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核酸检测方法范文1
1计算机硬件故障的分类
按出现的时间分类，计算机的硬件故障主要分为以下三种，分别是：先期故障；中期故障；后期故障。先期故障指的是用户完成购买、安装、使用直到计算机保修期前后的时间内出现的故障，出现这类故障的原因多是产品设计不合理，配送过程中出现碰撞，使得计算机设备的元器件受到损坏，除此之外也有不少是由人为操作不当造成的。中期故障指的是用户在使用计算机三年左右出现的故障，这些故障大多均匀分布，并没有什么明显的特征，一般是由某一个或是几个零部件质量不佳导致的，更换存在故障的零部件即可排除故障。后期故障指的是设备在使用多年以后出现的故障，例如计算机内部的半导体和集成线路因为长久使用而发生物理或化学反应，从而导致设备元件老化失效。电阻和电容元件的使用寿命往往低于常用的半导体元件，而分立元件的使用寿命又低于集成电路，集成电路虽然价格较为昂贵，但是使用寿命却是最长的。对于那些即将超出使用寿命期限的故障元件，更换新的元件之后就可以正常工作。而在后期故障中，除了计算机使用过程中突发的故障外，老化故障最为常见。它的特点是电阻元件变质，电容器的容量减少，会出现漏电的现象。这些故障的表现往往不会很明显，但是一旦出现却难以迅速解决，属于疑难故障的范畴，需要专业的工作人员进行排除。
2计算机硬件设备出现故障的原因
对于计算机硬件设备存在故障的原因主要分为三个部分，分别是内部原因、外部原因以及人为原因。内部原因主要指设备内部的元器件性能不良，开关、触点等部分被氧化以及印刷板漏电等由于生产方的原因造成的故障，像如元器件以及机械内部零部件出现不可逆的损坏，无法正常使用也是属于这类故障。外部原因指的是用户使用计算机的外部条件造成的，像如电路元件的损坏，计算机长时间工作造成内部零件的损坏以及外界环境的尘埃造成计算机操作性能下降等问题。人为原因多是为运输过程计算机设备受到了猛烈的撞击或震动，或是使用者随意组装、错误操作而造成的故障。
3计算机硬件常用维修方法概述
3.1常规观察法。常规观察法是最为简单易行的，打开计算机设备的后盖，直接用肉眼观察设备的元件是否存在损坏、变形等情况。再连接电源观察设备内部是否有异味或者异常声音，以此来判断是否存在以下故障。3.1.1断线。在计算机设备故障中最常见的就是电源线路断裂，保险丝断裂以及晶体管引线断裂等。3.1.2短路。短路这种故障常发生在分布较为密集的印制线路和芯片连接的引线之间，常见的是焊锡、裸的引线以及电路板上的汕垢短路。此外元器件相互碰撞以及元器件与屏蔽罩以及金属地板之间的短路也时有发生。3.1.3漏电。某些漏电故障也能够凭借感官观察而直接发现，例如由电解电容外壳炸裂而引起的漏电、电解液流出而引起的漏电亦或者高压元器件的漏电都能够凭借感官观察而直接发现。一旦发生高压元器件发生漏电，会导致其出现放电打火现象。3.1.4过热。个别元器件一旦过热，通常会伴随着各种异味，维修时可以通过用手背触摸的方式来判断其是否过热，从而决定是否需要更换。3.2电路检测法。计算机硬件设备维修中电路检测法主要由以下几个部分组成。首先电流法，电流法是用来检查计算机硬件设备的电源电路负载电流，以及电路中各个部分的直流工作电路。简而言之，若电流值正常，晶体管以及芯片就会处在正常的工作状态，电源的负载电流若是保持正常状态，负载中就不会出现故障问题。其次拆除法，有些计算机设备中的元器件只是起辅助作用，像如减少干扰、调节电路正常工作的元器件。但是当这些元器件出现故障时，不仅不能发挥其辅助作用，甚至会影响到设备的正常工作。若将此类元器件进行应急拆除并暂留空位，设备便可马上恢复正常的工作。一般在缺少替换元器件的情况时，可采用拆除法加以处理。
4完善计算机维修工作的措施
4.1掌握硬件故障的简单处理技巧。对硬件部分故障进行处理的难点就是快速对故障位置进行准确的判断，这时就需要用到电阻检测法以及替换法等检测方式，发现故障之后再进行针对性的处理。比如说CMOS电源发生故障之后，就需要对电池进行更换。当按下开机键显示器没有正确显示，而且伴随着蜂鸣声时，我们就需要取下计算机的内存条对其进行清理。清理之后将计算机进行还原，然后再尝试开机。如果计算机还是不能正常开机，那么就应该更换内存条。若没有遭受病毒攻击的状态下计算机的运行速度无缘无故的变慢，就应该从计算机的温度以及主机是否故障这两个方面来考虑问题，在理清楚故障原因之后要根据实际的状况来及时进行处理。4.2掌握专业的维修技巧。掌握专业的故障判断技巧是快速准确的维修计算机设备的关键所在，工作人员需要根据故障想想在脑海中明确检验故障的方法和次序，只有这样才能最大限度的减少维修时间。在维修的过程中要掌握专业的维修技巧，像如先清洁后检测、先机外后机内、先简单后复杂等，只有牢牢的掌握这些专业技巧才能尽可能的排除其他故障，以避免硬件故障给计算机带来的损害。
5总结
维护人员不仅要掌握专业的知识，还应该掌握一些具体操作方法和维修技巧，还要在工作中总结经验，能够对计算机存在的故障进行深入的分析，并采取相应的措施加以解决。
参考文献
[1]杨琳.计算机硬件常用维修方法和技巧分析[J].中国新通信,2016,18(05):132.
