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免疫组化范文1
免疫细胞学是免疫学与细胞化学相结合的一个分支学科，它是在免疫学理论基础上利用抗原与抗体的特异性反应，在细胞或组织中定位抗原或抗体。免疫组化技术是用标记物或显色物标记的抗体检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疾病的目的。随着免疫组织化学技术在临床病理研究与诊断中的广泛应用，因其反应步骤多，影响因素复杂，质量控制已被越来越多的病理技术专家重视。2008年全国病理学技术进展和应用研讨会上提出将质控应用到免疫组化技术上。本文对免疫组化技术的标准化质控管理进行了探索，现介绍如下。
1 标本的固定
为了更好地保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，必须对标本进行固定。标本固定的好坏是影响病理诊断的关键，同样也影响免疫组化的结果，所以固定是质控的首要也是关键步骤。影响标本固定主要因素有以下几点。①标本离体后固定不及时：一般离体标本要求15 min内必须固定[1]，最好是在手术室由专业的护士将离体的标本用清水冲洗干净后立即放入质量浓度40 g/L中性甲醛内，固定液的用量为标本体积的5～10倍。而目前本院手术室做不到这一点，这就要求病理技术员在接到标本后要及时固定，不能延误时间。但是在手术室和路上延误的时间不能控制。因此，呼吁临床医生应和病理科联合起来，将标本固定地点放在手术室，以使标本及时固定，减少因固定不及时而出现的诊断困难。②标本固定的时间：40 g/L中性甲醛渗透速度一般是2 mm/h，随着时间延长速度会逐渐减慢，增加浓度反而会降低渗透速度。一般手术标本用40 g/L中性甲醛固定的时间以12～24 h为佳，最长不要超过72 h；如穿刺标本可用AFF液固定2～4 h。有研究显示，用40 g/L中性甲醛固定1周后的标本，其组织抗原几乎不能被检出[1]。但是，日常工作中常常会遇到有人催发病理报告的情况，他们希望病理科的报告最好像检验科那样早晨送下午就能拿到。这种情况下只有缩短制片程序，包括固定时间，这种操作只会增加病理诊断的风险，埋下误诊的隐患。③固定液的种类及浓度不恰当：免疫组化检测常用的固定液有40 g/L中性甲醛、40 g/L钙甲醛、40 g/L多聚甲醛磷酸缓冲液等。穿刺标本可用AFF液固定。固定液浓度过高、过低都会因组织固定差而导致组织抗原丢失或易出现非特异性背景染色，从而影响免疫组化结果。EDTA是用于骨组织脱钙的螯合剂，因在脱钙过程中对组织的破坏性小而得到广泛使用，缺点是脱钙时间太长。④标本固定时处理不当：如淋巴结组织往往因包膜没切开，影响了固定液的渗透，而使组织固定差。大标本因没切开固定，而使标本固定不匀等，都可影响免疫组化染色。我们接诊了很多低级别医院来会诊标本，都存在以上问题，因固定差而直接影响免疫组化结果及诊断。
2 切片与烤片
免疫组化检测的切片厚以3～4 μm为宜，淋巴结组织可行2 μm厚切片，太厚影响染色结果和诊断。因免疫组化反应步骤多，易出现脱片现象，需要将载玻片处理后方可使用。处理方法：先将载玻片用肥皂水洗净后，放入清洁液中浸泡12～24 h，清水冲洗2 h，蒸馏水洗5遍，体积分数0.95乙醇浸泡后，用干净的绸布擦干，再挂胶。挂胶方法有很多种，如： APES、铬矾明胶液、多聚赖氨酸等。切片裱片要完整，不能有气泡，烤片时温度不能过高，65 ℃烤30 min即可进行染色。烤片时间过短易造成脱片，温度过高或过长可破坏抗原。
3 减少或消除非特异性染色
组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色。最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上。常见的消除方法有：①在滴加第一抗体前用体积分数0.02～0.05山羊血清或牛血清封闭组织上带电荷基团，而除去与第一抗体的非特异性结合。此种方法一般用于不需抗原修复的抗体或内源性生物素较高的组织效果佳。②体积分数0.03～0.06过氧化氢法是目前最常用的方法之一，我们认为体积分数0.05过氧化氢处理10～15 min的效果较好。③洗涤过程中用高盐缓冲液冲洗切片，也是消除非特异性染色的方法之一。方法是将磷酸缓冲液中加入10 g/L的氯化钠（pH 7.4）。④稀释抗体浓度，但必须通过阳性对照来掌握稀释的最佳浓度。我们的实践证明，应用北京中杉试剂公司生产的PV9000二步法试剂盒，可有效地避免内源性生物素造成的非特异性染色，且操作简便。
4 抗原修复
