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表白的话语范文1
20xx年愚人节表白的话【热门篇】1) 一滴水在海洋中渺小，在沙漠中伟大;丹顶鹤在鹤群中渺小，在鸡群中伟大;你在人群中渺小，在猪圈伟大!
2) 我有件事求你，你那能找个空房让我住两天吗?这件事请你不要告诉任何人，本来我不想麻烦你的，可我真的找不到信任的人了，我是萨达姆!愚人节快乐!
3) 对你的感情是一个简单的自然指数，你要微分几次都可以，不变的始终不变…假如你喜欢也可以积分，不过会多出一个常数来，而那个常数等于—我爱你。
4) 宁愿是一杯水，润你的嘴，暖你的胃，到你心扉，冲走所有烦恼疲惫;宁愿是清风吹，带着甜味，陪你入睡，给你安慰，你的快乐伤悲，我都想体会。愚人节快乐!
5) 对不起!我不小心把“喜欢你”发到了你的手机里，如果你接受请保留;如果不接受，请把它发还给我。愚人节快乐!
6) 曾有一分真挚的爱，我没珍惜，失去才后悔莫及，若能再来，我会说：我爱你。若要选表白时间，我希望是：愚人节快乐!
7) 该MM霸主一面，为祸四方;待我练就本事，事业有成，得以报效父母;定然舍命生擒之，押至民政局伏法!愚人节快乐!
8) 走着走着，就散了，回忆都淡了;看着看着，就累了，星光也暗了;听着听着，就醒了，开始埋怨了;回头发现你，不见了，突然我乱了。小住哪里逃，愚人节快乐!
9) 如果我是法官，我将判决你，终身监禁。监禁在———我的心里。愚人节快乐!
10) 啊!你的皮肤如此富有光泽，你散发的香味如此难以抗拒，让我狠狠咬你一口吧，我亲爱的——红烧肉!愚人节快乐!
11) 拔苗助长是荒诞，掩耳盗铃是蛮干。草船借箭是妙算，破釜沉舟是决战。风花雪月是浪漫，舍生取义是奉献。你若继续往下看，你就是个笨蛋!愚人节快乐!
12) 白天思你，晚上想你，吃饭念你，睡觉梦你，日不成行，夜难入寐，倍受煎熬，千言万语化成一句：我什么时候才能得到你……万大奖啊!愚人节快乐!
13) 如果我不向你求婚，我会后悔一辈子，因为你是我的惟一。
14) 如果我的爱你不信，那就让它成为弥天大谎，骗你一辈子;如果我的爱你不逃，那就让它成为深牢大狱，困你一生一世;因为，我想我们一辈子在一起!
15) 我不爱你，是骗你的，是违心的，我真的不想说假话，但是我就是不爱你，就是要骗你，不能让你猜透我的心。
20xx年愚人节表白的话【精选篇】1) 我是黑板，你是白粉笔，我们的结合让文字见证我们爱得鲜明;我是浮雕石，你是凿石刀，让艺术见证我们爱得深刻!
2) 爱你不是两三天了，想你不是一两个星期了，念你不是一两个月了，你要再不同意嫁给我，那我就搬去跟你一块住了，你看着办吧。
3) 房子可以小一些，家具可以旧一些，电器可以少一些，但只要有你，爱和亲密就会多一些，幸福和欢乐就会满一些，有你的家就是五星级宾馆。
4) 任何时候，任何情况，只要你需要我，我立即赶来，尽我全力为你做事。
5) 如果爱情是一朵花，就让它开在我心里，败在我心里，深埋在我心里。
6) 我要变成一个小精灵，潜入你的灵魂深处，去倾听你的心跳，你的呼吸，感受你的思想，你的愿望，这样我就可以和你心有灵犀了，知道如何好好爱你了。
7) 我们之间似有似无的距离，让我害怕;我们之间若隐若现的朦胧;让我无措，我怕终有一天，我会累了，会学会放弃.
8) 我答应不会让任何人伤害你，包括我自己在内，相信我!我会给你幸福。
9) 我从来不会对任何一个女人许下诺言，也从不会对任何一个女人做我会为你所做的事，你在我心目中是多么地不同!
10) 愚人节变成了表白的日子，情人节变成了分手的日子
11) 愚人节···又到了啊···他的歌,他的戏,他的人···“我就是我,是颜色不一样的烟火,天空海阔,要做最坚强的泡沫”·······
12) 愚人节，最想开的玩笑，我们和好好吗?
13) 愚人节，只是给说谎的人一个说真话的机会。
14) 愚人节，整死一个是一个，反正清明节也就要到了
15) 愚人节，我可以大胆的和你表白，因为我可以笑着离去。
20xx年愚人节表白的话【经典篇】1) 愚人节，不是给愚人过的节，而是给说谎人一个说真话的机会。
2) 英语考试听力时，我沉浸在开头优美的歌声中，缓过神来。才知道听力已经结束了!。
3) 一觉醒来我以为我长高了,原来是被子盖横了
4) 一称体重我就很不开心，不开心的时候我就想吃东西。
5) 星期一愚人节，老师竟然让我们去上课!越想不对劲儿，不行!咱不能上当!
6) 星期一愚人节,公司竟然让我们去上班,还是八点半上班!越想不对劲儿,不行!咱不能上当!
7) 小时候傍晚在邻居家看鬼片，当回家的时候。结果摔倒了。在邻居家已经做好冲锋的准备，到门口就发腿跑。
8) 现在是愚人节丶整死一个是一个丶反正清明节也要到了
9) 现在的孩子，分手专挑情人节，告白专挑愚人
10) 我最爱的人，愚人节那天一定要来骗我
11) 我一直奇怪,为什么会有一个愚人节,难道鼓励大家骗人吗?后来才知道,原来愚人自娱,有讽刺骗人者的意思。越来越发现,越是珍贵的东西,其实越容易被我们 不小心的忽略,譬如新鲜的空气,干净
12) 的水源,譬如诚信,譬如健康的身体。而这些东西之所以珍贵,是因为很容易一去不复还,用钱买不到。四月,祝好
13) 我是不该再去找谁的 愚人节又怎么样,宣泄了我的无聊寂寞想念后又怎样,我不敢找
14) 我期待的不是情人节，而是愚人节，因为在愚人节里面别人才会对我说真话
15) 我对你，是不是只有愚人节才可以说“我爱你”
16) “在一起吧““啊!愚人节是下星期二”“嘻嘻，跟你开玩笑，傻瓜”
17) “愚人节打算怎么过?”“我打算去表白”“为什么?”“因为被拒绝了我还能笑着回答说愚人节快乐呀!”