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一、建筑施工企业会计核算的内容
建筑施工企业会计核算涉及建筑施工过程中的一切资金费用，具体包括施工费用、人工费用、机械费用、材料费用、直接费用、间接费用、往来款项等。在实际会计核算过程中，企业应依据工程在完成年限、税款、建筑面积（施工工作任务）等方面的不同，采取不同的核算方法，以总体成本核算为例，需要企业将开始建设到竣工结束所投入的全部资金费用进行核算，以准确反映项目资金的总体使用情况。
二、建筑施工企业会计核算的主要问题
1.会计核算不符合标准
目前，有相当一部分建筑施工企业的会计核算存在核算项目混乱、原始单据遗漏、批注使用不规范等问题，还有部分建筑施工企业未能在既定时间内进行资金结算，导致资金数据缺乏准确性，甚至出现坏账、假账、财务造假等严重问题。
2.成本控制不受到重视
建筑施工企业的会计核算人员通常只关注项目资金的管理和使用，其工作重心放在提高资金的流动性及使用效率等方面，对建筑成本控制缺乏考虑。另外，当前建筑企业普遍采用分层核算方式，而由于成本管理体系的不健全，加之企业内部权责机制的缺失，导致企业会计核算人员无法真实掌握施工细节及相关资金的使用情况，进而导致财务报表与真实情况的偏差，使企业蒙受巨大经济损失。
3.会计核算监督力度小
一方面，企业内部监管制度缺失，相关监督工作未能发挥应用作用，导致企业会计核算的准确性和真实性缺乏保障；另一方面，企业外部监管制度执行不力，尽管国家有建筑相关法律法规来对企业的会计核算工作进行约束，但相关制度的执行力度不够，未能发挥其会计核算监督作用。
4.会计核算人员素质低
目前，建筑施工行业的专业会计人才比较紧缺，企业会计部门的从业人员素质普遍较低，（再加上施工任务分散，会计人员流动性大）不能很好地满足企业会计核算工作的需要，这不仅影响了企业会计核算的效率，也引发人们对建筑施工企业财务报表真实性的怀疑。
三、建筑施工企业会计核算方法的完善策略
1.革新会计核算理念
理念是行动的先导，要想提高建筑施工企业的会计核算水平，最重要的一点就是摆脱固有理念约束，引进现代会计核算管理理念，使企业从根本上认识到成本核算的重要性，进而有的放矢地推动企业会计核算的规范化，自觉规避会计核算中的各种问题。
2.加强核算人员培训
企业要制定完善的会计人员培训计划，提高会计人员培训力度，使之能够满足企业会计核算工作的需要。首先，企业可利用工作之余的时间，对会计人员进行专业会计知识的讲解和培训，提高会计人员实操水平。其次，应让会计人员学习并了解会计制度、会计法规等方面的知识，提高会计人员的职业守法意识。再次，会计人员自身也要加强学习，不断丰富自己的知识储备，提高自己的工作能力。
3.健全会计核算体系
企业应严格遵循《会计法》有关要求，建立健全会计核算体系，为会计部门开展会计核算工作提供可靠依据。首先，企业应尽快设立会计核算中心财务核算系统，并明确规定会计核算人员的工作权限，对其财务行为进行有效约束。其次，企业要购置相应的信息设备，利用计算机技术服务财务核算工作，提高核算数据的真实性和时效性。另外，企业应建立完善的会计核算管理制度，明确会计核算的工作步骤和流程，并针对核算过程中易出现问题的环节制定相应的预防控制措施，及时完成核算信息的统一、整合工作，确保核算成果得到有效利用。
4.强化会计核算监督
首先，企业要建立健全内部监督体系，对会计核算人员的工作行为进行全面监管，使之严格按照工作章程来进行会计核算工作，提高核算数据的真实性与可靠性。其次，国家也要加大对建筑施工企业的监督管理力度，并针对建筑企业会计核算出台专项法律法规，以实现对企业会计核算的宏观监管和调控。对于在会计核算方面弄虚作假、违规操作的建筑施工企业，要根据相关法律追究其责任，以树立法律的权威性，督促建筑企业自觉遵守会计核算相关法规。
核酸检测方法范文3
关键词：蔬菜；有机磷类；氨基甲酸酯；检测
中图分类号：S481 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20161033032
众所周知，蔬菜生长存在农药残留，遭受着重金属等不同类型的污染。为实现保产增产，在蔬菜生长时期必然会施加农药。长期总结发现，农药污染通常表现在下述层面：违规使用国家严令禁止高度农药，私自使用非法的高残留农药；过度应用低毒农药；不思量安全间隔期，普遍存在今天用药，明天采摘的现象。现阶段，有机磷、氨基甲酸酯类是产生农药中毒的基本物质，且这2类农药也是最为常用、生产规模大和出现中毒几率较高农药，它们是国家监控的主要目标。
