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七夕表达爱范文1
【摘要】
目的：探讨细胞周期素D1在甲状腺癌中的表达及临床意义。方法：收集武汉大学人民医院及武汉大学中南医院存档甲状腺癌蜡块40例，另取5例瘤旁组织为对照组。将甲状腺癌及瘤旁组织做免疫组织化学染色，观察各组细胞内细胞周期素D1表达的变化，利用HPIAS-2000图像分析系统测定细胞周期素D1在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：癌旁组织中无棕黄色颗粒，细胞周期素D1呈阴性表达；甲状腺癌组织内可见密集分布的棕黄色颗粒，细胞周期素D1表达呈强阳性。图像分析结果显示，癌旁组织和甲状腺癌组织中的平均光密度分别为0.0841±0.0045、0.2748±0.0256，癌旁组织和甲状腺癌组织中阳性面积率分别为0.1142±0.0113；0.3759±0.0153。癌旁组织和甲状腺癌组织中之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P
【关键词】 细胞周期素D1 甲状腺癌 免疫组化
甲状腺是人体重要的内分泌腺，它在机体新陈代谢方面具有重要地位，是内分泌系统中发病率最高的器官。甲状腺癌是常见的内分泌系统恶性肿瘤之一，约占全身恶性肿瘤的1.5%。与一般恶性肿瘤好发于老年人不同，甲状腺癌多发于青壮年，平均年龄约40岁，统计显示近年来甲状腺癌的发病率呈增高趋势［1～3］。分化型甲状腺癌占所有甲状腺癌的90% ， 包括状甲状腺癌(PTC)和滤泡状甲状腺癌( FTC)。甲状腺未分化癌较为少见， 但恶性程度高、预后差。近来研究发现，细胞周期调节失控是肿瘤发生的重要原因， cyclinD1是一种重要的细胞周期调节因子。真核细胞的增生及分化调节大部分发生于细胞周期的G0/G1期和G1/S期的转变期。cyclinD1在细胞周期关键限速点G1至S期转换中，通过激活CDK4或CDK6使后者催化一系列关键底物而导致转录因子释放，促进DNA合成而发挥加速细胞增殖的正性调节作用。本实验采用免疫组织化学方法检测了癌旁组织和甲状腺癌组织中细胞周期素D1的表达， 旨在探讨细胞周期素D1在甲状腺癌组织中所发挥的作用及机制，为进一步预防和治疗甲状腺癌提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料来源及分组
收集武汉大学人民医院及武汉大学中南医院存档甲状腺癌蜡块40例。男12例， 女28例，年龄23～68 岁。状癌23例， 滤泡状癌14例， 未分化癌3例。按UICC 国际分期标准， I期12 例， II期15例， III期6例， IV 期7例。甲状腺癌组患者术前均未做放、化疗。另取5例瘤旁组织为对照组。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂 浓缩型鼠抗人细胞周期素D1单克隆抗体 (北京中山生物技术有限公司) ；超敏即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒(北京中山生物技术有限公司) ；显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。
1.2.2 主要仪器 YWY781型医用微波仪（250W，50 Hz），浙江临安电子器材厂生产；家用高压锅。
1.2.3 常规HE染色 4%多聚甲醛固定、包埋、石蜡切片、HE染色。
1.2.4 免疫组织化学S-P法检测细胞周期素D1相关抗原
主要步骤：
① 组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；
② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；
③ 细胞周期素D1采用微波抗原修复（3档，10 min）， PBS洗4×5min；
④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应；
⑤ 一抗37℃孵育1h，PBS洗4×5min；
⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；
⑦ 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；
⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；
⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。
用PBS代替一抗作为阴性对照。
1.2.5 免疫组织化学结果判断
细胞周期素D1以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。
采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。
（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）
1.3 统计学处理
对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α为0.05。
2 结果
癌旁组织中无棕黄色颗粒，细胞周期素D1呈阴性表达；甲状腺癌组织内可见密集分布的棕黄色颗粒，细胞周期素D1表达呈强阳性。图像分析结果显示：癌旁组织和甲状腺癌组织中的平均光密度分别为0.0841±0.0045、0.2748±0.0256，癌旁组织和甲状腺癌组织中阳性面积率分别为0.1142±0.0113、0.3759±0.0153。癌旁组织和甲状腺癌组织中之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P
表1 癌旁组织与甲状腺癌组织内细胞周期素D1表达的平均光密度和阳性面积率（略）
注：* 癌旁组织与甲状腺癌比较，P＜0.05。
3 讨论
