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咏柳的意思范文1
咏柳中裁的意思是裁剪。总的来说，这首诗的结构独具匠心，先写对柳树的总体印象，再写到柳条，最后写柳叶，由总到分，条序井然。在语言的运用上，既晓畅，又华美。
诗句译文高高的柳树长满了翠绿的新叶，轻柔的柳枝垂下来，就像万条轻轻飘动的绿色丝带。这细细的嫩叶是谁的巧手裁剪出来的呢？原来是那二月里温暖的春风，它就像一把灵巧的剪刀。
（来源：文章屋网 ）
咏柳的意思范文2
【关键词】精益思想；销售物流；库存管理；运输管理
精益思想（Lean Thinking）源于20世纪80年代日本丰田发明的精益生产（Lean Manufacturing）方式，精益生产方式造成日本汽车的质量与成本优势，曾经压得美国汽车抬不起头。世界汽车工业重心已向日本倾斜。 精益思想更进一步从理论的高度归纳了精益生产中所包含的新的管理思维，并将精益方式扩大到制造业以外的所有领域，尤其是第三产业，把精益生产方法外延到企业活动的各个方面，不再局限于生产领域，从而促使管理人员重新思考企业流程，消灭浪费，创造价值。精益思想的核心就是（消除浪费）以越来越少的投入―较少的人力、较少的设备、较短的时间和较小的场地创造出尽可能多的价值；同时也越来越接近用户，提供他们确实要的东西。
销售物流（Distribution logistics）是指生产企业、流通企业出售商品时，物品在供方与需方之间的实体流动。所以，又称为企业销售物流，是企业为保证本身的经营利益，不断伴随销售活动，将产品所有权转给用户的物流活动，具体包括订单管理、仓储与库存管理、运输管理、不良品退换货及售后管理。本文仅就仓储与库存管理、运输管理、售后管理三方面结合精益思想进行讨论。
1.精益思想在仓储与库存管理中的应用
库存问题是每个生产企业和流通企业必须要面临的问题。习惯上，人们总认为物资存储的越多越好，因为越大的库存量对于企业而言，多数时候是一种保障，可以防止企业因缺货造成的各种损失。然而，现实中也有很多实例证明这个观点是片面的。比如，如果配送中心物品存量过多，而用户订单较少，此时则会造成物品积压，占用过多的流动资金，使资金整体周转变缓，必将导致企业的库存持有成本过高，不但不利于企业稳定生产，同时会给企业增加更多诸如“机会成本”之类的负担。以上我们所指出的只是库存问题在库存量的合理与否上对企业形成的威胁，然而即使库存量合理，而不合理的库存结构也同样会对企业造成较大的影响，会使企业出现“眉毛胡子一把抓”的不合理的管理理念。可见，库存问题是企业普遍关注的问题，也理应是企业在经营管理过程中必须面对和重视的问题。
依据企业库存管理中普遍存在的问题，现提出四方面改进措施：
1.1提高需求预测的准确性――利用VMI法进行销售预测
充分结合本企业产品状况，通过利用VMI法进行合理库存优化。在不影响公司库存管理优化方法的基础上，采用VMI法来对公司产品的预测方法进行优化，即客户每周向公司提供采购需求计划最新信息，其中列明各品名未来四周及此后一个月以上的采购计划，并负有对未来两周需求的购买义务。企业对销售部门的职务要求除了在销售量的预测上应有相应的改善外，在产品结构、创新性的分析及预测上也应不断提升销售部门的市场敏感度。
1.2稳定并提高市场占有率――绩效评估矩阵法
市场占有率的不稳定会直接并严重影响到企业的库存问题，也不利于企业销售需求预测工作的开展，因此要着手解决这个问题，一方面企业应时刻以一种敏锐的洞察力和响应能力确保提供适销对路及数量可靠的商品去及时满足市场所需，及时生产及时补给，不给竞争者流出抢占市场份额的机会。另一个重要的方面，企业必须明确自身的市场地位和竞争力，强化自身的竞争优势，建立稳定的客户关系群，争取稳定的客源。
1.3杜绝呆滞品的发生
企业库存中呆滞品现象较为严重，原因有三：企业生产转型，故原有的成品由于企业关注重点的转移而造成留滞；原主要客户的流失，导致大量专项产品呆滞；对市场的响应柔性较差，提前存储现象严重。面对这些问题，企业应该重新设计和安排现有的生产管理模式，对于已经既成事实的前两种情况，应积极考虑和面对如何解决现有的呆滞品，看是否可通过成品改良、改造加以利用，同时要回避日后出现相同的情形。
1.4建立全体员工共同参与库存管理活动的制度
众所周知，企业效益的最大化必须是建立在企业整体团结、密切合作的基础之上的，坚实稳定的团队精神和信息充分共享的氛围是企业制胜的充要条件。
2.精益思想在运输管理中的应用
运输是物流配送作业中最直观的要素之一，也是物流系统中一个涉及面广并由诸多子系统所构成的大系统，是一个复杂的运输系统工程。而物流运输成本更是在整个物流中占有重要地位，其成本要占物流总成本的35%～50%，占商品价格的4%～10%，所以运输成本的减少对物流总成本的节约具有举足轻重的作用。那么，现代的企业应该怎样充分利用现在的时间、空间及财务资源，实现运输的功能并达到运输的目的，使整个物流系统处于最佳的运作状态呢？这就需要优化运输的方式：
2.1分区产销合理运输
根据产销情况和交通运输条件，按近产近销的原则组织货物运输，使货物走最少的路程。这种方法适合于品种单一、规格简单、生产集中而消费分散或生产分散而消费集中、调运最大的货物。
2.2直达运输
在组织货物运输时，越过批发商等中转环节，把货物从产地或起运地直接运到目的地，以减少中间的作业环节，降低运输成本。
