPG4 video encoding formats, which is of high compression ratio, is used in the SIP-based network video monitoring system. The system supports multi-channel IP video, using soft-switching platform for centralized management of the video stream to achieve the establishment of a network video connection, video streaming encoding and decoding, encryption, transmission, and intelligent alarm, video capture, playback and other functions.
Key words: SIP; IP; MPEG4; soft switch; video monitoring
近年来,随着各类如地震、冰雪等自然灾害和恐怖事件频繁发生,公共安全已经得到世界各国的高度重视。各级政府和单位投入大量的人力、物力研究新型安全防范系统。其中视频监控是安全防范的重要组成部分,它是一种可靠、防范能力极强的综合系统[1-2]。
SIP(Session Initiation Protocol)会话初始协议是IETF制订的,用于多方多媒体通信,是一个基于文本的应用层控制协议,独立于底层传输协议TCP/UDP/SCTP,用于建立、修改和终止IP网上的双方或多方多媒体会话[3-4],与RTP、RTCP、SDP等协议结合可实现语音、视频通讯;SIP协议可在TCP或UDP之上传送,由于SIP本身具有握手机制,可首选UDP。
1 视频监控系统的构架和工作原理
1.1 系统构成
该视频调度监控系统由视频嵌入式终端、监控管理平台以及SIP服务器系统三部分组成。其结构如图1所示。
其中嵌入式终端是基于SIP信令构建的系统,在SIP网元中也可以把它看作是包含媒体通讯功能的UA客户端。主要完成信号的采集、信号处理和前端摄像机的控制工作。
SIP服务器系统主要包括信令服务器(定位、、注册)、媒体服务器(转发、存储等)以及报警服务器等。当有监控中心向服务器发出监控请求时能够找到相应的监控设备,并且把请求转发到嵌入式终端。
监控管理平台是一个标准的SIP设备,用户除了可以观看监控现场的图像以外,通过扩展SIP信令,还可以支持授权用户对云台系统的控制。这里的管理平台可分为监控中心(外接电视墙或电视机),软件管理平台(其中包括在本地局域网内的客户端)和支持SIP的移动设备,如笔记本电脑、可视电话、SIP手机等。
1.2 系统的工作原理
嵌入式终端注册到SIP服务器,如果监控管理平台需要监控某个终端,可以发出接入请求,SIP服务器可以找到终端所在地,然后建立连接。连接建立后,嵌入式终端系统采集音视频的模拟信号,然后转化为数字信号,经过编码器编码后(如MPEG-4编码)传送给视频监控服务器,视频监控服务器把视频数据进行IP封装后发送到监控管理平台。
2 嵌入式终端设计
嵌入式终端采用Z228芯片开发,Z228是上海杰得微电子自主开发的多媒体应用处理器,是中国第一款0.13微米的高度集成的低功耗的具有强大多媒体处理能力的 SoC 芯片,单芯片包含了ARM926EJ CPU和MPEG-4硬件编码器[5]。嵌入式终端的主要功能是视频的采集、A/D转换、编码、发送等功能。
2.1 硬件体系结构
如图2所示,摄像头连接到视频输入接口,采集到的模拟视频数据经过A/D转换后进入高性能处理芯片,高性能处理芯片集成了硬件编码芯片和ARM处理器,数据经过硬件编码后成为高压缩比的MPEG4数据,通过RJ45接口传送到网络上。摄像头连接到云台上,使云台带动摄像头移动,摄像头以及云台的控制接口和控制器相连,控制器再和集成电路板上的485接口相连,这样就可以用485协议通过控制器对云台进行移动控制以及对摄像头进行变焦等操作。
2.2 MPEG-4编码
系统采用的视频编码格式是MPEG-4。
编码的过程如图3所示:
1)初始化阶段:初始一个实例,调用函数:MP4EncInit;
2)选项配置:对编码的码率等参数进行配置,调用函数:MP4EncSetRateCtrl、MP4EncSetCodingCtr、MP4EnSetUsrData、MP4EncSetSmooth、MP4EncSetCrop;
3)采集视频流:获取产生MPEG4码流的头信息,调用函数:MP4EncStrmStar;
4)数据编码:每次得到YUV的图像帧后,产生这一帧的码流。调用函数:MP4EncStrmEncode;
5)输出数据:把编码过的数据打包,经过RTP传到SIP服务器;
6)停止数据流:一个码流数据的结束,调用函数:MP4EncStrmEnd;
7)释放资源:释放初始化的实例,调用函数:MP4EncRelease。
2.3 媒体数据的发送
SIP连接建立成功以后,双方视频通道建立,在IP层上进行视频数据传递,利用RTP(实时传输协议)和RTCP(实时传输控制协议)通过UDP传输数据。RTP和RTCP配合使用,能以有效的反馈和最小的开销使传输效率最佳化,故特别适合传送网上的实时数据[6]。
RTP提供具有实时特征的、端到端的数据传输服务。在视频数据前插入包含有载荷标识、序号、时间戳和同步源标识符的RTP包头,然后利用数据报套接字(UDP)在IP网络上传输RTP包。
RTCP负责管理传输质量在当前应用进程之间交换控制信息。在RTP会话期间,各参与者周期性地传送RTCP包,包中含有已发送的数据包的数量、丢失的数据包的数量等统计资料。SIP服务器可以利用这些信息动态地改变传输速率,甚至改变有效载荷类型。
3 SIP服务器
SIP用来建立,改变,认证和终止基于IP网络的多个SIP的视频接入。在此接入过程的基础上很容易的实现多方的音视频、文本等各种类型的媒体会话。参与会话的成员可以通过组播方式、单播连网或者两者结合的形式进行通信。SIP服务器包括信令服务器、媒体服务器、监控服务器。
3.1 信令服务器
信令服务器用于响应SIP终端注册以及连接建立,图4是一个完整的SIP视频的建立流程[7-8]。