18) “我爱你”“我也爱你”“愚人节快乐”“愚人节同乐”看着就觉得心疼。
表白的话语范文2
关键词：凋亡蛋白质；原核表达；可溶性；纯化；稳定性
中图分类号：Q786文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)03-0007-05
Expression, Purification and Activity Detection in vitro of Apoptin
FU Wen-bing1, SHI Xuan1, ZHAO Jian1*, FAN Li-qiang1, LI Su-xia, WANG Fu-jun2, SONG Yu-wen1, YUAN Qing-sheng1
(1. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China; 2. Zhejiang Rishengchang Pharmaceutical Co., Ltd, Zhejiang 322100, China)
Abstract ：Objective To construct an soluble expression system in E. coli for apoptin which was encoded by VP3 gene of chicken anemia virus (CAV), and study the purification and stabilization of apoptin. Methods The VP3 gene was amplified by PCR , then the segment was inserted into pET-28a (+) and the expression vector pET-28a-VP3 was constructed in E. coli BL21(DE3). The recombinant soluble protein was expressed in E. coli BL21(DE3)and purified by Ni-NTA column chromatography. The stability of apoptin was analyzed under different conditions. Results The target protein was expressed in E. coli BL21(DE3). The purity of apoptin was beyond 90 %after purification. The target protein was better stabilized by carrageenan in E.coli BL21(DE3). Conclusion Apoptin with high purity and stability can be successfully obtained, which do a base of the further study on clinic application of apoptin.
Key words：apoptin; prokaryotic expression; solubility; purification; stability
凋亡蛋白质是鸡贫血病毒（CAV）的VP3基因编码的小分子蛋白质，由121个氨基酸组成，含有2个脯氨酸富含区和2个碱性区，近N端（33～44a）含有一个11个氨基酸组成的核运输序列（NES），靠近C端（84～90，112～118）含有2个核定位序列（NLS）。
Noteborn等[1]研究揭示，凋亡蛋白质能够诱导人的肝癌、淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌等多种癌细胞的凋亡，以及转化细胞的凋亡，但对未转化的人双倍体细胞无损伤[2]。凋亡蛋白质的核定位可能是其诱发细胞凋亡的前提之一[3]。凋亡蛋白质选择性诱导肿瘤细胞的凋亡不同于通常的凋亡机制，它不是通过半胱天冬酶级联反应进行的，不需要p53参与，也不被bcl-2的过表达抑制，反而能被bcl-2所促进[4]。由于大部分肿瘤细胞具有p53突变或缺失，这种非p53依赖性使凋亡蛋白质作为抗肿瘤药物有很好的前景。
在许多关于凋亡蛋白质表达和纯化的研究中，凋亡蛋白质多以包涵体形式表达。本实验以pET-28a为载体进行凋亡蛋白质的原核表达，尝试不同的诱导条件及纯化方法，找到了可溶性目的蛋白质表达的条件，用金属螯合层析法直接纯化得到较高得率的活性目的蛋白质，并研究其稳定性。本研究对凋亡蛋白质作为肿瘤治疗药物应用于临床具有积极意义。
1材料和方法
1.1质粒、菌株和试剂
含有凋亡蛋白质全长基因的质粒pET-11a-VP3（浙江日升昌药业有限公司提供）；质粒pET-28a和菌株BL21(DE3)等（本实验室保存）；低相对分子质量蛋白质和DNA Mark（Sigma公司）；IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）（BBI分装）；SDS（十二烷基磺酸钠）（Amresco分装）；限制性内切酶、T4-连接酶、Taq酶（MBI公司）；其它化学试剂均为国产分析纯。
1.2原核表达重组质粒的构建
VP3基因来源于pET-11a-VP3质粒。PCR引物分别为P1：5’-AATTTCAAC ATATGAACG CTCTCCAAG-3’；P2：5’- CGTCGGATCCTATT ACAGTCTTATACGC-3’。分别引入NdeI和BamHI位点。PCR产物经NdeI和BamHI双酶切后，回收的VP3基因片段与经同样双酶切的质粒pET-28a连接和转化。抽提质粒，用BamHI和NdeI对重组质粒进行双酶切鉴定得到阳性重组质粒。
1.3凋亡蛋白质的原核表达及纯化
1.3.1凋亡蛋白质的表达与鉴定将含有重组质粒pET-28a-VP3的BL21(DE3)菌株接种于LB培养基中，37 ℃培养过夜，次日按1∶100的比例稀释后放大培养，至一定菌体浓度时，加入适量IPTG诱导培养，离心收集菌体。
SDS-PAGE分析 12 % SDS-PAGE电泳，电压100 V，待样品即将进入分离胶时，调节至120 V。电泳后凝胶用考马斯亮蓝溶液（45 %甲醇，10 %乙酸，0.25 %考马斯亮蓝R 250）染色。