甲状腺癌仅占全身恶性肿瘤的1.5%左右，但却是最常见的内分泌系统恶性肿瘤。统计显示近年来甲状腺癌的发病率呈增高趋势。大多数甲状腺癌恶性低，预后良好。早期诊断和及时正确的治疗是提高生存率的关键。 根据起源细胞的不同，可将甲状腺癌分为滤泡上皮细胞癌(状癌、滤泡状癌及未分化癌)和滤泡旁细胞癌(即髓样癌)两大类。状癌和滤泡状癌临床上常见，预后较好，两者又合称分化型甲状腺癌(DTC)［4］。未分化癌临床最少见，恶性程度高，患者5年生存率最低。髓样癌可分为家族型和散发型两种，因肿瘤结节可分泌降钙素、5-轻色胺、前列腺素、肾素和血管活性肠肤等活性物质，临床上患者可出现腹泻、心悸、头晕等表现。随着分子生物学技术的不断进步，发现甲状腺癌的发生、演化与其它肿瘤类似，均与癌基因和抑癌基因有关［5］。cyclin D1基因定位于染色体11q13 ，长度约120 kb，基因跨距约15 kb ，含有5个外显子，编码295个氨基酸构成的蛋白质，分子量为34kD。在细胞周期进程中，其含量受到生长因子等因素的调控，呈周期性变化［6～8］。cyclin D1可发生多种形式的基因突变，目前未发现明显地域性和种族性差异。cyclin D1的异常一般在鳞癌和腺癌较为常见，主要表现为:cyclin D1基因扩增、染色体易位及cyclin D1基因多态性的发生等。随着对cyclin D1 研究的不断深入，研究者们发现cyclin D1 不但与肿瘤的发生发展相关，而且与肿瘤的转移、预后也密切相关［9，10］。我们采用免疫组织化学方法观察了癌旁组织与甲状腺癌组织内细胞周期素D1表达，结果显示癌旁组织和甲状腺癌组织中细胞周期素D1的表达差异有显著性意义(P
【参考文献】
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6 Umekita Y， Ohi Y， Sagara Y， et al . Overexpression of cyclin D1predicts for poor prognosis in estrogen receptor2negative breast cancer patients. Int J Cancer，2002，98 (3): 415～418.
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七夕表达爱范文2
[关键词] CEA mRNA；肺癌；肿瘤转移；中药
[中图分类号] R730.5[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）01（b）-011-02
Detecting the role Chinese herbs to the effect and machenism of lung cancer
ZHANG Jie-xia, MAO Xiao-ling, ZHENG Li-xia
（Oncology and Hematology of Guangzhou Medical College the First Affiliated Hospital，Guangzhou 510120，China）
[Abstract] Objective:To detect both the gene CEA mRNA and the remission rate of Chinese herbs in lung cancer. Methods: Both the experiment group and the control included 40 cases. CEA mRNA gene analysis was performed by semi-nested-polymerase chain reaction before and after treatment.The remission rate was observed.Results:The CEA mRNA positive rate 22.5%(9 cases) of the experimental group was lower than the control one's 45%(18 cases)(P＜0.05).The CR+PR+SD rate of the experimental group increased to 80.0%(P
[Key words]CEA mRNA; Lung cancer; Tumor metastasis; Chinese herb
癌细胞的微转移是肺癌术后复发的重要因素，及时发现微转移对肺癌复发和预后的判断有重要意义，对指导临床治疗也有特殊价值。目前，检测循环肺癌细胞的标记物中以CEA阳性率及表达率最高 ，在肺癌中55%表达。而且它具有较高的敏感性及特异性，所以CEA mRNA是十分适合检测循环肺癌细胞的标记物[1]。
因此，我们用聚合酶链反应（PCR）检测对照组和中药组肺癌患者CEA mRNA基因的情况。
1 材料和方法
1.1对象
2004年12月~ 2005年8月，我院确诊的肺癌患者80例，均为ⅢB和Ⅳ期，男56例，女24例，年龄34～73岁。随机分为两组，实验组：手术、化放疗加中药40例，化疗用GP和TP方案，6个疗程后胸部适形调强放疗，同时注射中药6个疗程；对照组：手术、化放疗但未注射中药40例。放疗以可见肿瘤为靶区，照射总量达60 Gy，缩小区野避开脊髓，对于有转移灶的Ⅳ期患者采用姑息放疗30 Gy，放疗要使胸腔积液消失或减少后开始。药物：抗癌中药注射液由纯中药制成，由斑蝥、七叶半枝莲、黄芪、人参、刺五加等为配方。
1.2方法
1.2.1 RNA抽提采用Trizol抽提法。Trizol试剂购自Invitrogen公司。取抗凝外周血20 ml，经白细胞分离液无菌分离后，然后经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量和提取量，置-80℃待用。
1.2.2 引物合成序列为，①逆转录引物。B：5' TGTAGCTGTTGCAAATGCTT TAAGGAAGAAGC 3'；②PCR引物。A：5' TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG 3'；B：5' TGTAGCTGTTGCAAATGCTT TAAGGAAGAAGC 3'；C：5' GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG 3'。PCR反应在两个体系中进行，第1轮引物为A+B，第2轮引物B+C，PCR产物长度为152 bp。③内参对照β-actin引物。正义引物5' CATTGTGATGGACTCCGGAGACGG 3’；反义引物5' CATCTCCTGCTCGAAGTCTAGAGC 3'。
1.2.3 逆转录反应1 μg的标本RNA和100 ng逆转录引物在70℃下变性5 min，然后加核酸酶抑制剂25 U (pramega)，4种核苷酸（dNTP）0.5 mmol/L，逆转录酶2 U，在42℃下反应60 min。