嵌入式终端和监控管理平台首先向Sip Proxy(SIP注册服务器)发起注册;当监控中心要接入某路视频时,监控软件经SIP服务器向特定嵌入式终端发起包含SDP(Session Description Protocol 会话描述协议)结构的INVITE请求,嵌入式终端返回180响铃消息,然后嵌入式终端返回包含SDP结构的200OK数据包表示同意接听,并且进行媒体协商,最后监控软件向嵌入式终端发送ACK确认包,此时通话建立;启动媒体和485总线的相关线程。
当断开某路视频时,监控软件向嵌入式终端发BYE消息,嵌入式终端返回200OK,则连接断开。
3.2 媒体服务器
媒体服务器的主要作用是媒体流数据的转发、录像、点播等功能。
当监控管理平台和嵌入式采集终端连接成功后,媒体服务器建立起映射关系,嵌入式采集终端采集现场实时图像,进行编码打包后发送到媒体服务器,媒体服务器根据该连接的映射关系,把IP视频包转发至监控管理平台;而监控管理平台通过同样的方法实现对嵌入式采集终端的各种控制命令的发送。
媒体服务器的另一个重要功能是视频流的存储点播。媒体服务器可以把经过该服务器的视频数据保存到硬盘中,用户可以对视频数据进行检索和回放。当监控系统比较庞大,一台媒体服务器无法满足整个系统需求时,可以对媒体服务器进行扩展,使用多台媒体服务器并发协作执行。
3.3 监控服务器
当摄像机收集到异常信号(如探测到了高温信号,认为发生了火灾)后,将其通过监控系统传至报警联动装置,再由报警联动装置通过某种通信手段(如手机短信、E-mail等)自动向监控人员发出报警信号,或者系统自动地处理现场(如火灾时断电等)。
4 监控管理平台
SIP监控平台的主要作用是连接并控制远程视频,视频流接收、解码、回放等。
4.1 平台构成
监控管理平台包含SIP模块、RTP模块、XVID模块、远程控制模块等。分别实现远程网络视频连接的建立、视频流接收、解码播放、远程控制等功能。每个监控平台可以同时监控多路视频,能够对视频数据进行拍照或录像,对摄像头和云台进行操控。对指定区域的情况实时监测报警。
监控平台另一个重要的功能是通过图像处理算法对比一段时间间隔的图像数据的相似性,来识别指定区域是否有异常活动,实现自动报警、抓拍、跟踪等功能。
4.2 MPEG-4解码
从SIP服务器转发过来的的视频流,需要解码后,才能呈现图象,解码包含Decoder 和VPD 2 部分。其中Decode 用于数据的读取和解码,而VPD 用于图像缩放、格式转换等处理。
解码流程如图5所示:
1)初始化:初始化Decoder和VPD实例,调用函数:MP4DecInit、VPDInit;
2)取数据头信息:启动接收MPEG-4数据流,解出视频数据的头信息,调用函数:MP4DecDecode;
3)预留视频图象处理空间;
4)配置VPD:根据头信息中码流的宽高等,配置VPD模块。根据需要,将输出配置为Framebuffer或者内存。调用函数:VPDGetConfig、VPDSetConfig;
5)解码:根据头信息接收解码单元(一段数据),解码单元内的数据。一帧图像解码完毕则输出显示,否则继续解码,调用函数:MP4DecDecode;
6)释放资源:结束时候,释放相关实例,调用函数:VPDRelease、MP4DecRelease。
5 结束语
该文设计和实现了一种基于SIP的视频监控系统。该系统使用嵌入式设备代替传统的监控系统,传输方式采用了集中管理代替点对点的方式,提高了监控设备的可靠性、灵活性、易管理性。SIP监控适合应用于大规模分布式监控,具有IPV4/IPV6双协议栈,不仅应用于现在的网络,也可平滑过度到下一代网络。随着SIP相关技术的成熟,SIP将成为视频监控领域主流信令控制协议之一,具有广阔的发展空间。
参考文献:
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[6] 蒋建国,苏兆品,李援,等.RTP/RTCP自适应流量控制算法[J].电子学报,2006,34(9):1659-1662.
sip协议范文4
关键词：TRIPS协议；错误；胁迫；统一性；多样性
中图分类号：D993.8
文献标识码：A
文章编号：1009—3060（2012）03—0109-06
“条约的成立以缔约各方意思表示的一致为要件。但意思表示的一致还必须是自由的，才能使形式上有效的条约在实质上也有效。所以，同意的自由是条约的实质有效要件之一。同意自由有欠缺，在条约法术语上称为同意的瑕疵，对条约的实质有效有不利的影响。《维也纳条约法公约》也将下列四种同意的瑕疵：错误、欺诈、贿赂、强迫，明文规定为导致条约在实质上无效的原因。仔细分析TRIPS协议的订立过程，不难发现发展中国家同意存在“瑕疵”，尽管这种“瑕疵”的程度是否足以导致该协议无效不是本文重点，但是，分析发展中国家同意的“瑕疵”，在很大程度上可以帮助我们理解发展中国家实施TRIPS协议艰难处境产生的原因。
一、发展中国家意思的“错误”
在条约法上，错误可以分为两种情况：（1）缔约一方或双方因对有关的事实或法律认识错误而缔结条约：（2）缔约一方或双方并无第一种错误，而只是用了错误的字句来表达其所订条约的条款。
我们现在回头审视发展中国家接受TRIPS协议的前前后后。可以概括发展中国家缔约过程中明显的“错误”。
首先，以为TRIPS协议的目标如其所述，像发达国家所承诺的，可以带给发展中国家所期望的未来。这明显涉及协议的两个条款的规定。一是有关“国内公共政策目标在知识产权法律体系中地位”的规定。TRIPS协议前言规定各成员“认识到各国知识产权保护制度的基本公共政策目标，包括发展目标和技术目标”，追本溯源，该条文来自发展中国家提交的14国提案。发展中国家坚持在TRIPS协议前言中写入该条文是为了要TRIPS协议明确承认：就建构各国的知识产权保护制度而言，各国的公共政策目标处于制度建构的基础地位。因此，发展中国家期望该条文能够成为界定保护知识产权这一“私权”与实现各国公共政策目标之间关系及其性质的条款，明确承认包括发展目标和技术目标在内的公共政策目标在知识产权保护体系中具有基础性的地位和作用，保护本身并不是目的。二是TRIPS协议第7条的有关协议的目标中鼓励向发展中国家技术转让的规定。该规定指出：“知识产权的保护和实施应有助于促进技术的革新及技术转让和传播，有助于技术知识的创造者和使用者的相互利益，并有助于社会和经济福利及权利与义务的平衡”。目标强调知识生产者和使用者的利益平衡，以促进技术知识市场的良性循环。而且在TRIPS协议的第六部分第67条专门对“技术合作”作出规定，涉及到发展中国家的优惠安排。它要求发达国家提供使发展中和最不发达国家成员受益的技术和金融合作，包括鼓励向最不发达国家的技术转让。
