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表白的话语范文1
20xx年愚人节表白的话【热门篇】1) 一滴水在海洋中渺小，在沙漠中伟大;丹顶鹤在鹤群中渺小，在鸡群中伟大;你在人群中渺小，在猪圈伟大!
2) 我有件事求你，你那能找个空房让我住两天吗?这件事请你不要告诉任何人，本来我不想麻烦你的，可我真的找不到信任的人了，我是萨达姆!愚人节快乐!
3) 对你的感情是一个简单的自然指数，你要微分几次都可以，不变的始终不变…假如你喜欢也可以积分，不过会多出一个常数来，而那个常数等于—我爱你。
4) 宁愿是一杯水，润你的嘴，暖你的胃，到你心扉，冲走所有烦恼疲惫;宁愿是清风吹，带着甜味，陪你入睡，给你安慰，你的快乐伤悲，我都想体会。愚人节快乐!
5) 对不起!我不小心把“喜欢你”发到了你的手机里，如果你接受请保留;如果不接受，请把它发还给我。愚人节快乐!
6) 曾有一分真挚的爱，我没珍惜，失去才后悔莫及，若能再来，我会说：我爱你。若要选表白时间，我希望是：愚人节快乐!
7) 该MM霸主一面，为祸四方;待我练就本事，事业有成，得以报效父母;定然舍命生擒之，押至民政局伏法!愚人节快乐!
8) 走着走着，就散了，回忆都淡了;看着看着，就累了，星光也暗了;听着听着，就醒了，开始埋怨了;回头发现你，不见了，突然我乱了。小住哪里逃，愚人节快乐!
9) 如果我是法官，我将判决你，终身监禁。监禁在———我的心里。愚人节快乐!
10) 啊!你的皮肤如此富有光泽，你散发的香味如此难以抗拒，让我狠狠咬你一口吧，我亲爱的——红烧肉!愚人节快乐!
11) 拔苗助长是荒诞，掩耳盗铃是蛮干。草船借箭是妙算，破釜沉舟是决战。风花雪月是浪漫，舍生取义是奉献。你若继续往下看，你就是个笨蛋!愚人节快乐!
12) 白天思你，晚上想你，吃饭念你，睡觉梦你，日不成行，夜难入寐，倍受煎熬，千言万语化成一句：我什么时候才能得到你……万大奖啊!愚人节快乐!
13) 如果我不向你求婚，我会后悔一辈子，因为你是我的惟一。
14) 如果我的爱你不信，那就让它成为弥天大谎，骗你一辈子;如果我的爱你不逃，那就让它成为深牢大狱，困你一生一世;因为，我想我们一辈子在一起!
15) 我不爱你，是骗你的，是违心的，我真的不想说假话，但是我就是不爱你，就是要骗你，不能让你猜透我的心。
20xx年愚人节表白的话【精选篇】1) 我是黑板，你是白粉笔，我们的结合让文字见证我们爱得鲜明;我是浮雕石，你是凿石刀，让艺术见证我们爱得深刻!
2) 爱你不是两三天了，想你不是一两个星期了，念你不是一两个月了，你要再不同意嫁给我，那我就搬去跟你一块住了，你看着办吧。
3) 房子可以小一些，家具可以旧一些，电器可以少一些，但只要有你，爱和亲密就会多一些，幸福和欢乐就会满一些，有你的家就是五星级宾馆。
4) 任何时候，任何情况，只要你需要我，我立即赶来，尽我全力为你做事。
5) 如果爱情是一朵花，就让它开在我心里，败在我心里，深埋在我心里。
6) 我要变成一个小精灵，潜入你的灵魂深处，去倾听你的心跳，你的呼吸，感受你的思想，你的愿望，这样我就可以和你心有灵犀了，知道如何好好爱你了。
7) 我们之间似有似无的距离，让我害怕;我们之间若隐若现的朦胧;让我无措，我怕终有一天，我会累了，会学会放弃.
8) 我答应不会让任何人伤害你，包括我自己在内，相信我!我会给你幸福。
9) 我从来不会对任何一个女人许下诺言，也从不会对任何一个女人做我会为你所做的事，你在我心目中是多么地不同!
10) 愚人节变成了表白的日子，情人节变成了分手的日子
11) 愚人节···又到了啊···他的歌,他的戏,他的人···“我就是我,是颜色不一样的烟火,天空海阔,要做最坚强的泡沫”·······
12) 愚人节，最想开的玩笑，我们和好好吗?
13) 愚人节，只是给说谎的人一个说真话的机会。
14) 愚人节，整死一个是一个，反正清明节也就要到了
15) 愚人节，我可以大胆的和你表白，因为我可以笑着离去。
20xx年愚人节表白的话【经典篇】1) 愚人节，不是给愚人过的节，而是给说谎人一个说真话的机会。
2) 英语考试听力时，我沉浸在开头优美的歌声中，缓过神来。才知道听力已经结束了!。
3) 一觉醒来我以为我长高了,原来是被子盖横了
4) 一称体重我就很不开心，不开心的时候我就想吃东西。
5) 星期一愚人节，老师竟然让我们去上课!越想不对劲儿，不行!咱不能上当!
6) 星期一愚人节,公司竟然让我们去上班,还是八点半上班!越想不对劲儿,不行!咱不能上当!
7) 小时候傍晚在邻居家看鬼片，当回家的时候。结果摔倒了。在邻居家已经做好冲锋的准备，到门口就发腿跑。
8) 现在是愚人节丶整死一个是一个丶反正清明节也要到了
9) 现在的孩子，分手专挑情人节，告白专挑愚人
10) 我最爱的人，愚人节那天一定要来骗我
11) 我一直奇怪,为什么会有一个愚人节,难道鼓励大家骗人吗?后来才知道,原来愚人自娱,有讽刺骗人者的意思。越来越发现,越是珍贵的东西,其实越容易被我们 不小心的忽略,譬如新鲜的空气,干净
12) 的水源,譬如诚信,譬如健康的身体。而这些东西之所以珍贵,是因为很容易一去不复还,用钱买不到。四月,祝好
13) 我是不该再去找谁的 愚人节又怎么样,宣泄了我的无聊寂寞想念后又怎样,我不敢找
14) 我期待的不是情人节，而是愚人节，因为在愚人节里面别人才会对我说真话
15) 我对你，是不是只有愚人节才可以说“我爱你”
16) “在一起吧““啊!愚人节是下星期二”“嘻嘻，跟你开玩笑，傻瓜”
17) “愚人节打算怎么过?”“我打算去表白”“为什么?”“因为被拒绝了我还能笑着回答说愚人节快乐呀!”
