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一百岁感言范文1
【摘要】 目的： 研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植到急性心肌梗死区心肌样细胞再生后nesprin蛋白的表达情况。方法: 大鼠16只，随机分为实验组和对照组，每组8只。利用密度梯度分离法和贴壁培养MSCs，流式细胞仪检测MSCs表面相关抗原、DAPI标记MSCs备用;SD大鼠开胸手术结扎心脏冠脉左前降支建立心肌梗死模型，并在实验组梗死区注射MSCs，对照组注射DMEM;术后3周取梗死区心肌，利用免疫细胞学化学方法鉴定肌节肌动蛋白和肌钙蛋白的表达，免疫荧光技术和蛋白质印迹鉴定nesprin蛋白在MSCs移植后的表达。结果: MSCs移植到梗死缺血区3周后可以用DAPI示踪、并有心肌细胞特异蛋白呈阳性表达;免疫荧光和蛋白质印迹鉴定在MSCs移植前后有nesprin蛋白的表达，移植后出现nesprin蛋白表达量的增加。结论: MSCs在梗死心肌内移植具有分化再生的能力，nesprin蛋白在MSCs移植后出现表达量的增加，可能在MSCs分化为心肌细胞样过程中起到一定的作用。
【关键词】 nesprin蛋白; 间充质干细胞; 细胞移植; 心肌细胞再生
[Abstract] Objective: Identify the differentiation of rat bone mesenchymal stem cells(MSCs)into myocardiumlike cells after MSCs was transplanted into acute myocardial infarction.Then， identify the expression of nesprin protein. Methods: Sixteen SD rats were randomly pided into experimental group (n=8) and the control group (n=8).MSCs were isolated and purified from the bone marrow of rats by density gradient centrifugation and adhering to the culture plastics. Surfaceassociated antigens of MSCs were detected by flow cytometry. These cells were labeled with DAPI. SD rats were anesthetized， through thoracotomy，then ligated the left anterior descending coronary artery in order to establish model of myocardial infarction. The DAPI marking MSCs were injected into the infarcted area in the experimental group; DMEM was used in the control group.The expression of αsarcomeric actin， troponin I were studied by immunocytochemistry three week later when MSCs were transplanted into acute myocardial infarction. The expression of nesprin protein in MSCs was identified by immunofluorescence and westernblotting before and after transplantation. Results: MSCs can be traced by DAPI three weeks later when MSCs were transplanted into the infarcted ischemic area. The expression of αsarcomeric actin and troponin I were positive in MSCs three weeks after transplanting into the infarcted ischemic area. The expression of nesprin protein was positive in MSCs by immunofluorescence and westernblot whenever MSCs were transplanted or not. But， three weeks after MSCs were transplanted，the expression of nesprin protein in the infarcted ischemic area was higher than that of DMEM was used in the infarcted ischemic area. Conclusion: This study suggests that MSCs were capable to differentiation with subsequent myocardial regeneration，after being implanted into the infarcted myocardium; the expression quantity of nesprin protein was higher after MSCs were implanted. When MSCs are differentiating into cardiac myocytelike， nesprin protein may play a role in this procession.