事实上，TRIPS协议的整体证明了其更多的是一个私人权利制度。它扩大了的专利保护客体以及从保护中排除一定发明的不法性，毫无疑问的有利于私人利益。延长了的保护期限及其在所有领域所有产品上的适用性，也对私人利益有利。TRIPS协议关于平行进口的规定表明上看是中性的，可其效果还是更多对私人有利。此外，TRIPS第31条允许强制许可制度是否还能支持公共利益是值得怀疑的。因为，列出的例外和大量制定的条件对发展中国家和公众不利，解决的办法只有通过对其解释、修订，以减少限制，但包括努力消除强制许可的主张将进一步危害发展中国家可期待利益。当条款和目标寻求实现私人和公共利益的适当平衡时，可能该平衡比现实更加不可琢磨。可TRIPS协议创立的这种平衡已明显倾向私人利益。可见，对发展中国家公共政策目标的承认只是留于表面，限于原则性的规定，没有起到真正的作用。而TRIPS协议有关鼓励向发展中国家技术转让的规定，因为缺乏相应的、具体可操作的安排，更像是协议在有利于保护发达国家成员的总体趋势下，不得不做出一点照顾发展中国家成员的样子。
其次，以为接受TRIPS协议所导致的损失可以通过发达国家降低纺织品和农产品的关税得到补偿。由于存在诸多原因，TRIPS协议是发达国家和欠发达国家相互妥协的产物。当发展中国家加强对其境内的发达国家的知识产权的保护时，作为回报，发达国家同意降低纺织品和农产品的关税。从乌拉圭回合谈判中，美国与发展中国家在知识产权和纺织品、农业等问题的讨论实际上是发展中国家的一个重大的战略失误。只要仔细分析就不难发现其中的原因。首先，在知识经济时代，知识产权已经成为一个特别重要的问题。信息工业，而不是农业或制造业将会成为21世纪的主要驱动力。发展中国家在WTO体制下的农业和纺织业所获得的利益根本无法弥补其在知识产权领域内的损失。发展中国家在WTO的安排下显然是个失落者。更糟的是，这个偏向于知识产权领域的不公平体制迫使他们使用那些已经过时了的竞争模式，这样就使得发展中国家为了赶上发达国家的步伐所做的努力付之东流。众所周知，尽管发展中国家在TRIPS协议上做出巨大的妥协，但他们仍然未能在削减关税、农业和纺织品领域内的补贴上获得其所期望的应有的回报。这种失望加剧了早期存在问题的暴露，事实上，因为这次的挫败和失望，发展中国家从WTO前行的过程中醒悟过来，坎昆部长会议的失败，以及多哈会合谈判至今无果应该就是醒悟的表现之一。
第三，以为TRIPS协议切实考虑到发展中国家特殊情况，做出的一些优惠发展中国家的特殊安排，可以缓解其执行协议过程中的压力。发展中国家由于缺乏精通国际知识产权法的专家导致其对TRIPS协议规定内容的理解不充分，TRIPS协议制定过程中无法充分保护自己的利益。原以为TRIPS协议可以带来一些优惠的措施和待遇，最后却发现不可能带给发展中国家任何特别的优惠。根据WTO秘书处的分析，可以按照特殊措施的性质，将乌拉圭回合一揽子协议中专门针对发展中国家和最不发达国家的特殊条款分为四类：（1）总体上对发展中国家和最不发达国家利益的承认，（2）减轻应履行的规则和义务的量，（3）规定较长的特定义务的实施期，（4）提供技术援助。①但是，TRIPS协议的优惠条款（除《伯尔尼公约》已有规定的以外）中，唯独不包括第二类——减轻义务和差别规则的规定。同时，另外三类特殊条款中，真正在法律上具有直接操作性的是第三类条款——延长期条款。这个内容规定在TRIPS协议第65条中。因此，事实上，TRIPS协议中真正直接指向发展中国家的优惠条款只有“第三类——过渡期条款”和“第四类——提供技术援助条款”，而“第一类——总体利益的承认”是指向最不发达国家的。实践证明过渡期条款对发展中国家带来的优惠非常有限，甚至被发达国家立法技术处理过以后对发展中国家的意义已经很小了。技术援助条款由于没有具体实施安排，几乎是不具有可操作性的。相反地，发达国家则可以充分地利用TRIPS协议中的规则使自己处于有利地位，而置发展中国家于不利境地。以TRIPS协议中专利药品规定为例，TRIPS协议既保护产品专利权又保护生产过程专利权，使得药品的20年产品专利权保护期到期后还可以为其生产过程申请更长的保护期。因此，跨国药业公司完全可以通过申请延长某一药品的生产过程、药品使用形式、剂量形式和混合形式专利延长对此种药品的垄断。美国的药品专利权就曾在其基本药物活性成分的产品专利权早已失效的情况下以新的混合药品的形式存在。
条约法强调，关于要素错误，以缔约方对于重要的事实发生错误为要件，换言之，以缔约方在缔约当时如果知道真正的事实将不同意缔约为要件。如果错误不是有关重要的事实，也就是说缔约方在缔约当时如果知道真正的事实仍会同意缔约，那么这个事实的错误就不是重要的事实错误，不构成关于要素错误。笔者认为发展中国家的错误足以构成要素错误。尽管导致发展中国家产生这种错误的原因是多方面的，却不可否认发达国家的引诱在其中的“功劳”。
二、发达国家的“强迫”
强迫对条约效力的影响问题，不仅关系到条约当事国相互的权利义务，而且也涉及国家社会中所实行的是法治还是武力统治的问题。按照条约法理论，在条约缔结过程中缔约国实施的强迫，可以分为两种情形：对另一缔约国实施的强迫；对另一缔约国的代表实施的强迫。历史上强迫情形下缔约的事例不少。我们回顾TRIPS协议签订过程美国等发达国家的所作所为，不难发现他们强迫发展中国家按照其意图接受TRIPS协议的因素。
美国对WIPO的关注始于上世纪七十年代，也就在那个时候发展中国家在国际专利体制中开始发挥越来越大的作用。在1980年至1984年举行的WIPO外交会议上，这些发展中国家政府要求对巴黎公约的专利条款进行修订，赋予其优惠待遇。美国对任何削弱公约的行动均表示强烈反对。1985年外交会议结束时，实际上是陷入一种僵局，没实现对公约的任何修订。
虽然成功地抵制了对巴黎公约的“破坏”，美国政府仍然受到本国知识产权工业界不断增长的压力。国际上的律师和国际关系理论家经常将国家视为一个单一的行动者，在与其他国家进行谈判时能以实现合理地计算及追求本国的利益。但实际上，国家间关系远没这么简单。公共选择理论就将政府决策视为利益群体政治的产物。它认为那些有着强烈自身利益的利益群体如果能从某种规则中获得市场所无法给予的好处时，他们就会不惜血本去游说政府官员。与广泛组织起来的投票者或消费者相比，这些利益群体有更低的信息和组织成本，他们容易成功地筹集资金来影响立法结果。从公共选择的角度来审视国际立法有助于辩识究竟哪些政府或私人在推动国家寻求建立或改变某种国际制度。从WIPO、GATT直至TRIPS，表面上是美国和欧盟的贸易官员将知识产权纳入WTO。