免疫组化在病理学上的应用常因甲醛固定等因素影响造成抗原失活。解决因固定包埋导致抗原失活的问题有3个途径：①开发新型抗体以识别甲醛固定后的组织抗原或提高免疫组化试剂的灵敏度；②用改良固定液取代甲醛；③挽救因甲醛固定而失活的抗原，即抗原修复。而后者因方法简单而增敏效果显著，在病理技术中得到广泛应用。抗原修复是影响染色结果的最关键因素，目前最常用的是加热煮沸法，少数用酶消化法。加热抗原修复是1991年由SHI等最先报道，其机制是通过加热打开了组织抗原因甲醛固定所引起的抗原表位的交联。修复的方法有高压法、微波法、水浴法等。英联邦免疫细胞化学室间质控组织（UK NEQASICC）进行的有105家实验室参与、历时两年的研究结果显示，ER、PR染色偏弱是由于微波加热时间不足与实验中操作控制不当所致，强烈推荐使用高压抗原修复[2]。国内也有专家研究表明，目前抗原修复最突出和最顽固的问题是修复不够。各种修复方法染色强度比较，高压法>水浴法>微波法。抗原修复液常用的有枸橼酸缓冲液（pH 6.0）、EDTA缓冲液（pH 8.0～9.0）等。在2008年全国病理学技术进展和应用研讨会上周小鸽教授做了以下实验（图1）：A类抗原在任何pH条件下，修复效果都很好；B类抗原在低和高pH时，修复效果好，但在中等pH时，修复效果很差；C类抗原随着pH的增高，修复结果越来越好。如果实验室只想用1种修复液，又能兼顾3类抗原，就可选择图中3条曲线最靠近的区域所对应的pH值，此处所对应的pH为8.0～9.0。因此，他认为高pH修复液比低pH修复液更好。我们认为高压修复具有压力稳定、受热均匀、阳性检出率和阳性强度高、背景着色少等优点，对核染色阳性的抗原用pH 9.0的EDTA修复液效果较好，胞浆胞膜染色阳性的用pH 8.0的EDTA抗原修复液修复的效果较好，但如果采用pH 9.0的EDTA在高压修复时易脱片。高压修复的方法是：先将高压锅内的修复液煮沸，将切片放入高压锅内，将压力加热至最大（105 kPa）1～2 min，加热功率不要大于1 000 W。有研究表明，Ki67与P53在使用电磁炉加热时，随着功率的增强，阳性强度反而减弱。我们认为只要功率在800 W左右，不管是电磁炉还是电炉加热对免疫组化的结果影响都不大。
5 标准化实验对照
免疫组化对照实验的设立在免疫组化标准化中是极其必要的。随着病人法律意识的不断增强，医患之间的矛盾越来越大，病理医师的诊断风险也越来越大。这就要求医生对染色结果要有正确判断，同时也对病理技术人员提出了设立阳性和阴性对照的要求，这不但是对病人负责，也是保护自己的一种方式。阴性对照是用确定不含有待测抗原的组织作为阴性对照组织，阳性对照是对照组织中含有已知的抗原[3]。我们认为在日常工作中设置阳性对照最关键，通常是用阑尾来做阳性对照组织，因为阑尾中含有多种组织成分如上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。
图1 3种抗原不同pH条件下修复效果（略）
总之，要做出好的免疫组化结果，除了要求病理技术人员掌握丰富的理论知识外，还要求有较强的责任心，严格按标准化、规范化操作，只有这样才能更好地将免疫组化技术应用于临床，服务于病人。
【参考文献】
[1]王小亚，崔全才. 免疫组织化学病理诊断[M]. 北京：北京科学技术出版社， 2007：47.
免疫组化范文2
【关键词】Tween-20；免疫组化；非特异性染色
表面活性剂Tween-20为聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯和一部分聚氧乙烯双去水山梨醇单月桂酸酯的混合物，亲水性强，为一种非离子型去污剂，能增加乳剂的稳定性。也可作 2006―2012年龙里县流行性腮腺炎疫情资料分析 神经阻滞联合甲钴胺注射液治疗带状疱疹后神经痛效果观察 保定市2004～2011年急性弛缓性麻痹病例监测系统运转情况分析 早产儿经下肢置入PICC20例的方法探讨 129例2型糖尿病患者合并恶性消化道肿瘤临床分析 绝经后妇女取宫内节育器92例临床分析 高血压性脑出血156例临床分析 蒙古族老年人慢性房颤（AF）319例抗凝治疗分析 浅谈产后出血的原因及防治措施 80例老年口腔修复临床分析 不育不孕症夫妇生殖道分泌物衣原体和支原体检测结果分析 头静脉修剪高位重建动静脉内瘘11例 老年获得性肺炎的临床特点及预后分析 2012年昆明市五华区居民死亡原因分析 探讨钞票对健康促进的影响 呼吸内科感染常见病原菌与相关因素 南宁市吴圩镇健康人丙氨酸氨基转移酶参考值的制订 老年恶性骨肿瘤54例误诊原因分析 带状疱疹病人的健康教育方式及效果评价 承┮┪锏脑鋈芗痢＞匝榉⑾置庖咦榛讨屑尤肓ween-20的PBS缓冲液冲洗切片，能够使切片更清洁，非特异性染色减少。本文对分别经过PBS-Tween-20缓冲液及PBS缓冲液冲洗的免疫组化切片进行对照，并将应用体会介绍如下。