18) “我爱你”“我也爱你”“愚人节快乐”“愚人节同乐”看着就觉得心疼。
表白的话语范文2
关键词：凋亡蛋白质；原核表达；可溶性；纯化；稳定性
中图分类号：Q786文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)03-0007-05
Expression, Purification and Activity Detection in vitro of Apoptin
FU Wen-bing1, SHI Xuan1, ZHAO Jian1*, FAN Li-qiang1, LI Su-xia, WANG Fu-jun2, SONG Yu-wen1, YUAN Qing-sheng1
(1. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China; 2. Zhejiang Rishengchang Pharmaceutical Co., Ltd, Zhejiang 322100, China)
Abstract ：Objective To construct an soluble expression system in E. coli for apoptin which was encoded by VP3 gene of chicken anemia virus (CAV), and study the purification and stabilization of apoptin. Methods The VP3 gene was amplified by PCR , then the segment was inserted into pET-28a (+) and the expression vector pET-28a-VP3 was constructed in E. coli BL21(DE3). The recombinant soluble protein was expressed in E. coli BL21(DE3)and purified by Ni-NTA column chromatography. The stability of apoptin was analyzed under different conditions. Results The target protein was expressed in E. coli BL21(DE3). The purity of apoptin was beyond 90 %after purification. The target protein was better stabilized by carrageenan in E.coli BL21(DE3). Conclusion Apoptin with high purity and stability can be successfully obtained, which do a base of the further study on clinic application of apoptin.
Key words：apoptin; prokaryotic expression; solubility; purification; stability
凋亡蛋白质是鸡贫血病毒（CAV）的VP3基因编码的小分子蛋白质，由121个氨基酸组成，含有2个脯氨酸富含区和2个碱性区，近N端（33～44a）含有一个11个氨基酸组成的核运输序列（NES），靠近C端（84～90，112～118）含有2个核定位序列（NLS）。
Noteborn等[1]研究揭示，凋亡蛋白质能够诱导人的肝癌、淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌等多种癌细胞的凋亡，以及转化细胞的凋亡，但对未转化的人双倍体细胞无损伤[2]。凋亡蛋白质的核定位可能是其诱发细胞凋亡的前提之一[3]。凋亡蛋白质选择性诱导肿瘤细胞的凋亡不同于通常的凋亡机制，它不是通过半胱天冬酶级联反应进行的，不需要p53参与，也不被bcl-2的过表达抑制，反而能被bcl-2所促进[4]。由于大部分肿瘤细胞具有p53突变或缺失，这种非p53依赖性使凋亡蛋白质作为抗肿瘤药物有很好的前景。
在许多关于凋亡蛋白质表达和纯化的研究中，凋亡蛋白质多以包涵体形式表达。本实验以pET-28a为载体进行凋亡蛋白质的原核表达，尝试不同的诱导条件及纯化方法，找到了可溶性目的蛋白质表达的条件，用金属螯合层析法直接纯化得到较高得率的活性目的蛋白质，并研究其稳定性。本研究对凋亡蛋白质作为肿瘤治疗药物应用于临床具有积极意义。
1材料和方法
1.1质粒、菌株和试剂
含有凋亡蛋白质全长基因的质粒pET-11a-VP3（浙江日升昌药业有限公司提供）；质粒pET-28a和菌株BL21(DE3)等（本实验室保存）；低相对分子质量蛋白质和DNA Mark（Sigma公司）；IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）（BBI分装）；SDS（十二烷基磺酸钠）（Amresco分装）；限制性内切酶、T4-连接酶、Taq酶（MBI公司）；其它化学试剂均为国产分析纯。
1.2原核表达重组质粒的构建
VP3基因来源于pET-11a-VP3质粒。PCR引物分别为P1：5’-AATTTCAAC ATATGAACG CTCTCCAAG-3’；P2：5’- CGTCGGATCCTATT ACAGTCTTATACGC-3’。分别引入NdeI和BamHI位点。PCR产物经NdeI和BamHI双酶切后，回收的VP3基因片段与经同样双酶切的质粒pET-28a连接和转化。抽提质粒，用BamHI和NdeI对重组质粒进行双酶切鉴定得到阳性重组质粒。
1.3凋亡蛋白质的原核表达及纯化
1.3.1凋亡蛋白质的表达与鉴定将含有重组质粒pET-28a-VP3的BL21(DE3)菌株接种于LB培养基中，37 ℃培养过夜，次日按1∶100的比例稀释后放大培养，至一定菌体浓度时，加入适量IPTG诱导培养，离心收集菌体。
SDS-PAGE分析 12 % SDS-PAGE电泳，电压100 V，待样品即将进入分离胶时，调节至120 V。电泳后凝胶用考马斯亮蓝溶液（45 %甲醇，10 %乙酸，0.25 %考马斯亮蓝R 250）染色。
1.3.2可溶性目的蛋白质的纯化将新鲜菌体按1∶5（W∶V）的比例用Tris-HCl缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，10 %甘油，pH 8.5）重悬，保持在冰浴中，超声破碎至菌液澄清。4 ℃，10 000×g离心20 min，取上清，Ni-NTA Agarose 金属亲和树脂（Qiagen公司）分离纯化。将上清液加入经Tris-HCl缓冲液平衡的Ni-NTA 介质中，4 ℃结合60 min。将混合物小心加入下端封闭的层析柱后，除去下端封盖，收集流出液（穿出峰）。以15 mL含20 mmol/L咪唑的磷酸缓冲液漂洗后，再分别以15 mL含40，60，100，200 mmol/L咪唑的磷酸缓冲液洗脱目的蛋白质。分别收集洗脱组分，进行SDS-PAGE鉴定，Bradford法测定蛋白质浓度，凝胶扫描软件分析纯度。
1.4凋亡蛋白质溶液稳定性研究
将重组表达的凋亡蛋白质于4 ℃放置3 d后，取样进行SDS-PAGE电泳鉴定，对照3 d前样品观察凋亡蛋白质在溶液状态中的稳定性。通过改变离子强度（增加NaCl浓度）和添加不同稳定剂来增加凋亡蛋白质的稳定性。
2结果
2.1重组表达质粒的构建
以pET-11a-VP3为模板扩增PCR，得到预期大小的目的片断。切胶回收后双酶切（BamHI＋NdeI），酶切产物与同样双酶切的pET28a连接。连接产物转化E.coli DH5α，用BamHI和NdeI双酶切鉴定重组质粒（见图1），得到了含有400 bp目的片段的阳性克隆，与预期结果相同。经上海生工生物公司测序验证构建好的pET-28a-VP3，序列正确，并使凋亡蛋白质的N端带有His-Tag，为目标蛋白质的纯化提供了条件。
2.2重组蛋白质的表达
为了提高重组蛋白质的表达量，本实验研究了IPTG的浓度。当菌体密度到达约A600 0.6时，加入IPTG至终浓度分别为0.2，0.5，1 mmol/L，30 ℃诱导表达5 h，见图3。
由图3可见，经1 mmol/L IPTG诱导后表达量较高，目标蛋白质相对分子质量约16×103，与预期大小一致。
2.3可溶性凋亡蛋白质的纯化
诱导表达后菌体破碎离心，上清液用目的蛋白质N端的6×His咪唑基团与镍离子特异性结合，金属螯合层析法分离纯化，得到较纯的目的条带。经SDS-PAGE电泳扫描分析，纯度高于90 % ，见图4。蛋白质浓度测定表明每克湿菌体可以到0.49 mg凋亡蛋白质。