但是，实际上，它主要是美国和欧盟在其知识产权产业界推动下采取的一种战略，这些对知识产权立法现状不满的产业界预见到将知识产权谈判转移到贸易制度上将会产生十分可观的利益。他们要求通过打击世界范围内的侵权并提高保护标准以增强其竞争力，而对专利保护谈判的持续失败使美国最终认定通过WIPO无法实现其目的。从上世纪80年代开始，美国政府通过与发展中国家的一系列双边谈判将知识产权与贸易联系起来，从而迫使对方提高保护标准。为了迫使发展中国家接受美国的知识产权标准，从19世纪80年代中期开始，美国贸易代表办公室根据1974年贸易法301条款的授权，每年将那些不对美国知识产权提供足够保护的国家列入“观察国家”和“重点观察国家”。并通知那些被列入观察表的国家，如果他们不改变国内的专利法，美国将对他们实施贸易制裁（以对他们出口到美国的商品征税的形式）。这种情况在1988年当国会制定了1988年贸易法“特殊的301条”后就更加变本加厉，这个规定要求美国贸易代表办公室对那些不修改他们专利法的国家实施制裁。尽管美国贸易代表办公室将十多个国家列入观察国家，其制裁威胁的主要目标是那些开始发展国内工业和美国竞争比较大的发展中国家和地区。印度，阿根廷，巴西，台湾和泰国都在他们的国内或地区内的市场生产药品。1988年10月在知识产权的舞台上美国第一次实施了它的贸易制裁。作为对PMA提讼的回应，在长期的谈判之后里根政府对从巴西进口的价值3900万美元的货物征收100%的关税。里根政府声称这个数量与由于巴西对药品缺少相关的专利保护给美国药品生产商带来的市场损失相等。巴西政府和媒体对此反应强烈。巴西政府指责根据GATT美国现在的单边行为是不合法的，并指出贸易协定要求成员国通过GATT争端解决机制来解决争端。美国的制裁成功的改变了巴西的专利法，但是巴西政府态度的变更仍然没有使美国满意。直到1990年，当新自由主义政府的新总统（Fernando Collor de Mello）同意修改专利法以提供更强的专利保护，美国政府才撤销了制裁。1990年协定进一步缓解了美国巴西冲突的紧张形势，但它并没有完全消除摩擦。USTR在1991年和1992年将巴西列入它的优先观察国家，并在1993年仍称巴西为最严重的知识产权侵犯者之一，列为优先观察国。
美国也对其他一些认定为侵犯美国公司知识产权的国家施加同样的持续压力。在美国的强大压力面前，泰国和台湾等都同意对他们的专利法进行相当大的改变，这方面的成功极大鼓励了美国政府，于是，在知识产权所有者的推动下，美国转向多边途径。在1986年GATT乌拉圭回合谈判中，美国极力主张将知识产权纳入谈判议题。随后欧盟也对此进行认可，并在与贸易有关的知识产权的谈判方面强力迫使发展中成员方接受自己的建议。到1994年春天，在国际上美国和欧盟成功使有强制力的知识产权规范纳入到世界贸易体系中。WTO中出现了与贸易有关的知识产权协议，所有WTO成员国必须遵守这个协议。
归根结底WTO的制度性特点，使其成为美国等发达国家迫使发展中国家提高知识产权保护标准谈判的最佳场所。一方面，这些国家在GATT/WTO上享有非同寻常的谈判主导地位。作为有着最大国内市场的地区和国家，通过承诺对国外货物开放或者威胁去关闭其本国市场，欧盟和美国有着极大的实力按照他们的利益去形成贸易交易。因此，GATT/WTO谈判采用协商一致同意的决策机制，由于美国和欧盟掌握着主动权，他们完全可以阻碍发展中国家提出反对意见。在一定程度上，协商一致同意掩盖了GATT/WTO运作中实际存在的实力决定一切的本质，并且使公约谈判作为平等基础上一致同意的产物具有了合法的外衣。另一方面，即便发展中国家准备默许在更强有力的贸易制度中纳入知识产权和其他新的主题，如果美国不废弃或明显地减少其在上世纪80年代所采取的那种贸易制裁政策，发展中国家应该不会真正去那样做。就美国“特别301条款”与TRIPS协议以及DSU的关系看，正如有的论者指出的那样，“特别301条款”的目的在于向国外推行美国知识产权的高标准保护，TRIPS协议的实体条款在很大程度上就是美国“特别301条款”的国际化，因此二者的目标基本上是一直的。从手段上看，将裁决与贸易制裁联系起来，并且规定可以授权进行交叉报复，从而保证败诉方执行裁决，这种手段正是美国“特别301条款”所追求的。从程序上看，规定的程序也几乎是美国“301条款规定”程序的国际化版。而从TRIPS协议的实体规范内容中，也很容易发现其中的很多措辞和表述都来源于美国的知识产权法律，或与美国的知识产权法律有着密切的联系。TRIPS协议详细规定了对于版权及其邻接权、商标等知识产权的保护。其中许多内容与美国的知识产权保护标准密切相关，实现了美国的意愿。如TRIPS协议第一次按照美国的做法将商业秘密纳入了知识产权的范围。美国强调的是其强项，而将发展中国家占强项的民间艺术、传统知识（如中国的中药专利）排除在保护之外。因此，西方知识产权体制之所以会成为全世界通用的体制，是因为它有强大的军事实力做后盾，而不是该制度体现了全球普遍价值。
三、知识产权保护的统一化与多样化
TRIPS协议生效后发展中国家在执行TRIPS协议过程中的困境可以帮助证明发展中国家成员当初缔约过程的担忧和非自愿的现实性及合理性，有力地表明缔约瑕疵对条约执行的不利影响，甚至对条约必须信守原则产生的破坏作用。
1 知识产权保护统一化与多样化的抉择
通常情形如果你不知道一个制度是好还是坏的话，最安全的政策结论就是接触它。我们不能在没有专利体制的情况下，简单地依据我们目前能够产生经济效益的知识建议设计一个专利体系，因为这将是不负责任的。同样，当已经拥有专利体制很长时间了，我们也不能基于以前的知识简单要求废除它，这也是不负责任的、不现实的。而且毕竟知识产权国际统一化、协调化有其原因。首先，协调与统一化可使知识产权的国际保护法律能够利用其他一些国家在这一法律制度上所取得的成果。国际知识产权法律，就使得后接受这种法律制度的国家不再能够对先前其他国家已经取得的发明和创造免费搭便车。第二，协调和统一有助于管理和行政行为更规模经济化。例如，《专利合作公约》为所有成员国国民简化了早期的专利审查程序。《欧洲专利公约》使欧洲专利局能够审查所有成员国的专利。第三，统一化为反对毁灭性的保护主义提供了保障，进而促进了自由贸易的发展和国际社会的稳定性。事实上，GATT的创立就是要与毁灭性的保护主义和在大萧条时期导致世界经济衰退的损人利己的对外政策相斗争。最后，统一化降低了在国外进行商业贸易的交易成本。