1 材料与方法
1.1 材料
PBS磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，PH7.2-7.4）、Tween-20、500ml容量瓶、
吸水纸，均购自福建迈新试剂有限公司。
1.2 方法
取500ml已配制好的PBS磷酸盐缓冲液置容量瓶中，加入250μl Tween-20，充分混匀，待用。现将经抗原修复后的组织切片分成3组（A、B、C）放入蒸馏水中备用。
A组：常规PBS磷酸盐缓冲液冲洗后，专用免疫组化油笔划圈。
B组：PBS-Tween-20缓冲液冲洗后，专用免疫组化油笔划圈。
C组：专用免疫组化油笔划圈后，PBS-Tween-20缓冲液冲洗。
将3组处理过的切片进行同样的免疫组化后续操作。
2 结果
A组 在抗体孵育过程中，抗体用量偏多，无需用吸水纸擦拭，同时还有个别组织边缘干燥，发生了边缘效应。
B组 在抗体孵育过程中，抗体用量偏少，但每次滴加抗体前均需用吸水纸擦拭，未发生组织边缘干燥。
C 组 在抗体孵育过程中，抗体用量偏少，无需用吸水纸擦拭，未发生组织边缘干燥。
3 讨论
本实验室免疫组化染色标本例数多，量大，半个工作日出片，由于一抗、二抗的孵育时间以及显色时间比较固定，这就要求在操作过程中尽量减少操作时间，并且尽可能地降低非特异性染色。A组虽然免疫组化油笔的使用节省了时间，但只能防止滴加的试剂不向四周流失，如果组织偏大就无法保证一次性将滴加的试剂完全覆盖整个组织，只有增加抗体用量将组织全部覆盖，抗体用量偏多，并且可能导致抗体覆盖不均，增加边缘效应、非特异性染色等。B组PBS-Tween-20缓冲液冲洗后，玻片上含有Tween-20，用吸水纸擦拭后使用免疫组化油笔划的圈不能与玻片充分结合，再次冲洗后划痕被Tween-20溶解，不能保持完整性，需用吸水纸另外擦拭干水分，耽误时间。相比之下C组划圈后和玻片充分结合，再用PBS-Tween-20缓冲液冲洗，划痕不被溶解，将其倾斜在吸水纸上，划痕能保持完整性，不用吸水纸另外擦拭，节省不少时间。
Tween-20为聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸脂和一部分聚氧乙烯双去水山梨醇单月桂酸脂的混合物。由于其分子中有较多的亲水性基团（聚氧乙烯基），故亲水性强，具有乳化、扩散、增溶、稳定等性能，是一种常用的非离子性去垢剂和表面活性剂，对人体无害、无刺激性，常用为医药品的乳化剂、扩散剂和稳定剂。用其多次冲洗能够均匀覆盖整张切片，如同在切片上增加了一层液体膜，不会使组织和切片空白区形成明显的分界线，在离组织边缘
该方法在本实验室已使用1年余，与不加Tween-20的PBS缓冲液做过多次对照实验，发现Tween-20对免疫组化染色结果无影响，可以放心使用。且PBS-Tween-20缓冲液配制方法简单，2000ml每包的PBS加入1ml的Tween-20，浓度不太高，价格也便宜，同时各种抗体的价格昂贵，这样节省了抗体的用量，节约医疗成本，值得推广。
参考文献：
免疫组化范文3
关键词：宫颈；宫颈癌；高级别上皮内瘤变；免疫组化；P16；HPV感染
宫颈癌（Squamous carcinoma of the cervix；SCC）是妇科常见的一种恶性肿瘤，我国每年约有15万宫颈癌新发病例，每年约有8万人死于子宫颈癌，其死亡率居女性肿瘤的第二位，仅次于乳腺癌[8]。1995年国际癌症研究机构（IARC）专题讨论认为：HPV感染是宫颈癌发生的必要条件[1]，90%以上的宫颈癌伴有高危型HPV感染[2]。P16作为检测高危HPV感染的免疫组化指标，通过P16免疫组化检测可作为诊断宫颈癌癌前病变及SCC的有力证据，可提高宫颈高级别上皮内瘤变（CIN）及宫颈SCC的早期诊断率[5]。
宫颈组织切片P16免疫组化结果与宫颈病变病理组织学诊断的关联性，作者对146例宫颈组织切片P16免疫组化及HE切片进行研究，观察宫颈组织切片P16免疫组化的病理组织学特点，为丰富传统病理组织学的内容提供依据。
1 临床资料
从2012年至今宫颈P16免疫组化206例，按入选条件：①HE切片完整，组织结构清晰；②罗氏VentanaBenchMark XT全自动免疫组化染色仪标准化操作制片[9]，符合该标准的入选病例146例。③选用罗氏试剂盒作为生物标记物的检测。④P16阳性标准：P16阳性显示上皮细胞核与胞浆着色，且呈弥漫连续性染色，而局灶性染色和无着色均视为阴性[3]。
2 结果
2.1患者的年龄分布 呈正态分布，见图1。
2.2 P16阳性率的年龄分布 15～55岁各组的P16阳性率变化不大，在30%～40%，55岁以上组急剧上升至73%，见图2。