1 有机磷类、氨基甲酸酯类的主要检测方法
现阶段，国家标准针对有机磷类与氨基甲酸酯类主要提出了气相色谱和液相色谱检测，如NY/761液相色谱、酶抑制有效检测与气相色谱/质谱等方法。
1.1 NY/761液相色谱
1.1.1 实验仪器和材料
液相色谱仪-荧光检测器、电子天平、氮吹仪等、水浴锅等；大白菜等新鲜蔬菜，乙腈、二氯甲烷等；标准溶液与OPA溶液。
1.1.2 检测步骤
确定色谱条件，对样品进行处理，通过粉碎机粉碎，再匀浆处理，规范称取适宜的量放至锥形瓶，进行匀浆操作，借助滤纸完成过滤，收集至具塞量筒内部，多次震荡，再静置，随后加热，净化、比较定量与计算。
1.2 酶抑制有效检测法
1.2.1 实验试剂与主要仪器
甲拌磷、乐果与对硫磷等；农药提取液和残留速测卡。
1.2.2 检测步骤
样品检测随机抽样，样品质量为20g，借助剪刀剪出方形碎片，其大小为1cm，完全混匀；提取5g蔬菜碎片将其放置到带盖瓶，添加10ml浸提液，把提取瓶放置到超声波提取器进行震荡，大约震荡30s，然后将其静置2min；启动INSTEK仪器电源，进行预热；当仪器绿色指灯变亮后，将速测卡摆放至INSTEK仪器中；规范提取提取液，并在速测仪中滴入2滴左右的提取液；提取空白浸提液并滴入速测仪，大约2滴左右，进行对比；关合速测卡，对速测仪进行加热，持续3min左右；打开速测卡，根据白色药片进行判定。
标准溶液检测分别规范称取合理的农药对照品，将其放置于10mL容量瓶内，经由农药提取液进行溶解，同时，将其稀释到特定刻度，以此来充当备用液，提取一定的储备液，将其转移到10mL容量瓶内，使其成为农药标准液。依据上述步骤进行检测，得到各种农药对应的极限检出限。
1.3 气相色谱/质谱法
实验试剂是无水硫酸钠，二氯甲烷和丙酮，六氯苯，乙酸乙酯；所用仪器及设备是粉碎机、离心机与旋转蒸发仪等不同设备；测定步骤：提取。规范称取进行磨碎处理的蔬菜，将其放置100mL三角瓶，添加较多的无水硫酸钠，进行搅拌，真正均匀后，将其静置，添加适量的二氯甲烷和丙酮，辅以代用品，进行漩涡混合，超声波提取，再进行离心操作，提取上层清液，多次重复，将获得的清液进行混合，然后旋转蒸发，最后氮吹浓缩；净化和测定。制作活性炭小柱和乙酸乙酯柱，以供浓缩过柱，将流速控制在1mL/min，经由乙酸乙酯洗脱与其和正己烷混合液洗脱后，完全收集，将其储存在刻度管，利用氮吹仪进行浓缩处理，添置内标六氯苯，再利用质谱仪进行测定；标准曲线与计算。将标准储备液独立稀释到不同浓度，添置内标六氯苯，依据标准开展进样分析，绘制标准曲线。明确色谱峰面积，清楚内标色谱峰的实际面积，参照峰面积比值，通过标准曲线获得检测结果。
2 不同检测方式的比较讨论
NY/761液相色谱是一种定量方法，检测结果较为精准，但会消耗较长的时间，一般不会应用在快速检测中。
酶抑制高效检测中速测卡法具有一定的针对性和可行性，能够围绕有机磷、氨基甲酸酯类展开粗布筛选。速测卡法具有优良的灵敏性，且检测高效，剖析研究一个样品常常消耗10min左右。气相色谱/质谱法具有定量可靠、灵敏性优良，重现性强等特点。不同的方法具有不同的优点，且适用条件也存在差别，应结合具体情境选择适宜的方法。
3 结语
蔬菜作为膳食结构的基本组成，至关重要，不可或缺，经由合理检测可掌握蔬菜当下的安全情况，全面控制，以免不达标蔬菜流入餐桌，提升饮食安全水平，促进监督执法工作的开展，保障食品安全。
核酸检测方法范文4
艾滋病即获得性免疫缺陷综合症，由感染“HIV”病毒引起。HIV是一种能攻击人体免疫系统的病毒，它可以侵袭人的免疫体系，并终极损坏人体的免疫功效。随着人体免疫力的下降，人会越来越频繁地感染上各种致病微生物，而且感染的水平也会变得越来越来重，终极会因各种复合感染而导致逝死亡。艾滋病严重威胁人类的身心健康，当我们出现一些异样的症状后，应该选择什么样的检测方法，怎样确诊自己是否患有艾滋病就显得格外重要。按规定的检测程序对艾滋病的检测方法研讨如下。
1 材料和方法
1.1 材料：选取我院临床初筛检测病例72例，其中男性40例，女性32例。年龄28-63岁，平均39岁。
1.2 临床症状：初期的开始症状像伤风、流感、全身疲劳无力、食欲减退、发热、体重减少、随着病情的加重，症状日见增多，如皮肤、粘肤出现白色念球菌感染，单纯疱疹、带状疱疹、紫斑、血肿、血疱、滞血斑、皮肤容易损伤，伤后出血不止等。
1.3 方法：目前作为诊断手段使用的检测主要包括抗HIV病毒抗体检测、核酸检测和抗原检测。其中对病毒抗体的检测是艾滋病初筛实验室常规使用的方法