正如19世纪的经验证明的那样，国际政治的变化是瞬息万变和不可预测的，并且当外国作者和发明者在国外投资的时候，他们常常得不到所在国承诺的应有的保护。通过建立一个与世界体制相联系的统一的或协调的规则，各国能够合理的期待他们的国民不会受到外国政府的任意的伤害。显然这些好处大多都是有利于发达国家的，特别是有利于发达国家投资者的。尽管有这些好处，但协调和统一存在的弊端和缺陷也是显见的。许多时候多样化对国家，特别是发展中国家来说可能更好些。我们知道，每个社会都有适合其物质生产方式、社会政治制度、法律文化传统的法律制度形态。当一个国家决定采取强硬的知识产权保护时，其实是有一定的政治、社会、经济及政策因素反映在其中的。对于发展中国家而言，制定合理的政策不仅仅是履约的需要，而且还必须考虑相关机构如立法、司法、行政以及政策制定机构的执行能力。不同的国家在政治和经济的发展水平上都是不同的，对知识产权所能提供的保护水平也必然不同的与多样化的，而这在制定TRIPS协议的协商过程中并没有给予足够的注意。因为，多样化允许各国根据各自的特殊要求和不同之处采取各种保护措施，而不是一种措施解决所有问题，而这种措施往往与当地情况并不相符合；多样化可以使司法机关监督政府的低效和滥用政府权力的行为更加容易、方便；也可以使立法过程更加考虑到当地人的利益，由当地人民自主决定他们应当适用的规则和制度。概言之，多样化才能使得各国构建起自己的法律体系。TRIPS协议也应该促进多样化的发展，但是，按照此种想法，TRIPS协议的专利法内容的最佳条件应该为非强制性的，即允许各成员国的行政机关可以采取与协议内容相反的程序出现，让成员国自己决定采用的是协议中的内容还是使用自己的国内法创新的内容。遗憾的是，TRIPS协议强调的更多是统一性，而非多样性。
知识产权在国际关系与国际经济中的作用日显突出，发达国家要求严格的知识产权制度，发展中国家则要求相对更宽松，发达国家与发展中国家在知识产权保护与协调上明显存在矛盾和冲突。由于历史的原因，发达国家应当承担起在经济、技术等多方面辅助发展中国家的责任，帮助后者提高发展能力。因此，为实现国际经济新秩序，发展中国家在知识产权领域要求共同而有差别的待遇是必然的、合理的。
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“今年，PE业务是我们的发展重点，大家都在紧张地看项目。”信达资产管理公司相关负责人告诉记者。据其透露，目前资产管理公司都在奋战PE，希望其成为转型当中的“催化剂”。
其实，资产管理公司涉足PE由来已久：2009年，华融资产管理公司与华菱钢铁达成协议，拟建立10亿元的产业投资基金。
2010年8月，华融资产管理公司还与重庆渝富资产经营管理有限公司合作，出资成立了规模为100亿元的华融渝富股权投资基金管理有限公司。
2010年，作为东方资产管理公司在国内实业领域投融资与经营运作的唯一平台，总资产为50亿元、净资产为25亿元的邦信资产管理有限公司开始成立。
种种资料显示，做为“国家队”的队员，资产管理公司已经携百亿元以上资金进入PE领域。
不可忽视的力量
其实，资产管理公司当初并没有把PE业务当做重点。
资料显示，1999年，为处置四大国有商业银行的不良资产，相对应的信达、华融、东方和长城四家资产管理公司获批成立。除了财政部为四家公司各提供的100亿元资本金外，央行发放了5700亿元贷款，四大资产管理公司获准向对口国有商业银行发行8200亿元金融债券，并用这些钱向四大行收购1.4万亿元不良资产。
“大家在剥离不良资产的过程当中发现，PE业务除了可以成为集团的一个盈利点之外，还可以帮助集团进行转型。”信达资产内部人士告诉《投资者报》记者，他们发现，公司需要剥离的一些不良资产可以通过PE投资解决问题，同时，借助PE的投资经验，还可以加速资产重组的步伐。
借助PE业务，劣势可以转变成优势，其他资产管理公司也同样看到了PE的价值，一时间，四大资产管理公司都冲进了PE领域，搅动了PE市场的现有格局。
上述内部人士对记者表示，早在2004年，四大资产管理公司刚开始传出转型的信号时，信达资产就成立了PE公司，只是没有对外公布，“当时，我们就考虑，借由PE业务进一步处理自身的不良资产，加速股权重组及并购，进而帮助资产管理公司实现转型。”
7年已过，信达投资的规模早已扩张到几十亿，据他透露，其有一只在发改委备案的基金规模就达40亿元。
“PE、VC的投资模式，都是资产管理公司的拿手好戏。”东方资产管理公司旗下邦信资产管理的内部人士告诉记者，集团下面的不良资产是其独特的项目来源，同时，集团擅长的企业重组、股权整合、行业并购正是PE最需要的经验。
“资产公司旗下的众多不良资产可以成为PE的优先和直接选择，利用资产公司特有的产业资源优势，整合PE直接投资优势，这样可以实现双赢。”据长城资产管理公司内部人士分析，资产管理公司涉足PE具有先天优势，除了可以在PE领域简化PE寻找资产投资的程序，降低成本。
同时，对于资产管理公司来讲，还可以突破资产公司对麾下不良资产进行再投资的行政限制瓶颈。同时，如果其以产业投资基金形式出现的话，还可以规范资产公司的行为，“最重要的是，在投资过程当中，还可以充分发挥资产公司对收购资产的知情优势，在投资、重组、产业整合，以至于最终现金流回收上，刺激资产公司的参与热情与关注程度。
国有PE的困扰
特殊的地位和资源优势注定了这些资产管理公司刚涉足PE就能享受到“荣华富贵”，然而，这些PE新贵到底能走多远，受到许多人的质疑。
“对于国有PE来说，他们一般都被冗长的决策流程和缺失的权责匹配机制所困扰。”某民营PE人士透露，虽然来势凶猛，然而，作为民营PE，他们并不担心这些PE新贵的冲击。
真正的企业家需要的不是钱，而是投资人带给他们的经验，即企业创业过程当中遇到的困难，而这一点，国有PE并不具备。更重要的一点就是国有PE的激励机制，这从根本上制约了他们的发展规模。
根据《中华人民共和国企业国有资产法》第二十七条规定，建立国家出资企业管理者经营业绩考核制度。履行出资人职责的机构应当对其任命的企业管理者进行年度和任期考核，并依据考核结果决定对企业管理者的奖惩。这个要求对国有大企业参与创业投资而言是非常苛刻的。
“从PE运营角度来说，基金运作的前2~3年不太可能产生收益，因此国资创投管理应适合创业投资特点，根据创业投资基金的生命周期，按中长期的时间段来考核，而不是每年考核。”