2.3先行流通加工
有些由于形态和特性不同于一般产品，不适合直接运输，在对他们进行运输前，先经过适当加工，可以减少体积、重量，使运输合理化。
2.4计划运输
对运输时间和路线等事先做出计划安排，在运输时选择最佳运输路线和最佳运输时间，避开交通高峰期及交通拥挤地段，可以降低运输成本。譬如说，著名的日本花王公司为避免交通阻塞，提高物流作业效率，它合理地针对每个销售公司的地理环境，交通道路状况和经营特点，安排了不同的运输时间和路线，从而使货车避开了交通高峰，顺利畅通地实现了商品的配送，从而也大大地降低了运输成本，为公司的发展、壮大发挥了不可估量的作用。
3.精益思想在售后管理中的应用
售后管理的重心是流程的优化。在企业客户服务流程中，多数问题出在客户的诉求需要经过多个环节才能得到响应。然而对于网络化的企业来说，其管理理念之一是对客户需求的“快速响应”，这种多环节的运作模式显然不适应。于是，基于信息化平台的新的客户服务流程就应运而生。客户信息进入新系统后，其诉求立刻在企业诊断系统中得到响应，诊断系统直接向各相关部门发出指令，指挥相关部门解决客户的具体要求。同时，整个服务过程进入知识库，供故障研究与分类部门进行深入分析和总结。这样，一个自动化的“快速响应”系统就形成了。
咏柳的意思范文3
论文关键词：刘易斯拐点，人口红利，用工荒，用工机制
一、“刘易斯拐点”的显现与“人口红利”逐渐消失
“刘易斯拐点”是由英国经济学家刘易斯在讨论“二元经济”发展模式提出的，“二元经济”发展模式一般经历两个阶段，一是劳动力无限供给阶段，二是劳动力短缺阶段，由第一阶段转变到第二阶段，劳动力由剩余变为短缺，劳动力工资水平也开始不断提高，后来经济学把联接第一阶段与第二阶段的交点称为“刘易斯拐点”。在2009年以前，我国劳动力供应总体上一直源源不断，市场基本处于无穷供给的状态，但进入2009年以后，随着我国经济情况的不断回暖，形势发生急转，尤其我国四大劳动力密集产业部门如机械制造业、纺织业、电子和酒店服务业的用工开始出现紧张起来，很多企业正经历着持续的开工不足的用工难题，并且影响范围已经由地方性波及到全国，这似乎预示着我国劳动力供应过程中“刘易斯拐点”开始显现。
与“刘易斯拐点”相对应的是“人口红利”， 前者的显现，往往是“人口红利”逐渐消失的一个前兆。人口红利是是指一个国家的劳动年龄人口占总人口比重较大，抚养率比较低，为经济发展创造了有利的人口条件用工荒，整个国家的经济成高储蓄、高投资和高增长的局面。严格来说，任何完成了人口转变的国家，都会出现这样一种“人口红利”。但最早实现人口转变的西方发达国家，日本是亚洲最早实现人口转变和经济腾飞的国家，“人口红利”也出现得最早，大约开始于1930~1935年，结束于1990~1995年，持续了60年左右的时间。
中国目前的人口年龄结构中60岁老龄人口已超过1.6亿，且每年以近800万的速度增加，按照国际上通行的标准（60岁人口比例10%），我国已经进入老龄化社会，而且老龄化速度越来越快，预计到2050年，中国60岁以上老龄人口将达到总人口的三分之一。由此可以看出虽然我国，每年供给的劳动力总量约为1000万，劳动人口比例较高，但由于由于人口老龄化速度加剧，人口红利正逐渐缩减直至消失，而 “用工荒”就是劳动力市场变化的征兆。
二、“刘易斯拐点”对旅游酒店行业用工的影响表现
1.招工难和留人难并存。截止到2009年，全国共有星级饭店14237家，拥有客房167.35万间，而2010年预计星级饭店的客房数量将达到180万间，酒店从业人员的数量需求也将突破270万。但实际上，截止2009年我国酒店从业人员的数量一直徘徊在170万左右，每年我国酒店的用工缺口都在50万-80万左右，最近随着我国电子、纺织、制造业的对用工的强劲需求，更加剧了酒店的招工困难。另外一个突出表现是酒店行业与金融危机之前相比更难留住人才，据中调网调查，2009年我国半数以上星级酒店的员工的流失率已经达到45%，而酒店正常的员工流失率应该在6%-20%之间，这就造成很多酒店常年都在疲于招聘员工论文格式范文。
2.从发生频率上看，酒店行业的用工荒由阶段性正转变为常态化。众所周知，酒店业务淡旺季非常分明，酒店为了降低成本，正式在编的员工人数很少，因此以前我国酒店行业用工荒主要表现为季节性和阶段性，即每年重要节日前后以及节事活动期间，用工荒问题表现特别突出。但是进入2009年以后，酒店行业的用工局面已经发生重大的变化，用工紧张已经出现了常态化，不再分淡旺季或特定某个时期，主要原因随着电子和制造产业向中西部地区转移用工荒，一些劳动力输出大省的务工人员不用再背井离乡了，在家门口都能找工作环境和薪酬待遇比酒店行业更具优势的的工作，从而造成了可从事酒店服务业的劳动力人口绝对数量大幅减少，因而酒店用工问题会持续紧张。
3.从发生范围上来看，我国旅游酒店业用工已经由局部的用工荒转向了全国性的大范围的用工荒。过去，酒店行业用工荒主要集中于旅游业较发达大城市和东南沿海地区，如北京、上海以及广东、福建、江苏和浙江等地区，并且用工紧张程度在不同档次和类型的酒店中表现是不一样。但是2009年经济回暖之后，我国旅游酒店行业用工紧张已经从经济较发达的地区波及到全国，即使在中西部地区和一些三四线城市，用工紧张程度与东南沿海地区相比有过之而无不及，据笔者对2010年全国酒店行业用工统计，中国大陆地区31个省、自治区和直辖市中除西藏自治区情况稍好一些外，都大范围存在着不同程度的酒店行业用工荒，尤其一些中西部的重要的旅游城市，影响程度更加严重一些。