1.3.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）：目前应用的ELISA法有8种之多。它们的特异性和敏感性超过99%。在一些特殊情况下，当抗体检测无法满足HIV感染诊断的需要时，病毒分离及测定、核酸检测、抗原检测可作为辅助手段使用，这包括对非典型血清学反应样品的诊断、HIV感染的窗口期诊断、新生儿早期诊断和对特殊样品的诊断。
1.3.2 明胶颗粒凝集法（PA）：它是快速、简便的一种筛选方法。PA的基本过程是先将样品稀释，然后分别加入经抗原致敏的和未致敏的明胶颗粒，混匀后保温(一般为室温)。当血清中有HIV抗体存在时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA操作简便,无需特殊仪器设备,适合对少量标本的检测。是对大量人群初筛实验使用的方法，例公民义务献血的初筛检测。
1.3.3 免疫荧光试验(IFA)：基本原理为应用H9或HUT78培养细胞作为载体，用HIV感染细胞,该细胞内就会含有HIV抗原,将HIV感染的淋巴细胞涂于玻片上固定，制备为抗原片，加入待检血清，待检血清中的抗 HIV抗体与抗原结合后，再与荧光素标记的抗人Ig结合，在荧光显微镜下可见到细胞内有黄绿色荧光。
1.3.4 免疫印迹试验：主要用于确认试验，基本原理是HIV全病毒抗原经过SDSPAGE电泳，将分子量大小不等的蛋白带分离开来，然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状，每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。将待检血清样品用稀释液稀释成1/100，再把它直接加到硝酸纤维素膜上，恒温震荡，使其充分接触反应,血清中若含有抗HIV抗体，就会与膜条上的抗原带相结合并呈现紫褐色。此确认实验室是初筛阳性的标本送检省疾控的HIV确认实验室或市疾控的HIV中心实验室进行的。
1.3.5 病毒核酸检测：是通过检测HIV RNA水平来反映病毒载量，具有很高的灵敏度，使用适时荧光聚合酶链反应(PCR)技术，能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸。病毒核酸检测方法可用于HIV的早期诊断，如窗口期辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效测定、预测疾病进程等。目前常用的测定方法有逆转录PCR实验(RT PCR)、核酸序列扩增实验(NASBA)、分支DNA杂交实验(bDNA)等。使用高灵敏度的适时荧光PCR技术，能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸。此种检测是在HIV感染确诊之后，判定使用抗病毒药物的检测指标，现在可有省疾控中心的艾滋病检测实验室完成。
2 结果
经过我院的检测和分析后，14例送检经确认实验，未确诊艾滋病感染。
3 讨论
近年来，HIV检测技术取得了很大进展，但是仍有不足的地方。例如ELISA法第四代试剂增加了P24抗原的检测， p24抗原检测能够在病毒开始复制后检测到血液中的可溶性p24抗原，但易出现假阳性。因此，阳性结果必须经中和试验确认，该结果才可作为HIV感染的辅助诊断依据。还有病毒核酸检测方法具有很高的灵敏度，对疾病进展的监测、抗病毒疗效观察和耐药性监测非常重要。但是，由于HIV基因的多样性，没有一套引物可以覆盖所有的HIV序列，使检测的敏感性又受到限制。
HIV感染的诊断是艾滋病预防控制工作的重要组成部分，建立敏感实用的检测方法对于监测、诊断或血液筛查，控制艾滋病的流行显得尤为重要。总结以上讨论的检测方法，我们得出的结论是，既要提高检测的敏感性、特异性，缩短窗口期，又要简便、快速和降低成本已成为HIV检测技术发展的要求和方向，很多的研究正致力于寻找病毒检测的替代技术。
参考文献
[1] 曹韵贞我国艾滋病的现状中国抗感染化疗杂志 2002,2(2):65 66
核酸检测方法范文5
本文综合介绍迄今为止检测DNA脱碱基位点的化学探针检测方法，归纳总结DNA脱碱基位点在构建小分子检测元件和生物传感器等方面的应用，并作以展望。2DNA脱碱基位点的化学探针检测法