[Key words] nesprin protein; mesenchymal stem cells; cell transplantation; cardiomyocyte regeneration
Nesprin蛋白是一种细胞核膜蛋白质，在很多组织均有表达，其中以骨骼肌、心肌和血管平滑肌表达较高;研究发现其除了在细胞的有丝分裂、RNA的复制转运、细胞核膜的稳定性方面起着关键作用外，在细胞的分化中可能也起到相关的作用[1，2]。Nesprin蛋白的缺失将导致相关性疾病的发生，如扩张性心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)、埃德二氏肌营养不良(EmeryDreifuss muscular dystrophy，EDMD)等遗传性疾病，影响细胞骨架组织和动态平衡，将引起细胞骨架刚性的丧失，或者导致细胞的过早成熟老化[3]。Nesprin蛋白的研究对治疗一些以肌肉和心血管系统为表现的遗传疾病有重要意义。
心肌在缺血损失后表现为功能不全或者严重心功能衰竭，虽然药物和外科手术可以缓解病情，改善组织缺血，但无法改变取代受损的心肌细胞。通过移植骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)到缺血心肌组织可以分泌多种因子，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等改善心功能，代替受损心肌细胞[4，5]。我们建立大鼠急性心肌梗死模型，将体外分离提取、培养及4′，6二脒基2苯吲哚盐酸(DAPI)标记的MSCs经局部注射移植入梗死心肌区域内。观察MSCs在梗死心肌移植后的分化情况，同时对nesprin蛋白进行鉴定，为临床细胞移植治疗心脏疾病打下理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康SD大鼠16只，体质量250～300 g，由上海交通大学医学院动物实验中心提供。随机分为实验组和对照组，每组8只。
1.2 主要试剂和仪器
LDMEM培养基、特级胎牛血清FBS、0.25%胰蛋白酶和EDTA(Gibco公司);密度为1.077的Ficoll(GE公司);荧光标记抗鼠CD45FITC、抗鼠CD90PE(eBioscience公司);抗鼠CD29APC(BioLegend公司);抗鼠心肌特异性肌钙蛋白I(TnI)抗体、抗鼠肌节肌动蛋白、兔抗大鼠nesprin蛋白抗体(Abcam公司);Triton(Amresco公司);牛血清白蛋白BSA(Proliant公司);细胞分离液(Gibco公司);荧光标记山羊抗兔LgG(Abcam公司);Trizol(Invitrogen公司);BCA 试剂盒(碧云天公司)。倒置荧光相差显微镜(Olympus公司);FACSca流式细胞仪(Becton Dickinson公司);垂直电泳仪(GE公司);半干转膜仪、硝酸纤维素膜(BioRad公司);ECL发光剂(GE公司);柯达活体成像仪cymentre2000(Kodak 公司);无菌DAPI 储存液 (Sigma公司);动物小型呼吸机(浙江动物实验仪器厂)。
1.3 MSCs的分离和培养[6-8]
密度梯度离心贴壁培养法:引颈处死SD大鼠，75%乙醇浸泡，无菌条件下取股骨和胫骨，在无菌皿中，用LDMEM反复冲洗骨髓腔;利用密度梯度离心法分离MSCs。含LDMEM，20% FBS，100 U/ml氨苄西林的培养液悬浮获取细胞，调整细胞浓度为2×106/ml后，25 cm培养瓶、37 ℃ 5%CO2细胞培养箱培养。3～4 d后首次换液，去除不贴壁细胞，以后每2～3天换液1次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及生长情况，待细胞长满至瓶底面积的80%～90%后，用0.25%胰蛋白酶常规消化，按1∶3比例传代培养。第2代的MSCs用来实验研究。
1.4 MSCs的特征性抗原的鉴定[8]
取第2代MSCs，细胞分离液消化，被测细胞浓度用含1%FBS的PBS缓冲液调节至1×106/ml，吸取50 μl标本，加入抗大鼠CD45FITC、CD90PE和CD29APC各10 μl，对照未加抗体;4 ℃暗环境孵育30 min。PBS洗2遍后加入0.5 ml PBS将细胞打匀，应用流式细胞仪检测MSCs表面抗原CD45、CD90和CD29的表达情况。
1.5 DAPI标记细胞
第2代的MSCs 80%～90%融合时，移植细胞当天将无菌的DAPI储存液加入培养的MSCs培养液中，至终浓度为50 mg/L，37 ℃孵育染色至少30 min。细胞至少用PBS平衡盐溶液冲洗6遍以除去未结合的DAPI。离心收集细胞，用无血清的DMEM悬浮，移植所需细胞数为3×106，置于冰上备用。
1.6 动物模型的建立及细胞的注射
通过结扎冠脉左前降支建立急性心肌梗死模型。将动物注射10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)麻醉后固定在手术台上，用笔型静脉置留针进行气管插管接呼吸机(呼吸频率85次/min;呼吸比1∶1;潮气量18 ml)，胸部剃毛、乙醇棉球消毒，在左胸3～4肋间逐层进胸，在左心耳与肺动脉圆锥下1～2 ml左右找血管，穿70号线，拉紧丝线，形成心肌缺血，观察线扎紧的部位上下范围的心肌有发白，手术完成关胸。梗死模型以组织病理学验证。心肌梗死1周后注射MSCs，使用30 G针头、1 ml注射器把用DAPI标记的细胞0.3 ml(3×106个细胞)分3点注射到心肌梗死区内，对照组使用等量未含细胞的DMEM。
1.7 心肌梗死的病理学检测
模型成功后将大鼠脱颈处死，打开胸腔，将心脏剪下，用生理盐水将心脏清洗干净并排出心脏内的淤血，分别用刀片将心脏切成1 mm厚的切片，放入0.1%的2，3，5氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，37 ℃水浴7～10 min，取出切片用生理盐水冲洗数次，观察结果。苏木精伊红(HE)染色按步骤进行。
1.8 组织免疫荧光化学检测
3周后处死动物，取出心脏，取梗死区组织进行冰冻切片(8 μm/张)，在荧光镜下观察到有DAPI标记的细胞存在，并进行相应部位免疫荧光染色检测肌节肌动蛋白和nesprin蛋白的表达。将冰冻切片放入4 ℃酮内固定10 min，晾干后，用0.01 mol/L，pH7.4的PBS冲洗切片3×3 min，再用0.1% Tritonx100处理15 min PBS漂洗切片，使切片保持一定湿度。0.03%过氧化氢/甲醇封闭内源性过氧化物酶20 min(25 ℃;1% BSA室温孵育30 min 后加入各种蛋白抗体4 ℃过夜;第2天，加荧光标记二抗，25 ℃孵育60 min;PBS漂洗3×5 min;取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。立即用荧光显微镜观察(实验过程避光操作)。观察标本的特异性荧光为阳性反应。对照组取相同部位梗死组织，操作均同，以供对照。
1.9 蛋白质印迹鉴定nesprin蛋白的表达情况
收集MSCs组和DMEM组心肌梗死区组织检测nesprin蛋白，提取蛋白， BCA 法测定蛋白质含量。参照分子克隆实验指南进行纯化蛋白的SDSPAGE。SDSPAGE电泳、转膜、封闭后加入1∶1 500稀释的抗neprin多抗(用TBST稀释)，4 ℃反应过夜。加入羊抗兔IgGHRP (TBST稀释 1∶5 000)，室温作用2 h，TBST漂洗，加入ECL显色液，置于柯达活体成像仪中观察结果，条件设置为曝光5 min，CCD自动获取图片结果。相应蛋白表达值为条带的灰度值除以β肌动蛋白(1∶1 000， 43 ku)内参照校正。
1.10 统计方法
使用Image Programer软件对图片进行分析，利用GraphPad Prism 5 Demo和SAS v6.12软件进行相关统计学分析，所得数据用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，实验进行3次。
2 结 果
2.1 MSCs培养和细胞的特性鉴定
培养24 h后约80%左右贴壁，贴壁细胞中见少许逗点状或短棒状细胞。3天后，贴壁细胞呈短梭形、多角形，细胞呈扁平多角不规则形态。7～10 天左右细胞间排列渐紧密、呈均匀一致的长梭形，并有克隆集落形成、渐融合，贴满瓶底，原代培养结束。流式细胞仪分析MSCs表面抗原CD29和CD90阳性，CD45阴性(图1)。
2.2 DAPI标记细胞效果情况
DAPI标记的细胞1 h染色效果较强，3周后效果明显减弱，可能是出现荧光衰减(图2)。
2.3 TTC和HE染色结果
TTC染色示非梗死区因脱氢酶还原TTC而呈红色，梗死区因脱氢酶流失而呈白色;HE染色示心肌梗死区心壁明显较正常心壁变薄(图3)。
2.4 免疫荧光检测结果
DAPI标记3周后在荧光显微镜下仍可见，移植3周的MSCs荧光染色表现出肌节肌动蛋白和肌钙蛋白阳性结果，移植心肌梗死区MSCs检测到有nesprin蛋白的阳性表达，对照组未见明显的相应表达(图4)。
2.5 蛋白质印迹鉴定nesprin蛋白的表达
结果显示，MSCs组nesprin蛋白表达量高于DMEM组，差异有统计学意义(P
3 讨 论
MSCs可以使用Ficoll密度梯度分离法和贴壁培养法得到有效的分离和扩增，MSCs可以在体外扩增和诱导最终分化成软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、神经细胞、肌细胞和心肌细胞等。MSCs具有较好的可塑性和活力，我们课题组前期研究表明骨髓单个核细胞移植可以提高心肌缺血模型的心功能，但单个核细胞至少包含了造血干细胞、间充质干细胞和内皮组细胞等;曾用Brdu标记MSCs移植到心肌缺血模型，3周后检测到MSCs表达MHCs、肌钙蛋白等心肌特异性收缩蛋白和缝隙连接蛋白43，同时产生连接效应，与相关学者报告一致[4，5]。在本实验中我们再次进行DAPI标记的MSCs移植，DAPI对细胞无明显毒性作用。实验3周后在荧光镜下仍能看到DAPI标记的MSCs。使用荧光免疫学和蛋白质印迹技术检测到3周后移植到体内缺血区的MSCs表达肌钙蛋白和肌节肌动蛋白。进一步说明了MSCs在体内有分化为心肌样细胞的能力，但什么原因引起MSCs分化和MSCs分化的机制并不明确，为此我们对MSCs分化前后的另一蛋白——nesprin蛋白进行了检测和对比，以提出此蛋白可能在MSCs分化中起到一定的作用。
细胞分化中基因表达的调节控制是一个十分复杂的过程，在蛋白质合成的各个水平，从mRNA的转录、加工到翻译，都会有调控的机制。在DNA水平也存在调控机制(如基因的丢失、放大、移位重组、修饰以及染色质结构的变化等)。相关研究发现:在细胞有丝分裂间期nesprin1和2与核膜附近异染色质存在表位连接[1，2]。nesprin1直接与伊默菌素结合，但由于蛋白核膜位点结合区的退化而不能和自整合障碍因子(barriertoautointegration factor，BAF)相结合，BAF蛋白质与dsDNA的连接牵涉到染色质的重塑和转录过程[9]。体外共沉淀实验证明nesprin1和2蛋白的钙调蛋白同源区域和肌动蛋白连接，在细胞迁移过程中调整组织细胞骨架肌动蛋白起到了作用[2， 3]。在骨骼肌肌节内，不同的nesprin1和2存在Z带、A/I接头、肌质网和线粒体膜上，肌节蛋白如钙离子通道受体(ryanodine受体)和mAKAP与nesprins相结合[10]，有关研究表明nesprin1α为肌细胞A激酶定位蛋白(muscle Akinase anchoring protein，mAKAP)在心肌细胞核膜上的受体，而由mAKAP及相关成分组成的复合体在心肌细胞内具有传导cAMP和钙离子信号的作用[10]。研究证实了在肌肉形成过程中，有nesprin蛋白各亚型量的增加或者减少，说明nesprin蛋白在肌细胞中起到了关键的调节作用;nesprin1基因突变导致了人和小鼠心脏疾病的发生，说明nesprin蛋白的缺失将引起细胞的异常增殖、异常分化和个体器官的异常发育[11]。
本实验中利用蛋白质印迹检测到nesprin蛋白在移植MSCs心梗组织的表达量高于未移植MSCs的心梗组织。有关研究提示nesprin是肌细胞分化过程中复杂结构的重排和重组所必需，这在肌肉兴奋/收缩过程中，对保证肌细胞内细胞器正确的空间定位以确保钙信号正常传递非常重要。体外实验:C2C12肌细胞分化成肌管，nesprins从细胞核及核膜转移到细胞质和肌节，表明nesprins在肌肉的分化中起到特殊的作用。但其如何引起细胞的分化还不清楚。本实验发现nesprins在MSCs移植后出现表达的增加，可能在分化中起到了作用。肌节肌动蛋白是横纹肌肌动蛋白，仅存在于骨骼肌和心肌，是肌细胞舒缩活动的物质基础。肌钙蛋白是心肌细胞中的调节蛋白，由钙离子参与调节、控制收缩蛋白的舒缩活动。正因为多种蛋白都与钙离子的参与和调节相关、且对细胞骨架的维持和信号传递相关，以后的研究考虑是否能够以钙离子作为切入点寻找一条信号通道对MSCs分化成心肌细胞的机制进行相关研究。
(本文图2～图4见彩色插图)
参考文献
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一百岁感言范文2
《项脊轩志》中有语：“庭有枇杷树，吾妻死时所手植之，如今已亭亭如盖矣。”苏轼曾言：“十年生死两茫茫，不思量，自难忘。”同是悼念亡妻，一个亲手栽树以表思念之绵长，一个眼泪成诗以示思念之深切。无须痛哭，无须多言，让这思念在心中生根发芽，他年瓜瓞绵绵，亭亭如盖。这是人对生命中挚亲的真情。
杨绛先生曾在《一百岁感言》中说：“到最后才发现，人生中最曼妙的风景，竟是内心的淡定和从容。”杨绛与钱锺书相知相惜，相依相伴，身居斗室，几乎婉拒一切媒体的采访，只醉心于书稿的编撰和整理，才能著作等身。卡夫卡生命短暂，从事文学创作的时间并不算长，却有《变形记》《城堡》等佳作流传后世，这也源于简单的生活使他全心投入文学创作。而他在遗嘱中要求友人烧掉他所有不尽完善的书稿，也是他对作品、对读者负责任的体现。
纳博科夫在《洛丽塔》中借亨伯特之口说道：“当日的如花妖女，如今只剩枯枝还乡……但我爱她，她可以褪色，可以萎谢，怎样都可以，但我只看她一眼，万般柔情，涌上心头。”即使这种感情有悖伦理，受千夫所指，但我更愿意肯定亨伯特所付出的真心。除去华丽的辞藻，抛掉浮夸的举动，愿我们所付出的感情因为真挚而被人接纳。
杨绛说：“我只是一滴清水，不是肥皂水，不能吹泡泡。”的确，生命应如一泓清水，于简单淡然中散发光彩。当今社会，一片喧嚣，机遇与陷阱并行，简约与浮华并存。我们不能心高气傲，不能企图一步登天，要保持内心的简单安宁，脚踏实地，全情投入所做的事情中。
海子云：“目击众神死亡的草原上野花一片，远在远方的风比远方更远。”愿真情于简单中闪耀，与你我比肩行向远方。
教师点评
一百岁感言范文3
尊敬的各位领导、各位老师、同学们：
下午好！很荣幸能代表2014届全体高三老师在这里与大家交流。今天是距离高考310天的日子，直面高三，高考已不再遥远，不论你意识到还是没意识到，不论你在学习状态还是没在学习状态，高考都在悄悄地逼近你。很多同学可能今天心中还是模糊的，会默默地问：高三是什么？高三我怎样过？
高三将促成人生中一次真正意义上的成长，无论是身体，还是思想。高三乃是大苦与大乐的最佳结合，惟有大苦，方能大乐。高三将带来一种彻悟，"何物动人，六月凤凰八月桂；有谁催我，三更灯火五更鸡"。高三，并不只是背书，做题，成打的试卷，成堆的草稿纸，弄清高三内涵的全部，把轨道切入高三，是每个即将开始高三生活的同学刻不容缓的问题。进入高三，适应高三，从心理到行动，完成角色上的转换，是今天要谈的主题。