2.4凋亡蛋白质的稳定性研究
实验中发现凋亡蛋白质在溶液中不稳定，极易沉淀。实验中分别取IPTG诱导后样品立即进行SDS-PAGE分析，第3天再进行1次SDS-PAGE分析，见图5-A、5-B。
1. 低相对分子质量标准蛋白； 2，3. 放置2 d后目标蛋白质
图5-A. 诱导的菌体取样后立即SDS-PAGE，1和2 皆为目标蛋白质；图5-B. 诱导的菌体2 d后SDS-PAGE
图5 凋亡蛋白质SDS-PAGE稳定性分析
图5-A. 诱导的菌体取样后立即SDS-PAGE，1和2 皆为目标蛋白质；图5-B. 诱导的菌体2 d后SDS-PAGE
诱导的菌体取样后立即SDS-PAGE分析，可以看到目的蛋白质的表达条带清晰；2 d后SDS-PAGE分析，几乎观察不到目的蛋白质条带，推测凋亡蛋白质随着储存时间延长发生了聚合。这说明可溶性表达的凋亡蛋白质在溶液状态中易形成沉淀，一般2～3 d就发生大量聚集。因此有必要进行可溶性蛋白质的稳定性研究。
将表达得到的目的蛋白质分别保存于高、中、低3种不同盐浓度的缓冲液中，观察其稳定性。低盐溶液：20 mmol/L Tris.HCl缓冲液；中盐溶液：80 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris.HCl；高盐溶液：300 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris.HCl。pH值均为8.0。
实验表明，凋亡蛋白质在低盐溶液中不稳定，在超滤过程中即有大量沉淀析出。分别取高盐溶液和中盐溶液中4 ℃保存48 h前、后的样品，分析上清蛋白质浓度。2次重复实验结果表明，高盐蛋白质浓度平均降低16 %，中盐溶液中平均降低34 %。推测高盐环境更有利于凋亡蛋白质的稳定。
进一步研究，于缓冲液中加入各种稳定剂（最终浓度0.1 %）：阿拉伯树胶、卡拉胶、瓜豆尔胶、CMC（羧甲基纤维素钠）、明胶、高酯果胶、魔芋胶、黄原胶等，观察是否有利于重组凋亡蛋白质的稳定性。以上样品4 ℃保存7 d后离心得到的上清经SDS-PAGE分析，结果见图6。
1. 对照；2. 阿拉伯树胶；3. 卡拉胶；4. 瓜豆尔胶5.CMC；M. 低相对分子质量标准蛋白质；6. 明胶；7. 高酯果胶；8. 魔芋胶；9. 黄原胶
图6 添加剂对凋亡蛋白质稳定性的作用分析
图5-A. 诱导的菌体取样后立即SDS-PAGE，1和2 皆为目标蛋白质；图5-B. 诱导的菌体2 d后SDS-PAGE
实验结果表明，在高盐缓冲液中加入卡拉胶，目标蛋白质几乎没有沉淀，卡拉胶可以有效增强可溶性蛋白质的稳定性。
3讨论
本实验构建了表达质粒pET-28a-VP3，并在E. coli BL21(DE3) 中获得表达，用Ni-NTA柱纯化目标蛋白质。由于稀有密码子占VP3基因氨基酸序列组成的25 %左右，为了提高表达量，本实验选用严紧型表达宿主菌BL21(DE3)pLysS及促进富含稀有密码子的基因表达的Rosetta菌株表达目的蛋白质。实验结果（数据未列出）表明，Rosetta菌株中目的蛋白质的表达量并未增加，说明稀有密码子不是限制其表达量提高的因素。BL21(DE3)pLysS目的蛋白质的表达量也没有明显变化，表明目标产物对细胞无毒性或毒性很小。由于凋亡蛋白质稳定性差，其稳定性对于其临床应用至关重要。本实验通过改变溶液的离子强度及添加稳定剂来增加目标蛋白质的稳定性[5]，高盐缓冲液中加入卡拉胶可以有效增强凋亡蛋白质的稳定性[6]。本实验为在原核生物中进行目标蛋白质的表达和分离纯化，以及稳定性研究提供了简易可行的途径，为凋亡蛋白质的进一步药理研究奠定了基础。
参考文献
[1]Noteborn H M, Danen-van Oorschot A A, Vandereb A J. The apoptin gene of chicken anemia virus in the induction of apoptosis in human tumorigenic cells and in gene therapy of cancer[J]. In:Boulikas T. ed. Gene Ther Mol Biol. 1998: 399-406
[2]Danen-van Oorschot A A, Fisher D F, Grimbergen J M, et al. Apoptin induces apoptosis in human transformed and m alignant cells but not in normal cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94 (11): 5834.
[3]Zhang Y H, Abrahams P J, Vandereb A J, et al. The viral protein apoptin induces apoptosis in UV-C- irradiated cells from individuals with various hereditary cancer- prone syndromes[J]. Cancer Res, 1999, 59 (12): 3010-3015.
[4]Noteborn M H, Zhang Y H, Vandereb A J. Apoptin specifically causes apoptosis in tumor cell and after UV-treatment in untransformed cells from cancer-pron individuals: areview[J]. Mutat Res, 1998, 400(1-2): 447.
表白的话语范文3
【摘要】 目的 建立藕节炭中3-表白桦脂酸含量的测定方法。方法 采用高效液相色谱法。色谱柱：Lichrospher C18 (4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.2%冰醋酸(75∶25)，流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：207 nm。结果 3-表白桦脂酸的进样量在0.365 4～3.654 μg范围内线性关系良好，r＝0.999 6，平均回收率为98.83%，RSD＝2.47%。不同地区市售藕节炭中3-表白桦脂酸的含量最高为0.575 8%，最低为0.048 3%。结论 本法简便、准确、重复性好，可作为藕节炭中3-表白桦脂酸的含量测定方法。
【关键词】 藕节炭；3-表白桦脂酸；高效液相色谱法；含量测定
Abstract：Objective To establish a method for the content determination of 3-epibetulinic acid in Nodus Nelumbinis Rhizomatis Charcoal. Methods HPLC was used on Lichrospher C18 column (4.6 mm×150 mm， 5 μm) with mobile phase of acetonitrile-0.2% glacial acetic acid (75∶25)， the flow rate of 1 mL/min， the column temperature of 30 ℃ and the detection wavelength of 207 nm. Results 3-epibetulinic acid has a good linearity within 0.365 4～3.654 0 μg (r＝0.999 6) and the average recovery was 98.83% with RSD＝2.47%. The content of 3-epibetulinic acid in Nodus Nelumbinis Rhizomatis Charcoal from different region varied from 0.048 3% to 0.575 8%. Conclusion This method is simple， accurate， with good reproducibility， and can be used for the content determination of 3-epibetulinic acid in Nodus Nelumbinis Rhizomatis Charcoal.