大量脱碱基位点的检测方法包括32P后标记法、LCMS、ELISA等方法被用于基因中脱碱基位点的检测。32P后标记法具有灵敏度高、特异性好的优点，但也存在操作复杂且具有放射性的缺欠；LCMS结果准确、可靠，但对待测样品的前处理要求高，且需要专业人员进行大型仪器操作等。相比之下，ELISA检测法操作简单，仪器价格低，但由于所用抗体对结构相似的物质一般有交叉反应，降低了检测的特异性。20世纪90年代初发展起来的化学探针法某种原因，因为操作步骤简单、特异性强，且灵敏度合适，成为目前脱碱基位点检测的主要研究方法之一。
化学探针根据不同作用机理可分属为共价反应型探针及非共价作用探针两大类。共价反应探针，是利用化学反应将标记分子与脱碱基位点共价联接的一类探针。例如脱碱基位点及其氧化衍生物结构中的醛基基团，能够与氨基基团发生缩合反应，形成稳定的共价结构。基于这个氨醛缩合反应，可合成一端具有氨基基团、另一端为标记基团的共价反应型探针分子，实现脱碱基位点的标记。非共价作用探针，是依靠探针与核酸分子之间的氢键、静电引力、碱基堆积力等弱相互作用力，使探针分子能够进入脱碱基位点，由此改变探针分子的物理信号（吸光度、荧光、电化学等），从而实现对脱碱基位点识别的探针类型。
基于以上检测机理，一系列探针可归结为共价反应型探针。如，对（4硝基苄基）羟胺上的羟胺基团能够与脱碱基位点核糖残基的醛基发生缩合反应，将硝基苄基基团共价标记在脱碱基位点上。标记上的对（硝基苄基）羟胺用5′磷酸脱氧核糖4硝基苄基羟胺的单克隆抗体来识别，实现对脱碱基位点的检测，此方法可以检测104个碱基对中出现的1个脱碱基位点，或10 fmol/L的脱碱基位点[15]。氨基玫瑰树碱（9Aminoellipticine， 图3a）[16]的氨基与脱氧核糖残基的醛基缩合生成希夫碱，根据希夫碱的荧光信号，实现脱碱基位点的检测。用14C甲氧胺滴定含有醛基型脱碱基位点的DNA，生成DNA14C甲氧胺复合物，检测其放射性，实现对脱碱基位点的识别[17]。基于DNA甲氧胺复合物阻断内切酶及聚合酶的作用，不用具有放射性的甲氧胺，也成功的检测了脱碱基位点[18]。
目前广泛用来检测脱碱基位点的醛基反应探针ARP（Aldehyde reactive probe， 图3d）[19，20]， 由生物素酰肼与对羧甲基羟胺在碳化二亚胺存在下反应生成对烷基羟胺衍生物，然后将生物素酰肼的联氨转换为羟胺而得到。ARP的羟胺与普通脱碱基位点的醛基进行缩合反应，将生物素共价标记在脱碱基位点。标记上的生物素利用生物素/亲和素辣根过氧化物酶检测，可检测小牛胸腺DNA或噬菌体f1 DNA经过酸加热处理产生的脱碱基位点，70～100 ng DNA样品中可检测出每104个碱基中的1个脱碱基位点。
2.2非共价作用探针
DNA互补碱基对之间形成的氢键作用力以及碱基与相邻碱基间形成的碱基堆积力，是DNA双螺旋结构稳定的重要因素。碱基脱落后形成的脱碱基位点使局部氢键作用力、碱基堆积力失衡，导致DNA局部结构甚至整体结构趋于不稳定，单个碱基缺失能够降低DNA稳定性3～11 kcal/mol[29]。而小分子进入脱碱基位点形成的空腔后，能够弥补这些弱相互作用力，从而利于DNA结构趋于稳定。非共价探针进入脱碱基位点空腔，参与分子间氢键、范德华力、静电引力、碱基堆积力等非共价弱相互作用力，导致探针信号发生变化，实现脱碱基位点的检测[30～32]。
C5呋喃环的嘧啶衍生物（图4a）是检测脱碱基位点的一种典型非共价荧光探针。使用C5呋喃环衍生物取代DNA序列中的正常碱基形成C5呋喃环衍生物修饰的DNA序列。此修饰序列与互补DNA序列互不配对形成双螺旋结构时，C5呋喃环衍生物对面位置为腺嘌呤A时，其荧光信号被淬灭。而当互补碱基脱落成脱碱基位点，其荧光信号相比于对面为腺嘌呤时增强7倍，根据此荧光信号变化可检测脱碱基位点[33，34]。
Buzzeo等[35]设计合成了具有电化学活性的非共价探针雷德蒙红（图4c）。当固定在金电极表面的DNA序列含有脱碱基位点时，雷德蒙红进入空腔结构，参与碱基堆积作用，产生稳定、可逆的电流信号，明显高于正常碱基的情况，从而实现了碱基脱落位点的检测。在另一个工作中，他们合成的金属铑配合物Rh（bpy）2（chrysi）3+（图4b） 能够进入脱碱基位点，并在光催化作用下切断DNA骨架。基于这一发现，并利用核酸的常规生物学检测方法，实现了Rh（bpy）2（chrysi）3+金属嵌入剂对脱碱基位点及单碱基凸起微摩尔级的检测[36，37]。