1.2.4 聚合酶链式反应第1轮PCR以逆转录产物2 μl，加引物A+B，dNTP 200 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 U，在DNA扩增仪上，94℃ 40 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，扩增35个循环。第2轮PCR以第1轮PCR产物2 μl，加引物B+C，其他条件相同，扩增30个循环，第30周期后72℃延伸10 min。每次扩增均设空白阴性及阳性对照。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，以分子量标准带鉴别PCR产物位置。
1.2.5观察有效率每2个疗程复查CT评价瘤体大小，按照WHO评价标准，治疗效果评价为：临床缓解（CR），部分缓解（PR），临床无变化（SD），临床进展（PD）。
1.3统计学处理
实验数据采用SPSS软件分析，统计方法为χ2检验和两个独立样本非参数检验，P
2 结果
2.1抗癌中药治疗前后CEA mRNA基因在各期肺癌的检出情况
对照组40例病人治疗前22例阳性，治疗后18例阳性；而实验组40例患者治疗前24例阳性，治疗后9例阳性(P
2.2抗癌中药治疗有效率
对照组临床有效率为72.5%，实验组为80%。抗癌中药联合手术、放化疗能提高临床有效率（P0.05），见表2。
3 讨论
肺癌为我国发病率较高的恶性肿瘤之一，但是发现时60%以上的患者已失去手术机会。近年来，含铂类的联合化疗能延长患者的生存期，肺癌的治疗多采用外科手术及应用化疗药物等方法。中医药是肺癌综合治疗的一个环节。中医认为本病属脏腑失调，正气虚弱，气滞血瘀，邪凝毒聚而成。针对本病正虚邪实的病机特点，我们用抗癌中药辅助手术、放化疗治疗呼吸系统肿瘤，全方具有补益肺肾、清热解毒、消瘀散结的功能。
用手术、化放疗联合中药注射液6个疗程后，外周血CEA mRNA从术前60%下降到术后22.5%，而对照组从55%下降到45%，对照组和实验组治疗前状态无显著性差异，治疗后实验组与对照组比较，CEA mRNA明显下降(P>0.05），两组治疗前分期和化放疗均按本院常规，无差异。接受中药联合治疗的患者缓解持续时间延长，缓解率达85.0%，而对照组72.5%。本组所以能达到阳性率下降，与本研究检测的是外周血有关，肿瘤细胞核酸释放到循环血而被检测到呈较低数量级，血中基因的含量转阴，可能原发部位还有病灶，只是并没释放入血或未被检测到而已。CEA mRNA在肿瘤细胞及某几种特定细胞中有高水平的表达，正常体细胞与非肿瘤炎性细胞几乎不表达 CEA mRNA。已知游离于细胞外的mRNA很不稳定，极易被Rnase降解，外周血检测到肿瘤特异或其相关基因的mRNA就提示血液中存在完整的能表达该mRNA的细胞。肺癌与其他肿瘤一样，血液播散是重要特征之一，严重影响治疗和预后[1]。
Guadagni等发现，各期肺癌患者，35％血清CEA阳性，而69％有CEA mRNA表达；更重要的是，Ⅲ和Ⅳ期患者只有20％血清CEA升高，而70％有CEA mRNA阳性，为什么CEA-CEA mRNA系统表达量呈不同步性，可能是肿瘤基因组调控紊乱，CEA mRNA转录系统过于活跃，导致CEA mRNA过量转录，而CEA合成系统未能被同步激活或失控的转录系统合成大量的无模板功能的CEA mRNA，出现CEA表达低于CEA mRNA表达的现象[2]。中药治疗组细胞亚群CD8下降明显、CD4/CD8比值、NK细胞及血清IgG、IgM含量上升明显[3]。大连医科大学研究肺癌患者血清血管内皮生长因子(serum VEGF，sVEGF)的影响， 显示该药具有抗肿瘤血管生成的机制。可见抗癌中药是肿瘤综合治疗的重要部分，该药有显著的抗疲劳功能，具有抗癌、升白、提高免疫功能及对化疗药物有增效减毒作用，能够缓解中晚期肺癌患者临床症状，提高患者细胞免疫功能，改善患者生存质量，延长生存期。对复发或一线化疗失败的ⅢB/Ⅳ期非小细胞肺癌患者的观察提示，该治疗方案在近期疗效、中位生存时间、1年生存率、疾病无进展时间均有所提高，而且毒副反应轻， 中药扶正不助邪，患者食欲增加，患者容易耐受，生存质量得到明显提高，使患者增加了对化疗的信心，有利于患者坚持治疗[4，5]。
微转移是一个独立的预后指标，分子学指标诊断检测肿瘤微转移对患者预后的判断优于肿瘤分级和分期，可对临床分期的精确、手术方式及清扫范围的确定、建立个体化辅助治疗方案起到重要作用，应用指标，对辅助诊断呼吸系统恶性肿瘤血行转移具有较高的实用价值。抗癌中药具有活血化瘀，散结止痛，清热解毒，扶正驱邪等功效，对肿瘤患者有缓解症状、缩小瘤体，抑制肿瘤生长，减轻痛苦，提高免疫力，延长生命的作用。
[参考文献]
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七夕表达爱范文3
【Abstract】 AIM: To investigate the expression and significance of selenoprotein P in colon carcinoma tissues. METHODS: Samples were derived from 30 cases of colon carcinoma，and 30 corresponding normal colon tissues were used as controls. The expression of selenoprotein P in colon carcinoma tissues were investigated by immuohistochemical stain. RESULTS: The expression rate of selenoprotein P in colon carcinoma(60.0%) was significantly lower than that of their control normal tissues（80.0%， P
【Keywords】 Neoplasms/pathology; proteins/analysis; selenium; immuohistochemistry
【摘要】目的： 研究结肠癌组织中硒蛋白P的表达及其意义. 方法： 选用手术切除结肠癌组织30例，同时另取30例正常结肠组织作为对照，用免疫组化的方法观察硒蛋白P在结肠癌组织中的表达. 结果： 硒蛋白P在结肠癌组织中的阳性表达率(60.0%)低于其在正常结肠组织中的表达率（80.0%），二者相差有统计学意义(P
【关键词】 肿瘤/病理学；蛋白质类/分析；硒；免疫组织化学
硒是哺乳动物必需的一种微量元素，缺硒会导致多种病理状态. 硒蛋白是微量元素硒发挥生物学功能的主要形式. 为了进一步探讨硒蛋白P在肿瘤中的作用，我们利用免疫组化技术观察该抗体在结肠癌中的表达.