硅谷天堂创业投资公司某负责人告诉记者，据他观察，作为国有创投，“国资”与“创投”运作的根本理念是相矛盾的，国资创投是国有资产运营管理中出现的新事物，国资委对国资创投的管理等同于一般的国有资产管理，但是国资管理最基本的原则是保值增值，而创业投资的运营理念则是追求“高风险”、“高回报”。
“基本理念不合拍，因此，二者很难走远。”该负责人说。
走一步看一步
虽然理念不和看起来是难以调和的矛盾，然而，这对已经涉足PE业务的资产管理公司来说，并非只有“华山一条路”。
“我们在PE公司成立之初就建立了市场化运作的思路，只对他们进行战略上的支持，属于典型的LP、GP模式。”信达资产内部人士透露，只有在年终合并报表的时候二者会体现子公司与母公司的关系，在平时的日常运作当中，信达资产并不会干涉信达投资，都是按照市场规定运行，其中包含激励机制等因素，“对于团队构成，我们也是从市场上招聘，同时结合我们以前积累的一些人才。”
2010年6月，在财政部出资100亿元的支持下，信达资产成功改制为股份制企业，走在资产管理公司转型的前列。
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【关键词】 脑缺血再灌注损伤； 磷酸腺苷活化蛋白激酶； 神经保护
The Impact of Inhibiting Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase on the Behavior and Cerebral Infarction Volume of Mice after Cerebral Ischemia/MA Yu，DANG Hui，BU Juan，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（28）：001-006
【Abstract】 Objective：To discuss the impact of inhibiting adenosine monophosphate activated protein kinase（AMPK） on the behavior and cerebral infarction volume of mice after cerebral ischemia.Method：Sixty-six male Kunming mice were randomly divided into the sham operation group，saline control group and drug intervention group，each group had 22 mice.The AMPK specific inhibitor Compound C（20 mg/kg）was injected intraperitoneally in the drug intervention group during the time of ischemia，the middle cerebral artery occlusion/reperfusion model was made by thread embolism method，saline control group was given intraperitoneal injection of normal saline at the same time and the sham operation group did not give any drugs.After reperfusion for 24 h，the neurological function score was evaluated in mice，TTC staining was used to observe the volume of cerebral infarction and Westem-Blot method was used to detect the expression of pAMPK protein in the ischemic side of the brain.Result：There were no neurologic impairments and cerebral infarctions in the sham operation group，there was a small amount of pAMPK protein expression includes cortex（0.700±0.197） and hippocampus（0.690±0.228）.After cerebral ischemia reperfusion injury，the neurological function score were（2.63±0.52） in the saline control group，the volume of cerebral infarction was（49.57±9.71）%，ischemia side brain tissue pAMPK protein includes the cortex（1.410±0.322） and the hippocampus （1.510±0.418），were higher than those of the sham operation group（P
【Key words】 Cerebral ischemia reperfusion injury； AMP-activated protein kinase； Neuroprotection
First-author’s address：The People’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.28.001
脑梗死（cerebral infarction，CI）是指多种因素引起脑部血流受阻，相应血供障碍的脑组织出现不可逆损伤，最终导致局部脑组织发生缺血缺氧性坏死，是常见于中老年人的脑血管疾病，脑梗死占所有脑卒中的87%[1]。脑血管堵塞引发复杂的缺血诱导事件，包括细胞能量耗竭、代谢应激、离子稳态失衡、兴奋性氨基酸毒性、梗死灶周边去极化、脂质过氧化、错误蛋白合成、DNA损伤和细胞凋亡等[2-3]。缺氧引起细胞代谢急剧下降，抑制相关能源依赖途径，破坏神经胶质细胞膜、血管内皮和脉络膜内皮间稳定的溶质梯度，以上最终导致不可逆神经损伤[4]。脑梗死是能量衰竭始发的能量代谢障碍性疾病，能够感知能量失衡的分子对减轻脑缺血损伤至关重要[5]。
磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是异质三联体，包含α催化亚基（α1、α2）和β、γ调节亚基（β1、β2、γ1、γ2、γ3），通过α亚基上苏氨酸-172的磷酸化被激活[6-7]。AMPK是许多生物（从酵母到哺乳动物）关键的能量监控器，也是细胞能量平衡的关键调节器，当细胞能量供应缺乏时，AMPK被激活[8-9]。在细胞水平，激活AMPK通过抑制消耗ATP的合成代谢途径，同时激活产生ATP的分解代谢途径维持能量储备，启动级联反应确保代谢适应和细胞生存力[10]。在外周，AMPK调节细胞新陈代谢，减少能量储备，增加能量利用，为能源不足细胞提供ATP[11]。此外，AMPK也是主要代谢转换器，控制细胞和整体能量平衡，有研究表明AMPK通过与线粒体生物发生、蛋白质合成和降解途径的相互作用在细胞生长中发挥重要作用[12]。因此，已将靶向AMPK治疗糖尿病、肥胖、癌症和心血管病等多种疾病。中枢神经系统神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞中均有AMPK表达，AMPK在中枢神经系统广泛分布的特点为其成为有效神经保护靶标提供重要生物学基础[13-15]。有研究已经提出AMPK代表内源性的神经保护通路，该信号通路在脑卒中病理生理过程中发挥重要作用[16]。在本研究中，笔者制作小鼠脑缺血再灌注模型，检测缺血侧脑组织中AMPK蛋白表达，观察抑制AMPK后小鼠的行为结局和脑梗死体积，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物分组和处理 清洁级健康成年雄性昆明小鼠66只，体重25～30 g，由新疆实验动物研究中心提供（许可证号：SCXK新2011-0001）。按照随机数字表法将其分为假手术组、盐水对照组（脑缺血再灌注损伤模型组）、药物干预组（Compound C给药组），每组22只。药物干预组小鼠在造模、线栓刚插入时立即腹腔注射AMPK特异性抑制剂Compound C，即6-{4-[2-（1-哌啶基）乙氧基]苯基}-3-（4-吡啶基）吡唑并[1，5-A]嘧啶20 mg/kg（美国Sigma公司），盐水对照组在相同时间点给予等量生理盐水腹腔注射，假手术组则不予任何药物[17]。
1.2 方法
1.2.1 制作动物模型 采用改良线栓法制作短暂性右侧大脑中动脉栓塞模型[18]。应用氯胺酮复合麻醉剂（氯胺酮、安定、阿托品按2∶1∶1配伍，0.9%氯化钠注射液稀释至15 mL，新疆医科大学一附院动物实验研究中心）以1.5～2 mL/kg体重腹腔注射麻醉小鼠。沿颈部正中线纵行剪开2 cm切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，在颈外动脉远端距分叉处约6 mm处斜剪一切口，将0.22 mm硅胶线栓（北京沙东生物技术有限公司生产）缓慢插入，沿颈内动脉向前推进约10 mm，有轻微阻力时则停止进入，此时开始记录缺血时间，缺血60 min后，缓慢拔出线栓恢复血流再灌注，缝合手术切口。小鼠清醒后出现对侧肢体偏瘫，表示模型制作成功。假手术组仅分离颈总、颈外和颈内动脉，不插入线栓，术中控制小鼠体温在37 ℃左右。
1.2.2 神经功能评分 再灌注24 h后，按Longa等[19]方法对各组小鼠进行神经功能评分。评分标准如下：0分：无神经功能缺损征象；1分：缺血对侧前肢内收；2分：行走时向瘫痪侧转圈；3分：行走时向瘫痪侧倾倒；4分：不能自发行走、意识丧失或死亡。1～3分为模型成功，0、4分及出现癫痫发作、取材时发现脑出血者均予剔除并随机补充。
1.2.3 脑梗死体积测定 再灌注24 h后，颈椎脱臼法处死小鼠，速取脑组织，置入-20 ℃冰箱速冻10 min，离额极2 mm向后连续等距切取4个冠状脑片，间距2 mm，将切片放进1%的 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，美国Sigma公司）磷酸盐缓冲液中，37 ℃恒温箱避光孵育20 min，再在4%多聚甲醛（美国Gibco公司）液中固定2 h，数码相机照相。正常脑组织染成红色，梗死组织为白色。采用Image pro plus 5.0软件测量梗死面积，计算梗死灶体积：V=∑（S1+S2）×d/2，V为总体积；S1、S2分别表示切片头侧和尾侧面积；d为切片厚度。为除去患侧脑水肿因素，脑梗死体积（%）=脑梗死体积/非梗死侧大脑半球体积×100%。
1.2.4 Westem-Blot法检测缺血侧脑组织中AMPK和磷酸化的AMPK（pAMPK）蛋白表达 再灌注24 h后，处死小鼠，速取脑组织在冰上分离缺血侧脑皮质和海马，分别置于细胞裂解液中低温匀浆、离心、取上清，置-80 ℃冰箱保存。用BCA蛋白定量试剂盒（江苏海门碧云天生物试剂有限公司）测定蛋白浓度，行SDS-PAGE电泳，再用蛋白转移装置将蛋白转移到PVDF膜上。AMPK、pAMPK（Thr172）和β-actin用相应抗体检测，β-actin为内参照。加入一抗[pAMPK（Thr172）（1∶1000，美国CST公司）、AMPK（1∶1000，美国CST公司）、β-actin（1∶5000，武汉博士德生物工程有限公司）]溶液，4 ℃孵育过夜，将PVDF膜移入TBST溶液（包含4%牛血清白蛋白和0.1% Tween-20）中，室温下轻振荡10 min；再将膜置于二抗[羊抗兔IgG（1∶5000，武汉博士德生物工程有限公司）]溶液中孵育，最后用ECL化学发光试剂盒（江苏海门碧云天生物试剂有限公司）显色。测定每一条带灰度值，用pAMPK（Thr172）灰度值/AMPK灰度值表示pAMPK蛋白相对表达量。
1.3 统计学处理 使用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD法，以P
2 结果
2.1 小鼠脑缺血再灌注损伤后缺血侧脑组织中pAMPK蛋白表达 假手术组小鼠脑组织中有少量pAMPK蛋白表达，包括皮质（0.700±0.197）和海马（0.690±0.228），盐水对照组包括皮质（1.410±0.322）和海马（1.510±0.418），和假手术组相比pAMPK蛋白表达明显增加，比较差异有统计学意义（皮质：P=0.000；海马：P=0.000）；给予20 mg/kg Compound C干预后，可显著抑制pAMPK蛋白水平，包括皮质（0.930±0.229）和海马（0.960±0.378），与盐水对照组比较差异有统计学意义（皮质：P=0.005；海马：P=0.017）。三组间比较皮质和海马pAMPk蛋白表达比较差异均有统计学意义（F1=12.000，F2=8.530；P1=0.001，P2=0.003），各组小鼠脑皮质和海马区pAMPK蛋白表达见图1、2。