Key words：Nodus Nelumbinis Rhizomatis Charcoal；3-epibetulinic acid；HPLC；content determination
藕节为睡莲科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)的干燥根茎节部，具有止血、消瘀的作用，用于治疗吐血、咯血、尿血、衄血、崩漏。2005年版《中华人民共和国药典》(一部)记载藕节的加工炮制方法为加工制成藕节炭，但藕节炭的质量标准比较简单，仅有加工程度的描述[1]。经研究，3-表白桦脂酸为从藕节炭止血活性部位醋酸乙酯部分中分离得到的主要成分，因此，本试验参考文献[2]，以3-表白桦脂酸为指标，采用高效液相色谱(HPLC)法，测定了各地市售藕节炭中的含量，为制定藕节炭的质量控制方法提供参考。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪(美国Waters公司)，泵Waters 2695，检测器为Waters2996二极管阵列检测器，数据处理器为Waters empower工作站。超纯水(Millipore公司纯水器)，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。3-表白桦脂酸对照品由本课题组从藕节炭中分离制得，高效液相归一化法测定纯度为98.57%。藕节炭样品为从全国不同地区收集的市售藕节炭，粉碎过50目筛备用。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Lichrospher C18(4.6 mm×150 mm，5 μm，江苏汉邦科技有限公司)；流动相：乙腈-0.2%冰醋酸(75∶25)；流速：1 mL/min；检测波长：207 nm；进样量：10 μL；柱温：30 ℃。理论塔板数按3-表白桦脂酸计算为11 012，分离度为2.47。色谱图见图1。
2.2 供试品溶液的制备
取不同地区市售藕节炭样品1.0 g，精密称定，精密加入甲醇25 mL，称定重量，回流提取0.5 h，再称定重量，以甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液以0.45 μm滤膜滤过，作为供试品溶液。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取3-表白桦脂酸对照品11.42 mg于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，浓度为0.456 8 mg/mL，作为对照品储备液。精密量取4 mL于10 mL的量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为对照品溶液，浓度为0.182 7 mg/mL。
2.4 线性关系考察
精密吸取对照品溶液(0.182 7 mg/mL)2、5、10、15、20 μL，按上述色谱条件测定峰面积积分值，对所得数据进行回归分析，回归方程为：Y＝527 405X－444 417，r＝0.999 6。表明3-表白桦脂酸进样量在0.365 4～3.654 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。
2.5 精密度试验
精密吸取建联藕节炭供试品溶液10 μL，连续进样5次，测定峰面积积分值，结果RSD＝0.556%。精密度良好。
2.6 稳定性试验
精密吸取济南建联的藕节炭供试品溶液10 μL，每隔2 h进样测定1次，共进样测定5次，结果RSD＝0.727%。其峰面积积分值在测定时间8 h内基本不变，表明在8 h内稳定性良好。
2.7 重复性试验
取同一批济南建联藕节炭1.0 g，共取6份，精密称定，按含量测定项下方法，依法测定并计算3-表白桦脂酸的含量，结果其含量为(0.420 0±0.005 52)%，RSD＝1.31%。表明重复性良好。
2.8 加样回收率试验
取同一批济南建联藕节炭0.5 g，精密称定，共取6份，分别加入3-表白桦脂酸2.278 mg，按“2.2”项下方法制得回收率试验液，依法测定。结果平均回收率为98.83%，RSD＝2.47%。结果见表1。表1 加样回收率试验结果（略）
2.9 样品测定
取不同地区市售藕节炭1.0 g，每批取3份，分别精密称定，按上述色谱条件依法测定3-表白桦脂酸的含量。结果见表2。表2 含量测定结果(略)
3 讨论
试验中对加入甲醇的量、提取时间进行了比较研究，加入甲醇25 mL易于过滤操作，且其测定值在线性范围考察内，故选择了25 mL。对回流提取的时间(0.5、1 h)进行比较，结果测得二者的含量基本接近，因此选择提取0.5 h。
3-表白桦脂酸为从藕节炭止血活性部位中分离得到的主要化学成分，因此，以3-表白桦脂酸为指标对藕节炭的含量测定进行了研究，但其是否具有止血作用有待研究。
不同地区市售藕节炭从性状观察上看有较大差异，收集的样品中仅福州市藕节炭为斜片状，其3-表白桦脂酸的含量最低，其他样品均为原药材直接加工炒制而成，这与加工方法及产地是否有关尚待进一步研究。本方法准确、灵敏、专属性强、重复性好，可作为藕节炭中3-表白桦脂酸的含量测定方法。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社，2005.264－265.
表白的话语范文4
【关键词】 QKI
［摘 要］ 目的: 获得原核表达的RNA结合蛋白QKI7蛋白， 并制备其兔抗QKI多克隆抗体。方法: 将成功插入QKI7编码区cDNA的PET32b(+)原核表达载体用热休克法转化BL21(DE3) 感受态细菌， 以IPTG诱导6×HisQKI7融合蛋白的表达， 分别经金属鳌合柱、 反向柱和强阴离子交换柱进行层析纯化。经SDSPAGE和Western blot鉴定后， 应用纯化的融合蛋白， 分别以弗氏佐剂、 聚丙烯酰胺凝胶、 NC膜作为佐剂免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体， 并以Western blot进行检测。结果: 经表达并纯化的QKI7蛋白纯度达到95%以上， 应用纯化的融合蛋白以弗氏佐剂作为佐剂免疫新西兰大白兔后获得高滴度， 特异性的抗QKI的多克隆抗体。结论: 成功地表达并纯化了QKI7蛋白， 并制备了高滴度、 高特异性的抗QKI多克隆抗体。采用弗氏佐剂作为免疫佐剂进行免疫的效果优于聚丙烯酰胺凝胶和NC膜。
[关键词]QKI7; 原核表达; 蛋白纯化; 多克隆抗体