2.3病理特点 本组146例宫颈组织做P16免疫组化，P16阳性36例，阳性率24.66%。
2.3.1上皮内P16阳性分布特点 P16的阳性表达主要是核表达，胞浆也有表达，呈弥漫状棕褐色[4]。染色强度往往是鳞状上皮基底层>棘层>表层。CINⅡ-CINⅢ和宫颈癌（包括鳞癌、腺癌和腺鳞癌中）P16呈现中等或强阳性胞浆、胞核表达，与文献报道相符[4，6]，宫颈鳞状上皮挖空细胞大部分表达阴性。
2.3.2 P16阳性的组织学特点，见图3。
图3
3 讨论
免疫组化的标准化操作 研究组为科室2013年10月引进美国罗氏公司BenchMark XT免疫组化自动仪后进行观察病例，操作标准化程度提高，实验结果准确、稳定、可靠[8-9]，并做阳性对照片，免疫组化染色效果理想。
P16表达强度往往是鳞状上皮基底层>棘层>表层，CINⅡ-CINⅢ和宫颈癌（包括鳞癌、腺癌和腺鳞癌中）P16呈现中等或强阳性胞浆、胞核表达，挖空细胞的核大部分表达阴性。提示P16表达在生物活性强的细胞更为明显。传统认为挖空细胞与HPV病毒感染有关，本组资料并不显示挖空细胞与P16阳性有多大的相关性。
本组观察认为，P16阳性率与CIN向鳞癌渐变的过程相关，当CINⅢ及CINⅢ累及腺体时，P16的阳性率与鳞癌一样，P16阳性率达100%。目前已经明确宫颈癌与持续高危HPV感染有关，但HPV感染可以是一过性的并未能说明就有癌变。研究证明，P16过表达已说明HPV癌蛋白的细胞已经开始了细胞转化过程（癌变），因此P16的阳性高度表达可以用作为宫颈癌变的标记物，P16阳性表达是观察宫颈早期癌变的良好指标[4]。P16在正常宫颈、慢性宫颈炎、CINⅠ级、CINⅡ-Ⅲ、宫颈癌（鳞癌和腺鳞癌）中的阳性表达率依次增 加[7]。
本组观察还提示，宫颈增生主要有两种增生。一种为炎症性或宫颈脱垂时发生的适应性增生，表现为鳞状上皮各层增生，表层可有成片状挖空细胞发生，有的上皮脚伸长，但少有多状增生，此种上皮极少有P16阳性表达。另一种为不典型增生及癌，一般认为，高危型HPV感染可启动异常增生，往往增生的上皮厚度不大，但多见状增生，细胞有一定异型性。统计前者P16阳性率仅15.4%，而多状增生P16阳性高达83.3%，相比P
参考文献：
[1]Franceschi S.The IARC commitment to cancer prevent ion： theexample of papillom avirus and cervical cancer[J].Recent ResultsCancer Res，2005，166（2）：277-297.
[2]Mu？oz N.The causal link between HPV and invasive cervical cancer-a population-based case-control study in Colombia and Spain[J].Int J Cancer，1992，52（5）：743-749.
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免疫组化范文4
［关键词］ 鼻咽组织;免疫组织化学;标准化;质量控制
Quality Control of Immunohistochemical Stainig in Slice of Nasopharynx Tissues
Abstract： Objective To establish a standard empirical process of immunohistochemical staining and slice making of nasopharynx tissues catering to the requirement for pathological diagnosis and research in the future.Methods Introducing the methods of immunohistochemical staining and slice making of nasopharynx tissues as well as the link of quality control in detail. Results The results shown that method has three features: stable and reliable， strong specificity， and high sensitivity. Conclusion This method can improve the quality ofimmunohistochemical staining of nasopharynx tissue.