核黄素等是一类本身具有荧光的生物小分子，与含有脱碱基位点的双链DNA结合后，荧光信号发生变化。当脱碱基位点对面为胸腺嘧啶且邻位为鸟嘌呤时，构建的23 nt 双链DNA实现了对核黄素的特异性检测，核黄素与核酸的结合常数达到5.3×105 L/mol，而对黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）及仅相差1个磷酸根的黄素单核苷酸（FMN）的结合能力分别为0.25×105 L/mol及0.21×105 L/mol，与SELEX技术筛选得到的RNA适配体具有相当的识别能力[40，41]。
对于本身不具备荧光特征的靶分子，可以在双链DNA脱碱基位点的附近引入荧光基团。靶分子进入脱碱基位点空腔后，与相邻的碱基和荧光基团发生相互作用，改变荧光基团的光学性质。如在脱碱基位点的邻位引入荧光性碱基类似物2氨基嘌呤（图5），构建茶碱的识别元件。茶碱进入脱碱基位点后，既与对面的碱基形成氢键，又与邻位2氨基嘌呤发生碱基堆积作用，使其荧光信号下降。这种荧光标记的含脱碱基位点双链DNA识别元件，与茶碱结合的解离常数为10 μmol/L，且在同样反应条件下对咖啡因（与茶碱仅在N7位相差1个甲基）无响应，与SELEX技术筛选得到的RNA适配体具有相当的识别能力[43]。
利用含有脱碱基位点的DNA构建核酸适配体传感器的基本思路为：将待测靶分子的核酸适配体经过剪切后延长（图6 A）、直接延长或设计一段部分互补序列（图6 B），延长部分或部分互补的DNA序列中含有脱碱基位点[45]。如利用以上方法构建的腺苷适配体传感器，对腺苷的检出限为μmol/L级[46]：将腺苷的完整核酸适配体剪切为两段序列，各自含有腺苷结合位点的部分碱基，在其中一段序列的延长位置引入脱碱基位点。在没有腺苷分子存在的情况下，两段序列几乎不能形成稳定的二级结构，因此脱碱基位点对荧光信号分子几乎没有结合能力，荧光信号分子没有完整的结合位点而游离在溶液中，表现出游离分子的荧光特性。当腺苷分子存在时，腺苷分子与两段序列中的位点结合，同时使部分互补碱基形成稳定的双螺旋结构，脱碱基位点在双螺旋结构内形成疏水空腔，荧光分子进入脱碱基位点而产生荧光信号变化，从而将适配体与腺苷的作用直接转换成荧光信号改变，能够检测1 μmol/L的腺苷。
对腺苷适配体进行直接延长或设计一小段部分互补序列（图6 B），序列中含有脱碱基位点，使直接延长的部分或者部分互补序列在没有腺苷存在情况下，与核酸适配体上的某一段序列形成互补配对，互补配对的螺旋结构中脱碱基位点形成空腔结合荧光信号分子，产生初始荧光信号。当溶液中存在腺苷分子时，由于核酸适配体与腺苷分子的结合能力高于核酸适配体与互补单链核酸之间的结合能力，互补配对的螺旋结构解旋，含有脱碱基位点的互补序列脱落或游离于结合位之外，脱碱基位点不形成稳定空腔结构，信号分子被释放到溶液中，产生荧光信号变化，从而将适配体与靶分子的相互作用转换为荧光信号的变化[47，48]，此传感器对腺苷检出限为2 μmol/L。
3.3对SNP的检测
4发展与展望
碱基脱落是一种常见的DNA损伤，无法修复的脱碱基位点可能会导致DNA转录复制的终止或碱基突变、变异，最终会造成机体的癌变、畸变、甚至死亡。脱碱基位点的检测方法的发展趋势以操作简单、快速、实时、安全为目标，同时保证高灵敏度和高特异性。根据不同的脱碱基位点结构，研究人员已经设计合成了相应的共价反应性化学探针，这些探针显示了非常好的特异性和较高的检测灵敏度，一般可以检测出104～105个正常碱基中1个脱碱基位点的存在，是极具潜力的检测方法。
核酸检测方法范文6
关键词：PCR；食品安全；食品微生物；检测
0引言
现代食品行业,有很多有害的微生物严重危害食品的品质与人们的健康,甚至会引起一些严重的疾病。而随着经济的迅速发展,对各类食品的需求也日益增大,因有害微生物引起的各类食物中毒事件也逐渐增多。然而,使用传统的检测方法即非选择性与选择性增菌、生长法及血清学鉴定虽然比较准确,但费力、耗时,一般需4～7 d才能完成。
此外,低水平的病原菌污染,食品加工后导致菌体的“致伤”及食品其它成分的干扰等因素,使得传统的检测方法受到了一定的限制。因此,急需一些快速、特异、敏感的检测方法,以及时发现致病菌,控制污染及其可能对人体健康产生的危害。
分子生物学技术的发展使得许多食品工作者得以寻求更为快速有效的方法来检测病原菌,以期增加敏感性与显著地减少检测时间。其中, PCR技术是比较有效,也是应用得最为广泛的一种检测方法之一。
1 多聚酶链式反应(polymerasechainreaction)PCR技术
PCR技术是由Kleppe等人在1971年首先提出的,即多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR),在食品中微生物的检测中发挥着重要作用。自从1985年成为基因工程中重要技术的同时,也为微生物的鉴定分析提供了新的快捷方法。目前美国、加拿大、日本与我国的科研工作者都将致力于PCR技术应用于啤酒等食品中微生物的检测。