4.从影响结果来看，酒店的可持续性经营受到严重威胁。刘易斯拐点的显现效应通过影响酒店行业的用工直至全方面影响酒店的正常经营活动。中国计划生育实施于上世纪80年代，如今独生子女已经成为就业人口的主力军，在吃穿不愁的环境下长大的80、90后已经远远不满足于1000-2000元的工资，在城市生活成本居高不下，低于2000元的月收入在沿海城市甚至可以成为贫困人群。酒店的基层服务人员从城市人口，转向农村人群和内地欠发达地区，而且还普遍招不到人。作为酒店经营者，应该好好考虑中国的酒店业是否还是能够采取劳动力密集的形式继续生存下去了。
三、创新酒店行业用工机制积极应对用工荒
1.创新用工制度，尊重员工权利，改善薪酬待遇。酒店行业“用工荒”从侧面反映了用工的权利长期受到漠视，造成招工难和离职潮，实际是一种“权利荒”。我国《劳动合同法》从2008年初颁布至今到3年，而《企业职工带薪年休假实施办法》也出台了两年有余，但是这些法规条例到了企业层面还没有真正落实到位。因此，在酒店规章制度应该与劳动法规同步实施，对原有《劳动合同》进行清理，在严格考核的基础上，按法律有关规定，及时与相关人员续签《劳动合同》。在合同期限上，以1—3年为一个合同期限，形成阶梯型合同时限，避免同步到期，集中离店造成的短期劳动力紧张状况，同时也延缓无固定期限合同生成的周期。在当前劳动力供需矛盾突出的形势下，较好地稳定了员工队伍，并为下一步员工有序流动打下了一定基础。另外用工荒，合理安排员工年休假，改善员工薪酬待遇水平，饭店管理层从饭店实际出发，强化员工休假意识，建议将年休假安排放权给各部门，要求各部门根据经营情况，利用营业淡季，灵活安排员工年休假。
2.以信息技术为核心对酒店业务流程进行再造（BPR），使酒店的业务流程更加人性化和简约化。这样不但可以降低成本，还可以减轻员工工作负担和强度，从而降低酒店员工的流失率。目前我国很多星级酒店的业务流程还是因循上世纪九十年代的管理模式设计，没有充分融合现代高度发达的信息技术。最典型的是国外酒店目前普遍实行的收益管理系统和服务外包的经营模式在我国很多酒店还处于探索阶段。以收益管理为核心的运营模式是以信息技术为基础，以市场需求为主导，以收益为目标，对业务流程进行精简裁撤，实现员工一岗多能，降低运营成本，提高顾客的满意度。而服务外包则是把酒店相对繁琐、劳动强度比较大的业务如公共区域清洁、日常清扫和餐具、衣物洗涤等外包给社区专业机构，酒店只做专业性比较强的核心业务。经过重新设计的业务流程更加强调信息化和人性化，员工也更有成就感论文格式范文。
3.加强员工长期职业生涯规划，注重交叉培训。员工职业生涯规划酒店应该为每一位员工设计其职业发展规划，尤其是对大中专毕业生等高素质人才的职业发展要有一套明确的规划方案，使其能够看到未来的发展方向和目标。目前我国毕业的旅游大中专毕业生数量接近30万人，同时每年还有30万左右旅游专业在校实习生，如果这些半数以上毕业生能够选择酒店行业，不但能提升酒店员工素质，而且极大的缓解用工紧张的问题。在招聘时，酒店选择有潜质并热爱酒店工作的旅游毕业生，按照其性格特点和兴趣爱好，制订职业生涯规划，经过一段时间的基层锻炼，达到了特定的指标并通过评审，可以获得晋升。这样，酒店行业必将受到旅游毕业生青睐。交叉培训是一种员工通过接受额外服务技巧的培训来满足不止一个工作岗位需要的培训方式，现已被越来越多的西方酒店作为保持人员素质优势、提高服务质量及竞争力的重要手段。实施交叉培训有助于酒店更加有效的控制成本，在旅游旺季业务量突增或员工生病、休假以及顾客额外需求导致酒店内部出现工作缺位时能够及时弥补，同时还可以降低员工的跳槽率。
4.在旅游人才培养和储备方面，建立校企合作培训交流机制，旅游院校可以为旅游酒店提供人才输出和管理咨询，酒店方可以为旅游院校提供实习基地和专业实践课程指导，从而达到“双赢”。我国旅游院校再也不能关起门来办教育了，应该邀请酒店方参与专业目标的定位和课程设置用工荒，使得旅游专业人才培养更加适销对路；酒店企业应该主动和旅游学院进行交流合作，通过建立实习基地的合作形式定期接纳一定数量合作院校的实习生，不但可以缓解旺季时候的用工紧张的问题，同时也为酒店未来的发展储备了一定数量的专业人才，保证酒店用工的可持续性。
5.加强企业文化建设，营造人性化的工作环境。企业文化是企业的灵魂，良好的企业文化激发企业员工积极性和创造性的精神源泉，有助于塑造人性化的工作氛围，这样既能有效降低员工流失率，还能提高酒店企业对求职者的吸引力。企业文化是以价值为核心，以知识为基础，以事业为共同追求，以职业道德、相关法令、制度和政策为导向的全体职工和企业领导的长期共识。酒店在塑造企业文化时，一要注重兼容性，能吸收和接纳不同酒店管理模式的精髓，容忍员工个性上的缺陷和不足；二是加强学习性，建立学习型组织架构，并创造新的经营管理与服务理念；三是强调战略性，注重酒店服务的长期效应，增强员工危机感。另外，酒店管理者应把员工当顾客，主动解决员工的困难和要求，使员工在物质生活和精神生活两方面都能感受到酒店的温暖。
[参考文献]
[1]威廉·阿瑟·刘易斯.劳动无限供给条件下的经济发展[J].曼彻斯特学报，1954，(2).