Key words:Nasopharynxtissue;Immunohistochemistry;Qualitycontrol
鼻咽癌是我国华南地区常见的恶性肿瘤之一，其发生的病因、发病机制以及发生发展也是我们广东医学院病理学教研室一直关注和研究的课题。由于鼻咽组织活检时不易大量取材，且组织中淋巴细胞较多，组织质地较脆，石蜡切片常出现组织碎裂、染色发白、模糊不清、细胞固缩等现象，另外淋巴细胞、网状细胞表面上的Fc受体及一些反应性淋巴细胞干扰免疫组化的结果，导致制作满意的鼻咽组织石蜡切片及其免疫组化染色较为困难，继而影响病理诊断及后续的科研工作。为此，我们摸索自己实验室的工作条件及各种抗体最佳的实验条件来制定标准化实验流程，稳定鼻咽组织石蜡切片及其免疫组化染色的质量，现报道如下。
1 材料与方法
1．1 材料 来自广东医学院附属医院临床送检的鼻咽标本。
1．2 主要仪器 轮转切片机(德国，Leica)、家用高压锅(广州)。
1．3 主要试剂 p53、PCNA、Ecadherin等鼠抗人单克隆抗体、多克隆抗体及免疫组化染色SP试剂盒、浓缩型DAB试剂盒、抗体稀释液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1．4 组织切片的制备 鼻咽组织离体时立即用生理盐水轻轻洗去组织上的血液及黏液，随后即用4%中性缓冲甲醛液固定，并及时送病理科作进一步处理。4%中性缓冲甲醛液固定不宜超过18 h。脱水从低浓度乙醇到高浓度乙醇梯度脱水，级差以10%为宜，一般从60%乙醇开始30 min，70%乙醇30 min，80%乙醇25 min，95%乙醇25 min，无水乙醇Ⅰ20 min，无水乙醇Ⅱ20 min;二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min;58 ℃石蜡浸蜡，期间最好更换1次，浸蜡3 h后60 ℃石蜡包埋制成蜡块。一次性刀片进行切片，切片厚度为2 μm～3 μm，40 ℃以下水温展片，65 ℃温箱烤片1 h～4 h。
1．5 免疫组化染色方法 切片烤片后脱蜡至水，然后蒸馏水洗两次，高压锅内放约5 cm深的自来水，大火加热至沸腾，再将柠檬酸盐缓冲液(200 ml～400 ml pH 6.0)倒入搪瓷杯中，把切片置于耐高温塑料切片架上放入盛有缓冲液的搪瓷杯中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续中火加热至喷气，从喷气开始记时1 min后，压力锅离开火源，冷却至室温(稍冷后，可在自来水龙头下流水加速冷却)，取出切片，先用蒸馏水冲洗两次之后用PBS(pH 7.2～7.4)冲洗，余下按免疫组化步骤选择不同的抗体进行染色。
2 结果
鼻咽切片组织无收缩、开裂，组织结构、细胞形态清晰，鼻咽癌癌细胞及各种炎症细胞能清晰辨认，HE染色鲜艳，细胞核呈鲜明的蓝色，细胞质被伊红染成深浅不同的粉红色、桃红色，核仁呈红色，对比度良好(见图1)。免疫组化染色结果为病变组织结构完整、无脱片现象，阳性与阴性对比明显，阳性物质定位准确；背景干净、清晰，无非特异性着色(图2)，组织结构与细胞轮廓完整、清晰，染色结果稳定可靠、敏感性高、特异性强、细胞核呈蓝色、适合显微照相等。
图1 鼻咽癌组织(HE 400)（略）
图2 Ecadherin在鼻咽慢性炎上皮的强阳性表达(SP 400)（略）
3 讨论
免疫组织化学由于其具有的复杂性，在技术应用过程中存在不少问题，直接或间接地影响了最终的病理诊断，应予以重视以下几方面，才能从总体上保证鼻咽组织免疫组化染色的质量。
3.1 制作优质石蜡切片是做好鼻咽组织免疫组化染色的基础 取材时鼻咽组织上的血液及黏液将影响固定液的渗透和干扰免疫组化染色的结果，而且鼻咽组织由于组织中淋巴细胞比较丰富和致密，间质成分较少是难以制作优质石蜡切片的主要原因，所以组织固定的好坏是影响免疫组化结果的关键因素。因此有条件时，鼻咽组织离体时立即用生理盐水洗去组织上的血液和黏液，并用4%中性缓冲甲醛液固定；或者用4%中性缓冲甲醛液固定后及时送病理科做进一步处理：即轻轻晃动瓶内固定液，利用原有固定液洗去鼻咽组织上的血液及黏液，再换一次4%中性缓冲甲醛液固定。乙醇脱水尽可能从较低浓度起始，以免组织过度收缩。常温下二甲苯透明时间≤30 min，不然组织变脆。制片严格按操作程序进行，否则是免疫组化产生假阳性、假阴性或脱片的主要原因。
3.2 鼻咽组织蜡块的管理 因为要考虑患者的经济负担，经病理确诊后的病例做免疫组化染色不普遍，鼻咽组织做免疫组化染色绝大部分是教师或研究生的研究课题需要。为了档案资料的齐全和避免医疗纠纷，＜2 mm组织的蜡块一般不允许再切片。教师或研究生选择做免疫组化的鼻咽组织蜡块要通过观察HE染色切片的组织形态的基础上来决定，根据诊断来选择，不要选择组织坏死和出血多的蜡块，所有需要做免疫组化的鼻咽组织切片均由有经验的专业技术员切片，以防组织蜡块切削过多。切片完毕后组织蜡块要及时封蜡归档，力求科研工作有延续性和档案资料的完整性。