1对象和方法
1.1对象结肠癌30例，为第四军医大学唐都医院普通外科200310/200505手术切除标本，男17例，女13例. 年龄45~79(平均61.4)岁；高分化10例，中分化5例，低分化15例；肿瘤TNM分期：I期8例，II期9例，III期13例. 另取30例原发器官正常结肠组织作为对照.
兔抗人硒蛋白P多克隆抗体，由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室先期制备保存. 免疫组化试剂盒购自北京中杉公司.
1.2方法① 将组织蜡块切片，常规脱腊：70℃烤片2 h，二甲苯10 min×2次. 水化： PBS洗3 min×2次. ② 30 mL/L H2O2溶液室温处理10 min，双蒸馏水洗3 min×3次. ③ 在0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）92~98℃水浴中处理25 min修复抗原，自然冷却到室温. 缓冲液洗3min×2次. ④ 分别用正常山羊血清和卵白素室温封闭2 h. ⑤ 滴加稀释的一抗SelP多克隆抗体（1∶50），37℃孵育4 h. PBS洗3 min ×3次. ⑥ 生物素结合的羊抗兔IgG二抗和ABC复合物室温分别孵育2 h. ⑦ 滴加DAB溶液显色，注意观察颜色变化，及时终止，冲洗. ⑧ 苏木素复染，梯度乙醇脱水，封片.
以免疫组化试剂盒中的阳性片作阳性对照，以0.01 mol/L PBS（pH 7.4）和正常羊血清分别替代一抗和二抗作为阴性对照. 阳性染色为棕黄色，定位于细胞胞质和细胞膜. 染色阳性细胞数量评分： 0分（全片未见着色或少于5%细胞散在着色），1分（5%~25%细胞着色），2分（25%~50%细胞呈阳性），3分（50%~75%细胞染色阳性），4分（>75%细胞染色阳性）. 染色强度评分：0分（阴性），1分（弱阳性），2分（中等阳性），3分（强阳性）. 染色阳性细胞数量评分与染色强度评分之积为最终染色评分标准：0分（阴性），0~4分（弱表达），4~8分（中等表达），8~12分（强表达）.
统计学处理: 采用SPSS10.0统计软件包，用非参数检验，两个独立样本Wilcoxon检验进行统计学分析. P
2结果
2.1硒蛋白P在肿瘤及正常对照组织中的表达免疫组化染色结果见表1.表1硒蛋白P在肿瘤及正常对照组织中的表达 阳性信号为棕褐色或棕黄色，呈弥漫状或片状分布. 硒蛋白P染色主要定位于细胞胞质及胞膜中，细胞外间质也有部分染色，而细胞核无染色.在结肠癌中硒蛋白P表达与分化程度有关，尤其是伴黏液分泌者中低表达明显；细胞富于黏液成分或杯状细胞无论是正常还是肿瘤中表达均为阴性.硒蛋白P在正常对照组织中的阳性率表达高于结肠癌中的表达（图1）.
2.2硒蛋白P在肿瘤中的表达与其分化程度及临床分期的关系见表2.
3讨论
目前硒蛋白P真正的生物学功能还不清楚，特别是与肿瘤发生的关系不甚明了. Burk等［1］认为硒蛋白P可能是自由基的清除剂. 硒蛋白P可能由于其抗氧化的保护性作用，通过消除自由基，减少DNA损伤，预防突变阻止肿瘤的发生［2-3］. 其他可能的机制是调节机体免疫系统，增强机体免疫系统的抗癌活力；拮抗肿瘤细胞内cGMP的增加，抑制DNA， RNA及蛋白质的合成；抑制肿瘤病变中新生血管生成［4-6］.
A: 结肠癌组织;
B: 正常结肠组织.