[2]梁伟.人口红利面临衰竭我国或步入人口负债期[N].上海证券报.2009-12-11(2).
[3]中华人民共和国国家旅游局.2009年中国星级饭店统计公报[EB/OL]. cnta.com/html/zh/index.html，2010-10-07.
咏柳的意思范文4
【关键词】牛肉汤；亚硝酸盐；食物中毒
【中图分类号】R426【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)03-0140-01
2010年8月12日晚11时30分，区疾病预防控制中心接到区卫生局通知，称有疑似食物中毒患者，正在某医院急诊室治疗。接报后，我中心立即组织有关人员迅速赶赴医院和事发现场进行调查。现将调查情况报告如下：
1 事发经过
患者孙某某,男,45岁;患者仵某某,男,40岁左右。2人于2010年8月12日下午一同乘车到南阳，约20时左右，2人一同在车站路杏树庄前街刘记牛肉汤菜馆喝牛肉汤，后先后出现呼吸困难、头晕、恶心等症状，当时饭店老板建议打120急救电话，但2人认为可能是中暑，就到附近诊所诊治，在诊所内服用几粒霍香正气胶囊，但诊所医生觉得2人病情不像是中暑，建议到医院诊治，并立即拨打了120急救电话，后某医院120急救车赶到,但当时2人不愿去,后来大约在21时15分左右，2人又自行到该院急诊室治疗。
2 流行病学调查情况
2.1 患者调查情况。
2.1.1 就餐情况：患者孙某某和仵某某2人当晚就餐食物均为10元熟牛肉(大约150g)和一碗牛肉汤（500g左右），并共同喝不到2瓶果啤。其中仵某某吃的比较快，没过几分钟，就说感觉不舒服，头晕，身体站不起来；等到孙某某把自己的牛肉汤喝完后，大概有10分钟左右，也感觉不舒服，头晕，恶心，并在饭店外吐了2次。食用当餐牛肉汤者还有多位（店主提供不出人数），没有类似病例报告。
2.1.2 患者临床症状和潜伏期：孙某某伴有恶心、呕吐、头晕、呼吸困难、口唇青紫、腹痛等症状。仵某某伴有头晕、腹痛、胸闷、呼吸困难、口唇青紫等症状，并晕厥一次。两人首发症状均为食用牛肉汤后10分钟左右。
2.1.3 治疗及用药情况：医生对2名患者的初步临床诊断为：“呼吸困难、青紫待查，亚硝酸盐？”。对患者仵某某首先进行了洗胃处理，随后用药物亚甲蓝和维C进行治疗；对患者孙某某进行导泻，并用药物亚甲蓝和维C进行治疗。经治疗，2名患者病情稳定，未出现严重后果。
2.2 样品采集情况：我中心受区卫生监督所委托，采集到该牛肉汤菜馆当餐熟牛肉、牛肉汤各1份；医院医生提供2名患者的呕吐物各1份，其中仵某某采集的是洗胃洗出的内容物。结合患者临床症状、医生的初步诊断和特效治疗效果，报验亚硝酸盐项目。
3 实验室检验结果
采集的2份样品中，熟牛肉中亚硝酸盐（以亚硝酸钠计，下同）检测结果为10mg/kg；牛肉汤中亚硝酸盐检测结果为300mg/kg；仵某某的呕吐物中亚硝酸盐检测结果为1mg/kg；由于孙某某的呕吐物太少，无法进行检验。
4 初步分析
亚硝酸盐是一种常见的物质，是广泛用于食品加工业中的发色剂和防腐剂，可使腌制肉、鱼呈肉红色。如亚硝酸盐加入数量过多，或硝酸盐还原为亚硝酸盐，可引起中毒[1]。大剂量的亚硝酸盐进入人体后，氧化血液中的血红蛋白为高铁血红蛋白，导致组织缺氧，引起肠原性青紫症，人体摄入0.2~0.5g即可引起中毒，3g即可致死[2]。结合流行病学调查情况、患者的临床症状、治疗用药和治疗效果以及实验室检验结果，倾向于认为这是一起由亚硝酸盐引起的食物中毒。但还存在以下问题：
一是按照《食品添加剂使用卫生标准》（GB2760~2007）规定，亚硝酸钠或亚硝酸钾做作为护色剂和防腐剂，加工酱卤肉制品，以亚硝酸钠计残留量不得超过30mg/kg。本次采集患者食用的熟牛肉样品中亚硝酸盐残留量为10mg/kg，不超标；牛肉汤样品中亚硝酸盐残留量为300 mg/kg，虽无明确卫生标准，但作为直接入口卤制肉汤类食品，认为可以参照酱卤肉制品亚硝酸盐残留量卫生标准判定，属于严重超标。
根据资料显示，亚硝酸盐中毒剂量为0.2 g ~0.5g。患者食用牛肉汤约500 g，则食入亚硝酸盐约150 mg；食用熟牛肉约150 g，则食入亚硝酸盐约1.5mg。患者总共食入亚硝酸盐量约为151.5mg，尚达不到中毒剂量。
二是患者在医院诊治期间，均未做血液高铁血红蛋白测定，缺乏实验室诊断依据。
但笔者认为，任何食物中毒都存在个体差异，即使达到中毒剂量也未必同食者都会发病。因此，无论是根据中毒症状，还是临床治疗，倾向认定为亚硝酸盐中毒不无道理。提示我们，在食物中毒判定实践中，不能仅靠有无共餐者群体发病而妄下结论，必须结合中毒者个体差异、临床特点、治疗效果、实验室检验等做出综合判定。
参考文献
[1]杨本兴，张玉超，梅振华.食品营养卫生与管理.郑州：河南医科大学出版社，2001:140-141
咏柳的意思范文5
【关键词】 抗原,cd59;卵巢肿瘤;rna干扰;小鼠，裸
【摘要】 目的 探讨针对cd59的sirna(cd59sirna)对人卵巢癌裸鼠移植瘤cd59的沉默效应及其抑瘤作用。方法 采用脂质体转染法将cd59干扰质粒(t组)和空质粒(v组)转染a2780细胞，获得稳定表达细胞株，将t组、v组a2780细胞和未转染(c组)的a2780细胞分别接种于裸鼠皮下建立肿瘤模型，通过绘制肿瘤生长曲线、rtpcr和免疫组织化学法研究其抑瘤效应和对cd59基因及蛋白的沉默效应。结果 与v组和c组比较，t组肿瘤体积和质量明显减小(f=301.88、5.39,q=4.01～30.41,p<0.05)，cd59基因及蛋白表达减少(f=817.77、247.71,q=26.59～52.25,p<0.05)。结论 特异性沉默cd59基因的sirna表达载体可以明显抑制cd59的表达及卵巢癌在体内的生长。