QKI是属于STAR家族的一种RNA结合蛋白，在进化过程中高度保守， 在神经系统的髓鞘形成、 胚胎发育、 心血管系统的发育等方面起着重要的作用。qki基因不同部位的突变体小鼠可以表现在出生前死于心血管肌肉系统发育障碍， 或于出生后10 d表现为快速的震颤以及到了成年强直性惊厥的发作[1-3]。Pilotte 等[4]发现QKI7可以引起成纤维细胞和原代培养的大鼠少突胶质细胞发生凋亡， QKI5 和QKI6不但不能诱导凋亡， 反而可以与QKI7形成二聚体， 并转移到细胞核内， 抑制QKI7的致凋亡作用。为了研究QKI在外界不同信号刺激下在炎症发生、 血管生成过程中表达水平的变化， 我们表达和纯化了6×HisQKI7融合蛋白， 并制备了高特异性的多克隆抗体[5]。同时还比较了利用3种不同的免疫佐剂制备QKI多克隆抗体的效果。
1 材料和方法
1.1 材料 6×His融合表达载体PET32b(+)QKI7含有编码QKI7 cDNA序列， 由美国Emory大学药理系教授冯越惠赠。Ni金属鳌合柱（Sepharose Fast Flow）、 反相层析柱（source 30RPC）和强阴离子柱（source 30Q）均购自Pharmacia 公司。纯种新西兰白兔由本校实验动物中心提供。弗氏佐剂购自Gibco BRL 公司。HepG2细胞、 Hy906细胞为本室保存的引自美国ATCC的标准细胞株。
1.2 方法
1.2.1 细菌的发酵和裂解 将6×His融合表达载体PET32b(+)QKI7转化的大肠杆菌BL21(DE3)接到5 mL的LB培养基中， 30℃培养过夜， 转接细菌到500 mL 2×YT培养基中， 30℃培养10 h无菌接种于30 L发酵罐中（内有8 L培养液， 不含抗生素）37℃培养6 h后开始流加补料， 9 h后加入IPTG至终浓度05 mmol/L开始诱导， 诱导4 h后停止发酵。4000 r/min离心25 min， 收集沉淀， -70℃保存备用。取发酵细菌， 按照细菌和裂解液为1∶8的比例加入裂解(20 mmol/L Tris pH10， 3 mL/L巯基乙醇， 6 mol/L盐酸胍)， 不停搅拌， 室温过夜。8000 r/min离心30 min， 收集上清; 然后用超声波发生器以1500W的功率超声， 超声9 s间歇15 s， 一个循环超声90次， 攻击超声5个循环， 待用。
1.2.2 亲和层析纯化QKI7 金属鳌合柱经过A液(20mmol/L TrisHCl pH80， 150 mmol/L NaCl， 6 mol/L脲)平衡后， 取第一步准备的上清直接采用金属鳌合柱层析。上样流速为8 mL/min; 上样完成后用A液流洗至基线， 直接用B液(20 mmol/L TrisHCl pH80， 150 mmol/L NaCl， 6 mol/L脲， 200 mmol/L咪唑)洗脱， 收集目的蛋白峰， 准备下一步反相层析纯化。
1.2.3 反相层析纯化QKI7 以8 mL/min的流速用B液(20 mmol/L TrisHCl pH80， 1 mL/L巯基乙醇， 5 mol/L脲， 500 mL/L异丙醇)流洗30 mL， 然后用A液(20 mmol/L TrisHCl pH80， 1 mL/L巯基乙醇， 5 mol/L脲)平衡层析柱至基线， 调整紫外吸收至零点。用8 mL/min的流速上样， 上样结束后用A液流洗至基线， 采用20% B液流洗2个柱体积， 收集蛋白峰， 记为peak1， 再用75% B液洗脱2个柱体积， 收集蛋白峰， 记为peak2， 最后用100% B液洗脱2个柱体积， 收集蛋白峰， 记为peak3。电泳鉴定发现目的蛋白存在于peak2中。收集peak2， 准备阴离子柱纯化。
1.2.4 强阴离子层析纯化QKI7 以8mL/min的流速用B液(20mmol/L TrisHCl pH80， 1mL/L巯基乙醇， 5mol/L脲， 1 mol/L NaCl)流洗30 mL， 然后用A液(20 mmol/L TrisHCl pH80， 1mL/L巯基乙醇， 5 mol/L脲)平衡层析柱至基线， 调整紫外吸收至零点。用8 mL/min的流速上样， 上样结束后用A液流洗至基线， 采用7% B液流洗2个柱体积， 收集蛋白峰， 记为peak1， 再用20% B液洗脱2个柱体积， 收集蛋白峰， 记为peak2， 最后用100% B液洗脱2个柱体积， 收集蛋白峰， 记为peak3。电泳鉴定发现目的蛋白存在于peak2中， 纯度在95%左右， 4℃保存备用。
1.2.5 抗原的Western blot检测 将未诱导细菌的裂解产物和最终纯化的目的蛋白产物经SDSPAGE并转膜后， 用100 g/L的脱脂奶粉（TBST）封闭2 h， 一抗为anti6×His mAb(1∶1000稀释)， 二抗为羊抗鼠HRPIgG（1∶500稀释）， 依次加DAB和H2O2显色。
1.2.6 抗体的制备 将6只新西兰大白兔随机分成3组， 用纯化的6×His 融合蛋白分别以弗氏佐剂、 聚丙烯酰胺凝胶、 NC膜作为佐剂常规免疫， 每次免疫PET32b(+)QKI7融合蛋白200 μg。首次免疫后1月进行第2次免疫， 其后间隔2周进行第3次免疫， 共3次。其中弗氏佐剂组第1， 第2次免疫分别用完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂及200 μg抗原等体积混合， 于腋下和腹股沟区注射， 第3次免疫用200 μg纯抗原于耳缘静脉直接注射。聚丙烯酰胺凝胶和NC膜组3次免疫均为腋下和腹股沟区注射。3组最后1 次免疫2周后， 从兔耳静脉采血1 mL， 以间接ELISA 法检测血清抗体效价， 其中弗氏佐剂组抗体效价高于1∶105， 聚丙烯酰胺凝胶组和NC膜组抗体效价低于1∶102， 颈动脉插管分别收集血清。血清在4 ℃孵育过夜， 离心收集上清， 分装冻存于-70以备用。
1.2.7 3种不同的免疫策略抗体特异性的鉴定 用过表达QKI7的HepG2细胞蛋白提取进行SDSPAGE 后， 电转移至NC膜上， 以100 g/L脱脂奶粉封闭过夜， 用3组抗QKI血清(1∶700稀释)进行Western blot分析。
1.2.8 所获得抗体对内源性抗原的检测 用Hy906细胞蛋白提取物进行SDSPAGE 后， 电转移至NC膜上， 以100 g/L脱脂奶粉封闭过夜， 用弗氏佐剂组抗QKI血清(1∶1000稀释)进行Western blot检测。
2 结果
2.1 6×His融合蛋白的表达与纯化抗原的鉴定 经IPTG 诱导后， 在PET32b(+)QKI7转化菌裂解液中， 新出现1条Mr约40000的蛋白带(图1)， 与预期的6×HisQKI7融合蛋白Mr相符。经金属鳌合柱（图2）， 反相层析柱（source 30RPC）（图3）， 强阴离子柱（source 30Q）（图1）层析法纯化的上述蛋白， 在SDSPAGE后几乎为单一条带， 纯度达到95%以上。
图1 6×HisQKI7融合蛋白的诱导表达和纯化（略）
1: 未用IPTG诱导; 2: IPTG诱导4 h; 3: 纯化的6×HisQKI7.