1.3.2可溶性目的蛋白质的纯化将新鲜菌体按1∶5（W∶V）的比例用Tris-HCl缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，10 %甘油，pH 8.5）重悬，保持在冰浴中，超声破碎至菌液澄清。4 ℃，10 000×g离心20 min，取上清，Ni-NTA Agarose 金属亲和树脂（Qiagen公司）分离纯化。将上清液加入经Tris-HCl缓冲液平衡的Ni-NTA 介质中，4 ℃结合60 min。将混合物小心加入下端封闭的层析柱后，除去下端封盖，收集流出液（穿出峰）。以15 mL含20 mmol/L咪唑的磷酸缓冲液漂洗后，再分别以15 mL含40，60，100，200 mmol/L咪唑的磷酸缓冲液洗脱目的蛋白质。分别收集洗脱组分，进行SDS-PAGE鉴定，Bradford法测定蛋白质浓度，凝胶扫描软件分析纯度。
1.4凋亡蛋白质溶液稳定性研究
将重组表达的凋亡蛋白质于4 ℃放置3 d后，取样进行SDS-PAGE电泳鉴定，对照3 d前样品观察凋亡蛋白质在溶液状态中的稳定性。通过改变离子强度（增加NaCl浓度）和添加不同稳定剂来增加凋亡蛋白质的稳定性。
2结果
2.1重组表达质粒的构建
以pET-11a-VP3为模板扩增PCR，得到预期大小的目的片断。切胶回收后双酶切（BamHI＋NdeI），酶切产物与同样双酶切的pET28a连接。连接产物转化E.coli DH5α，用BamHI和NdeI双酶切鉴定重组质粒（见图1），得到了含有400 bp目的片段的阳性克隆，与预期结果相同。经上海生工生物公司测序验证构建好的pET-28a-VP3，序列正确，并使凋亡蛋白质的N端带有His-Tag，为目标蛋白质的纯化提供了条件。
2.2重组蛋白质的表达
为了提高重组蛋白质的表达量，本实验研究了IPTG的浓度。当菌体密度到达约A600 0.6时，加入IPTG至终浓度分别为0.2，0.5，1 mmol/L，30 ℃诱导表达5 h，见图3。
由图3可见，经1 mmol/L IPTG诱导后表达量较高，目标蛋白质相对分子质量约16×103，与预期大小一致。
2.3可溶性凋亡蛋白质的纯化
诱导表达后菌体破碎离心，上清液用目的蛋白质N端的6×His咪唑基团与镍离子特异性结合，金属螯合层析法分离纯化，得到较纯的目的条带。经SDS-PAGE电泳扫描分析，纯度高于90 % ，见图4。蛋白质浓度测定表明每克湿菌体可以到0.49 mg凋亡蛋白质。
2.4凋亡蛋白质的稳定性研究
实验中发现凋亡蛋白质在溶液中不稳定，极易沉淀。实验中分别取IPTG诱导后样品立即进行SDS-PAGE分析，第3天再进行1次SDS-PAGE分析，见图5-A、5-B。
1. 低相对分子质量标准蛋白； 2，3. 放置2 d后目标蛋白质
图5-A. 诱导的菌体取样后立即SDS-PAGE，1和2 皆为目标蛋白质；图5-B. 诱导的菌体2 d后SDS-PAGE
图5 凋亡蛋白质SDS-PAGE稳定性分析
图5-A. 诱导的菌体取样后立即SDS-PAGE，1和2 皆为目标蛋白质；图5-B. 诱导的菌体2 d后SDS-PAGE
诱导的菌体取样后立即SDS-PAGE分析，可以看到目的蛋白质的表达条带清晰；2 d后SDS-PAGE分析，几乎观察不到目的蛋白质条带，推测凋亡蛋白质随着储存时间延长发生了聚合。这说明可溶性表达的凋亡蛋白质在溶液状态中易形成沉淀，一般2～3 d就发生大量聚集。因此有必要进行可溶性蛋白质的稳定性研究。
将表达得到的目的蛋白质分别保存于高、中、低3种不同盐浓度的缓冲液中，观察其稳定性。低盐溶液：20 mmol/L Tris.HCl缓冲液；中盐溶液：80 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris.HCl；高盐溶液：300 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris.HCl。pH值均为8.0。
实验表明，凋亡蛋白质在低盐溶液中不稳定，在超滤过程中即有大量沉淀析出。分别取高盐溶液和中盐溶液中4 ℃保存48 h前、后的样品，分析上清蛋白质浓度。2次重复实验结果表明，高盐蛋白质浓度平均降低16 %，中盐溶液中平均降低34 %。推测高盐环境更有利于凋亡蛋白质的稳定。
进一步研究，于缓冲液中加入各种稳定剂（最终浓度0.1 %）：阿拉伯树胶、卡拉胶、瓜豆尔胶、CMC（羧甲基纤维素钠）、明胶、高酯果胶、魔芋胶、黄原胶等，观察是否有利于重组凋亡蛋白质的稳定性。以上样品4 ℃保存7 d后离心得到的上清经SDS-PAGE分析，结果见图6。
1. 对照；2. 阿拉伯树胶；3. 卡拉胶；4. 瓜豆尔胶5.CMC；M. 低相对分子质量标准蛋白质；6. 明胶；7. 高酯果胶；8. 魔芋胶；9. 黄原胶
图6 添加剂对凋亡蛋白质稳定性的作用分析
图5-A. 诱导的菌体取样后立即SDS-PAGE，1和2 皆为目标蛋白质；图5-B. 诱导的菌体2 d后SDS-PAGE
实验结果表明，在高盐缓冲液中加入卡拉胶，目标蛋白质几乎没有沉淀，卡拉胶可以有效增强可溶性蛋白质的稳定性。
3讨论
本实验构建了表达质粒pET-28a-VP3，并在E. coli BL21(DE3) 中获得表达，用Ni-NTA柱纯化目标蛋白质。由于稀有密码子占VP3基因氨基酸序列组成的25 %左右，为了提高表达量，本实验选用严紧型表达宿主菌BL21(DE3)pLysS及促进富含稀有密码子的基因表达的Rosetta菌株表达目的蛋白质。实验结果（数据未列出）表明，Rosetta菌株中目的蛋白质的表达量并未增加，说明稀有密码子不是限制其表达量提高的因素。BL21(DE3)pLysS目的蛋白质的表达量也没有明显变化，表明目标产物对细胞无毒性或毒性很小。由于凋亡蛋白质稳定性差，其稳定性对于其临床应用至关重要。本实验通过改变溶液的离子强度及添加稳定剂来增加目标蛋白质的稳定性[5]，高盐缓冲液中加入卡拉胶可以有效增强凋亡蛋白质的稳定性[6]。本实验为在原核生物中进行目标蛋白质的表达和分离纯化，以及稳定性研究提供了简易可行的途径，为凋亡蛋白质的进一步药理研究奠定了基础。
参考文献
[1]Noteborn H M, Danen-van Oorschot A A, Vandereb A J. The apoptin gene of chicken anemia virus in the induction of apoptosis in human tumorigenic cells and in gene therapy of cancer[J]. In:Boulikas T. ed. Gene Ther Mol Biol. 1998: 399-406
[2]Danen-van Oorschot A A, Fisher D F, Grimbergen J M, et al. Apoptin induces apoptosis in human transformed and m alignant cells but not in normal cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94 (11): 5834.