【关键词】 抗原,cd59;卵巢肿瘤;rna干扰;小鼠，裸
effect of silencing cd59 gene by rna interference on ovarian cancer transplanted in nude mice feng cuiping, gao meihua (department of immunology, qingdao university medical college, qingdao 266021,china); [abstract] objective to investigate the inhibition effect of cd59sirna on cd59 gene and the growth of ovarian cancer in nude mice. methods a2780 cells were stably transfected with shrna plasmid (group t) and blank plasmid (group v), respectively, using lipofectamne 2000. these cells and a2780 cells without trnsfection (group c) were subcutaneously injected into nude mice. the inhibition effect of cd59sirna on tumor and the expreesion of cd59 was evaluated by tumor growth curve, rtpcr and immunohistochemistry (ihc). results compared with groups v and c, the gross tumor volume and weight were significantly inhibited in group t (f=301.88,5.39;q=4.01-30.41;p<0.05), rt pcr and ihc showed that the expression of cd59 mrna and cd59 also decreased (f=817.77,247.71;q=26.59-52.25;p<0.05). conclusion cd59sirna can significantly suppress the expression of cd59 and growth of ovarian cancer in vivo.
[key words] antigens, cd59; ovarian neoplasms; rna interference; mice, nude
cd59是一种广泛分布于组织细胞表面的糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚固糖蛋白，具有多种重要的免疫功能,其最重要的功能是作为补体系统终末阶段的调节蛋白，以同源限制的方式抑制补体攻膜复合物(mac)的装配以保护宿主细胞免受补体溶解破坏[13]。近年来，国内外文献报道，多种实体肿瘤细胞膜表面高表达cd59等一系列膜补体调节蛋白(mcrps)，使肿瘤细胞逃脱了自身的免疫监视[4]，与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关[5]，同时也是导致众多肿瘤治疗失败的重要原因。本课题组前期利用rna干扰技术(rnai)构建了针对cd59的psupercd59sirna重组载体[67]，并在体外实验证明了其对cd59的沉默效应。为深入了解cd59基因表达变化对肿瘤细胞在体内生长的影响，本研究利用该重组载体，观察其在荷瘤裸鼠体内对肿瘤细胞cd59基因的沉默及抑瘤效应，为肿瘤基因治疗提供动物实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料
人卵巢癌细胞系a2780细胞由本实验室保存;小鼠抗人cd59抗体购自bd pharmingen公司;lipofectamne 2000和总rna提取试剂盒均购自invitrogen公司;4～6周龄雌性裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司;psuper质粒由我院罗兵教授惠赠; 重组质粒psupercd59sirna由本室构建和保存;access rtpcr a1250试剂盒购自promega公司;dab显色试剂盒购自北京中杉金桥公司;sabc免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞转染及稳定转染细胞克隆的筛选 用 2.5 g/l胰酶消化生长状态良好的a2780细胞，调整细胞密度达2×108/l,取0.5 ml加入24孔细胞培养板过夜培养，待细胞达到80%～90%汇合时进行转染。利用脂质体lipofectamne 2000，将psupercd59sirna及空质粒psuper分别转染a2780细胞。g418选择性培养基中筛选具有抗性的单细胞来源的细胞克隆,扩大培养。将筛选出的干扰质粒整合的细胞克隆作为干扰组(t组)，空质粒整合的细胞克隆为阴性对照组(v组)，未转染的a2780细胞为空白对照组(c组)。