图2 6×HisQKI7融合蛋白经金属鳌合柱后纯化结果（略）
1: 金属鳌合柱层析产物; M: 蛋白marker.
图3 6×HisQKI7融合蛋白经反相层析柱纯化结果（略）
1: 反向层析柱柱层析物; M: 蛋白marker.
2.2 抗原的鉴定 将未诱导细菌的裂解产物和最终纯化的目的蛋白产物作Western blot进行鉴定（图4）， 未诱导细菌的裂解产物可以看到1 条很弱的反应带， 最终纯化的目的蛋白产物可以分别看到明显的蛋白带反应。证明所纯化的蛋白是我们所要的带有His标签的融合蛋白。
图4 抗His抗体对纯化后抗原的Western blot分析（略）
1: 未诱导细菌的裂解产物; 2: 纯化的6×HisQKI7融合蛋白fusion protein(12 μg); 3: 纯化的6×HisQKI7融合蛋白(2 μg).
2.3 3种不同的免疫策略抗体特异性的鉴定 在Western blot中， 3种不同的免疫策略组中只有弗氏佐剂组所产生的抗QKI多克隆抗体（1∶700稀释）与在HepG2细胞中过表达的QKI5蛋白起反应， 而聚丙烯酰胺凝胶和NC膜组不与过表达QKI5蛋白的HepG2细胞裂解产物反应(图5) 。该组抗体能与HepG2细胞蛋白提取物中1 条Mr约40000的蛋白带反应， 与QKI5的Mr相符。
2.4 所获得抗体对内源性抗原的检测 用弗氏佐剂组所产生的抗QKI多克隆抗体（1∶1000稀释）对Hy906细胞的蛋白提取物做Western blot， 该组抗体能与Hy906细胞蛋白提取物中1条Mr约40000的蛋白带反应，
与QKI5的Mr相符（图6）。说明我们所获得的QKI多克隆抗体能检测内源性抗原的表达。
图5 抗QKI多克隆抗体的Western blot 鉴定（略）
1， 2: 聚丙烯酰胺凝胶组多克隆抗体; 3， 4: NC膜组多克隆抗体; 5， 6: 弗氏佐剂组多克隆抗体.
图6 抗QKI多克隆抗体对内源性抗原的Western blot鉴定（略）
1， 2: 抗内源性QKI5蛋白; 3: 蛋白 marker.
3 讨论
QKI不同的剪接体之间有90%以上的氨基酸同源序列， 有几乎相同的抗原表位， 因此利用6×HisQKI7融合蛋白所制备的多克隆抗体可以识别QKI不同的剪接体， 其实是针对各种QKI蛋白的多克隆抗体[6]。为了进一步研究QKI的功能， 我们表达、 纯化了6×HisQKI7融合蛋白， 并制备了高效价、 高特异性的抗QKI的多克隆抗体， 为从蛋白水平对QKI进行研究提供了有力的工具[7]。实验中6×HisQKI 融合蛋白的His标签与Ni金属离子鳌合柱的亲和力很低， 以致于经过一次亲和层析后所收集的目的蛋白峰中还是含有很高比例的杂蛋白。我们又根据QKI7蛋白的氨基酸序列和蛋白质疏水性， 等电点等性质设计纯化方案， 利用常用的反相柱层析和强阴离子柱层析才达到目的蛋白在95%比例以上的纯化效果。分析原因可能是QKI蛋白的氨基酸序列和空间构象影响了His标签与Ni金属离子鳌合柱的亲和力， 所以一步纯化很难达到预期的效果。此外， 我们用所获得的抗血清作过表达QKI5蛋白Western blot检测， 虽然可以与目的蛋白起反应， 但是目的条带的上下可以看到一些相对较弱的非特异条带。分析原因可能有以下两点: (1)多克隆抗体针对的是多个抗原表位并且免疫用的抗原纯度并未达到100%， 所以与细胞裂解液中的其他蛋白成分发生反应属于正常现象。可以对获得的多克隆抗血清进行纯化以获得更高特异性的抗体。(2)可以调整Western blot中抗体的稀释度， 进一步优化实验条件， 使非特异带降低。最终利用我们所制备的抗体成功的检测出在Hy906细胞中表达的QKI5， 说明所制备的抗体可以对内源性抗原进行检测， 并具有很高的效价和特异性， 这为我们今后研究QKI的内源性表达调控搭建了很好的一个平台。弗氏佐剂、 聚丙烯酰胺凝和NC膜是我们常规免疫中最常用的3种免疫佐剂， 我们比较了利用这3种不同的免疫佐剂进行免疫的效果。其中聚丙烯酰胺凝胶和NC膜组虽然为常规免疫策略但产生的抗体效价很低。通过3种方法的比较， 可以得出制备多克隆抗体， 采用弗氏佐剂作为免疫佐剂进行免疫的效果可能优于聚丙烯酰胺凝胶和NC膜， 为我们今后在免疫佐剂的选用上提供一定的指导。
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表白的话语范文5
【关键词】 玻璃体视网膜病
关键词: 玻璃体视网膜病，增生性;肌动蛋白类;免疫组织化学
摘 要:目的 观察PVR增生膜中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达. 方法 用免疫组化染色法和免疫荧光法对14例视网膜脱离伴PVR行玻切术时切除的增生膜（PRM）进行检查、分析. 结果 免疫组化染色法显示α-SMA在14例PRM中均有表达，位于胞质中，其分布与PRM的收缩方向一致.在200倍视野下，PRM C级膜中α-SMA阳性细胞比例为35/80，D级膜中α-SMA阳性细胞比例为50/60;免疫荧光法结果与染色法相符.荧光定量分析:PRM C级膜中α-SMA阳性荧光总量12.31.D级膜中α-SMA阳性荧光总量23.09，约为C级膜的1.88倍（P
Keywords:vitreoretinopathy proliferative;actins;immuno-histochemistry
Abstract:AIM To investigate the expression of alpha-smooth muscle actin（α-SMA）within the periretinal mem-brane（PRM）of PVR.METHODS Fourteen specimens of PRM were obtained during vitrectomies of patients suffered from PVR of different grades.α-SMA expression in PRM were detected by immunohistochemical staining，and quanti-tative analysis performed by image process of immunofluorescence.RESULTS α-SMA expression was detected in all14PRMs.The distributions ofα-SMA were present in the cytoplasma，and accordance with the direction of stress fibers..α-SMA expression was stronger in PVR/D than in PVR/C.CONCLUSION Expression ofα-SMA was a com-mon feature of PRM，and the expression correlated with severity of PVR and the process of membrane traction.