3.3 免疫组化切片的质量控制要求 免疫组化染色使用的玻片必须用饱和的重铬酸钾浓硫酸液浸泡3 d以上，捞出后用自来水彻底清洗干净，再经95%乙醇过一遍，晾干后涂防脱片剂烘干备用。裱片时切片片膜不能留有气泡，烤片时温度过低、时间过短，则易脱片，温度过高、时间过长则对抗原有破坏，烤片后用专用二甲苯、乙醇脱蜡至水洗，脱蜡要彻底。我们曾采用微波加热等方法进行抗原修复，但效果不如高温高压抗原修复法理想。另外高温高压加热时间的长短很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅离开火源的总时间控制在3 min内，时间过长，可能会使染色背景加深。柠檬酸缓冲液不能重复使用，且容量必须保证所有切片都能浸泡到，整个染色过程不要让切片干涸。显色在镜下控制，时间约3 min～7 min，在阳性明确的部位着淡黄色即终止显色，此时显色程度较佳，能有效地避免背景着色。苏木素复染后要充分返蓝，否则背景呈紫红色(见图3)。
图3 苏木素复染未充分返蓝、背景呈紫红色（略）
3.4 增强特异性着色、降低非特异性染色是免疫组化的质量保证 抗体是免疫组织化学最核心的试剂，其质量直接影响免疫组织化学的结果判断继而影响诊断，由于鼻咽组织中的淋巴细胞、网状细胞会产生非特异性染色。因此要选择特异性强、效价高的一抗，新购进的抗体储存在4 ℃冰箱并进行预实验，摸索出最佳实验条件。抗体的稀释包括特异性一抗、中间联结抗体及标记抗体，其稀释度与抗体的浓度、质量及有效期、孵育时间和采用的方法等。防止失效的抗体进入实验室，此外要选择病变典型的做免疫组化染色对照，一定要每一批免疫组化均设有已知阳性对照和用PBS代替一抗的空白对照。
3.5 免疫组织化学结果的判读 结果的判断免疫组化切片应是阳性标记强而非特异性染色淡或无，两者形成鲜明的对比，阳性表达必须在细胞或组织特定的部位，细胞边界清楚;每批染色都要有阳性对照、阴性对照和自身对照才能对染色结果作出正确判断。判断标准常根据阳性细胞的百分比或阳性细胞的染色深度来判断，其颜色深浅反映抗原量的多少。免疫组化染色结果还要结合组织形态学判断是真正的阳性染色而非其他着色。阳性反应分布总是有规律、局限、定位准确和一定形态特征的，如细胞膜着色呈圆形;典型的细胞核着色为均质状，核仁和染色质呈颗粒状着色。
3.6 免疫组织化学阳性库的建立 为了保证阳性对照的可靠性，在日常工作中要收集各种抗原的阳性组织和阳性切片，逐步建立阳性对照切片库及相应的电子档案库。如预期结果为阴性或病理形态诊断与免疫组化结果相反时，必须要有阳性对照才能作出正确的病理诊断，阳性对照能说明染色技术和阴性结果的可靠性，不是由于标本处理不当导致的抗原丧失、方法错误、技术不熟练等造成的假阴性。鼻咽组织免疫组化染色步骤多、过程长、影响因素也多，因此只有在各个细节都认真对待，然后以常规的形式相对固定下来，才能确保其免疫组织化学结果的可靠性。
参考文献：
［1］ 陈杰，郑杰，霍临明.重视免疫组织化学的质量控制和标准化［J］.中华病理学杂志，2005，(2)：6566.
免疫组化范文5
【关键词】 MMP-2； MMP-9； 子宫内膜腺癌； 免疫组化； 肿瘤； 转移
在过去20年中，子宫内膜腺癌的发病率呈逐年上升的趋势。2010年美国估计新发子宫内膜癌43 470例，同期宫颈癌只有12 200例[1]。虽然传统的手术、放化疗等多种治疗措施的综合应用已显著地提高了患者的生存质量，但子宫内膜腺癌的浸润和转移仍是许多患者死亡的主要原因。继续认识子宫内膜腺癌肿瘤细胞的生物学行为，探讨其浸润和转移的机制，开发新的抗肿瘤药物，是目前亟待解决的问题。目前关于MMPs在子宫内膜癌中的研究较多[2-6]，但研究结果不一致，目前仍存在争议。本研究采用免疫组化方法检测MMP-2、MMP-9在不同子宫内膜组织中的表达，研究子宫内膜腺癌的相关生物学行为，探讨两者与子宫内膜腺癌的发生、发展和浸润转移的相关性，为子宫内膜腺癌的早期临床诊断和预后判断、靶向治疗提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集蓬莱市人民医院2010年1月-2013年12月手术切除、经病理确诊的100例子宫内膜腺癌组织蜡块和30例子宫内膜增生组织蜡块，同期因无症状子宫肌瘤行子宫全切除术的20例正常子宫内膜作为对照组。子宫内膜腺癌患者年龄37～68岁，平均（50.67±7.93）岁，所有患者在手术前均未放化疗或内分泌治疗，不合并其他部位的恶性肿瘤，病例资料查询提示每组患者的孕产史差异无统计学意义。所有切片染色后均经病理证实，子宫内膜腺癌病例采用国际妇产科联盟（FIGO 2009年）标准进行手术病理分期以及组织学分级，其中手术-病理分期组中Ⅰ期58例、Ⅱ期22例，因Ⅲ、Ⅳ期均为晚期，合并两期病例共为20例；组织学分级：G1 65例、G2 24例、G3 11例。肌层浸润