[3]Zhang Y H, Abrahams P J, Vandereb A J, et al. The viral protein apoptin induces apoptosis in UV-C- irradiated cells from individuals with various hereditary cancer- prone syndromes[J]. Cancer Res, 1999, 59 (12): 3010-3015.
[4]Noteborn M H, Zhang Y H, Vandereb A J. Apoptin specifically causes apoptosis in tumor cell and after UV-treatment in untransformed cells from cancer-pron individuals: areview[J]. Mutat Res, 1998, 400(1-2): 447.
表白的话语范文3
人物的神情与动态
以乐舞为题材的画像石被当做是平面造型艺术，在处理人物的神情和动态上其实已经做得非常完备了。乐舞百戏里的人物造型，大部分以正面和侧面描绘为主。作品构图精简、线条流畅、生动形象。
山东盛产青石，其质地较细密。在面部的处理上，己注意到五官的表情，画像石常以上下分层或左右分格的手法去刻画宴饮图。而南阳画像石更多的是用石灰石，因为其质地坚硬，但又易脆，不太适合精雕细刻。工匠们想出一法子，通过采用粗犷的雕刻手法，来凸显南阳画像石的大气、粗犷之美。南阳以前地属楚地，那里的巫风浓郁，同时充满浪漫主义情调。南阳画像石对人物形象刻画很新颖，尤其是面部表情夸张，鲜明。对形象轮廓则是追求大形而不是拘于小节。内部线条简洁、质朴。在相对空白的画面上，更加突出了主体人物，画中人物排列疏密有致，没有太多装饰，通过简练的云纹来联系彼此，形成一种疏密与动静的结合。由于该区域画像石较早达到成熟状态，对周边地区的影响也是很明显的。
四川地区一般多以崖墓及石棺画像石为主。由于这里的石材质地粗糙且松软，又是砂岩，所以不太适合对物象进行精细刻画，只能用大块面、凹凸起伏、又富有视觉冲击力的雕刻技艺来完成。在人物造型与动态的表现方面，生动活泼，简洁明快。在画面造型方面，不仅要求动感，更多的是夸张的处理。风格依然是汉代文艺所固有的雄伟古朴的感觉。
陕北地区采用的是页岩，其结构较厚，不利于精雕细化，所以陕北画像石对人物面部的处理，主要以浅浮雕为主，不追求细枝末节，人物处理的也非常简洁，人物形象的外轮廓也表现得当，更多采用类似剪纸中“连”的手法，将不同物象巧妙相连，营造出浓郁的剪影风格。陕北的乐舞百戏图像更多了一种娴静优雅，使其极富艺术美感。
画面的内容与布局
汉画像石的创作空间十分广阔，不仅仅表现在内容选取上，同时也表现在构图形式上。从山东、苏北、皖北、豫东区乐舞百戏画像石画面布局来看，构图大多呈“密集型”布局，画面很少留白，一般填充的很饱满，通常将一块石面分为好几格，按照从上至下，从左至右排列，有时还将一格分为数小格。如果画面未分隔，雕刻者则会将最重要的内容放在画面最中心的位置，其余的地方会刻上一些花纹加以装饰，总之其目的就是最终将画面填满，整个画面呈质朴敦厚、充实密集的风格特点。让人有种密而有秩、乱而有序的感觉，因为整幅画面想要呈现的重点往往会被放在构图的中心点上。
南阳汉画像石在构图上基本呈现“疏朗型”的布局。即画面不分层也不分格，不会将不同题材的画面集聚在一起，只在一块石头上呈现一种题材画面。这样就使画面所要呈现的物象有着较为宽松的画面空间，也使雕刻工匠们在规划好画面构图的基础上，能够充分发挥其工艺技巧，对画面中物象的细节部分进行更加细致的刻画。
陕北地区则运用了多种手法去描绘画像石，凸显出很强的图案化和装饰性。在画面构图与分割上也是颇具想法，使局部和整体之间更加协调统一。在表现手法和技巧运用方面，使得轮廓特征更加平面化且具备夸张变形的艺术特色。
四川区域的汉代乐舞百戏画像石有着以下儿个艺术风格特点，画面的内容与陕北亦有明显不同，舞者有的着长裙，有的穿短裤，均腰束带，手牵手翩翩起舞，具有浓郁的西域文化风貌。就以单个作品的构图来看，依旧采用较简洁的构成方式，从而简化了内容繁杂、场面宏大的题材，既有留白，有很写意。
题材的程式与变化
在山东、苏北、皖北、豫东区的乐舞百戏画像石中，乐器大部分情况都是以乐舞伴奏的形式呈现出来的，在舞蹈和百戏同时表演的大型场面中，乐器的伴奏起到了非常关键的作用，既可以对节奏进行控制、又能活跃气氛，使得表演者能更好的表情达意。
南阳对楚文化的保留格外重视，在这个重要地区，楚文化通过天人合一、追求浪漫、夸张等风格特点深刻影响着南阳汉画像石的题材与画面。它的构图十分简洁，一个画面对应一个主题，清晰明朗；对跳舞的人描绘的形象生动，极具艺术表现力。
陕北、晋西北地区乐舞百戏画像石在题材内容方面，由于砖石砌筑的墓室结构的局限，其题材内容突出地表现了当地的历史环境和农牧兼营的经济特点。
四川区域的汉代乐舞白戏画像石一般以现实生活为样本，在对内容处理上充满着现实生活的情调。整体组织较为复杂，既有单幅单个主题的，多幅一个主题的，又有多幅多个主题的，还有分格多个主题的。以骑吹为主题材的画像石较丰富，骑吹也称鼓吹，它主要是受西域游牧民族的影响，在马上进行的一种演奏形式。许多从西域传入的民族乐器也出现在该地区的画像石中，例如琵琶和胡笛等。四川地区在吸取中原和西域文化的基础上，形成了特有的巴蜀文化，这些在后来都被作为乐舞和百戏的载体记录下来。
表白的话语范文4
作者：梁英民 蒋姗姗 孙强 吴绒丽 陈萍 李荣 周鹏 王键 韩骅
【关键词】 基因表达
关键词: bcr/abl;基因表达;融合蛋白;抗血清
摘 要:目的 克隆并表达bcr/abl融合基因片段，并制备其抗血清. 方法 PCR扩增包含蛋白融合点的bcr/abl癌基因片段，序列测定后克隆入带有His标签的原核表达载体pET-16b，转化宿主菌BL21，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表达结果，Ni-NTA树脂亲和纯化，皮下多点注射免疫小鼠，ELISA确认抗血清的滴度. 结果 PCR扩增得到大小约523bp的目的片段，序列测定表明与发表序列完全一致;得到了一种新的癌基因bcr/abl片段的原核表达载体pET-16b-bcr/abl，在BL21中表达可见于Mr21×103 处有一蛋白新生带，表达的BCR/ABL蛋白免疫小鼠后，ELESA确认抗血清的滴度>1∶2000. 结论 成功的克隆、表达了bcr/abl融合基因片段，并制备了相应的抗血清.
Keywords:bcr/abl;gene expression;fusion protein;immune serum
Abstract:AIM To clone and to express bcr/abl fusion gene fragment and to produce immune serum against the expressed fusion protein.METHODS PCR-amplified bcr/abl gene fragment was inserted into plasmid pET-16b with His tag to form a new plasmid pET-16-bcr/abl（pEb）.The BCR/ABL fusion protein was expressed in E.coli BL21trans-formed with pEb and induced with IPTG.The expressed pro-tein was purified by affinity resin-Ni-NTA and analyzed by SDS-PAGE.In order to produce anti-serum，Mice were im-munized by subcutaneously multi-site injection with BCR/ABL protein.The anti-serum was assayed by ELISA.RESULTS Molecular weight of the PCR-aimplified bcr/abl gene fragment which was consistent with the published se-quence was about523bp.Plasmid pEb was constructed.The molecular size of BCR/ABL protein expression was about Mr21×103 .The titer of the BCR/ABL protein anti-serum was more than1∶2000.CONCLUSION Fragment of bcr/abl fu-sion gene is successfully cloned and expressed.The antiserum of BCR/ABL protein fragment has been produced.
0 引言
慢性粒细胞白血病（Chronic myelogenous leukemia，CML）是起源于骨髓造血干细胞的恶性肿瘤.绝大多数CML患者的肿瘤细胞带有染色体异常，即9∶22号染色体易位，形成特征性的费城染色体（Pheladophia，ph染色体）［1，2］ .在分子水平，这一染色体易位造成bcr基因和abl基因的融合，表达的BCR/ABL融合蛋白具有持续性的激酶活性，引起细胞的转化［2］ .Bcr/abl融合蛋白被认为是CML特异性肿瘤抗原，可作为CML诊断和治疗的指标［3-6］ .我们用PCR扩增了BCR/ABL融合蛋白的基因片段，并在大肠杆菌中进行了表达.表达产物经纯化复性后，用于免疫小鼠，得到可识别该抗原的小鼠抗血清.
1 材料和方法
1.1 细菌和质粒 大肠杆菌XL-10gold由本室保存.质粒pET-16b及大肠杆菌BL21均来自Nav-agene公司.带有人bcr/abl（b3a2）融合基因的质粒pGD210由本校附属唐都医院血液科刘立博士提供.
1.2 引物设计与bcr/abl融合基因表达质粒的构建 DNA重组所用试剂来自Promega、宝生物工程公司及华美生物工程公司.以质粒pGD210为模板，用PCR扩增了bcr/abl基因跨越融合点的523bp基因片段（93aa-265aa）.PCR引物的序列为:上游引物:5’-CTCGAGACGTTCCTGATCTCCTCT;下游引物:5’-GGATCCTTAGTAGTTGCTTGGGACC-CA.PCR产物经电泳回收纯化后插入pGEM-T载体（Promega），进行DNA序列分析.从正确克隆的载体中，用Xho I和BamH I双酶切下含有bcr/abl融合基因插入片段，插入质粒pET-16b，得到表达BCR/ABL融合蛋白的质粒pET-bcr/abl（Fig1），以下简称pEb.
1.3 重组蛋白的诱导表达和纯化 用表达质粒pEb转化大肠杆菌BL21，加入IPTG至终浓度1mmol・L-1 ，诱导不同时间后，收集菌体.悬浮于PBS，超声裂菌，离心弃去上清.向沉淀中加入2mol・L-1 尿素，离心除去杂蛋白.再用8mol・L-1 尿素溶解沉淀的蛋白，在Ni-NTA-agarose柱（Vector公司）上进行亲和层析.用250mmol・L
-1 咪唑洗脱.收集洗脱的蛋白，透析后冻干保存.
图1 略
1.4 抗血清的制备 BALB/c小鼠由第四军医大学实验动物中心提供，用50μg基因重组的BCR/ABL融合蛋白与等量的福氏佐剂混后皮下多点注射，每周一次，第四周腹腔注射加强一次，加强免疫后14天取血，分离血清备用.
1.5 酶联免疫试验（ELISA） 向96孔板中加入纯化的BCR/ABL融合蛋白（5μg/μL）100μL，4℃包被过夜.加入稀释的经免疫小鼠的血清与未经免疫小鼠的血清，血清稀释度均为1∶500，1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000，1∶16000，设一阴性对照孔， 37℃水浴1h，加入酶标抗体，37℃1h，TMB显色15～30min，酶联免疫检测仪测定，测定波长为492nm.
1.6 DNA序列分析 按说明书用PE公司的荧光DNA序列测定试剂盒（Big-dye）进行序列测定反应，用310型DNA序列测定仪进行电泳及结果分析.
2 结果
2.1 bcr/abl基因的亚克隆 为表达BCR/ABL融合蛋白融合点两侧约200个氨基酸的片段.以全长bcr/abl基因为模板，用PCR扩增了这一片段的cD-NA.Fig2显示523bp的目的片段被扩增出来.将这一片段插入T载体后，进行DNA序列分析，但在5’和3’端分别插入了设计的Xho I和BamH I酶切位点.
图2 略
2.2 BCR/ABL融合蛋白的诱导表达 用bcr/abl表达质粒pEb转化大肠杆菌BL21，培养后用IPTG进行诱导.SDS-PAGE分析结果表明，与用pET-16b转化的BL21及未转化质粒的BL21裂解产物相比，在21kd处有一新生蛋白带，与预期的融合蛋白分子大小相同.灰度扫描显示IPTG诱导3h后融合蛋白的表达约占细菌总蛋白的20%.
2.3 BCR/ABL融合蛋白的纯化 用Ni-NTA-a-garose亲和层析柱进行BCR/ABL融合蛋白的纯化.收集蛋白峰，PBS透析后，进行SDS-PAGE分析（Fig3）.表达的融合蛋白被纯化为单一条带.
2.4 BCR/ABL融合蛋白在小鼠中的抗体应答 收集免疫小鼠的抗血清，ELISA检测结果见图4，与正常对照比较，接受融合蛋白免疫的小鼠产生了较高滴度的血清，说明基因重组的BCR/ABL融合蛋白对小鼠具有免疫原性.
图3 － 图4 略
3 讨论
bcr/abl融合基因是CML的分子标记，bcr/abl融合基因编码一个分子量为Mr21×104 的融合蛋白.由于融合蛋白连接区的氨基酸序列是其他任何正常蛋白质不具有的，被认为是CML细胞所特有的.BCR/ABL融合蛋白是一种胞浆内蛋白，研究bcr/abl融合蛋白在细胞表面的表达的类型和该融合蛋白的免疫学特点对开展CML的免疫治疗有重要意义［3-6］ .然而，由于融合蛋白很难从患者体内获得，而且在细胞内加工和提呈的效率也难以检测，为此，本文用体外基因重组的方法获得了bcr/abl融合蛋白的原核表达产物，经纯化复性后，用于免疫小鼠，得到了可识别该抗原的小鼠抗血清，为随后的单克隆抗体制备及免疫治疗的研究奠定了基础.
参考文献
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表白的话语范文5
【关键词】 玻璃体视网膜病
关键词: 玻璃体视网膜病，增生性;肌动蛋白类;免疫组织化学
摘 要:目的 观察PVR增生膜中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达. 方法 用免疫组化染色法和免疫荧光法对14例视网膜脱离伴PVR行玻切术时切除的增生膜（PRM）进行检查、分析. 结果 免疫组化染色法显示α-SMA在14例PRM中均有表达，位于胞质中，其分布与PRM的收缩方向一致.在200倍视野下，PRM C级膜中α-SMA阳性细胞比例为35/80，D级膜中α-SMA阳性细胞比例为50/60;免疫荧光法结果与染色法相符.荧光定量分析:PRM C级膜中α-SMA阳性荧光总量12.31.D级膜中α-SMA阳性荧光总量23.09，约为C级膜的1.88倍（P
Keywords:vitreoretinopathy proliferative;actins;immuno-histochemistry
Abstract:AIM To investigate the expression of alpha-smooth muscle actin（α-SMA）within the periretinal mem-brane（PRM）of PVR.METHODS Fourteen specimens of PRM were obtained during vitrectomies of patients suffered from PVR of different grades.α-SMA expression in PRM were detected by immunohistochemical staining，and quanti-tative analysis performed by image process of immunofluorescence.RESULTS α-SMA expression was detected in all14PRMs.The distributions ofα-SMA were present in the cytoplasma，and accordance with the direction of stress fibers..α-SMA expression was stronger in PVR/D than in PVR/C.CONCLUSION Expression ofα-SMA was a com-mon feature of PRM，and the expression correlated with severity of PVR and the process of membrane traction.
0 引言
增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreo-retinopathy，PVR）属于眼内组织创伤愈合的一种特殊表现，可以分为炎症期、细胞增生期和瘢痕期三个阶段，其中在细胞增生期可以形成视网膜表面的增生膜组织（PRM），这些膜组织在瘢痕期可以明显收缩，形成对视网膜的牵拉而导致视网膜脱离［1，2］ .视网膜色素上皮细胞（RPE）是参与增生膜形成的主要细胞之一，在PVR病变过程中可以有明显的形态改变，部分RPE可以转化为肌纤维母细胞样细胞而具有收缩功能［3］ .α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）是一种有收缩功能的细胞骨架微丝结构
［4］ .McGillem［5］ 等曾报道:在PVR病变的增生膜中有多种细胞表达α-SMA，但针对α-SMA在增生膜中的整体表达及其与PVR病变程度的相关性研究，尚未见报道.本实验采用免疫组化技术，观察PVR的视网膜前膜中α-SMA的表达情况.
1 材料和方法
1.1 材料
标本来源于1998-07/1999-11在本院眼科住院的孔源性视网膜脱离伴PVR患者14名，年龄4～63岁，病程2mo～2a.PVR分级标准参照1983年美国视网膜学会分级方法，分级为C3-D3.以上患眼行玻璃体切割术时取视网膜表面增生膜，其中下膜5例，前膜9例.以上组织用40g・L-1 多聚甲醛固定30min，4℃.经脱水、透明和浸蜡，制成腊块，然后制成5μm厚的切片，贴附于载玻片上.小鼠抗人的α-SMA单克隆抗体（1∶200;中国博士德公司），DAB免疫组化试剂盒（DAKO公司，丹麦），Avidin标记的Texas Red（Molecular Probes，美国）. 1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学染色及免疫荧光
切片浸入7.5mL・L-1 H2 O2 -PBS，37℃，30min，以阻断内源性过氧化物酶.正常羊血清封闭消除非特异性染色.滴加小鼠特异性抗体，在湿盒内37℃保温30min.PBS振洗3次，滴加生物素化羊抗小鼠IgG，在湿盒内37℃保温30min，免疫组织化学染色法滴加ABC复合剂，37℃保温30min.加入显色剂显色，镜下观察，水洗中止反应，苏木精复染核，脱水透明封片.免疫荧光法加入抗生物素化标记的Texas Red，37℃保温30min.缓冲甘油封片.采用人大隐静脉血管组织作为阳性对照;采用人类角膜移植后供体眼的眼后段组织，包括视网膜色素上皮细胞（RPE）、视网膜组织、脉络膜和巩膜，以及不加一抗的标本作为阴性对照，与手术取材标本平行染色.
1.2.2 结果判定和分析
免疫组织化学DAB染色法的结果:在OLMPUS显微镜（BX50）下观察，以背景清晰、棕黄色部位定位明确的细胞作为阳性细胞，在200倍视野下，计数阳性细胞比例.
Texas Red荧光标本在BIO-RED共聚焦显微镜（MR-1024）下观察，作定量分析:任意选一视野，在相同面积下计数荧光总量.
2 结果
阳性对照组显示均对所用的单克隆抗体呈阳性反应:DAB染色阳性细胞胞质中呈现棕色或深棕色的颗粒，细胞核经复染成蓝色;Texas Red在595nm激光激发下，阳性部位发出深红色颗粒样荧光.阴性对照组中未见阳性染色及荧光.
DAB染色结果显示，在14例PRM中α-SMA均有阳性表达，但其表达的程度有所差别.在6例PVR/C3级的PRM中，可见细胞成份较多，细胞间质较少，α-SMA表达阳性细胞的比例为35/80，呈散在分布，随分布区域的不同细胞染色以及形状表现有差异:在膜的表面可见少量染色较深，胞体呈梭形，胞核呈圆形或卵圆形的阳性细胞;在细胞较多的区域，阳性细胞数目较多，染色较浅淡，胞体为长圆形，胞核呈圆形，在部分阳性细胞中可见色素存在（Fig1（略））;在膜的中央组织中可见少量阳性细胞，胞体呈狭长的梭形，与标本的长径走行方向平行;在8例D级PRM中，α-SMA阳性细胞比例约为50/60，多分布在膜的表面，染色深，细胞呈梭形，胞核为长圆形（Fig2（略）），常可见此类细胞在膜组织的起伏处呈“搭桥样”存在，在组织的中央区域阳性细胞较少.
免疫荧光与DAB染色结果相一致.在C级膜中，阳性部位多位于膜的周边，量较少（Fig3（略））;在D级膜中，阳性部位多位于膜的表面，量较多（Fig4（略））.
3 讨论
在本实验中，我们观察到在14例不同时期PVR病变组织中α-SMA均有表达，α-SMA阳性细胞在C级和D级的PRM中有不同的表达程度，在C级膜中呈散在分布，大部分阳性细胞染色较浅淡;在D级PRM中主要分布在膜的表面，阳性细胞的走行多与膜标本横断面的长径一致或呈“搭桥样”存在，阳性染色为明显的深棕色.这一结果提示在PVR病变中存在α-SMA的表达以及阳性细胞数量存在着动态变化的过程，这个过程对PRM的重新塑形以及收缩能力的改变可能有重要作用.
α-SMA是一组表达在多种类型细胞胞质中的具有收缩功能的微管微丝结构，是细胞移行和具有收缩 功能的基础.同时可以作为一种特异性免疫组化染色标志来标识肌纤维母细胞［6］ .肌纤维母细胞多存在于一些需要收缩功能的组织中，如肺泡的间隔、血管等［7］ .在病理条件下，肌纤维母细胞是参与伤口收缩的主要成份，其收缩功能对减小创面的面积以及后期的瘢痕重新塑形有重要的作用［8］ .
RPE是参与PVR形成的重要细胞成份［9］ ，RPE脱离原位后可以发生明显的形态和功能的变化［10，11］ .Lewis等［12］ 报道，在PRM中存在一种有足突的RPE细胞，电镜观察下这种细胞内有大量呈集束状排列的微丝，同时细胞核有明显的切迹，提示其可能有收缩现象，在这些细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间存在多种形式的联结，这些联结被证实对组织的收缩功能是有相当重要的作用.而这些特点与肌成纤维母细胞［13］ 是十分相似的. 转贴于
RPE的异常转型过程可能对PVR的发生过程有重要的意义［14］ .脱离原位后的RPE上皮表型以及胞质内的色素颗粒逐渐消失，合成多种细胞外基质，并表达α-SMA ［5］ ，导致眼内过度的损伤愈合过程以及收缩能力的持续增加.特别是α-SMA的持续表达对PVR的发生有重要意义［15］ .
从我们实验的结果来看，在C级的PRM中，有较多的细胞成份存在，同时也有较多α-SMA阳性细胞，但着色浅淡，提示在这些细胞中α-SMA的表达较弱;在D级PRM中虽然细胞数目明显减少，而α-SMA阳性细胞的着色明显加深，定量分析显示α-SMA在D级膜中的表达量是C级膜的1.88倍.从分布上看，其附着点位于PRM收缩的“受力点”位置.从RPE转型的特点来看，RPE在C级PRM中轻度表达α-SMA的过程可能与细胞本身合成细胞外基质、移行以及具有一定的收缩能力有关;而在D级PRM中，RPE明显表达α-SMA可能与其增强的收缩能力有关，这种α-SMA阳性细胞在数量上的变化和空间重新分布的表现，可能是RPE细胞在PRM中处于不同位置受到不同应力作用的结果.同时也提示PVR病变中，大部分RPE细胞可以在转型的过程失去其收缩功能，而处在某些特殊空间位置的RPE其收缩的功能反而明显增强，这种变化与牵拉性视网膜脱离的形成会有相当重要的作用.
