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三查三比对照检查材料范文1
【关键词】皮质发育不良；卡莫司汀；新皮质；海马；双向电泳；质谱；差异蛋白表达；癫痫
Comparative proteomics of rat brain in the BCNU-induced model of cortical dysplasia GUO Yi， ZHANG Man-man， DING Yao， YANG Yi， JIANG Yan， HU Jian-wen， DING Mei-ping. Department of Neurology， Second Affiliated Hospital， School of Medicine， Zhejiang University， Hangzhou 310009，China
Corresponding author： DING Mei-ping， Email：
【Abstract】ObjectiveTo screen the differential proteins in the brain （neocortex and hippocampus） between the rats with cortical dysplasia （CD） and control ones， and investigate the role of their alteration in the development of epilepsy in CD. MethodsCortical dysplasia was induced in rat pups via in utero delivery of BCNU. A two-dimensional electrophoresis （2-DE）-based approach was used to construct the expression profiles of proteins in both the neocortex and hippocampus at different age groups （postnatal day 7 and 60） and to detect proteome changes between CD rats and control ones. Following gel image analysis， protein spots that differed in abundance between CD and control rats were identified by using Matrx-assisted laser desorption/ionization （MALDI） mass spectrometry （MS） and MS/MS. ResultsA total of 57 kinds of protein were screened out（P
【Key words】Cortical dysplasia； BCNU； Neocortex； Hippocampus； 2-DE； Mass spectrometry； Comparative Proteomics； Epilepsy
皮质发育不良（Cortical dysplasia，CD）是难治性癫痫的重要病因之一，但CD的致痫机制仍有待进一步阐释。比较蛋白质组学技术是一种新型的高通量差异蛋白筛查技术，正在逐步运用到神经病学研究的各个领域。我们采用卡莫司汀诱导的CD大鼠模型，运用双向电泳技术对比分析CD大鼠和正常大鼠皮质及海马组织在不同发育时期（新生期和成年期）的蛋白质表达谱，筛选出差异表达的蛋白质斑点并应用MALDI-TOF-MS技术平台进行鉴定，以期进一步探讨皮质发育不良癫痫易感性的发生机制并发现新的治疗靶点。
1材料与方法
1.1动物模型的建立与实验分组
健康怀孕Sprague-Dawley大鼠5只由浙江中医药大学实验动物中心提供，孕17 d（Embryonic day 17， E17），体质量270～320 g。于E17随机选取3只孕鼠腹腔内注射卡莫司汀（天津金耀制药厂），给药剂量为15 mg/kg，E22仔鼠出生，所产雄性仔鼠存活11只归入模型组；余下2只孕鼠在同一天腹腔内注射同等剂量生理盐水，所产雄性仔鼠存活16只入对照组。仔鼠出生当天记作P0，到P21与母鼠分开饲养。P7随机（随机数字法）选取模型组和对照组仔鼠各3只，行病理切片对照检查验证制模成功。
1.2蛋白质样品的制备与双向凝胶电泳
在P7和P60分别随机（随机数字法）选取模型鼠和对照鼠各3只，留取前额部分新皮质并分离海马组织[1]，所得标本液氮中速冻后-80 ℃保存。
取大约300 mg样本，PBS清洗后切碎成1 mm3见方的小块，转移至匀浆器中，加入2D裂解液（9.5 mol/L 尿素，65 mmol/L DTT， 4% CHAPS， 0.2% IPG 缓冲液，按1∶50加入蛋白酶抑制剂约1 mL，均来自美国sigma公司），匀浆20次，全过程在冰上完成。将匀浆液转入离心管中，超声破碎细胞（80 W，5次，每次10s，间隔15 s，冰上完成）。12 000 g离心45 min，取上清液蛋白定量后-80 ℃低温保存。