1.2.2 移植瘤裸鼠模型的建立 4～6周龄雌性裸鼠饲养在spf环境中, 随机分为3组(t组、v组和c组)，每组6只。采用常规培养细胞种植法，收集处于对数生长期的各组a2780细胞，于相应组每只裸鼠右腋皮下注射细胞5×106个(0.2 ml)。连续观察30 d，记录肿瘤出现的时间;并于接种后每5 d测量肿瘤的长轴(l)和短轴(w),计算肿瘤体积(v)，v=1/2×lw2，绘制肿瘤生长曲线。于第30天断颈处死裸鼠，摘取移植瘤称质量。
1.2.3 rtpcr检测裸鼠荷瘤组织cd59 mrna的表达 trizol试剂盒提取肿瘤组织总rna，采用access rtpcr a1250系统进行一步法检测cd59的mrna表达。rtpcr反应参数为：48 ℃孵育45 min，94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，47℃退火1 min，68 ℃延伸2 min，40个循环后，68 ℃延伸7 min。以gapdh作内参照。cd59引物序列[6]：上游引物5′acaactgtcctaacccaa3′;下游引物5′gagtcaccagcagaagaa3′;扩增片段为267 bp。gapdh引物序列：上游引物5′cgtggaaggactcatgacca3′;下游引物5′tccaggggtcttactccttg3′;扩增片段为509 bp。取3 μl扩增产物进行10 g/l琼脂糖凝胶电泳并照相。利用uvp 公司的image analysis software 测定cd59 扩增片段的灰度值,将其与gapdh扩增片段灰度值的比值作为cd59 mrna 表达水平的半定量指标。
1.2.4 免疫组化sabc法检测肿瘤组织cd59蛋白的表达 免疫组化步骤按sabc免疫组化试剂盒说明书进行。采用image pro plus 6.0 for windows软件对免疫组织化学图像显色程度进行分析。对每张切片进行半定量分析[8]：高倍镜下(400倍)随机选取5个不重复的阳性反应视野，将阳性细胞的染色强度转变为量化指标，统计切片阳性染色细胞的平均吸光度(a)，取5个视野的平均值作为该片的a值,a值大小与cd59蛋白和mrna的含量成正比。
1.3 统计学处理方法
应用spss 16.0及ppms 1.5[9]统计学软件进行数据处理，结果以±s表示，组间比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 裸鼠移植瘤生长曲线
皮下注射卵巢癌a2780细胞6～8 d后，v组和c组的裸鼠均可观察到4～6 mm大小皮下肿瘤结节，并随时间的延长不断增大;而t组在接种后12～15 d才可观察到肿瘤结节，并且生长缓慢。18只裸鼠无死亡，所有肿瘤包块均无红肿和溃破。裸鼠肿瘤生长曲线(图1)显示，与v组和c组相比，t组肿瘤的生长明显受到抑制。接种后第30天,与v组和c组比较，t组肿瘤体积和质量明显减小(f=301.88、5.39,q=4.01～30.41,p<0.05);v组与c组的肿瘤体积和质量比较，差异无显著意义(q=0.75、0.02,p>0.05),见表1。表1 各组裸鼠移植瘤的质量和体积
2.2 各组裸鼠移植瘤cd59 mrna表达比较
各组裸鼠肿瘤组织中cd59 mrna表达的rtpcr电泳检测结果见图2。cd59电泳条带的灰度值经同一标本的gapdh条带的灰度值校正后分析显示，t组与v组、c组的cd59 mrna表达相比较差异有显著意义(f=817.77,q=51.00、52.25,p<0.05)，v组和c组差异无显著意义(q=1.25,p>0.05)。见表2。
2.3 各组cd59蛋白在裸鼠卵巢癌移植瘤组织中的表达比较
cd59蛋白免疫组化阳性表达为棕黄色，主要定位于细胞膜，也可见于细胞浆。t组cd59蛋白表达与v组和c组比较明显降低(f=247.71,q=26.59、27.89,p<0.05)，v组和c组相比差异无统计学意义(q=1.30,p>0.05)。见表2。表2 各组裸鼠肿瘤组织中cd59 mrna及蛋白表达比较
3 讨 论
cd59作为一种补体调节蛋白，以同源限制的方式抑制mac的装配，保护宿主细胞免受补体溶解破坏，但由于它在多种实体肿瘤细胞中高表达，抑制了机体补体系统对肿瘤细胞的攻击, 使肿瘤逃避机体的免疫防御。肿瘤细胞的免疫逃逸是导致众多肿瘤治疗方案失败的重要原因[10]，而使肿瘤细胞膜上的补体调节蛋白失活或者不表达则是实体肿瘤免疫治疗中一个更加有效的策略。为此，本研究采用了先进的rna干扰技术沉默cd59基因在卵巢癌细胞中的表达，探讨cd59基因表达变化对肿瘤细胞在体内生长的影响。
rnai技术是近年发展起来的沉默基因的新技术，是自然界生物体的一种遗传现象，主要是利用双链rna特异性介导其互补同源mrna序列的降解，从而特异性抑制目的蛋白的表达[11]。2001 年,rnai 技术被成功地应用于哺乳动物细胞,证明哺乳动物细胞中也存在rnai 现象[12]。rnai作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域的发展极为迅速[13]。由于sirna具有高效敲除基因表达的作用，已被广大科学工作者用作研究基因功能和基因治疗的工具。