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表白的话语范文6
[关键词] 肿瘤异常蛋白；乳腺癌；化疗；相关性
中图分类号：R737.9 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2016）06-097-03
DOI：10.11876/mimt201606036
乳腺癌被认为是化疗最有效的实体肿瘤之一，部分患者对化疗不敏感，如何早期评估患者化疗效果并寻求其他治疗策略十分重要[1]。肿瘤异常蛋白（Tumor abnormal protein，TAP）又称异常糖链糖蛋白，是一类细胞癌变初期致癌因子促发原癌基因和抑癌基因突变后产生的异常糖蛋白及钙-组蛋白复合物，癌细胞异常增生的发生发展往往伴随着TAP表达的显著增加[2]。作为一种病理学、影像学、肿瘤标志物检测的补充诊断手段，近年来TAP检测在子宫内膜癌、胃肠肿瘤的早期筛查与疗效评估中得到了关注 [3]。本研究就乳腺癌患者TAP表达及其与化疗效果的相关性进行了分析，旨在弥补关于TAP与乳腺癌研究的空白。
1 资料与方法
1.1 一般资料
自我院2014年1月―2015年3月收治的确诊乳腺癌[4]患者中进行筛选，选取标准：1）卡氏功能状态评分（KPS）≥70分，预计生存期≥6个月；2）接受新辅助化疗。排除标准：1）合并其他良恶性肿瘤；2）合并TAP检测阳性干扰因素，包括糖尿病、自身免疫性疾病、风湿和类风湿进行期、骨折未愈、异常增生等；3）妊娠或哺乳期女性。共选取符合条件的患者156例，将其纳入此次研究。本研究经我院医学伦理委员会批准，患者及家属均知情同意并签署书面协议。
1.2 检测方法
对患者化疗前后TAP表达进行检测[5]：末梢血 25μL涂血片2张。晾干后，每张血片间隔均匀滴加3滴TAP试剂，共6个液斑，2 h后使用TAP检测图文系统，选取面积测量功能，对TAP凝聚颗粒面积进行测量。TAP检测仪和TAP凝聚助剂均购自浙江瑞生医疗科技有限公司。凝聚颗粒面积测量方法[6]：单颗典型凝聚颗粒面积≥81μm2为有效凝聚颗粒；若有效凝聚颗粒仅为1颗，则报告面积为该有效凝聚颗粒的实测面积；若有效凝聚颗粒≥2颗，报告面积为所有有效凝聚颗粒的实测面积之和×0.62；若最大凝聚颗粒面积
1.3 分析方法
比较不同临床病理特征患者化疗前TAP表达情况，分析TAP表达与肿瘤直径、肿瘤分级、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体（HER-2）等特征的关系。TAP表达情况包括：TAP正常（无明显凝聚物）：凝聚物面积
参照世界卫生组织（WHO）实体瘤疗效评价标准[7]，
对其化疗2周期后近期疗效进行评价。比较疗效为PR、SD、PD患者化疗前后TAP值变化。
1.4 统计学分析
数据采用SPSS18.0进行分析，计数资料以（n/%）表示，并采用χ2检验，计量资料以（x±s）表示，满足方差齐性则采用独立样本t检验，若方差不齐，则采用校正t检验，以P
2 结果
2.1 不同临床病理特征患者化疗前TAP表达情况
化疗前TAP正常者36例，TAP异常（凝聚物较小）者76例，TAP异常（凝聚物较大）者44例，TAP异常率为76.92%。不同肿瘤直径、病理分级、淋巴结状态、ER状态、PR状态及三阴性乳腺癌患者化疗前TAP表达情况比较，差异有统计学意义（P
2.2 不同临床疗效患者化疗前后TAP表达情况
156例患者均完成2周期化疗，疗程结束后CR 0例，PR 89例，SD 40例，PD 27例。不同临床疗效患者化疗前后TAP表达情况比较，差异有统计学意义（P
3 讨论
既往关于乳腺癌生物学行为的研究表明，多数患者对化疗具有较高的敏感性[8]，但仍有部分患者化疗疗效受限，且目前临床尚缺乏一种可早期判定化疗敏感性、预测临床疗效的有效指标[9]。
糖基化作用是蛋白质翻译后修饰过程中的主要方式，故TAP与恶性肿瘤发生、发展、转移及预后均存在一定关联，自国外学者率先将TAP检测系统用于恶性肿瘤的诊断以来，近年来已有大量研究证实TAP在食管、胃、大肠癌癌前病变早期筛查中较高的灵敏度与特异性[10-12]。本研究就TAP与乳腺癌患者临床病理特征的关联性进行了观察，结果表明，随着患者肿瘤直径、病理的上升与淋巴结阳性、ER阴性、PR阴性的出现，其TAP异常率及凝聚物面积均呈现上升趋势，提示TAP在乳腺癌进展过程中扮演了重要角色，其可能机制为：1）乳腺癌细胞恶变早期，糖基转移酶、糖苷酶等糖基化修饰酶失活，某些胚胎成熟时期静止的酶类激活，可能导致细胞表面糖类结构变化，其中，聚糖结构的变化即可造成异常糖链蛋白合成增加，并表现为体液TAP表达上升[13]；2）某些糖链蛋白在肿瘤细胞的转移中亦发挥了重要作用，如β1，6分支糖链蛋白表达上升可造成肿瘤细胞粘附纤连蛋白能力下降，导致肿瘤迁移能力上升[14]，而唾液酸水平的降低往往导致肿瘤细胞连接紧密性下降，转移能力增强[15]。
恶性肿瘤治疗的有效性不仅仅反应为肿瘤体积的缩小，故单纯应用影像学手段无法明确肿瘤功能或活性变化，其有限的时效性可能造成延迟治疗或过度治疗，影响患者预后质量[16]。新型的TAP试剂弥补了判断结果仅为阴性、阳性的局限性 [17]。为验证其价值，本研究对不同临床疗效患者化疗前后TAP表达进行了比较，结果表明，临床疗效较佳者，其治疗前TAP表达水平较低且化疗后TAP表达水平进一步下降，而TAP表达水平的上升往往伴随着疾病的进展，且TAP检测具有操作方便、采血量少、结果可靠等多种优势[18]。
总之，乳腺癌患者末梢血TAP呈异常表达，TAP可能在病情进展演变的过程中扮演了重要角色，且TAP高表达者化疗效果较差。
参 考 文 献
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