1.1 PCR技术检测微生物的原理
PCR技术检测微生物的基本原理是在被检测微生物核酸序列,在PCR体系下经高温变性、低温退火、适温延伸三步循环将单个核酸分子序列以二的指数进行大量复制扩增的过程。即在检测时,被检测微生物双链DNA序列在94℃变性解链成双链,55℃特异性引物与单链DNA结合,72℃在引物的引导延伸复制检测微生物DNA序列。
以上三步进行循环扩增得到大量的被检测微生物DNA序列,最后一般在凝胶电泳下检测目的DNA。理论上只要样品中有一个分子的微生物就可以在短时间内用PCR技术检测到。
1.2 PCR技术检测食品微生物的优点
1.2.1方便性
操作烦琐,自动化程度不高是传统检测方法的一大缺点。传统的检测方法往往需要花费大量的人工来实现。适合不同微生物生长的培养基以及不同微生物适宜生长的pH、温度等都需要花费一定的人力与时间,观察菌落特征、细胞特征、革兰氏染色以及生理生化鉴定等步骤烦琐。
因此,落后的检测方法与高自动化的现代企业形成鲜明的对比,极大地限制了现代化食品企业的发展。而PCR技术检测食品微生物操作简单、方便,仅用一人就能完成检测,具有极大的方便性。
1.2.2快捷性
传统的检测方法最大的缺点就是检测需要时间长,一般的腐败菌检测至少需要2到5天,甚至7天以上。检验结果出来时往往产品已经流向市场,对实际生产具有严重的滞后性。而PCR技术检测食品微生物能在一天之内检测出结果,甚至在几个小时就检测出结果,对食品工业生产具有很好的指导作用。
1.2.3准确性
食品中污染微生物种类很多,即使是同一种食品中微生物种类也有很多,用传统的方法检测食品中微生物要分离出所有的微生物很困难。特别是在检测食品中的弱势菌时,可能很难用传统的方法检测出来,特别是有些微生物很难培养,而用PCR技术检测这些微生物可以避免这些问题,因此,利用PCR技术能够比较准确地检测食品中微生物。
2 PCR技术的发展
2.1普通PCR
随着科学技术发展,PCR技术也在逐步优化与简化其程序,如先进PCR仪,食品样品中微生物检测的PCR模板制取的简化(如超声波破碎法、反复冻融法等),使得PCR技术更加方便、准确。普通PCR技术发展而衍生出许多特殊的PCR检测技术,如PAPD-PCR、Nested-PCR等等。
加拿大LABATT公司的研究人员已经将PAPD-PCR技术运用到鉴别啤酒腐败细菌的种与亚种,Nest-PCR技术检测啤酒腐败菌能提高检测效率。
2.2定量PCR
随着科技的发展,检测也从定性检测发展到定量检测。即检测从有没有到有多少。特别是一些高致病性微生物的检测,有很少的细胞足以使人致病;在科学研究上致力于食品微生物细胞的数量对致病性的严重程度影响的研究。
2.2.1实时定量PCR
实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。此定量方法的应用基础是TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性及双标记荧光探针的发现,它融合了PCR及DNA探针杂交的优点,能直接检测PCR扩增过程中信号的变化,可对核酸进行相对及绝对定量。实时定量PCR较传统的PCR定量方法具有以下优点:
①敏感度高,仅需要极微量的模板。②闭管检测,不需要扩增后分析,减少了产物后分析的污染。③操作简单,反应快速且重复性好。基于实时定量PCR的广泛应用,介绍一下分子信标原理。
分子信标(molecularbeacon)技术是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针,两端的核酸序列互补配对,因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的猝灭基团紧紧靠近(图1),荧光基团被激发后产生的光子被猝灭基团猝灭。分子信标的茎环结构中,环一般为15～30bp,且与目标序列互补。
茎一般5～7bp,相互配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的5′端,而猝灭基团则标记在3′端。在复性温度下,模板不存在时形成茎环结构,如果有模板存在,加热变性时茎环双链解开的环序列将与模板配对,分子信标将成链状而非发夹状,使得荧光基团与猝灭剂分开。