图1硒蛋白P的表达ABC ×200 表2硒蛋白P在结肠癌组织中的表达与临床病理学因素的关系现认为血浆中硒蛋白P水平和肿瘤的发生呈负相关，PerssonMoschos等［7］发现对应于硒蛋白P浓度的5个水平，从低到高，发生肿瘤的相对危险度分别为5.2， 2.3， 2.9， 2.2和1.0，硒蛋白P水平最低组发生呼吸道和消化道肿瘤的概率分别是硒蛋白P高水平组的6倍和3.4倍，表明随着硒蛋白P浓度增高，肿瘤发生的危险度降低.
Mork等［2］发现，结直肠腺瘤较邻近正常黏膜硒蛋白P mRNA表达下降，并认为在结直肠腺瘤硒蛋白P mRNA表达下调可能是腺瘤到腺癌发展过程中的一个早期事件，这种下调使硒蛋白P表达减少，导致DNA受到氧化损伤，从而发生基因突变，引起肿瘤的发生和促进肿瘤的发展，而且硒蛋白P和同属硒蛋白的胃肠谷胱甘肽过氧化物酶在抗氧化细胞抵抗腺瘤腺癌演变中起到互补作用. AlTaie等［3］证实在结直肠癌中其mRNA表达明显减少或缺失，表明在结肠癌中可能存在着硒蛋白P基因的突变和转录异常.
本结果提示，硒蛋白P表达在结肠癌与正常组织差异显著，表达与分化程度有关. 伴黏液分泌者中低表达，细胞富于黏液成分或杯状细胞无论是正常还是肿瘤中表达均为阴性. 或许提示正常肠黏膜杯状细胞分泌功能与硒蛋白P表达无关；同样，其在结肠癌中的表达与肿瘤分期无关. 在结肠癌硒蛋白P低表达，除了受硒营养状况（血浆中硒蛋白P浓度）的影响，可能存在着硒蛋白P基因的突变和转录异常［3］，失去这一保护性因素，可能导致了肿瘤的发生.
【参考文献】
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七夕表达爱范文4
【关键词】Ang-2；大肠癌；病理和临床特征
大肠癌是消化科的常见疾病，恶性程度相对较高，容易发生淋巴转移、血行转移、消化道种植等，研究发现约50%的大肠癌病人手术之前已经有没有检测出来的微小转移灶，这可能是引起大肠癌术后复发或者转移的主要原因。患者远处转移风险的预测对患者预后和综合治疗有重要价值[1]。Ang-2与肿瘤转移联系密切，在肿瘤血管形成中发挥重要作用。本次研究分析探讨Ang-2在大肠癌中表达及其与病理和临床特征的关系，报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料选择2011年1月至2013年1月我院治疗的大肠癌患43例，男23例，女20例，年龄平均（50.9±3.3）岁，其中18例直肠癌患者，12例乙状结肠癌患者，8例升结肠癌患者，4例降结肠癌，1例横结肠癌患者。43例患者术前均没有进行放疗或者化疗等治疗。选择距离癌组织大于5厘米的癌周正常组织患者19例，男11例，女8例，年龄平均（51.2±3.3）岁。选择良性病变患者21例，男12例，女9例，年龄（49.9±4.3）岁，其中7例大肠腺瘤，14例肠息肉。三组患者在年龄、性别等方面比较差异无统计学意义（P>0.05）。
1.2检测方法选择型号为KIT-9902的免疫组化试剂盒和型号为DAB-0031的显色试剂，兔抗人的Ang-2多克隆抗体。选择中性10%的福尔马林固定标本，用石蜡包埋后切成4um的切片。每一标本用5张片，HE染色1张，免疫组化方法染色4张。用统一标准判定染色结果，评分3次以上确定结果。在高倍镜下任意选择10个视野，分别对100个细胞进行半定量计数，并对染色强度和阳性细胞比率进行评分。阳性细胞中染色强度：0分：无色，1分：浅黄色，2分：棕黄色，3分：棕褐色；阳性细胞比率评分：4分：>75%，3分：51%-75%，2分：26%-50%，1分：≤25%，0分：阴性；阳性细胞比率和染色强度之和：（-）：0-1分，（±）：2-3分，（+）：4-5分，（++）：6-7分，（-）、（±）为阴性，（+）、（++）为阳性。
1.3统计学方法均采用SPSS17.0软件进行统计分析，两个样本率的比较用X2检验，两样本均数比较用t检验，P
2结果
Ang-2在大肠癌组织阳性表达率为77.67%，在良性病变的组织阳性表达率为31.00%，在癌旁的正常组织阳性表达率为28.63%，在大肠癌组织的表达率与其他两种组织比较，差异有统计学意义（P0.05），与癌组织淋巴转移、浸润深度相关（P
3讨论
在大肠癌的发展中血管生长是关键，是肿瘤转移和侵袭的主要方面，宿主或者肿瘤组织形成的新生血管给肿瘤提供营养，促进肿瘤生长、转移、侵袭。肿瘤血管为瘤体提供营养物质和氧气，是肿瘤转移得以实现的重要通道。肿瘤血管的形成与很多因素有关，比如生长因子、粘附分子、蛋白酶、细胞外基质等[2]。
近年来研究发现血管生成素是一种既含有受体抑制剂又含有受体激动剂的血管调节因子。Ang-2是家族中一个成员，属于分泌型的糖蛋白，在血管生成早期的启动、激发阶段起作用，对Ang-1起拮抗作用，破坏血管外细胞之间的作用，引起血管不稳定，使之容易接受血管生长因子刺激，共同作用引起肿瘤血管形成，肿瘤生长[3]。
通过本次研究表明，肿瘤组织和良性病变、癌周正常组织比较，Ang-2高表达，差异有统计学意义（P0.05），与癌组织淋巴转移、浸润深度相关（P
参考文献
[1]马志兰，刘新兰，魏建敏.Ang-2在大肠癌中的表达及其与病理和临床特征的关系[J].天津医药，2012，3（40）：281-282.
七夕表达爱范文5
【摘要】 目的 构建HPV18型E6E7反义荧光真核表达载体，并观察其对宫颈癌HeLa细胞中HPV18 E6和E7基因表达的影响，探索反义技术用于治疗临床HPV感染及宫颈癌的可能性。方法 以HPV18型全基因质粒为模板，PCR法扩增HPV18型E6E7区716bp片段，利用基因重组技术将目的片段反向插入荧光真核表达载体pEGFPC1，EcoR I酶切并测序鉴定；采用脂转法将重组质粒pEGFPHPV18E6E7as（EGFP18AS）转染宫颈癌HeLa细胞株，通过RTPCR及western blot检测细胞中E6、E7 mRNA和蛋白的表达。结果 成功构建HPV18 E6E7反义荧光真核表达载体EGFP18AS，经脂质体转染HeLa细胞，48h后在荧光倒置显微镜下可见明显的绿色荧光，且细胞中E6、E7 mRNA及蛋白表达水平均明显下调。结论 反义荧光真核表达载体可以有效的抑制HPV18 E6、E7癌基因的表达，为治疗HPV感染和宫颈癌提供了一种新的方法。
【关键词】 人瘤病毒18型；E6/E7；反义；EGFP；宫颈癌
宫颈癌是妇女常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内，其发病率仅次于乳腺癌，但在广大发展中国家其发病率居首位，约占女性恶性肿瘤总数的25%[1]。研究表明，99%的宫颈癌组织中可检出人瘤病毒(human papillomavirus，HPV)，尤其是16、18型等高危型HPV与宫颈癌发生关系密切。现已证实高危型HPV早期蛋白中的E6和E7为宫颈上皮恶性转化中的关键蛋白，因此针对E6、E7基因为靶点的治疗手段成为我们研究的重点。反义技术是近年来兴起的一种基因治疗技术，该技术可以高效、特异的阻断目的基因的表达。因此利用反义技术从基因水平封闭病毒癌基因E6、E7，有望成为宫颈癌基因治疗的有效途径[2]。本研究成功构建了可表达HPV18的E6、E7反义RAN的荧光真核表达载体，经脂质体转染宫颈癌HeLa细胞株，观测其对于HPV18 E6/E7 mRNA及蛋白表达的影响，为临床HPV感染及宫颈癌治疗探索新的方法。
1 材料与方法
1.1 载体、菌株和细胞株 含有HPV18标准全长基因的质粒由德国海德堡大学EthelMichele de Villiers教授惠赠。真核表达载体pEGFPC1购自Clontech公司。HeLa细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），大肠杆菌株DH5α由本室保存。
1.2 引物和测序 扩增HPV18E6E7基因片段的引物：P1 5' TAA TCG ATA TAA TCC AAC ACG GCG ACC C 3'，P2 5' GGG ATC GAT GGC TTT CTA CTA CTA GCT CAA T 3'。检测HPV18的E6基因的引物：P1 5' GGC GAC CCT ACA AGC TAC CTG A 3'，P2 5' TTC TCT GCG TCG TTG GAG TCG TTC 3'。检测HPV18的E7基因的引物：P1 5' AAG CGA CTC AGA GGA AGA 3'，P2 5' CAC AAA GGA CAG GGT GTT 3'。内参照βactin的引物：P1 5'AGC CAT GTA CGT TGC TAT CC3'，P2 5'TTG GCG TAC AGG TCT TTG C3'。内参照GAPDH的引物：P1 5'GGA GCC AAA AGG GTC ATC A3'，P2 5'GCC ATC ACG CCA CAG TTT C3'。5个PCR扩增产物长度分别为716、440、199、498、255bp。上述所有引物的合成和测序工作均由上海英骏生物技术有限公司完成。
1.3 主要试剂 RNA提取试剂TRIzol和细胞培养基DMEM购自Gibco公司，Taq DNA聚合酶和T4连接酶为MBI公司产品，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，逆转录酶MMLV购自Promega公司，限制性内切酶EcoR I为TaKaRa公司产品。HPV16/18 E6抗体（sc460）、HPV18 E7抗体（SC1590）和βactin抗体（sc1616R）购自Santa Cruz公司。ECL试剂盒购自Pierce公司。
1.4 载体构建和鉴定 以含有HPV18全长基因组的质粒为模板，行PCR扩增HPV18E6E7基因片段，条件如下：95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 60s，35个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下拍照。PCR产物连接T载体，蓝白斑筛后EcoR I酶切获得目的片段，然后将其与经EcoR I酶切线性化的pEGFPC1 16℃连接。连接产物转化DH5α菌株，挑取单克隆，酶切和测序鉴定。将测序为反向构建成功的质粒命名为pEGFPHPV18E6E7as（EGFP18AS）。
1.5 细胞培养和转染 用EGFP18AS和pEGFP（对照质粒）分别经Lipofectamine 2000转染HeLa细胞后继续培养，6～8h后开始在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光并评估其转染效率。
1.6 RTPCR检测 转染后48h分别用TRIzol试剂提取转染EGFP18AS、pEGFP的SiHa细胞及未处理的SiHa细胞的总RNA，各取2μg mRNA，按照逆转录酶MMLV说明书进行逆转录，再取等体积cDNA模板，用检测HPV18的E6、E7基因的引物进行RCR扩增，条件如下：95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 60s，30个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下拍照。同时PCR扩增βactin或GAPDH作为内参照。
1.7 Western blot检测 在转染后48h分别用三去污法提取上述三组细胞总蛋白，测定浓度后取50μg蛋白上样，用Western blot检测细胞中E6、E7蛋白的表达。具体方法如下：蛋白经SDSPAGE 60V电泳1.5h后转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，后5%脱脂奶37℃封闭1h，一抗（1∶100）4℃过夜，相应二抗（1∶3000）37℃孵育1h，ECL试剂盒化学发光后曝光成像，同时检测βactin（1∶500）的表达作为内参照。
2 结果
2.1 HPV18 E6E7基因片段的扩增和EGFP18AS重组载体的鉴定 从含有HPV18标准全长基因的质粒中扩增目的片段，大小为0.7kb。将重组质粒用EcoR I酶切，获得两条大小为4.7kb和0.7kb的片段，与载体和目的片段吻合。测序证实重组载体中的插入序列与目的基因序列反向匹配。
2.2 HeLa细胞的转染 EGFP18AS和pEGFP两种质粒转染HeLa细胞后6h在荧光显微镜下可观察到少量绿色荧光，24h表达量明显增加，48h达到高峰。
2.3 转染后48h E6、E7表达的变化 用RTPCR检测转染前后E6、E7基因的mRNA的变化，见图1。结果显示，EGFP18AS转染后48h，HeLa细胞中E6、E7基因的mRNA较转染空质粒与未处理细胞显著减少，转染空质粒和未处理细胞间无明显差异。用Western blot检测转染前后E6、E7基因的蛋白的变化，见图2。结果显示，EGFP18AS转染后48h，HeLa细胞中E6、E7蛋白较转染空质粒和未处理细胞显著减少，转染空质粒细胞与未处理细胞间也无明显差异。
3 讨论
人瘤病毒是一种在人群中广泛流行的双链DNA病毒，具有嗜上皮性，易侵袭皮肤和黏膜。根据其基因组DNA的同源性，HPV可分为110多个型别。在宫颈癌患者的宫颈组织中常可检出HPV，尤其是所谓高危型HPV。现有的流行病学和分子生物学资料证实，高危型HPV的持续感染是导致宫颈癌的主要病因。HPV的致癌机理主要是病毒DNA整合于宿主基因组，异常表达病毒癌基因E6、E7。E6和E7基因分别编码含约180个氨基酸和100个氨基酸的癌蛋白。E6蛋白可以特异地与抑癌基因产物p53结合，经过泛素途径快速诱导抑癌基因p53降解，导致G1期进行DNA损伤修复的生理性停滞被解除；E7蛋白可与抑制基因pRb结合，使pRb高磷酸化失活，释放出原结合于pRb的核转录因子E2F。有研究[3]表明，E6、E7蛋白不仅在上皮细胞的恶性转化中起着重要的作用，对肿瘤的恶性表型的维持也起着最重要的作用。Yoshinouchi等[4]认为E6和E7不仅可以转化人上皮细胞，且表达高危型HPV的宫颈癌细胞株在在阻断E6、E7的情况下可以发生恶性表型的逆转。这些研究结果表明，阻断HPV的E6、E7基因，有可能成为宫颈癌基因治疗的有效途径[5]。
HPV18型是一种高危型HPV，与宫颈腺癌关系密切。Steele[6]的研究表明，封闭HPV18的E6和E7基因将明显减缓HeLa等含HPV18的肿瘤细胞的生长，引起细胞周期阻滞。用HPV18 E6基因的反义RNA[6]和siRNA[7]作用于宫颈癌细胞，HPV18 E6蛋白的表达明显降低，细胞凋亡显著增多。我们在以前的研究中构建了表达HPV16 E7基因反义RNA的腺相关病毒载体[8]，结果表明可以阻断E7pRb通路，引起细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡。考虑到HPV18型的E6和E7由同一条mRNA表达，是一对双顺反子基因[7]，两个基因紧密相邻。本次研究中，我们设计了针对HPV18型的E6、E7基因的反义片段。结果显示，我们构建的真核表达载体可以显著减少HPV18型E6、E7基因的mRNA和蛋白的表达。这些结果表明，HPV18型E6、E7基因的反义RNA可以从mRNA水平上封闭E6、E7基因，减少E6、E7癌蛋白的表达，从而有可能从E6p53、E7pRb两条通路上阻断肿瘤细胞的恶性增殖，诱导细胞凋亡。这就为我们利用HPV18型E6、E7基因的反义RNA来治疗HPV感染和预防宫颈癌发生提供了理论依据。
【参考文献】
［1］ Burd EM. Human papillomavirus and cervical cancer\[J\]. Clin Microbiol Rev， 2003，16(1):117.