双向电泳：上样100 μg，IEF为pH 3～10 非线性胶条（瑞典Amersham公司），电泳在Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System和Hofer SE 600（美国GE Amersham公司）中进行（电泳条件：30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 8 h，500 V 4 h），SDS-PAGE为12.5%的胶，先15 mA/胶 30 m，然后换30 mA/胶至溴酚蓝离胶下沿0.5 cm）。每个样品常规进行3次双向电泳，银染后经UMax Powerlook 2110 XL（美国GE Amersham公司）扫描，获得图谱。采用ImageMaster 2D软件对图像进行背景消减、蛋白质点检测和校正，获取蛋白质点的位置坐标和表达量等分析。
1.3质谱扫描与数据库搜索
选取并切下差异点（表达量比>1.8），做胶内酶解，每个胶粒切碎后放入离心管中，每管加入30～50 μL 30 mmol/L K3Fe（CN）6 ：100 mmol/L Na2S2O3=1∶1（体积比）脱色，冻干后，加入5μL 2.5～10.0 ng/μL测序级Trypsin （Promega）溶液，37 ℃反应过夜，20 h左右；吸出酶解液，转移至新管中，原管加入100 lL 60% ACN /0.1% TFA， 超声15 min，合并前次溶液，冻干；若有盐，则用Ziptip（美国Millipore公司）进行脱盐。
样品与5 mg/mL HCCA基质1：1混合后，用4800 串联飞行时间质谱仪（美国Applied Biosystems公司）进行质谱分析，激光源为355 nm 波长的Nd：YAG 激光器，加速电压为2 kV，采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据，PMF 质量扫描范围为800～4 000 U，选择信噪比大于50的母离子进行二级质谱（MS/MS）分析，每个样品点上选择8个母离子，二级MS/MS激光 激发2 500次，碰撞能量2 kV，CID关闭。
质谱结果查NCBI，IPI和EST库。
2结果
2.1病理验证结果
CD组仔鼠P7、P14大脑切片尼氏染色后镜下观察见：皮质变薄，皮层紊乱；海马区神经元排列稀疏，可见神经元异位成团状聚集，见图1、2。
A：P7正常鼠皮层；B：P7模型鼠皮层
图1P7皮质切片焦油紫尼氏染色图（×50）
Fig 1Nissl staining in cortical tissue sections on P7 （×50）
A、B：正常鼠P14海马；C～F：P14模型鼠海马
图2P14海马区脑组织切片尼氏染色图（×200）
Fig 2Nissl staining in hippocampus sections on P14 （×200）2.2差异蛋白组学研究结果
各实验组组织双向电泳重复3次，组内匹配率均高于85%。在模型组和对照组之间共筛选出57个差异表达蛋白质斑点（P
图3P7 d皮质双向电泳图图4P7 d海马双向电泳图
Fig 32-DE graph for proteinsFig 42-DE graph for proteins
from neocortex at P7 dfrom hippocampus at P7 d
3讨论
深入探讨CD癫痫易感性的发生机制并发现新的药物靶点是难治性癫痫治疗的重要课题之一，本研究首次将差异蛋白组学的研究方法应用于该领域。海马同多种类型癫痫发作密切相关，是癫痫研究的热点。本研究选取皮质、海马两个位点，分别于新生期和成年期对差异蛋白进行筛选，样本组织具有一定的代表性和多元性，能更全面地获取相关目的蛋白。限于篇幅，本文仅对已有相关证据表明同癫痫相关的蛋白进行讨论。这些蛋白质参与细胞骨架构成、突触形成、线粒体功能活动和磷酸化作用等多种生理过程。
细胞骨架是一种高度动态的结构，在构成细胞脚手架、维持细胞形态、维持可塑性、胞内运输和信号传导等方面起重要作用。脑部细胞骨架的破坏将导致多种神经病理变化，如神经元死亡、突触小体丢失等，可见于唐氏综合症、阿尔茨海默病等神经退行性疾病。细胞骨架主要由三类细胞质结构蛋白构成：微管蛋白、肌动蛋白和中间丝蛋白。我们鉴定出的蛋白涵括了这三类蛋白。
微管蛋白（表1中微管蛋白alpha-1B， 微管蛋白beta-2A）在真核细胞染色体分离、细胞形态和大小、轴突运输、细胞器分布和神经元极性等方面起至关重要的作用；肌动蛋白（表1中Beta-肌动蛋白）支架则参与控制细胞形状、膜蛋白分布、入胞转运机制等[2]。
胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein， GFAP）属于中间丝蛋白，具有多种异构体。GAFP-delta与其他异构体在C-末端的结构存在差异，形成独特的41氨基酸序列。对人类组织GAFP-delta表达模式的研究发现该型异构体特异分布于软膜下层、海马颗粒下层和脑室室管膜下层等区域[3]。GAFP-delta蛋白的表达会影响神经丝的稳定和细胞的能动性。目前认为，GFAP-delta的表达改变可出现于多种与癫痫相关的病理改变中。动物实验结果显示GFAP在海马和皮质的表达谱随着癫痫发生发展的时程而改变[4-5]。对CD所致的人类癫痫患者脑组织的研究发现，气球样细胞中出现GAFP-delta蛋白的表达改变，类似的改变还见于海马硬化患者胶质增生区域[6]。