1.2 检测方法及原理 所有标本均经固定、包埋、切片，采用免疫组织化学SP（链霉素抗生物蛋白-过氧化酶）方法检测。步骤按试剂盒说明书严格操作。第一抗体：MMP-2、MMP-9鼠抗人单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）、第二抗体：即用型免疫组化S-P试剂盒、DAB显色试剂盒（北京中杉）。实验原理：应用免疫学基本原理-抗原抗体反应，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肤和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。MMP-9另需要做抗原热修复。
1.3 MMP-2、MMP-9阳性的评价标准 以细胞膜和/或细胞浆出现明显的黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞，其染色深度的评分标准参照Shimizu等[7]的方法，根据每张病理切片的细胞内着色的强度，如无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别评分为0、1、2、3分；将着色阳性细胞的面积按无着色、着色2/3分别评分为0、1、2、3分。再计数子宫内膜腺癌肿瘤细胞的总数和阳性表达的细胞数，最后表达强度的结果就由染色细胞数和染色深度的共同评分来评价，两者评分相加作为该切片的最终评分，以评价细胞中两者的表达强度。评分由低到高分为4级，0～1分为（-），2～3分为（+），4～5分为（++），6分为（+++）。其中0～1分为阴性，2～3分为弱阳性，4～5分为阳性，6分为强阳性。
1.4 统计学处理 所有数据采用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析，表达阳性率的比较采用字2检验（chi-square）和Fisher精确概率检验法，表达强度的比较采用多组有序分类资料的Kruskal Wallis H秩和检验，以P
2 结果
2.1 不同子宫内膜组织中MMP-2、MMP-9的阳性表达比较 MMP-2蛋白在正常子宫内膜组织、子宫内膜增生症、子宫内膜腺癌的阳性表达率分别为15.0%（3/20）、26.7%（8/30）、88.0%（88/100），MMP-9蛋白在正常子宫内膜组织、子宫内膜增生症、子宫内膜腺癌的阳性表达率分别为25.0%（5/20）、33.3%（10/30）、95.0%（95/100），差异均有统计学意义（P0.05），见表1～2。
2.2 MMP-2、MMP-9在子宫内膜腺癌组织中的表达情况 手术分期Ⅰ期、Ⅱ期组分别与Ⅲ、Ⅳ期组比较，差异均有统计学意义（P
3 讨论
3.1 MMPs的生物学作用 国外多项研究表明，MMPs是降解细胞外基质（ECM）中最重要的酶类，MMPs超家族最早参与肿瘤的浸润与转移，在多种肿瘤组织的浸润和转移中起了重要的作用。MMPs在正常组织细胞中没有或仅有弱表达，而在恶性肿瘤组织中的阳性表达率明显高于正常组织或良性肿瘤组织[8]。MMPs主要由结缔组织细胞、内皮细胞、巨噬细胞、粒细胞及胶原细胞等合成和分泌，能消化细胞外基质和基底膜的蛋白酶类，在多种病理、生理过程及肿瘤的侵袭和转移中发挥作用[9]。MMP-2、MMP-9是MMPs超家族的重要成员，通过消化细胞外基质（ECM）和基底膜（BM）而破坏组织细胞的结构，以参与肿瘤细胞的恶。多项研究表明，肿瘤侵袭转移的潜能与肿瘤细胞产生MMP-9的能力有着密切的正相关关系，他们不仅参与细胞外基质的降解，而且还对肿瘤细胞的黏附和能动性有影响[10-11]。MMP-2具有潜在活化细胞外基质结构蛋白的能力，在吸引炎症细胞和刺激肿瘤细胞的转移中起重要的作用[12]。
3.2 MMP-2、MMP-9与子宫内膜腺癌的相关性 子宫内膜不典型增生是子宫内膜腺癌的癌前病变，本研究结果表明MMP-2、MMP-9在子宫内膜增生症各级组织中的阳性表达率均明显高于正常子宫内膜组织，随着子宫内膜增生程度加重，其表达强度逐渐增强，发展至子宫内膜腺癌，其表达强度最高，差异显著，与Di等[3]研究结论一致，认为子宫内膜癌组织中MMP-2和MMP-9的阳性表达率比正常子宫内膜组织及子宫内膜增生症明显增强。表明MMP-2和MMP-9与从子宫内膜癌前病变发展至子宫内膜腺癌这一过程相关，两者强阳性表达预测子宫内膜组织癌变的可能性大，可作为早期诊断子宫内膜腺癌的有效分子生物学指标。