当荧光基团被激发时,因猝灭作用被解除而发出荧光。由于酶切作用的存在,分子信标检测的也是荧光积累。荧光强度与溶液中模板的量成正比,因此可用于PCR定量分析。常用的荧光基团有FAM、Texas、Red。
根据分子信标的原理,Invitrogen公司设计了LUX(lightuponextention)引物。引物对中的一个引物3′端用荧光报告基团标记,在没有单链模板的情况下,该引物自身配对,形成发夹结构,使荧光猝灭。在模板存在的情况下,引物与模板配对,发夹结构打开,产生荧光信号。
使用LUX引物进行实时PCR扩增,不需要专门设计探针,既节省了成本又给实验设计提供了宽松的条件。由于没有探针控制特异性,因此它的特异性要弱于探针技术,但非特异性扩增或引物二聚体没有影响,所以其特异性要强于SYBRGreenI。
2.2.2竞争定量PCR
竞争PCR是目前用于分子水平检测的最有效的核酸定量方法,原理是在样品中同时扩增两种相似模板,它们竞争同一对引物、酶及三磷酸脱氧核糖(deoxy2ribonucleosidetriphosphate,dNTP),且以相同效率扩增,产物的比率准确地反映两种模板初始浓度之比。
根据竞争模板的来源分为外源性与内源性竞争模板。外源性竞争模板可分为RNA与DNA竞争模板。RNA竞争模板是提取组织的总RNA,反转录后再引入外源性核苷酸片段或将待测模板缺失掉一段核酸片段,使之与待测模板有相同的引物识别序列、相同的酶切位点及长度相近的重组体。
DNA竞争模板最大的优点是准确性强,操作简便,节约时间,应用范围广,可省去酶切、连接与诱变等步骤。内源性竞争模板一般地用持家基因如β-微球蛋白等作为基因表达定量的内标准,但受到以下因素的限制:
①内源性mRNA必须与目的mRNA的含量相近,否则扩增动力学与指数扩增期不一致;
②因二者mRNA的序列大小与二级结构存在的差异造成了逆转录效率可能不一致;
③两者在不同的引物下扩增,若扩增效率有细微的差别,将会极大地影响PCR产物量,使定量差异较大;
④内源性mRNA在组织细胞中的表达量不总是恒定的,因此内源性基因模板很难对目的mRNA进行精确定量。
3 PCR技术检测食品微生物中应注意的问题
PCR技术在食品检测的实际应用中表现出灵敏度高、速度快、特异性强、简便、高效等特点,为食品检测技术的发展提供了有力的技术支持。
但是,PCR技术在实际应用中也表现出一些缺陷,例如容易出现假阳性、假阴性、产物容易突变、不能检测致毒微生物产生的毒素等。由于食品样品的特殊性与PCR技术的特点,在检测过程中应注意以下几点。
3.1 PCR模板的制备
不论是在提取微生物的核酸,还是直接处理食品样品,模板的制备都很重要,特别是直接处理样品时,食品中有很多PCR抑制因子,要尽可能地除去(包括DNA提取时蛋白与有机溶剂等的去除),这一步的好坏直接影响最终检测结果。
3.2 污染问题
PCR极易被污染,为避免PCR的污染问题,操作要规范,勤换枪头。
4 展望PCR技术在检测食品微生物中的应用
食品在生产、运输、销售过程中很容易受到微生物的污染,所以微生物检测是食品检验中的一项重要内容。
随着生物技术的飞速发展与各项新技术与PCR技术的有机结合,以及今后专门针对如何控制外源DNA的污染、如何控制突变与如何利用PCR技术鉴别致毒微生物产生的毒素等方面的深入研究,必将为PCR技术在食品检测领域更加广泛的应用提供新的思路。
总之,随着国内外快速检测技术的发展,用PCR技术检测食品微生物已把食品微生物检测技术带入一个新阶段。
无论是检测中心还是企业,科研单位,在选用微生物的快速检测方法时,应该考虑到方法的预期目标的精确性、检测时间、经济性、可接受性、操作简便性、技术服务等因素。这需要具备完善的科研管理体系,由各种层次专业人员组成的技术队伍,相当先进的仪器设备配置与相应科研资金投入,以及对国外先进技术与信息的掌握。
5结语
由于其快速、特异、敏感的特点, PCR技术作为一种检测手段仍有巨大的应用价值。食品安全检测中一个十分重要的内容是及时准确地检测出食品中的病原微生物。传统的微生物检测方法虽然有效且特异性高,但存在检测成本高、速度慢、效率低等问题,难以满足现代社会快速检测的要求,并且由于传统的微生物检测方法基本上都需要对病原菌进行人工培养,对一些生长缓慢或是新的病原菌就难以用传统方法进行检测。
而PCR技术等现代生物学技术应用于食品微生物检测,可以克服传统食品安全检测方法的缺点与不足,而且还具有灵敏度高、操作简便、检测周期短、检测成本低等优点。相信随着PCR技术的进一步完善,将是今后食品微生物检测技术的一个重要研究方向,若能克服所存在的问题,相信大规模推广应用指日可待。
参考文献:
