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单摆周期范文1
用单摆测定当地重力加速度是中学物理教学过程中的一个重要的学生实验，而测定周期对实验产生很大的误差，传统的方法是用人工计时、计数，多次测量（30～50次）取平均值的方法，这种方法虽然能消除偶然误差的影响，但计时起点和终点位置选择，以及人的反应时间，实验习惯，会对实验产生很大的影响.
本装置采用磁性传感器采集数据，能将振动时间和振动次数同步显示在两组数码管上，利用磁传感器，很好地解决同步难的问题，大大节省实验时间，提高了实验效率.本装置有声光提示功能，趣味性强，器材成本低，便于学生动手制作，是中学物理分组实验首选方案之一，值得推广.
2研究报告
2.1该项目的背景和改进的基本思路
测定单摆全振动的周期，传统的方法会产生很大误差，实验室中传感器只能看到实验结果，不能看到实验过程.用单片机来完成测定振动时间及振动次数一般不能做到同步显示数据，原因是单片机只能一步步执行程序，做到两件事同时同步很难，因为单片机每执行一步程序都要做判断，会费时间.本装置利用两块显示屏，一个单片机，一个计时器，很好地解决同步难的问题，且可以脱离电脑，直接通过面板来编程.
2.2研究方法
文献资料收集法、科学实验对比法.
2.3工作原理
通过单片机编程实现输入单摆全振动次数，测定总时间，实现声光同步，高精度测定单摆振动周期.
2.4创新思路
（1）本装置由于采用磁性传感器采集数据，计时准确，对计时起点选择无特殊要求，只要测几次即可，大大节省实验时间，提高了实验效率.且可以通过与磁性传感器串联的手动开关实现排除前几次不稳定的全振动，振动过程中随时打开手动开关，即可采集数据.
（2）本装置能将振动时间和振动次数同步显示在数码管上，直观鲜明，便于学生进行分组实验.
（3）本装置利用两块显示屏，一个单片机，一个计时器，一个磁性传感器，很好地解决同步难的问题.且可以脱离电脑，直接通过面板来实现C语言编程，用机器码来代替程序.
（4）本装置与同类产品相比，智能计数，同步显示，同步计时，且计时开始和结束都可通过面板编程来实现所需要的声音提示，优势更明显，趣味性强，制作成本低，便于学生制作，值得推广，是中学物理实验首选方案之一，具有较高的经济社会价值.
2.5单片机程序
地址机器码文字说明
0008 13 00按DA键开始执行程序
0309 13 03是否松开DA键了
0604 00数码管显示00
0808 12 08按下减1键没有
1109 12 11松开减1键来吗
1406 01数字加1
1600 00端口0号灯亮
1803 00 00 用音乐休止延时0.1秒
2101 00关闭0号灯
2303 27 02奏高音7，半拍
2608 12 26再次按下减1键了吗
2909 12 29松开减1键了吗
3206 01数字加1
3411 10 39是否感应了10次了，等于10次了跳转到39
地址去执行程序，不满10次转26地址继续
3710 26转向26地址执行
3908 12 39按下减1键了吗
4209 12 42松开减1键没有
4506 01 数字加1
4700 00端口0号灯亮
4903 00 04用音乐休止延时1秒
5201 00关闭0号灯
5403 27 02奏高音7
5708 12 57等待按下减1键
6009 12 60等待松开减1键
6310 00感应满11次了，转向00地址重新开始
2.6进一步完善的设想
用液晶显示屏同步显示单摆振动时间和振动次数.用电容、电感传感器或光电传感器读取全振动次数，比磁传感器效果更好，用磁传感器的缺点是单摆做阻尼振动，全振动次数会减少.
2.7制作方法
（1）安装铁架台、铁夹，细线和磁性摆球.
（2）制作小木盒，安装cd2051单片机、数码管、干簧管、电源开关、手动开关.
（3）为单片机输入用C语言编写代码程序.
（4）设定全振动次数，进行实验和调试.
2.8使用方法
（1） 单片机启动方法如下：先按一下复位键，按住D/A键（不要松手），再按+1键，使数码管显示带电的“10”，松开+1键（D/A键仍然按住）同时按一下W键后松手.
（2）断开手动开关，按一下+1键等待计数.
（3）让摆球偏离平衡位置放手，剔除前几次全振动，待稳定后接通手动开关开始计数.
（4）开始计数（第1次，有声音提示），设定次数到（例如：全振动5次，n取11），结束计数（第11次，有声音提示），读出记录的总时间t.
（5）由周期公式T=2tn-1计算单摆周期.
3数据分析
单摆周期范文2
一、由于重力加速度变化而引起的周期变化
【例1】单摆在半径为R1、质量为m1的地球表面的周期为T1，若通过宇宙飞船带到半径为R2的另一颗星球表面时，其周期为T2，试求两种情况下的周期之比.
解析：根据万有引力定律有= m′g，再根据单摆周期公式T =2π可得，=.
一般来说引起重力加速度变化的原因有：纬度的变化、高度的变化、场环境的变化，为此可将单摆运动知识与万有引力知识、天体运动知识结合起来求解.
二、由于摆球受到浮力而引起的周期变化
【例2】用一根长为l的细线悬挂一个密度为ρ的小球，并将其放在密度为ρ0（ρ0 < ρ）的液体中，不计液体对小球的运动阻力，试求小球在平衡位置附近做小幅振动的周期.
解析：将重力mg = ρgV和浮力F = ρ0gV（V为小球的体积）合成一个等效重力mg′，则有mg′= ρgV- ρ0gV，即g′= （1-）g.
由此可得小球的振动周期为T =2π=2π.
三、由于单摆处于非惯性系中而引起的周期变化
【例3】如图2所示，沿平直轨道以加速度a做匀速直线运动的车厢中，用一根长为l的细线悬挂一质量为m的小球，求小球在平衡位置附近做小幅振动的周期.
解析：小球在相对车厢静止时，根据物体受力平衡得到等效重力mg′为mg′=，即mg′=m，则g′=.
故此可得小球的振动周期为T=2π=2π.
【例4】如图3所示，将一单摆挂于小车上，将小车放于一辆倾角为θ的斜面上，当小车在斜面上加速下滑时，摆线与竖直方向的夹角也为θ.已知摆球直链状为m，摆长为l，重力加速度为g，求此单摆的周期及小车与斜面间的动摩擦因数.
解析：由图示可知小车运动过程中，摆线的拉力F = mgcosθ，则g′ = gcosθ，故T =2π.
再由受力分析可知，动摩擦因数μ = 0.
一般这些阶段的非惯性系系统指处于匀变速直线运动的力学装置，在此前提下就可用类比法快速求解此类问题.
四、由于单摆处于匀强电场中而引起周期的变化
【例5】将一带电摆球置于一水平向右的匀强电场中，如图4所示.摆球静止时与竖直方向之间的夹角为α，已知摆球质量为m，摆长为l，带电荷量为Q.现若将摆球拉离静止位置一个很小的角度释放，求其振动周期；若要使摆球摆到竖直方向时速度为零，应将摆球拉离竖直方向一个多大的角度？
解析：摆球静止在平衡位置时的拉力F=，则g′=，故此摆球的振动周期为T=2π=2π.
一般当单摆处于匀强电场中时，由于所受的电场力为恒力，与重力的合力仍为恒力，运用类比法求解简捷、快速.
五、单摆周期公式的拓展运用
【例6】有一摆钟在地面上走时准确，其标准周期T0 = 2s，现将其移到高山上，发现它一昼夜慢了1min，求此山的高度.已知地面重力加速度g0=9.8m/s2，地球半径R0=6400km.
解析：设摆钟在标准时间内的振动次数为N，则其在标准时间内指示的时间t=N・T，在标准时间内慢的时间就应为t=N・T，其中N=，T=T-T0.
再由=（），代入已知数据可解得h=4450m.
由上述解题过程可归纳出一个有用的结论：钟在标准时间里指示的时间与摆振动的次数成正比，跟钟摆的振动频率成正比.写成比例关系式为：=====.据此可根据题目的特点，达到快速、简捷求解的目的.
【例7】竖直放置的光滑圆弧形球面半径R较大，在弧面中心O正上方高h处放置一个小球A，当A自由下落的同时，另一个小球B从球面某处C（OC弧远小于半径R）由静止开始滚下，为时两球相碰，h应满足什么条件？
解析：根据题意，小球B在光滑圆弧面上滚动等效于单摆，摆长即为圆弧半径，周期T=2π，考虑到单摆运动的周期性，由相碰的条件有（2n-1）=，解得h=R（n= 1，2，3，…）.
一般类单摆模型的计算，主要是求解其等效摆长或等效重力加速度.
练习
1. 已知北京的重力加速度g1=9.812 m/s2，南京的重力加速度g2=9.795 m/s2，在北京准确的钟摆，如果放在南京，钟将走慢还是走快？一昼夜差多少？要使其走时准确，如何调整摆长？
单摆周期范文3
【摘要】 肾脏细胞增殖与凋亡异常在肾脏疾病中具有重要意义，其调控最终发生在细胞周期水平上，细胞周期抑制蛋白P27属于细胞周期负向调控蛋白，与多种肾小球疾病中细胞增殖和凋亡异常有关，可能影响肾脏疾病进展，对此深入研究可为肾脏疾病的防治提供新的启示。
【关键词】 细胞周期； 细胞周期调控蛋白；肾小球疾病；P27
【Abstract】 Evidence is accumulating that those directly responsible for the rate of progression of glomerular disease are specific positive（cyclins and cyclin-dependent kinase）and negative （cyclin-kinase inhibitors） cell cycle regulatory proteins.P27 diffects glomerular cell proliferation and apoptosis as a kind of negative cell cycle regulatory proteins and may highly relate to the progress of renal disease.Ultimately the goal is to find ever more appropriate therapeutic strategies to arrest or prevent progressive renal disease.
【Key words】 cell cycle; cell cycle regulatory proteins;glomerular disease;P27
肾小球硬化是多种原因引起肾小球损伤后出现的共同转归，是肾功能衰竭的主要病理基础。而导致肾小球硬化最主要的原因就是系膜细胞增生和细胞外基质增多。其中细胞外基质的增多与系膜细胞增生又密切相关［1］。因此，探讨肾小球系膜细胞增生的内部机制及如何对其进行调控，已成为肾脏病领域的一个研究热点。
近年研究表明，细胞增生的调节最终都发生在细胞周期水平上，而细胞周期又受细胞周期调控蛋白的调控，细胞周期调控蛋白按其功能分为细胞周期正控蛋白和负控（抑制）蛋白。正控蛋白促进细胞周期进程，负控蛋白抑制细胞增生［2,3］。
1 细胞周期的概念
细胞增殖周期通常简称细胞周期，是指细胞从上一次细胞分裂结束到本次分裂终了的过程或间隔时间。根据细胞周期不同时相的特点，可将细胞周期分为4个连续阶段，即G1期 （gap phases 1），S期 （synthesis phase）,G2期（gap phases 2）及M期（mitotic phase）。细胞周期具有单向性和阶段性，细胞可因某种原因在某时相停滞下来，待生长条件好转后，细胞可重新活跃起来过渡到下一时相［4,5］。
1.1 G1期 是指从上一次有丝分裂完成到本次DNA复制之前的过程，持续时间一般为6～12h。G1期细胞的主要任务是积累能量和原料，为DNA的复制做准备，故又称DNA合成前期。
1.2 S期 即DNA合成期，持续时间一般为6～8h。S期末DNA含量增加1倍，细胞由二倍体变为四倍体。S期DNA的复制极其准确，每一段DNA只复制一次，从而可保证分裂后子细胞的遗传物质平均分配。
1.3 G2期 是指从DNA复制完成到有丝分裂开始的时间区间，持续时间一般为3～4h，只有完成了所有DNA复制后，细胞才进入G2期。故G2期又称DNA合成后期或有丝分裂前期。
1.4 M期 即有丝分裂期，一般持续时间为1h。在M期，细胞一分为二，一次细胞周期即告结束。本质上看，有丝分裂就是把细胞内已经倍增的大分子平均分配到2个子细胞中去。
此外，G0期 （静止期）不包括在细胞周期内，细胞在适宜刺激下能被触发，从G0期进入G1期。G1期在一定条件下也可退入G0期。此外，在细胞周期中至少有两个检查点，分别在G1/S和G2/M期。细胞周期的进程可停滞或终止于该处［6］。
2 细胞周期调控蛋白
2.1 细胞周期正控蛋白
2.1.1 周期素家族 （cyclin） 是一组结构类似能结合并调节周期素依赖蛋白激酶（CDK）的蛋白质，统称为cyclin家族。目前知道的有8种成员，即cyclinA，cyclinB，C，D…H。每一种cyclin有若干亚型，如D型包括D1，D2，和D3。周期蛋白在细胞周期的不同时相程序性合成与释放。它们作为调节亚基，需与特定的CDK结合，才能形成具有活性的全酶而促进细胞周期的进程。
2.1.2 周期依赖蛋白激酶家族（cyclin dependent kinase,CDK） 目前发现7种成员,有不同程度的同源性，故称CDK家族，各成员命名为CDK1，2，3…7。CDK含有催化亚基，但需要cyclin提供调节亚基才有活性，所以通常以cyclin- CDK复合物形式出现［6］。其中CDK2活性于G1晚期开始升高，在S期和M期达高峰，CDK2对G1/S转换是必须的。CDK的上游尚有CDK活化激酶，CDK也能与CDK的抑制物（负控蛋白）结合，而抑制细胞周期。
2.2 细胞周期负控蛋白（CDI） 又称周期素依赖激酶抑制物（CDI）。这些负控蛋白可与cyclin相互作用结合CDK而抑制全酶活性，从而抑制细胞增生。根据结构和所抑制的cyclin-CDK复合物的不同，可分为INK4（Inhibitor of CDK4）家族和CIP/KIP家族。INK4家族包括P15，P16，P18，P19等，可特异抑制cyclin-CDK4/6的磷酸化激酶活化而抑制细胞增生。CIP/KIP家族包括P21，P27，P57等，可抑制已知的大多数cyclin-CDK复合物的激酶活性，对G1期的早期与晚期、S期等各期都有重要作用，且分布与功能在不同的细胞各异，是目前的主要研究对象。其中P27作为一种重要的细胞周期负控蛋白，在肾小球疾病中的表达受到广泛的重视［7］。
2.3 关于P27 1994年发现并克隆出P27基因。P27最初从用TGF-β或细胞接触生长抑制的水貂肺细胞中分离出来的，被认为是一种热稳定蛋白。P27与cyclin-CDK结合成复合物，对后者有无抑制作用主要取决于P27的量，即所谓以化学剂量方式起作用。G0期细胞P27水平较高，从G0期到S期逐渐降低，在经过一个临界值后失去对cyclin D CDK4或cyclin D CDK6的抑制作用［8］。P27 在G1期维持较高水平，主要由于下述情况引起的周期阻滞：TGF-β处理、接触抑制、血清去除、Lovastatin处理、CAMP处理等［8］。IL-2可诱导外周血T细胞P27水平降低。单独用CSF-1（集落刺激因子-1）刺激巨噬细胞可使P27水平下降，改用“CSF-1+CAMP”刺激，则P27不下降，P27主要受细胞外刺激诱导表达。P27与P21有协同作用。P27的作用特点：（1）非特异性，P27可抑制所有CDK的活性。（2）化学剂量依赖性。
3 P27与肾小球疾病
作为一种重要的细胞周期负控蛋白，在正常静止状态下，P27在三种肾小球固有细胞都有相当强的结构型表达，它在肾小球疾病的细胞周期调控中起重要作用［2］。
3.1 对肾小球系膜细胞的影响 肾小球系膜细胞（MC）的增生及相应的系膜扩张是肾脏疾病的常见病理现象。以前的研究多局限于细胞外刺激因子（如细胞因子等）对细胞增生的影响，而对细胞外刺激因子怎样通过细胞内信号传导影响细胞增生的机制研究较少。现已明确，细胞增生受细胞周期调控蛋白控制。很多研究表明，P27可抑制MC增殖［3］。
近来研究发现，体外培养的MC予促分裂原如血小板源生长因子（PDGF）、内皮素-1或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） 刺激后早期细胞周期素D和CDK4增加，随后CDK2与细胞周期素E，继而细胞周期素A数量及生物活性增加，而P27明显降低；予体外培养的MC转染针对P27的反义寡核苷酸可增强对PDGF、bFGF等的增殖反应；Terada等也证实舒降之 （lovastatin）通过提高P27蛋白水平可抑制系膜细胞增殖，使细胞周期停止于G1期，也可抑制细胞外基质如IV型胶原，层粘连蛋白和纤维连接蛋白的合成与积聚，并明显改善肾功能［9］。大鼠抗Thy1肾炎模型中P27与MC的增生程度呈负相关，早期P27明显下降，至MC增生最甚的第5天几乎不能测及，随后在MC停止增殖的恢复期P27水平回复到基础值，表明P27的下降可使细胞周期从G1期进展到S期，从而产生细胞增殖［10］；另外，有发现尽管Thy1肾炎大鼠及正常大鼠间肾小球P27水平差异有显著性，但两者P27mRNA水平差异无显著性，这同细胞上获得的结果相似，提示体内肾小球细胞可能是在转录后水平调节P27的表达，从而使Thy1肾炎肾小球P27水平降低［11,12］。在P27野生型（P27+/+）与P27基因敲除 （P27 -/-）小鼠试验中发现，正常生理状况下缺乏P27对肾脏DNA合成无影响，但在增生性肾小球肾炎模型中，P27-/-小鼠肾小球DNA合成及细胞增殖早，且在各时间点其程度皆明显甚于P27+/+小鼠；将前者作全身照射，并予正常P27+/+小鼠的骨髓移植后再行肾炎模型，证明上述结果与免疫反应的差异无关，肾小球内P27的水平调控着对损害的增生阈值及程度。在抗肾小球基膜抗体诱发的新月体肾炎模型中，与P27+/+相比，P27-/-小鼠的肾脏反应（包括细胞增生、新月体形成和基质蛋白合成积聚等）发生更早，程度更为剧烈，损害也更为严重［2］。在实验性肾小球肾炎模型中，P27-/-小鼠肾小球细胞凋亡较P27+/+的小鼠为著，而予P27-/-的小鼠再转染P27又可避免凋亡，提示P27有防止肾小球细胞凋亡的作用［3］。
3.2 P27对足细胞增殖与分化的影响 足细胞（肾小球脏层上皮细胞）是独特而高度分化的细胞，其对损害的反应不同于MC或内皮细胞，成熟足细胞通常已丧失增殖能力；在胚胎发育过程中肾小球发生的早期阶段未成熟足细胞具有增殖能力，但S状生肾囊泡形成后即退出增殖周期而成为终末分化的静止细胞，且维持此终末分化静止状态是成熟足细胞保持正常功能结构，履行生理功能特别是肾小球滤过屏障所必需［13］。动物实验提示在生肾过程中具有增殖能力的足细胞转型为静止细胞有赖于P27的表达上调，而维持成熟足细胞静止和终化状态可能与P27持续表达有关［2,3］。近年研究发现失去增殖能力的足细胞可能是许多类型肾小球硬化发生的基础。Wolf等［14］认为虽然随着年龄的增长，足细胞逐渐老化，但由于肾脏足细胞缺乏增生能力，导致足细胞不能相应的分裂增生，从而使足细胞功能受损，不能很好的覆盖肾小球基底膜，继而肾小球基底膜功能受到损害，导致肾脏硬化，因而推测P27可能是老年人肾脏功能逐渐丧失的重要因素。在实验性膜性肾病动物模型（被动性Heymann肾炎）中，予足细胞FxLA抗原的抗体可造成对足细胞补体依赖性损害，免疫染色显示足细胞内细胞周期素A和CDK2并无降低，甚有增高，但P27显著增高。免疫沉淀反应示P27与细胞周期素A- CDK2复合物的结合增加从而抑制DNA合成。由于足细胞缺乏修复损伤或丢失细胞的能力使肾小球基膜致肾小球壁层上皮细胞侵占基膜以及肾小球毛细血管粘连是足细胞损害后阶段性肾小球硬化进展的重要因素［3,13］。正常成人肾小球足细胞有相当高的P27结构性表达，但缺乏P21；人类大多数累及足细胞的肾脏疾病如微小病变，膜性肾病等皆缺乏足细胞增生，也未证实有相关的细胞周期素与CDK上调及（或） CDI明显降低。但在特发性塌陷性肾病和人类免疫缺陷病毒相关肾病以及细胞性局灶节段性肾小球硬化的足细胞可检及细胞周期素A表达增加及P27明显降低甚或不能检及，伴P21的重新表达，并出现足细胞增生，常有肾功能急剧减退，提示P27等CDI对足细胞病变的结局有决定性影响［2,15］；最近研究显示这些增生的肾小球脏层上皮细胞失去正常成熟足细胞的多种标记（如WT1,podocalyxin、synaptopodin、GLEPP-1等）,出现表型调节异常和不再分化,可能是重要的病理基础［13］。
4 展望
总之，细胞周期抑制蛋白P27与肾小球细胞增殖有关，深入研究P27在肾小球疾病中的作用，有助于增加对肾脏疾病发病机制的认识。P27表达的调控可能影响肾脏疾病的进展，为肾脏疾病的防治提供新的途径。
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单摆周期范文4
关键词 糖肾Ⅰ号 周期蛋白 糖尿病肾病 中医药疗法 实验研究
糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的并发症，也是引起终末期肾病(ESRD)的主要原因之一。如何有效地控制糖尿病肾病的发病率及其进展已成为当今医学界一个关键课题。DN确切发病机制至今仍未完全阐明，治疗亦缺乏有效办法。因此，积极寻找防治DN的有效药物，在DN尚处于早期阶段就给予针对性的防治，对控制和延缓肾脏病的进一步发展具有重要意义。糖肾Ⅰ号是笔者针对DN之气阴两虚、脾肾亏虚、燥热血瘀的复杂病机，结合自己临床多年治疗DN的经验而拟定。近年来我们通过观察糖肾Ⅰ号对早期糖尿病肾病大鼠的生化指标及PCNA表达的影响，探讨其可能的作用机理，以期为临床防治DN提供实验依据。
1 实验材料
1.1 实验动物：SD雄性清洁级大鼠50只，体重(200士20)g，由温州医学院实验动物中心提供。
1.2 实验用药：糖肾Ⅰ号由怀山药、粉葛根、黄芪、芡实、莲须、白术、肉苁蓉、猫人参、山慈姑、漏芦、菝葜、天龙、丹参、黄柏、牛膝等组成，经常规煎煮、过滤、水浴蒸发浓缩至每毫升含相当生药2g，由温州市中医院药剂科提供；洛汀新(盐酸贝那普利，10mg／片)，北京诺华制药有限公司生产，批号：X1036。
1.3 主要试剂：链脲佐菌素(STZ)，美国Sigma公司产品，购于北京博爱科贸有限责任公司，批号：0602010。
2 实验方法
2.1 造模方法：参考徐氏等方法，大鼠正常饮食并适应环境1周，经尿糖、尿蛋白定性检测为阴性后开始实验。随机抽取10只大鼠为假手术组，仅切开大鼠皮层、肌层，暴露肾脏，随后缝合。其余40只大鼠在麻醉下行左侧肾脏切除术，术后恢复2周。将STZ溶于0.2tool/L柠檬酸缓冲液(PH=4.5)中，避光条件下迅速配成浓度为2％的STZ溶液。动物禁食12h后，按照55mg／kg，STZ一次性腹腔注射；72h后，尾静脉取血测定空腹血糖。血糖≥16.7mmol/L，尿量>假手术组的50％作为DN大鼠模型成功标准。
2.2 分组及给药方法：模型成功后随机分为模型组(M)、糖肾I号组(TS)、洛汀新组(B)、糖肾Ⅰ号+洛汀新组(TS+B)、假手术组(SO)，每组10只。大鼠给药剂量按照人与动物体表面积法换算。大鼠药量／kg／d等于成人量／kg／d的6.25倍。糖肾Ⅰ号组：以相当于生药27.08g／kg／d液体量，每日灌胃1次；洛汀新组：以相当于干药18.75mg／kg／d粉末，溶于蒸馏水中，每日灌胃1次；糖洛合组：药物用量、用法同上述两组。假手术组及模型组：给予等量生理盐水。连续给药共8周。实验期间动物自由进食、饮水，不使用胰岛素及其他降糖药物。
2.3 观察指标及方法：具体分述于下。
2.3.1 尿微量白蛋白和β2一微球蛋白测定：代谢笼中收集24h尿液标本，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测。
2.3.2 肾重及肾脏肥大指数：麻醉后，无菌操作，取右肾，去掉被膜，滤纸吸干血迹后称重，并计算肾脏肥大指数(肾重／体重)。
2.3.3 肾功能：酶法及苦味酸法测定Scr、BUN。
2.3.4 免疫组织化学法检测PCNA：右侧肾脏，沿矢状正中线切开，取1/2肾脏中一小块皮质置人4％多聚甲醛固定液中，备行免疫组织化学法观察。方法：石蜡切片，常规脱蜡至水；0.1mol/L枸橼酸缓冲液高压锅抗原修复；3％H2O2室温封闭20min，蒸馏水冲洗；PBS洗，滴加封闭液，37℃，20min；滴加1：75稀释的小鼠抗大鼠单克隆PCNA抗体(武汉博士德生物工程有限公司生产)单抗4℃过夜；PBS洗，滴加非生物素标记的二抗，37℃，30min；PBS洗，DAB显色，苏木素复染，常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。PBS代替一抗作阴性对照。
2.4 统计学处理：数据以均数土标准差(z±s)表示，采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。多个样本均数的比较采用单因素方差分析(One-way ANO-VA)，两两比较采用最小显著差法(LSD)。检验水准设为α=0.05，P
3 实验结果
3.1 各组大鼠尿β2-MG和UAlb比较：详见表1。与假手术组比较，模型组尿β2-MG、UAIb均显著增加(P
3.2 各组大鼠右肾重、肾脏肥大指数比较：详见表2。与假手术组比较，模型组和各治疗组肾重、肾脏肥大指数均显著增高(P
3.3 各组大鼠BUN、Scr比较：详见表3。与假手术组比较，模型组和各治疗组Scr、BUN均显著增高(P
3.4 各组大鼠肾脏组织PCNA表达的情况：详见图1、表4。免疫组织化学法染色后，将所制切片在光学显微镜低倍镜下观察细胞核呈现明确的棕黄色颗粒状染色为阳性细胞，细胞核蓝染的细胞为苏木素复染的阴性细胞。在10×20倍高倍镜下，每张标本随机选择5个视野，然后取平均值。免疫组织化学法染色结果采取半定量评分：按染色区变化和染色强度分为0～4分，即O分为无染色或染色极弱；1分为局部弱染、染色区75％。PCNA阳性表达主要在细胞核(详见图1)，假手术组PCNA表达较少，模型组呈强阳性表达，大量细胞核呈棕褐色颗粒状，着色较深，各治疗组表达较少。与假手术组比较，模型组和各治疗组PCNA表达均具有显著性差异(P
4 讨论
糖尿病属于中医“消渴”范畴，糖尿病肾病属于“肾消”范畴，以脾肾亏虚、气阴两虚为病之本，痰瘀互结为病之标，肾络瘀阻贯穿始终。针对本病虚实并见、阴阳并损、本虚标实的病理特点，我们以养阴益气、活血化瘀、清热祛湿立法，组方糖肾Ⅰ号，通过初步临床观察获得较好疗效。糖肾Ⅰ号以怀山药养阴益气，粉葛根生津止渴，黄芪补气升阳，共为君药；猫人参、山慈姑、漏芦、菝葜清热化湿解毒，芡实、莲须固肾收敛，白术、肉苁蓉健脾补肾，共为臣药；天龙、丹参活血化瘀，黄柏清热燥湿为佐药，使补而不滞；牛膝补益肝肾、逐瘀利水、引药下行，为使之用。诸药同用，共奏益气养阴、活血通络、利水泄浊之功。
尿微量蛋白的出现是肾脏早期损伤的标志。其中尿白蛋白升高提示肾小球结构和功能的损害，β2一微球蛋白则是反映肾小管损害非常敏感的指标。本实验结果显示：模型组24小时β2-MG和UAlb定量均显著高于假手术组，提示本实验模型出现肾小球滤过膜结构和功能的改变。与模型组比较，糖肾Ⅰ号组UAlb定量显著降低，由此推断，糖肾Ⅰ号可能通过降低糖尿病肾病模型大鼠的尿蛋白排泄，改善肾脏高灌注、高滤过，从而减轻或延缓基底膜损伤，改善肾小球和肾小管功能。
单摆周期范文5
【摘要】 目的: 研究SPTATApoptin融合基因诱导人肝癌HepG2细胞凋亡和细胞周期阻滞， 探讨其用于肝癌治疗的可能性。方法: 通过DNA重组技术， 以pcDNA3.1/Apoptin质粒11为模板， 构建SPTATApoptin融合基因 plenti6V5DTOPO真核表达载体。用SPTATApoptinplenti6V5DTOPO真核表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）， 转染后Blasticidin霉素进行筛选， 并进行鉴定得到稳定表达SPTATApoptin的CHO细胞株。收集含有TATApoptin融合蛋白的筛选细胞培养上清， 用于HepG2细胞培养。于共培养后的不同时段收集HepG2细胞， 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡和细胞周期。结果: 用包含SPTATApoptin融合基因的plenti6V5DTOPO真核表达载体瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）， 成功筛选出稳定表达SPTATApoptin融合蛋白的CHO细胞， 收集细胞培养上清， 继续用于HepG2细胞培养， 可观察到HepG2细胞阻滞于G1期并引起细胞凋亡。结论: SPTATApoptin融合表达可引起HepG2细胞的细胞周期G1期阻滞。
【关键词】 信号肽; 蛋白转导域; 鸡贫血病毒; Apoptin蛋白; 肝癌
二十世纪九十年代早期， 人们发现由鸡贫血病毒(Chicken anemia virus， CAV)来源的一种小蛋白VP3（Apoptin）能够诱导人转化细胞和肿瘤细胞凋亡， 但对正常的人二倍体细胞无凋亡诱导作用［1］。 Apoptin的肿瘤细胞特异性可能与其在细胞中的亚细胞定位有关， 在转化或肿瘤细胞中Apoptin定位于细胞核， 而在正常细胞中定位于细胞质。Apoptin诱导的细胞凋亡不依赖p53， 且不为Bcl2、 BclxL的过表达所抑制。Apoptin此种特性向我们展示了其在肿瘤治疗领域诱人前景［2］。但是使用传统的转染方法转染并表达活性肽， 因受到转导效率和表达细胞的自杀死亡的限制， 难达到有效治疗实体瘤的目的。HIVTAT是近年来发现的一种新型的高效运输载体蛋白质转导结构 （protein transductIon domains， PTDs） 或称细胞穿膜肽（cell penetrating peptides， CPP）。HIVTAT能穿透细胞膜、 细胞核膜， 携带肽、 蛋白质和 DNA 分子等进入胞质和胞核发挥生物效应， 具有高效性、 无须耗能或通过受体转运的特点， 为提高靶细胞在体内外的基因转移效率和蛋白质表达提供了一个高效、 简便的方法［3］。目前的体内及体外试验显示HIVTAT可以穿过包括神经元细胞在内的所有组织细胞， 且未观察到明显毒副作用［4］。我们构建了带有分泌信号肽、 蛋白转导结构域的融合基因SPTATApoptin从而实现转染细胞转染后的分泌表达TATApoptin融合蛋白的表达方式， 可使融合蛋白进入未转染的肿瘤细胞。希望通过以上设计来实现对肝癌等实体瘤安全有效的特异性治疗。1 材料和方法
1.1 材料 大肠杆菌DH5α、 TOPO10B菌种为西北大学生命科学院分子微生物实验室保存; 质粒pLenti6/V5DirectionalTOPO和大肠杆菌Shot Stbl3TM购买于美国Invitrogen公司; 质粒pcDNA3.1(+)/Apoptin［5］为中国军事医学科学院放射医学学研究所孙志贤研究员惠赠。HepG2肝癌细胞系、 CHO(中国仓鼠卵巢细胞)购买于中国科学院上海细胞库。细胞培养于含有10 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培养基中。LipofectamineTM2000脂质体和AntiV5FITC单克隆抗体（mAb）购买于美国Invitrogen公司。
1.2 方法
1.2.1 SPTATApoptin融合基因真核表达载体的构建 登陆GenBank拷贝鸡贫血病毒， CAV（NC_001427）序列。应用Invitrogen公司生物软件（Vector NTI Advance 9）， 选取Apoptin基因序列（bp 486～852）; 根据文献选取分泌信号肽（signal peptide， SP）序列［6］和TAT的氨基酸序列和核苷酸序列［7］。根据以上序列设计PCR引物: primer1: 5′GTGTGGGCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAATGAACGCTCTG
CAGGAAGATACTCC3′; primer2: 5′CTGCAGTCTTATACGCCTTTTTGCGG3′; primer3: 5′CACCATGTGGTGGCGCCTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG3′。 以pCDNA3.1/VP3为模版加入引物1和引物2， pfu DNA合成酶PCR扩增得平末端的含部分信号肽基因序列和TATVP3融合基因(命名为产物1); 以产物1为模版及引物2和引物3， pfu DNA聚链酶PCR扩增得平末端的SPTATVP3重链基因(命名为产物2)。合成的SPTATApoptin融合基因DNA重组双链定向插入plenti6V5DTOPO载体， 转化感受态细胞后扩增提取质粒进行酶切和测序鉴定， 具体试验步骤见文献［8］。
1.2.2 稳定表达SPTATApoptin融合基因的CHO细胞的筛选 在6孔板内按1×105细胞/孔接种CHO细胞， 筛选从转染后48 h开始， CHO细胞均以8 mg/L Blasticidin霉素的选择培养基继续培养， 约20 d至1月时出现多个Blasticidin霉素抗性的单克隆， 用消毒后的枪头挑取单克隆细胞入24孔板， 扩大培养， 获得稳定表达SPTATApoptin融合基因的单克隆细胞， 作为稳定转染细胞鉴定用。
1.2.3 RTPCR对稳定表达SPTATApoptin融合基因的CHO细胞的鉴定 分别离心收集筛选出稳定表达SPTATApoptin融合基因的单克隆CHO细胞或未转染的CHO细胞， 采用TRIzol RNA分离试剂提取生长状态良好的细胞总RNA， 紫外分光光度计测定总RNA浓度。取5 μg总RNA， 加入1 μL的0.5 g/L oligo(dT)， 按照SuperScriptRT逆转录试剂盒产品说明书操作合成cDNA第一链。将反转录的cDNA-20℃冻存， 以备进行PCR反应。使用引物2和引物3检测融合基因的表达， 使用内参引物（GS 5′caacggatttggtcgtattggg3′; GAS 5′cctggaagatggtgatgggatt3′， 210 bp）进行小鼠GADPH的PCR扩增。PCR条件为: 94℃变性30 s， 50℃退火30 s， 72℃延伸40 s， 共进行30个循环。10 g/L琼脂糖凝胶电泳， 照相。
1.2.4 Western blot对稳定表达SPTATApoptin融合基因的CHO细胞的鉴定 分别离心收集筛选出稳定表达SPTATApoptin融合基因的单克隆CHO细胞或未转染的CHO细胞， 用冰上预冷的PBS洗3遍， 用细胞裂解处理细胞收集蛋白， 加入适量蛋白上样缓冲液， 沸水煮5 min， 12 000 r/min离心10 min， 取20 μL 蛋白样品进行SDSPAGE凝胶电泳并将电泳结果进行PVDF转膜， 用一抗即AntiV5FITC mAb(Invitrogen公司， 货号: 554243)， 用PBST按1∶1 000稀释， 膜置于一抗稀释液中室温缓慢摇动1 h。将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体用PBST按1∶200稀释， 膜在二抗中室温缓慢摇1 h。进行Western blot分析， 具体操作步骤见试剂盒的说明书。
1.2.5 共培养 收集1×106生长状态良好的HepG2细胞接种于6孔板中， 培养24 h待细胞贴壁后用PBS洗2遍， 加入2 mL稳定表达SPTATApoptin融合基因的CHO细胞培养上清继续培养， 并于共培养后的不同时间收集HepG2细胞进行后续检测。
1.2.6 FCM分析共培养后的HepG2细胞周期分析 于共培养后的24 h、 48 h、 72 h和96 h收集每孔中的HepG2细胞， PBS洗2遍， 800～1 000 r/min离心5 min， 弃上清， 加入1 mL生理盐水制成单细胞悬液。加入预冷的无水乙醇2 mL快速混匀， 固定细胞。弃固定液， PBS洗2遍， 1 000 r/min离心5 min， 加入1 mL DNA荧光染料PI， 4℃避光染色15 min， FCM分析。
2 结果
2.1 SPTATApoptin融合基因真核表达载体的鉴定 设计并合成的SPTATApoptin融合基因DNA双链定向插入plenti6V5DTOPO载体， 转化感受态细胞后扩增提取质粒， 经限制性内切酶EcoR I和Sal I对提取的质粒做双酶切鉴定和测序， 载体构建作用。
2.2 Blasticidin霉素筛选浓度确定和筛选稳定表达SPTATApoptin融合基因的单克隆细胞 为了获得SPTATApoptin融合基因表达的单克隆细胞株， 本研究需筛选针对CHO细胞的Blasticidin霉素筛选浓度: 经不同浓度的Blasticidin霉素筛选后， CHO细胞在含100 mL/L FBS、 8 mg/L Blasticidin霉素的DMEM培养液中， 到第8天能杀死所有细胞。因此， 选8 mg/L Blasticidin霉素分别为转染后CHO细胞的筛选浓度。提取筛选出的细胞总RNA， RTPCR扩增， 表明筛选细胞可有效的转录SPTATApoptin融合基因的mRNA。对筛选的CHO细胞裂解液所进行的Western blot检测结果显示表明筛选细胞可有效的表达SPTATApoptin融合蛋白（图1）。
2.3 共培养后的HepG2细胞可观察到细胞周期G1期阻滞 共培养后24、 48、 72、 96 h分别进行细胞周期检测发现， 转染SPTATApoptin融合基因表达载体至CHO细胞后的培养上清与HepG2细胞共培养， 可有效引起细胞凋亡、 细胞周期阻滞于G0/G1期(图2）。
3 讨论
Apoptin以其对肿瘤细胞的选择性诱导、 毒性低等特点， 已经受到了广泛的关注， 成为新型的抗肿瘤候选药物之一。一系列的研究均显示了以Apoptin蛋白为基础的肿瘤特异性治疗的诱人前景［9］。通过将Apoptin基因与其他对肿瘤有治疗作用的基因相连接， 构建融合基因， 而获得对肿瘤有更显著作用的融合蛋白， 也是Apoptin应用研究的一大热点。Guelen等［10］构建了一种新的融合蛋白TATApoptin， 这是一种将TAT跨膜功能域与Apoptin相连接的融合蛋白。将该融合蛋白与细胞共培养30 min后， 其细胞内化高达98%; 24 h后， TATApoptin融合蛋白能诱导大部分的肿瘤细胞凋亡， 而对正常细胞无杀伤活性性。
使用传统的转染方法转染并表达活性肽， 因受到转导效率和表达细胞的自杀死亡的限制， 难达到有效治疗实体瘤的目的。采用基因工程， 将编码目的蛋白的基因序列融合到编码信号肽的DNA中可实现外源蛋白的分泌表达， 可以防止宿主细胞对表达产物的降解， 还可以使目的蛋白分泌出胞， 杀伤比邻的未转染的肿瘤细胞， 扩大治疗效应。我们构建了带有分泌信号肽， 蛋白转导结构域的融合基因SPTATApoptin从而实现转染细胞转染后的分泌表达TATApoptin和TATGFP融合蛋白的表达方式， 可使融合蛋白可以进入未转染的肿瘤细胞。我们在前期的实验中证明， SPTATApoptin融合基因转染后可有效的诱导HepG2细胞的凋亡［8］。
在本实验中， 我们用连有SPTATApoptin融合基因的plenti6V5DTOPO真核表达载体转染CHO细胞， 并用8 mg/L Blasticidin霉素对转染后的CHO细胞进行筛选。其后， 用RTPCR和Western blot对筛选后的CHO细胞从转录和翻译水平进行鉴定， 证明筛选的CHO细胞可有效的表达SPTATApoptin融合蛋白。收集筛选的CHO细胞的培养上清， 继续用于接种于12孔板的HepG2细胞培养。并于共培养后的不同时间进行细胞周期的检测。共培养后24、 48、 72、 96 h分别进行细胞周期检测发现， 转染SPTATApoptin融合基因表达载体至CHO细胞后的培养上清与HepG2细胞共培养， 可有效引起细胞凋亡， 细胞周期阻滞于G0/G1期。与何等［11］报道的Apoptin可引起肿瘤细胞G2/M期阻滞有一定的差异。这可能与实验方法的不同有关， 因为何等在实验中采用腺病毒方式进行转染， 而腺病毒可引起细胞G2/M期阻滞。至于TATApoptin将细胞周期阻滞于哪一期， 其具体机制如何还有待于实验的进一步验证。
总之， SPTATApoptin融合表达可引起HepG2细胞的细胞周期G1期阻滞， 并引起细胞凋亡， 有望发展成为肝癌的等实体瘤的基因治疗策略。
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单摆周期范文6
【关键词】 受精 体外 注射 细胞质内 胚胎移植
Abstract: Objective: To analyze the clinical outcomes of ICSI in patients with previous fertilization failure or low fertilization rate after conventional IVF. Methods: From Oct. 2001 to May. 2007， 38 ICSI cases with previous total fertilization failure after conventional IVF were allocated to group A. 17 ICSI cases with previous low fertilization rate after conventional IVF were allocated to group B. And 281 ICSI cycles for male factor infertility in the same period were allocated to group C as control group. The fertilization rate，high quality embryo rate，implantation rate and clinical pregnancy rate of three groups were retrospectively analyzed. Results: There were no significant differences in fertilization rate，high quality embryo rate and clinical pregnancy rate among three groups，but implantation rate of group A (14.3%) was significantly lower than that of group B and C（29.5% and 26.0%）. Conclusion: For patients who have previous low fertilization rate after conventional IVF，ICSI is a good choice to improve clinical outcomes. But for patients who have previous total fertilization failure after conventional IVF，the implantation rate of ICSI embryos is lower than that of the others. It suggests fertilization failure be due at least partly to occyte abnormity，which results in the descent of embryo development potential.
Key words: fertilization，in vitro；sperm injection，intracytoplasmic；embryo transfer
约5%～10%的常规体外受精（conventional in vitro fertilization，IVF）治疗周期出现完全受精失败和低受精[1]，其原因常常难以明确。尽管随后周期采用单卵胞浆内注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）常可避免受精失败，但进一步的临床结果仍有争议。本中心自2001年10月至2007年5月共对30例IVF完全不受精和12例IVF低受精不育夫妇分别在随后周期采取38个周期和17个周期的ICSI治疗，现将结果报告如下。
1 资料和方法
1.1 研究对象 2001年10月至2007年5月，30例IVF完全不受精和12例IVF低受精（受精率低于25%）不育夫妇分别在随后周期采取38个周期（A组）和17个周期（B组）ICSI治疗，两组的男方正常（WHO分析标准）。将同期因男性因素采用行第1周期ICSI治疗的连续281个周期作为对照（C组），男性因素的标准为密度
1.2 方法
1.2.1 促排卵方案、卵泡监测、阴道B超取卵、处理、IVF受精和ICSI的操作及胚胎培养观察的过程均按本中心常规方法进行[2，3]。
1.2.2 优质胚胎评估：取卵后第2～第3天根据卵裂球大小、形态、碎片进行评分。其中A级：卵裂球大小均匀或轻度不均，无核碎片≤5%；B级：卵裂球大小均匀或轻度不均，无核碎片≤20%。将培养2 d细胞数≥3个的和培养3 d细胞数≥6个的A、B级胚胎定义为优质胚胎[4]。
1.2.3 胚胎移植和妊娠试验：取卵后第2或第3天，选择质量最好的胚胎，每周期移植≤3个胚胎。所有患者取卵日起给予黄体支持，胚胎移植2周后检查血清人绒毛膜促性腺激素（hCG）含量，5周后B超检查确认有无胎心。
1.3 统计学处理方法 采用SPSS11.0统计软件进行分析，多组均数间的比较采用方差分析，率的比较采用x2检验。
2 结果
三组的注射hCG日E2、子宫内膜厚度差异无显著性。A、B组的女方年龄、不孕年限及基础FSH值均高于C组（均P
ICSI治疗结果见表2。三组正常受精率、优质胚胎率和临床妊娠率差异均无显著性，A组的胚胎种植率明显低于B和C组(P均＜0.05)。
3 讨论
人类受精过程包括顶体完整的与透明带结合、透明带上糖蛋白诱导顶体反应、穿透透明带并溶解卵膜、卵子激活和原核形成等过程。上述过程中任何一个步骤的异常都可能导致受精失败。研究表明，常规IVF受精失败55%是由于穿透失败和穿透异常造成，而卵母细胞激活失败占15.1%，原核形成障碍占19.2%[5]。
Liu等[6]曾报道，卵子受精失败与-透明带结合和透明带诱导的顶体反应异常有关，并认为透明带不能诱导正常的顶体反应是低受精的一个主要原因。本研究中，IVF低受精率患者在随后周期行ICSI治疗的受精率、临床妊娠率和胚胎种植率与因男性因素行ICSI治疗者相似，这提示其低受精的原因可能只是精卵结合障碍，而ICSI治疗可以直接跨越精卵结合障碍，避免了受精失败，从而改善了治疗结果，对于低受精患者来说是一个很好的选择。
本研究资料显示，尽管完全受精失败组患者在随后周期行ICSI的受精率、卵裂率、优质胚胎率与对照组和低受精组差异均无显著性，但其种植率显著降低。这与Tomas等[7]和Borini等[8]的报道一致，他们发现有受精失败史的病例进行ICSI时的妊娠率与种植率均低于男性因素不育病例。Borini等[8]发现，尽管IVF受精失败患者下一周期行ICSI的妊娠率明显低于男性因素组，但采用供者的卵子行ICSI，其妊娠率可达到与男性因素患者相似的结果。同时我们还发现IVF完全受精失败的患者多为原发不孕，女性年龄、不孕年限、基础FSH值均大于对照组，在随后周期行ICSI治疗中获卵数及卵子成熟率较低，这些可能会对卵子质量产生一定的影响。还有一些研究认为，IVF未受精的卵母细胞中有1/3的染色体有异常[9]，另外卵母细胞胞浆不成熟[10]及卵母细胞中线粒体某些基因组表达缺陷[11]等因素也可导致IVF受精失败，它们均有可能影响胚胎发育潜能，使其不能正常妊娠。因此我们认为完全受精失败至少部分是由于卵子异常所致，而卵子异常又导致胚胎发育潜能的下降。
总之，我们的研究表明IVF低受精组在随后周期改行ICSI可获得理想的临床治疗效果。完全受精失败组有可能因卵子的某些缺陷危及胚胎的进一步发育及种植，从而影响ICSI的治疗效果。
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