一、高三，首先是一种精神，一种状态。什么是高三精神，请允许我用五个特别给大家描述：“特别能吃苦，特别能忍耐，特别有信心，特别有志气，特别有作为"。很难想像，一个没有理想，没有志气的人，会有所作为；一个没有强大动力作支撑的人，能谈得上吃苦，而且还是特别；一个没有坚韧意志品质的人，能在"人生极处是精神"的拚杀中达到成功的彼岸，体会到苦中之乐的人生真味。因此，以咬定青山之志，鼓足信念的风帆，以饱满的精神，以激昂的斗志，以强烈的投入拚杀的渴望，以刻不容缓，只争朝夕的锐气，跑步进入高三，是学校对同学们的殷切期望。
二、高三，是意志的顽强和内心的淡定。进入高三，免不了许多的考试，免不了许多的挫折与失败。当成绩不如别人而想到前景叵测，当苦拚过一段后考试成绩依旧，当看到父母脸上的担忧与关注，许多人都会感到焦虑，浮躁，对自己的信心与能力产生怀疑，甚至选择放弃，自己扳倒自己。平庸与伟大往往只是在一念之间，而这一念往往要有顽强的意志。同学们，你不能样样顺利，但你可以事事尽力；你不能回避挫折，但你可以东山再起，从头再来；你不能预知明天，但你可以利用今天；你不能决定生命的长度，但可以控制它的宽度。最近看钱钟书夫人杨绛先生的《一百岁感言》，很欣赏那一句“一个人经过不同程度的锻炼，就获得不同程度的修养、不同程度的效益。好比香料，捣得愈碎，磨得愈细，香得愈浓烈。”此外，我还欣赏另外一句话：“人生最曼妙的风景，竟是内心的淡定与从容……”，可能你们会说，这是何等的修为啊，可能要等100岁才能领悟。但我认为不是的，高三一年承载的东西太多了，但它却如此的短暂，倘若我们样样焦虑，事事担心，我们又怎能严谨、细心去落实我们每一天的计划呢！所以我们在激情满怀的同时也要保持内心的淡定与从容。
三、高三意味着科学与高效。高考需要每位同学有理性的头脑，有科学高效的学习谋略。只有科学的，才能是高效的；只有是理性的，才能是准确的。我们的手头有许多成功者的经验，但模仿一个成功者的全部，未必会成为另一个成功者。借鉴别人的经验，规划好自己的高三，体现自己的个性特征，体现科学与高效，才是好的学习策略。规划高三，也许很容易，关键在于不论风清日淡，还是电闪雷鸣；不论是坎坎坷坷，还是一马平川，都能坚韧不拨，始终如一地执行它。坚持就是科学，坚持就是高效。
四、高三，是一种境界。有的同学可能会说，我已经规划好高三了，我知道现在最重要的事情就是学习，其他什么事我都不管了，为什么我的成绩还是不能提高。我想说你没有触摸到学习的精髓，你的成绩当然不能提高，因为学习还需要一种境界，一种厚德载物的境界。德，当然指品德，德行，修养，我想把它抽象出来，就是根基、行为、习惯，就像种树一样，无数人都一心往上长，从来不往下长，结果上面不断长，下面没有扎根，如水中浮萍，无根之草，如何枝繁叶茂呢！关于怎样扎根，下面给同学们四点意见供参考：
1、感恩的心。你要感谢生活和学习中的万事万物，身边的每一个人，如果你拥有感恩的心，就好比在水中放进了一小块明矾，它能沉淀所有的渣滓，沉淀很多的浮躁与不安，消融许多的不满与不幸。拥有感恩的心，你才能快乐地学习，幸福地生活。
2、宽广的胸怀。一个人只有心胸宽阔，才能容纳得了更多的知识。你可以现在审视自己，是否经常会生气，经常对身边的人、事、物感到不满意，如果这样就说明你的心胸狭隘，当然知识就不能够进入。
3、坚守本心。你内心的本真是什么？来象贤中学时你的梦想是什么？现在还记得吗？你坚守住了吗？到现在为此，你已经过了十一年的寒窗苦读，在高三的最后310天你能否保持努力，为内心的梦想全速前进呢？同学们，只要你能坚守住内心最原始的真实，你必将加速你梦想的实现。
4、严谨的生活态度。其实生活即学习，生活中散漫，丢三落四，衣冠不整，纪律问题不断，学习当然上不了层次，在上百年前弟子规对学习态度就有了很好的说明：房室清、墙壁净、几案洁、笔砚正、字不敬、心先病、列典籍、有定处、读看毕、还原处。注重生活中的细节，养成良好生活习惯，是你的学习能取得突破的基本条件。
同学们，如果你提升了厚德载物的境界，你必将厚积薄发。