2.2 神经功能评分 假手术组小鼠未出现神经功能缺损症状，评分0分；盐水对照组小鼠可见明显神经功能缺损症状，如Horner征，左侧前肢无力，行走时身体向左侧旋转，甚至彻底向左侧跌倒或不能行走，提尾时左前肢屈曲，评分（2.63±0.52）分；药物干预组小鼠仅出现轻微神经功能缺损症状，表现不能完全伸展左侧前爪或爬行时向左侧倾斜，评分（1.88±0.64）分。药物干预组神经功能评分与盐水对照组比较显著降低，比较差异有统计学意义（P=0.005）。三组间比较差异有统计学意义（F=64.658，P=0.000），各组小鼠神经功能评分见图3。
2.3 脑梗死体积 再灌注24 h后，假手术组小鼠TTC染色脑组织完全红染，无肉眼可见梗死灶，组织结构清晰；盐水对照组和药物干预组小鼠TTC染色后均可见脑组织苍白色梗死灶，内部结构消失，肿胀明显，部位主要累及大脑中动脉供血区（包括皮质和海马），脑梗死体积分别为（49.57±9.71）%与（24.07±7.74）%，与盐水对照组比较，药物干预组脑梗死体积显著缩小，比较差异有统计学意义（P=0.006）。三组间比较差异有统计学意义（F=39.959，P=0.000），各组小鼠脑组织TTC染色及脑梗死体积比较分别见图4、5。
3 讨论
缺血性脑卒中是一个严重的能量缺乏状态，乳酸积聚、自噬和再灌注期间失调的葡萄糖转运蛋白导致的葡萄糖增加都会加重卒中损伤，在缺血缺氧性脑损伤早期，以能量代谢障碍为中心环节[11]。磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）是关键的应激与代谢感受器，涉及许多调解途径，位于多个代谢通路的交叉点，对于调解能量平衡有非常重要的作用，故AMPK在缺血性脑卒中中的重要性已逐渐得到重视[20]。
笔者应用小鼠脑缺血再灌注模型，在缺血1 h、再灌注24 h后，应用Westem-Blot法检测小鼠缺血侧脑组织中pAMPK蛋白表达，结果显示pAMPK蛋白水平显著升高，即AMPK被过度激活，小鼠出现明显神经功能缺损症状，大片脑梗死灶形成，说明AMPK激活在缺血脑中是有害的。
脑梗死发生时，氧糖缺乏导致神经元细胞遭受兴奋性毒性和氧化损伤，在修复损伤过程中，许多能量消耗过程（如一连串的氧化和细胞死亡路径）被激活，这些途径过度激活导致完全的能量衰竭，ATP减少，同时AMP增加，能量衰竭是启动脑梗死神经元损伤的主要因素。AMPK通过AMP感觉能量水平变化，激活能源恢复过程，抑制能源消耗过程，通过调节一系列分解代谢和合成代谢过程适应细胞的新陈代谢[21]。然而，作为机体针对缺血应激的代偿性反应，有研究指出过度的AMPK激活可能在应激条件下具有不利作用[22]。缺血情况下，脑组织ATP供应不能满足需要，ATP/AMP降低，AMPK在脑中迅速激活，最初的AMPK激活旨在恢复缺血脑中的能量平衡，然而细胞死亡启动后，试图进一步从代谢受损的细胞中产生ATP只会导致损伤恶化和更严重的代谢障碍，AMPK激活可促成病理条件下（包括卒中和AD）的神经元细胞死亡[23-24]。AMPK是糖酵解强烈刺激素，大脑中AMPK作为能量感受器，在应对增加的代谢应激时激活糖酵解，进而在缺血脑卒中产生乳酸盐，缺血诱导的AMPK激活通过增加卒中诱导的乳酸酸中毒加重卒中损伤[25-26]。有研究表明，NMDA或谷氨酸兴奋性毒性引起初级皮层或小脑颗粒细胞中AMPK激活，长时间的AMPK活化可同时激活ATP相关的细胞死亡过程――兴奋性毒性的凋亡，增加促凋亡Bcl-2家族成员bim（参与凋亡和线粒体去极化的关键蛋白）的转录活性，导致神经元生存力逐步丧失[27]。AMPK活性增加是启动自噬级联反应的关键信号，可以激活自噬，研究表明自噬促进缺血后神经细胞死亡[28-29]。
为了解抑制AMPK激活在缺血脑卒中的效应，笔者给予AMPK特异性抑制剂Compound C干预，结果显示缺血侧脑组织中pAMPK蛋白表达显著减少，即抑制了AMPK激活。另外，小鼠神经功能评分显著降低，脑梗死体积明显缩小，表明在缺血条件下抑制AMPK激活可以减轻脑卒中损伤。以上结果强烈支持笔者关于抑制缺血脑卒中AMPK过度活化发挥神经保护效应的假设。
Zhang等[30]发现在H2O2处理的SH-SY5Y细胞中AMPK和pAMPK的表达显著上调，这是一个自我代偿反应，减少能量利用，增加能量产生。然而，体外过度AMPK激活对SH-SY5Y细胞是有害的，抑制AMPK激活可以抑制氧化应激，增加细胞抗应激能力。另外，有研究证实谷氨酸在HT22细胞中诱导AMPK活性增加，AMPK活化促成谷氨酸氧化毒性诱导的神经元细胞死亡，抑制AMPK激活能保护神经元免受氧化毒性损伤[31]。当沙鼠前脑缺血后，海马CA1区中AMPK被瞬时磷酸化，抑制AMPK激活通过减少海马CA1区中ATP损耗和乳酸积聚保护神经元免受缺血缺氧性损伤[32]。在缺血性脑卒中急性能量缺失阶段，抑制AMPK活性可能诱导一种“神经元冬眠”形式，和低温的作用机制一样，减少能量需求和随后的代谢衰竭，可能延长再灌注治疗的时间窗[33]。AMPK激活导致Kif5轴突动力蛋白驱动蛋白轻链磷酸化，破坏了它和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）的联系，故PI3K不能靶向轴突末梢，使轴突极化和生长被抑制[34-35]。AMPK激活抑制缺血事件后的轴突发生，急性抑制AMPK激活则对卒中发挥保护作用。AMPK信号参与脑缺血预处理，温和短暂的代谢应激通过缓慢减少AMPK活性导致神经元发生代谢耐受效应[36]。文献[37]指出，在小鼠局灶性脑缺血模型中，脑组织中AMPK活性增加，基因敲除法抑制AMPK活性具有神经保护作用，这与本研究结果一致。
综上所述，AMPK活性增强对脑组织的作用是复杂的，AMPK激活的持续时间是卒中结局的关键决定因素[38]。笔者研究证实缺血性脑卒中后立即抑制卒中诱导的AMPK过度活化能够减轻脑卒中损伤，具有显著神经保护作用，建议AMPK可能是缺血性脑卒中治疗的一个有前景的新靶点。
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