0 引言
增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreo-retinopathy，PVR）属于眼内组织创伤愈合的一种特殊表现，可以分为炎症期、细胞增生期和瘢痕期三个阶段，其中在细胞增生期可以形成视网膜表面的增生膜组织（PRM），这些膜组织在瘢痕期可以明显收缩，形成对视网膜的牵拉而导致视网膜脱离［1，2］ .视网膜色素上皮细胞（RPE）是参与增生膜形成的主要细胞之一，在PVR病变过程中可以有明显的形态改变，部分RPE可以转化为肌纤维母细胞样细胞而具有收缩功能［3］ .α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）是一种有收缩功能的细胞骨架微丝结构
［4］ .McGillem［5］ 等曾报道:在PVR病变的增生膜中有多种细胞表达α-SMA，但针对α-SMA在增生膜中的整体表达及其与PVR病变程度的相关性研究，尚未见报道.本实验采用免疫组化技术，观察PVR的视网膜前膜中α-SMA的表达情况.
1 材料和方法
1.1 材料
标本来源于1998-07/1999-11在本院眼科住院的孔源性视网膜脱离伴PVR患者14名，年龄4～63岁，病程2mo～2a.PVR分级标准参照1983年美国视网膜学会分级方法，分级为C3-D3.以上患眼行玻璃体切割术时取视网膜表面增生膜，其中下膜5例，前膜9例.以上组织用40g・L-1 多聚甲醛固定30min，4℃.经脱水、透明和浸蜡，制成腊块，然后制成5μm厚的切片，贴附于载玻片上.小鼠抗人的α-SMA单克隆抗体（1∶200;中国博士德公司），DAB免疫组化试剂盒（DAKO公司，丹麦），Avidin标记的Texas Red（Molecular Probes，美国）. 1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学染色及免疫荧光
切片浸入7.5mL・L-1 H2 O2 -PBS，37℃，30min，以阻断内源性过氧化物酶.正常羊血清封闭消除非特异性染色.滴加小鼠特异性抗体，在湿盒内37℃保温30min.PBS振洗3次，滴加生物素化羊抗小鼠IgG，在湿盒内37℃保温30min，免疫组织化学染色法滴加ABC复合剂，37℃保温30min.加入显色剂显色，镜下观察，水洗中止反应，苏木精复染核，脱水透明封片.免疫荧光法加入抗生物素化标记的Texas Red，37℃保温30min.缓冲甘油封片.采用人大隐静脉血管组织作为阳性对照;采用人类角膜移植后供体眼的眼后段组织，包括视网膜色素上皮细胞（RPE）、视网膜组织、脉络膜和巩膜，以及不加一抗的标本作为阴性对照，与手术取材标本平行染色.
1.2.2 结果判定和分析
免疫组织化学DAB染色法的结果:在OLMPUS显微镜（BX50）下观察，以背景清晰、棕黄色部位定位明确的细胞作为阳性细胞，在200倍视野下，计数阳性细胞比例.
Texas Red荧光标本在BIO-RED共聚焦显微镜（MR-1024）下观察，作定量分析:任意选一视野，在相同面积下计数荧光总量.
2 结果
阳性对照组显示均对所用的单克隆抗体呈阳性反应:DAB染色阳性细胞胞质中呈现棕色或深棕色的颗粒，细胞核经复染成蓝色;Texas Red在595nm激光激发下，阳性部位发出深红色颗粒样荧光.阴性对照组中未见阳性染色及荧光.
DAB染色结果显示，在14例PRM中α-SMA均有阳性表达，但其表达的程度有所差别.在6例PVR/C3级的PRM中，可见细胞成份较多，细胞间质较少，α-SMA表达阳性细胞的比例为35/80，呈散在分布，随分布区域的不同细胞染色以及形状表现有差异:在膜的表面可见少量染色较深，胞体呈梭形，胞核呈圆形或卵圆形的阳性细胞;在细胞较多的区域，阳性细胞数目较多，染色较浅淡，胞体为长圆形，胞核呈圆形，在部分阳性细胞中可见色素存在（Fig1（略））;在膜的中央组织中可见少量阳性细胞，胞体呈狭长的梭形，与标本的长径走行方向平行;在8例D级PRM中，α-SMA阳性细胞比例约为50/60，多分布在膜的表面，染色深，细胞呈梭形，胞核为长圆形（Fig2（略）），常可见此类细胞在膜组织的起伏处呈“搭桥样”存在，在组织的中央区域阳性细胞较少.
免疫荧光与DAB染色结果相一致.在C级膜中，阳性部位多位于膜的周边，量较少（Fig3（略））;在D级膜中，阳性部位多位于膜的表面，量较多（Fig4（略））.
3 讨论
在本实验中，我们观察到在14例不同时期PVR病变组织中α-SMA均有表达，α-SMA阳性细胞在C级和D级的PRM中有不同的表达程度，在C级膜中呈散在分布，大部分阳性细胞染色较浅淡;在D级PRM中主要分布在膜的表面，阳性细胞的走行多与膜标本横断面的长径一致或呈“搭桥样”存在，阳性染色为明显的深棕色.这一结果提示在PVR病变中存在α-SMA的表达以及阳性细胞数量存在着动态变化的过程，这个过程对PRM的重新塑形以及收缩能力的改变可能有重要作用.
α-SMA是一组表达在多种类型细胞胞质中的具有收缩功能的微管微丝结构，是细胞移行和具有收缩 功能的基础.同时可以作为一种特异性免疫组化染色标志来标识肌纤维母细胞［6］ .肌纤维母细胞多存在于一些需要收缩功能的组织中，如肺泡的间隔、血管等［7］ .在病理条件下，肌纤维母细胞是参与伤口收缩的主要成份，其收缩功能对减小创面的面积以及后期的瘢痕重新塑形有重要的作用［8］ .
RPE是参与PVR形成的重要细胞成份［9］ ，RPE脱离原位后可以发生明显的形态和功能的变化［10，11］ .Lewis等［12］ 报道，在PRM中存在一种有足突的RPE细胞，电镜观察下这种细胞内有大量呈集束状排列的微丝，同时细胞核有明显的切迹，提示其可能有收缩现象，在这些细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间存在多种形式的联结，这些联结被证实对组织的收缩功能是有相当重要的作用.而这些特点与肌成纤维母细胞［13］ 是十分相似的. 转贴于
RPE的异常转型过程可能对PVR的发生过程有重要的意义［14］ .脱离原位后的RPE上皮表型以及胞质内的色素颗粒逐渐消失，合成多种细胞外基质，并表达α-SMA ［5］ ，导致眼内过度的损伤愈合过程以及收缩能力的持续增加.特别是α-SMA的持续表达对PVR的发生有重要意义［15］ .
从我们实验的结果来看，在C级的PRM中，有较多的细胞成份存在，同时也有较多α-SMA阳性细胞，但着色浅淡，提示在这些细胞中α-SMA的表达较弱;在D级PRM中虽然细胞数目明显减少，而α-SMA阳性细胞的着色明显加深，定量分析显示α-SMA在D级膜中的表达量是C级膜的1.88倍.从分布上看，其附着点位于PRM收缩的“受力点”位置.从RPE转型的特点来看，RPE在C级PRM中轻度表达α-SMA的过程可能与细胞本身合成细胞外基质、移行以及具有一定的收缩能力有关;而在D级PRM中，RPE明显表达α-SMA可能与其增强的收缩能力有关，这种α-SMA阳性细胞在数量上的变化和空间重新分布的表现，可能是RPE细胞在PRM中处于不同位置受到不同应力作用的结果.同时也提示PVR病变中，大部分RPE细胞可以在转型的过程失去其收缩功能，而处在某些特殊空间位置的RPE其收缩的功能反而明显增强，这种变化与牵拉性视网膜脱离的形成会有相当重要的作用.
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表白的话语范文6
[关键词] 肿瘤异常蛋白；乳腺癌；化疗；相关性
中图分类号：R737.9 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2016）06-097-03
DOI：10.11876/mimt201606036
乳腺癌被认为是化疗最有效的实体肿瘤之一，部分患者对化疗不敏感，如何早期评估患者化疗效果并寻求其他治疗策略十分重要[1]。肿瘤异常蛋白（Tumor abnormal protein，TAP）又称异常糖链糖蛋白，是一类细胞癌变初期致癌因子促发原癌基因和抑癌基因突变后产生的异常糖蛋白及钙-组蛋白复合物，癌细胞异常增生的发生发展往往伴随着TAP表达的显著增加[2]。作为一种病理学、影像学、肿瘤标志物检测的补充诊断手段，近年来TAP检测在子宫内膜癌、胃肠肿瘤的早期筛查与疗效评估中得到了关注 [3]。本研究就乳腺癌患者TAP表达及其与化疗效果的相关性进行了分析，旨在弥补关于TAP与乳腺癌研究的空白。
1 资料与方法
1.1 一般资料
自我院2014年1月―2015年3月收治的确诊乳腺癌[4]患者中进行筛选，选取标准：1）卡氏功能状态评分（KPS）≥70分，预计生存期≥6个月；2）接受新辅助化疗。排除标准：1）合并其他良恶性肿瘤；2）合并TAP检测阳性干扰因素，包括糖尿病、自身免疫性疾病、风湿和类风湿进行期、骨折未愈、异常增生等；3）妊娠或哺乳期女性。共选取符合条件的患者156例，将其纳入此次研究。本研究经我院医学伦理委员会批准，患者及家属均知情同意并签署书面协议。
1.2 检测方法
对患者化疗前后TAP表达进行检测[5]：末梢血 25μL涂血片2张。晾干后，每张血片间隔均匀滴加3滴TAP试剂，共6个液斑，2 h后使用TAP检测图文系统，选取面积测量功能，对TAP凝聚颗粒面积进行测量。TAP检测仪和TAP凝聚助剂均购自浙江瑞生医疗科技有限公司。凝聚颗粒面积测量方法[6]：单颗典型凝聚颗粒面积≥81μm2为有效凝聚颗粒；若有效凝聚颗粒仅为1颗，则报告面积为该有效凝聚颗粒的实测面积；若有效凝聚颗粒≥2颗，报告面积为所有有效凝聚颗粒的实测面积之和×0.62；若最大凝聚颗粒面积
1.3 分析方法
比较不同临床病理特征患者化疗前TAP表达情况，分析TAP表达与肿瘤直径、肿瘤分级、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体（HER-2）等特征的关系。TAP表达情况包括：TAP正常（无明显凝聚物）：凝聚物面积
参照世界卫生组织（WHO）实体瘤疗效评价标准[7]，
对其化疗2周期后近期疗效进行评价。比较疗效为PR、SD、PD患者化疗前后TAP值变化。
1.4 统计学分析
数据采用SPSS18.0进行分析，计数资料以（n/%）表示，并采用χ2检验，计量资料以（x±s）表示，满足方差齐性则采用独立样本t检验，若方差不齐，则采用校正t检验，以P
2 结果
2.1 不同临床病理特征患者化疗前TAP表达情况
化疗前TAP正常者36例，TAP异常（凝聚物较小）者76例，TAP异常（凝聚物较大）者44例，TAP异常率为76.92%。不同肿瘤直径、病理分级、淋巴结状态、ER状态、PR状态及三阴性乳腺癌患者化疗前TAP表达情况比较，差异有统计学意义（P
2.2 不同临床疗效患者化疗前后TAP表达情况
156例患者均完成2周期化疗，疗程结束后CR 0例，PR 89例，SD 40例，PD 27例。不同临床疗效患者化疗前后TAP表达情况比较，差异有统计学意义（P
3 讨论
既往关于乳腺癌生物学行为的研究表明，多数患者对化疗具有较高的敏感性[8]，但仍有部分患者化疗疗效受限，且目前临床尚缺乏一种可早期判定化疗敏感性、预测临床疗效的有效指标[9]。
糖基化作用是蛋白质翻译后修饰过程中的主要方式，故TAP与恶性肿瘤发生、发展、转移及预后均存在一定关联，自国外学者率先将TAP检测系统用于恶性肿瘤的诊断以来，近年来已有大量研究证实TAP在食管、胃、大肠癌癌前病变早期筛查中较高的灵敏度与特异性[10-12]。本研究就TAP与乳腺癌患者临床病理特征的关联性进行了观察，结果表明，随着患者肿瘤直径、病理的上升与淋巴结阳性、ER阴性、PR阴性的出现，其TAP异常率及凝聚物面积均呈现上升趋势，提示TAP在乳腺癌进展过程中扮演了重要角色，其可能机制为：1）乳腺癌细胞恶变早期，糖基转移酶、糖苷酶等糖基化修饰酶失活，某些胚胎成熟时期静止的酶类激活，可能导致细胞表面糖类结构变化，其中，聚糖结构的变化即可造成异常糖链蛋白合成增加，并表现为体液TAP表达上升[13]；2）某些糖链蛋白在肿瘤细胞的转移中亦发挥了重要作用，如β1，6分支糖链蛋白表达上升可造成肿瘤细胞粘附纤连蛋白能力下降，导致肿瘤迁移能力上升[14]，而唾液酸水平的降低往往导致肿瘤细胞连接紧密性下降，转移能力增强[15]。
恶性肿瘤治疗的有效性不仅仅反应为肿瘤体积的缩小，故单纯应用影像学手段无法明确肿瘤功能或活性变化，其有限的时效性可能造成延迟治疗或过度治疗，影响患者预后质量[16]。新型的TAP试剂弥补了判断结果仅为阴性、阳性的局限性 [17]。为验证其价值，本研究对不同临床疗效患者化疗前后TAP表达进行了比较，结果表明，临床疗效较佳者，其治疗前TAP表达水平较低且化疗后TAP表达水平进一步下降，而TAP表达水平的上升往往伴随着疾病的进展，且TAP检测具有操作方便、采血量少、结果可靠等多种优势[18]。
总之，乳腺癌患者末梢血TAP呈异常表达，TAP可能在病情进展演变的过程中扮演了重要角色，且TAP高表达者化疗效果较差。
参 考 文 献
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