本课题组前期已经利用rnai技术设计了针对cd59 mrna的干扰序列并构建了psupercd59sirna重组载体，本研究将该质粒载体转染卵巢癌a2780细胞中并筛选出阳性克隆，获得稳定转染的细胞株，同时设立空质粒(psuper质粒)转染及未转染的a2780细胞作为对照。通过建立卵巢癌移植瘤模型，观察到psupercd59sirna重组载体能明显抑制肿瘤形成的时间及肿瘤生长。与阴性对照组和空白对照组比较，干扰组cd59的mrna和蛋白表达明显被抑制，肿瘤的体积显著减小，表明psupersicd59干扰质粒在体内可抑制cd59的表达，cd59的沉默使其失去抑制mac形成的功能，使卵巢癌a2780细胞抗补体活性下降，有利于机体肿瘤的清除。
综上所述，psupersicd59转录载体在体内外均实验证实了其沉默cd59的效应，并且也说明了cd59在肿瘤生长及肿瘤逃逸中的作用，为肿瘤的免疫逃逸和靶向治疗研究提供了一种全新的理念及实验依据，具有重要的理论价值及广阔的临床应用前景。
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咏柳的意思范文6
【关键词】 中期妊娠流产;米非司酮;依沙吖啶
以往对于妊娠12~16周流产一般都采取经阴插管注药加钳刮术,因操作繁琐,难度大,易逆行感染,患者痛苦大,副作用多,现在我们已经放弃此法;对于16~28周者多采用直接经腹依沙吖啶羊膜腔内注入术,因其容易发生蜕膜残留,我们对此做了改进。自2000年12月到2009年9月我们应用米非司酮配伍依沙吖啶联合应用于12~28周妊娠流产,并与同期单用依沙吖啶流产及米非司酮配伍米索前列醇经阴道给药和口服法进行了对比研究。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象 从2000年12月到2009年9月12~16周妊娠住院接受流产的健康妇女260例 其中初产妇148例、经产妇112例,肝肾功能均正常,排除严重内科疾患,均经彩超检查核实孕周及胎盘定位与宫颈从解剖学内口到外口的长度。
1.2 研究方法 260例孕妇随机分成两组,研究组100例,对照组160例。对照组又随机分成两组,即A组(60例)与B组(100例)。因B组系用同一药物两种不同给药途径,故又将B组分成B1组(6O例)、 B2组(40例)。
1.2.1 药物应用方法 研究组米非司酮150 mg,共1次,口服药物的同时即给予经腹羊膜腔内注入依沙吖啶100 mg;对照组:A组为经腹羊膜腔内注入依沙吖啶100 mg。B1组为米非司酮25 mg,3次/d,共6次,总量是150 mg。服完于次晨经阴道后穹窿放置米索前列醇600 μg。对无效或宫缩弱者间隔6 h再放200~400 μg。总量不超过1500 μg。B2组:米非司酮用法同B1组.服完次晨空腹口服米索前列醇600 μg。对无宫缩或宫缩逐渐减弱者,间隔6 h加服600 μg,总量亦不超过1500 μg,再观察48 h无宫缩者为失败。研究组与对照A组从经腹注入依沙吖啶开始观察并记录宫缩开始时间及胎儿、胎盘排出时间。B组从口服米索前列醇或于阴道首次放米索前列醇开始观察并记录宫缩开始时间及胎儿、胎盘排出时间。
1.2.2 疼痛分级 根据孕妇临床表现和主诉分四级。I级:无痛或稍感不适,活动自如,无出汗;Ⅱ级:轻度疼痛,可忍受,合作,微出汗;Ⅲ级:中度疼痛,难以忍受,辗转不安,合作欠佳,出汗伴肢冷;Ⅳ级:重度疼痛,不能忍受,出汗伴肢冷。
1.2.3 观察指标 宫缩开始时间,胎儿流产时间,胎盘排出时间,流产程,出血量,疼痛分级,副反应,流产效果及宫颈长度对产程、流产痛的影响。
1.2.4 流产效果评定标准 胎儿及胎盘完整娩出者为完全流产;胎儿娩出后胎盘滞留者为不全流产。两者合计为成功率,末次用药48 h后妊娠仍继续者为失败。
1.2.5 数据处理采用SPSS 10.0统计软件包,组间比较采用t检验和χ2检验,P
2 结果
2.1 用药次数及剂量研究组米非司酮150 mg,共1次.总量为150 mg.口服药物的同时即给予经腹羊膜腔内注入依沙吖啶100 mg,均1次成功。对照A组依沙吖啶100 mg羊膜腔内注入成功58例,用药48 h后无效2例,改用米非司酮50 mg口服,12 h后配伍米索前列醇经阴道放药1次成功。对照Bl组阴道放药600ug,1次成功40例(66.67%)、2次成功16例(26.67%)、3次成功2例(3.33%),失败2例改用依沙吖啶羊膜腔内注入。对照B2组口服米索前列醇600ug,1次成功32例(8O%),2次成功2例(5%),服药48 h无效应6例(15%),改用依沙吖啶100 mg羊膜腔内注入,均在36 h之内流产。
2.2研究组与对照A组流产成功时间比较见表1。
表1
两组流产成功时间的比较
平均宫缩开始时间平均流产时间平均胎盘排出时间(min)平均总流产程
研究组25 h60 min±7 h14 min6 h50 min±3 h8 min 9.14±4.16 h59 min±3 h8 min
对照组28 h32 min±8 h7 min 12 h36 min±6 h4 min11.38±5.1612 h47 min±6 h4 min
P值>0.05
两组平均宫缩开始时间差异无显著性(P>0.05)。研究组平均胎儿流产时间明显短于对照A组,差异有高度显著性(P
2.3 各组流产效果的比较见表2。
表2
流产效果的比较(例,%)
组别 n CA ICA失败 流产时、流产后出血量(ml,x±s)
研究组10084(84.00)16(16.00)0(0)137.00±40.83
对照A组6036(60.00)22(36.67)2(3.33)156.89±76.16
对照B1组6048(80.00)10(16.67)2(3.33)151.72±63.70
对照B2组4032(80.00)2(5.00)6(15.00)154.71±46.63
研究组100例均获成功,胎盘、胎膜完整排出84例,完全流产率为84%,不全流产16例,其中胎盘粘连或小叶残留8例行钳刮术;胎膜不全8例,其中4例因胎膜残留1/3~1/2行钳刮术,4例残留1/4~1/3未作处理,24 h后自行排出。对照A组成功58例,胎盘胎膜完整排出36例,完全流产率为62% ;不全流产22例,其中胎盘残留或粘连6例、胎膜不全16例,均行清宫术。对照B1组60例放药1次成功40例、2次成功16例、3次成功2例,其中胎盘胎膜完整排出50例,完全流产率为80% ;不全流产10例,其中胎盘粘连不下5例,胎盘部分粘连或胎膜残留3例、胎盘早剥2例,均行清宫术。对照组B2组成功34例、失败6例;胎盘胎膜完整排出32例,完全流产率为80%,其中有2例胎盘胎膜残留,行清宫术。
2.4 宫颈长度与流产程、流产痛比较 对照A组产痛程度明显高于研究组与对照B组。4组孕妇的宫颈长度2.5~3.5 cm 90例,平均总流产程7 h;3.6~4.5 cm 108例,平均总流产程10 h;4.6~5.5 cm 52例,平均总流产程12 h。见表3、表4。
表3
疼痛比较(例,%)
组别III-IV级I-II级
研究组 10(10.00)90(90.00)
对照B1组 4(6.90)54(93.10)
对照B2组 2(5.88)32(94.12)
对照A组36(62.07)22(37.93)
由表3可见.研究组及对照B组产痛明显低于对照A组,研究组与对照A组,产痛差异有高度显著性(P0.05)。通过宫颈长度与流产程比较,发现宫颈长度与流产程时间关系极为密切,宫颈越长,流产程时间越长,差异有高度显著性(P
表4
宫颈长度与流产程的关系(x±s)
宫颈长度(cm)n 平均流产程
2.5 副反应及处理 对照B组副反应的发生率为32%,主要表现为恶心、呕吐、乏力、腹泻。皮疹伴瘙痒4例、肢体麻木2例、寒战6例,除寒战患者给予地塞米松5 mg肌肉注射外,余未作特殊处理,观察2 h后逐渐好转。用依沙吖啶经腹羊膜腔内注入及联合流产法者未发生不良反应。单用依沙吖啶者(对照A组)副反应的发生率为16%,关节肿痛2例、发热4例、强直性宫缩伴呕吐4例,给予盐酸哌替啶100 mg肌肉注射,症状缓解。
3 讨论
3.1 应用米非司酮配伍米索前列醇行中期妊娠流产的缺点 主要是副反应的发生率超过了其他流产法。口服米索前列醇流产成功率低,只占85%,经阴道放米索前列醇有21%的孕妇需放第2次或第3次,反复阴道操作可增加逆行感染的机会。
3.2 单用依沙吖啶流产的优、缺点 此法成功率较高,是临床上中期妊娠流产的主要方法.缺点是流产痛时间长,重度腹痛发生率高达60%。本组有4例出现强直性宫缩,需使用强镇痛剂缓解。胎盘、胎膜的残留率为36.67%。
3.3 米非司酮与依沙吖啶联合流产法的优点 本法流产痛时间短,重度流产痛的发生率仅为10%,明显低于单用依沙吖啶的60%,完全流产率为84%,高于单用依沙吖啶者的60%。清宫率为16%,低于单用依沙吖啶者的36.67%,流产的成功率为100%,高于对照各组。联合用米非司酮与米索前列醇的副作用发生率为32%,单用依沙吖啶的副反应发生率为16%,联用米非司酮与依沙吖啶则未发生明显的副反应。联合流产法能够发挥优势流产作用主要取决两种药物的协同作用,米非司酮在分子水平结合孕酮受体,阻断孕酮发挥作用,使子宫肌对催产素的敏感性增加。而宫颈情况是流产成功的主要决定因素。米非司酮使宫颈胶原纤维降解,宫颈变软,易于扩张,成为加速分娩的因素之一[1]。依沙吖啶主要作用于胎盘,蓄积在蜕膜细胞的药物通过酶作用使细胞分解、坏死,胎膜剥离致胎儿死亡,依沙吖啶还能使蜕膜细胞中前列腺素合成及释放增加,增强子宫肌的收缩,促使胎儿排出。两种药物的联合作用避免了单用依沙吖啶流产发动宫缩与宫颈成熟的不同步致宫缩过强,流产程长,清宫率高等缺点,还能克服联合用米非司酮与米索前列醇流产的各种副反应。我们在研究中还发现宫颈的长度与流产痛分级、流产程时间有关,用依沙吖啶流产时宫颈长度与流产痛、流产程的正相关关系更为突出。
3.4 由于中期妊娠宫颈不成熟,扩张条件差且宫缩并非自发,极易出现不协调性宫缩和强直宫缩,子宫下段扩张能力弱,向宫颈方向传导宫压能力亦下降,更易出现产程延长、宫缩痛剧烈、胎盘残留及软产道损伤, 所以在产程发动前对宫颈做一定的预处理显得尤为重要。米非司酮不仅可对抗孕酮, 刺激子宫平滑肌兴奋, 使产程发动早且能加强宫颈胶原纤维分解,松弛和软化宫颈[2]。
综上所述,我们认为米非司酮与依沙吖啶联合用于12~28周妊娠流产操作简便,效果确切,副作用小,值得临床推广。
参 考 文 献