这些蛋白的差异表达意味着神经细胞传导通路中结构和功能的变化，提示它们在海马和皮质功能中具有广泛而重要的作用，可能参与信息存储及长期可塑性等病理变化并最终促进癫痫的发生发展。
GAP-43是一种磷蛋白，在未成熟神经元细胞中高表达。一般而言，当轴突生长延伸到达目的部位，突触生长完成后，GAP-43表达迅速降低。该蛋白是轴突末梢生长的调节因子，也是突触新生的调控因子[7-8]。由于突触联系的重塑活动持续存在，在成熟大脑的特定区域如嗅球海马等部位，GAP-43表达仍然维持在一定的高水平[9]。 GAP-43表达上调和兴奋性突触环路重组在多种脑损伤模型中也可出现，包括脑撞击、液体冲击脑损伤和兴奋性毒素注射等[10]。
GAP-43 mRNA和蛋白在岛叶电点燃致痫大鼠海马中表达增高，且表达变化与海马突触重建时程基本一致。在锂-匹鲁卡品诱导的癫痫大鼠海马中也发现GAP-43mRNA表达上调[11]。Bolognani等学者的研究进一步发现GAP-43mRNA在突触重塑过程中的表达变化接受RNA结合蛋白HuD的调控[12]。对海马严重硬化的人类癫痫患者的研究发现，齿状回颗粒层的GAP-43水平上调。诸多证据表明突触可塑性的改变可能是维持颞叶癫痫的病理基础，且与认知功能损害密切相关[13]。而本实验表明CD的海马组织中GAP-43蛋白表达谱发生改变，该变化可能与CD的癫痫原性相关。该发现与Yamanouchi等学者对CD痫源性病灶的研究结果一致，他们的研究发现CD特征病理之一的异常形态神经元中GAP-43表达增高，提示可能存在突触重塑活动的进一步激活[14]。
3.3广泛型线粒体肌酸激酶（ubiquitous mitochondrial creatine kinase，UbCKmit）
脑是高耗能器官，其中很大一部分ATP用以维持正常分子转运、信号传导、树突刺重塑和神经递质回收等活动。此外，除极化过程或癫痫发作时钙泵和钠钾泵的活动也需要消耗ATP[15]。脑型肌酸激酶（Brain-type creatine kinase，CK-B）和UbCKmit是局部磷酸肌酸-ATP循环的重要催化酶，参与维持神经元细胞和神经胶质细胞高能磷酸分子的区域稳定。线粒体功能异常可导致能量供应不足、离子稳态改变等，甚至引起细胞死亡[16]。
相关研究显示CNS线粒体功能异常与癫痫发作相关，海马线粒体功能异常可致TLE动物模型癫痫发作时程延长。Streijger等学者基于UbCKmit基因敲除鼠的研究提示UbCKmit介导的高能磷酸转移过程在听觉反应突触信号传导和海马依赖性学习环路中起一定作用[17]。其后他们又对CK基因双敲除（CK-B和UbCKmit-/-）的大鼠进行PTZ诱导，该型大鼠癫痫敏感性显著下调并且可记录到明显的癫痫相关脑电波，这些改变可能和海马区神经元钙离子清除速率增高可能和有关[18]。
总之，该蛋白的表达改变将导致线粒体功能异常，并进一步引起神经细胞丢失和海马损伤。然而，该蛋白在CD致痫过程中的作用仍有待进一步研究。
GAPDH是GABAAR αⅠ亚单位内源性磷酸化的激酶，维系着GABAAR的正常功能。本研究中成年CD大鼠皮质组织中GAPDH含量较对照组显著降低，提示CD组织中GAPDH激酶系统可能存在缺陷。对难治性癫痫患者致痫灶的研究也显示，这些区域皮质神经组织内磷酸化作用削弱，GABAAR功能下调，并可能进一步易化癫痫的产生和/或发作[19]。生酮饮食对小儿癫痫的疗效甚佳，其对代谢的影响之一是增高细胞质基质和线粒体的NADH/NAD+的比值。对急性分离锥体细胞进行的全细胞膜片钳记录显示NADH比NAD+更能加强GAPDH激酶活性和GABAAR功能，因而，Pumain等学者认为促进GAPDH对GABAAR的磷酸化功能是生酮饮食抗癫痫的机制之一[20]。
TMBr-3是脑型原肌球蛋白的一种异构体，分布于各脑区，但具体功能不详。推测TMBr可能通过与肌动蛋白细胞骨架的互动在神经系统发育和可塑性中起特异性作用，但各异构体在脑组织中表达的区域性和时间上均不尽相同[21]。TMBr-3只出现在神经元细胞中，分布于突触前末梢，其表达水平随着成熟过程上升。这些证据表明TMBr-3在维持神经元网络和突触功能方面具有一定的作用[22]。本研究成年CD大鼠TMBr-3蛋白表达下调，可能提示病变累及组织发育迟缓、成熟度下降，在某些特征模式上趋向于不成熟化，与CD相关研究结果吻合。而这种不成熟状态可能削弱了神经元网络的稳定性，增加对癫痫的易感性。
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（收稿日期：2013-04-04）
DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.12.013
基金项目： 浙江省自然科学基金（Y2080475）；国家自然科学基金（81000556、81171227）
作者单位：310009杭州， 浙江大学医学院附属第二医院神经内科（郭谊、张曼曼、丁瑶、杨怡、蒋艳、丁美萍）；中科新生命生物科技有限公司（呼建文）