3.3 MMP-2和MMP-9与子宫内膜腺癌进展的关系 子宫内膜腺癌的转移方式主要为直接转移和淋巴结转移，促进其转移的因素目前尚待研究。本研究结果提示：MMP-2、MMP-9的阳性表达率越高，子宫内膜腺癌的手术-病理分期越晚，组织分化越差。有肌层浸润的子宫内膜腺癌组织中MMP-2、MMP-9阳性表达高于无肌层浸润组，有淋巴结转移的子宫内膜腺癌组织中MMP-2、MMP-9的阳性表达高于无淋巴结转移组。表明MMP-2、MMP-9不仅与子宫内膜腺癌的发展密切相关，还参与子宫内膜腺癌的转移和侵袭。在参与子宫内膜腺癌细胞的侵袭能力活动中发挥作用。表明MMP-2、MMP-9的高表达与子宫内膜腺癌的恶性程度有关，且两者的高表达提示与子宫内膜腺癌的浸润、转移有关。因此，检测MMP-2、MMP-9在子宫内膜增生症组织中的表达程度可预示恶变的可能，检测两者在子宫内膜腺癌中的表达可作为预测子宫内膜腺癌预后的指标。
在子宫内膜腺癌的发生及发展过程中，MMP-2、MMP-9表达增强是一个重要的分子事件。对MMP-2、MMP-9作用机制的全面认识，将会为子宫内膜腺癌的早期诊断和预后提供新的理论根据，为肿瘤的临床治疗开辟新的思路。但MMP-2、MMP-9参与子宫内膜腺癌的具体过程和机制仍需要进一步的肿瘤分子生物学研究及临床试验证实。
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免疫组化范文6
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集2014年6月～2015年2月我院病理科22例乳腺肿瘤术中的冰冻切片，其中浸润性导管癌7例、导管原位癌3例、导管状瘤3例、状癌2例及其他良性乳腺肿瘤7例。纳入标准为：①阅冰冻HE片后，是否浸润难以确定；②良恶性难以区分。
1.2主要试剂 即用型EnVision super非生物素免疫组化检测试剂盒，鼠抗人CK5/6 单克隆抗体，阳性对照选用迈新公司提供的阳性对照片，阴性对照选用鼠IgG同比稀释液。
1.3方法
1.3.1常规免疫组化检测技术 ①石蜡切片65℃烘箱2h后，常规脱蜡水洗；②高温高压修复，PBS 清洗3min×3次；③除去PBS液，置放在4℃冰箱，滴加一抗后PBS清洗3min×3次，滴加二抗后存放在室温下孵育30min；④除去PBS液，DAB显色，高倍镜下观察；⑤自来水冲洗后进行苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明及中性树胶封固。
1.3.2快速免疫组化检测技术 ①冰冻切片甲醇固定20s后迅速入PBS清洗3次；②滴加一抗37℃孵育10min后再予PBS清洗20s 3次；③二抗37℃孵5min后予PBS清洗20s 3次；④DAB显色，苏木素复染10s，常规脱水封片。
1.4 判断结果 将阳性细胞按其数量及染色强度分为3级，按阳性细胞所占比例及分布情况记录如下：阳性细胞数50%记为强阳性（+++）。
1.5统计学处理 采用SPSS 18.0 统计软件进行数据统计分析，计数资料采用χ2检验，以P
2 结果
22例乳腺肿瘤患者的术中冰冻切片行快速EnVision免疫组化法，结果发现无明显的信号染色干扰背景，两种免疫组化检测技术诊断结果符合率高但清晰度及步骤优于组织切片常规免疫组化染色，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
3 讨论
大部分乳腺肿瘤的腺泡周围有功能性血管纤维结缔组织，乳腺整个腺管系统均被覆有腺上皮和肌细胞两层细胞。腺泡在病变情况下，细胞形态及成分比例的变化，不同病变其免疫组化表型也各有不同，特别是判断肌上皮的存在与否对乳腺疾病的病理诊断和鉴别诊断是非常重要的[3]。但在HE切片上，是很难对此做出判断的。在乳腺腺管的中间腺细胞、定向干细胞和中间肌细胞中表达CK5/6，其中85%～98%普通导管增生CK5/6强阳性，而导管原位癌和不典型导管增生中的表达明显减少，可作为导管原位癌和小叶原位癌，普通导管/小叶增生鉴别的有用标记物[4，5]。快速免疫组化法与常规法相比，步骤相应缩短。此外，因抗原非常新鲜，与一抗二抗结合的时间缩短，也不易发生抗原丢失的现象，对实验结果不会产生影响。本研究发现，快速EnVision免疫组化法检测CK5/6在乳腺肿瘤中的表达结果与常规免疫组化相比，病理诊断结果相符率较高。22例乳腺肿瘤患者的冰冻切片中，除1例导管原位癌的CK5/6的表达EnVision快速法为阴性但常规法为阳性外，其余诊断结果均基本相符。笔者分析可能是由于连续切片后，只选一片组织做检查出现无所测抗原或者是个别组织对抗体的表达差异而造成的。
病理诊断医师在巨检的时候，凭经验认为仅凭阅冰冻HE片可能难以区别良恶性，往往需要借助免疫组化结果来诊断，常规冰冻切片可以和快速免疫组化同步进行，不影响冰冻诊断的出报告时间。在阅冰冻HE片后，需要借助免疫组化结果来诊断的可以进行快速免疫组化法，能起到明确诊断的关键作用。
综上所述，笔者认为应用快速EnVision免疫组化法检测乳腺术中冰冻标本中CK5/6的表达情况，速度快且准确率高，对病理医生诊断所测乳腺标本的病理学类型发挥重要作用，并为临床医生决定手术方法和范围提供有效帮助。
参考文献：
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