\[2\] Rorke EA. Antisense human papillomavirus (HPV) E6/E7 expression， reduced stability of epidermal growth factor， and diminished growth of HPVpositive tumor cells\[J\]. J Natl Cancer Inst， 1997，89(17):12431246.
\[3\] Nomine Y， Masson M， Charbonnier S， et al. Structural and functional analysis of E6 oncoprotein: insights in the molecular pathways of human papillomavirusmediated pathogenesis\[J\]. Mol Cell， 2006，21(5):665678.
\[4\] Yoshinouchi M， Yamada T， Kizaki M， et al. In vitro and in vivo growth suppression of human papillomavirus 16positive cervical cancer cells by E6 siRNA\[J\]. Mol Ther， 2003，8(5):762768.
\[5\] Shillitoe EJ. Papillomaviruses as targets for cancer gene therapy\[J\]. Cancer Gene Ther， 2006，13(5):445450.
\[6\] Steele C， Sacks PG， AdlerStorthz K， et al. Effect on cancer cells of plasmids that express antisense RNA of human papillomavirus type 18\[J\]. Cancer Res， 1992，52(17):47064711.
七夕表达爱范文6
【关键词】 金属硫蛋白；肺癌；转移
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2012.08.120 文章编号：1004-7484（2012）-08-2512-01
Expression and clinical significance of metallothionein in lung cancer cell lines
LIU Jun，ZHANG Yun-biao，ZHANG Ting，SHEN Xiao-xia，ZHANG Jun-yi，JIANG Gui-yang
1.Liaoning province Shenyang city Sujiatun district hospital pathology department，Liaoning Shenyang 110101；
2.Liaoning province Shenyang Hunnan New District Hospital，Liaoning Shenyang 110068；
3.Department of Ophthalmology the First Affiliated Hospital China Medical University，Liaoning Shenyang 110001；
4.The Fourth Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine Department of hemodialysis，Liaoning Shenyang 110101；
5.Department of Pathology，Chifeng University School of medicine in Inner Mongolia，Affiliated Hospital Pathology Department，Inner Mongolia Chifeng 024000；
6.Department of Pathology，China Medical University，Liaoning Shenyang 110001
【Abstract】Objective Lung squamous cell carcinoma，adenocarcinoma of metallothionein expression in lung cancer cell lines.Methods Sp immunohistochemical methods to detect Expression and localization of the detection of lung cancer cell lines.Results MT results in lung cancer cell line A549，BE1 expression are cytoplasm.In HBE expression for the nucleus.Conclusion MT role in non-small cell lung cancer and metastasis.
【Key words】 Metallothionein protein；Lung cancer；Transfer
金属硫蛋白（Metallothionein，MT）参与许多病理过程，包括金属离子稳态和解毒、保护氧化损伤。在人体多种肿瘤，如乳腺癌、肾癌等表达增加，但在某些肿瘤，如肝细胞癌（HCC）表达下调，结论不尽一致。MT在肺癌细胞系中的表达目前研究报道较少。我们应用免疫组化方法来检测MT在肺癌细胞系的表达，并简单探讨其发生机制。
1 材料与方法
1.1 标本来源 肺癌细胞系，取自中国医科大学病理教研室，三种分别为：肺腺癌细胞系A549、HBE、肺巨细胞癌细胞系BE1。
1.2 试剂 实验试剂兔抗人MT单克隆抗体（FL-61，sc-11377）购自（三塔公司），s-p试剂盒（kit-9701）购自（福州迈新生物技术开发有限公司）。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞培养 肺腺癌细胞系A549用DAAM培养基培养、HBE、BE1细胞系用含10%的胎牛血清的1640培养基培养后，于含0.5%CO2的37°C孵箱内培养，0.25%胰蛋白酶消化、传代。
1.3.2 肺癌细胞系的免疫化学染色（s-p）法 选择生长状态好的细胞一瓶，待细胞贴壁生长且伸开伪足，形态恢复正常时倒掉培养基，制作细胞爬片。加入固定液固定20分钟。加入0.2%的Triton-100打孔，37°C孵育15分，加入A液，室温孵育20分，加入B液，室温孵育20分，加稀释的一抗（1：100），4℃冰箱过夜，加入C液，室温孵育15分，PBS洗5′×3遍。加入D液，室温孵育15分，PBS洗5′×3遍。DAB显色（棕褐色反应产物代表抗原定位），苏木素复染，中性树胶封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。
2 结 果
MT在肺癌细胞系HBE、A549、BE1的表达。采用SP法进行免疫组织化学染色检测MT在肺癌细胞系A549、BE1表达，均为胞浆表达。在HBE为胞核表达。
3 讨 论
MT是由位于染色体16q13上的10个功能性基因（MT—lA、1B、lE、lF、IG、lH、IX、2A、3A、4A）的异构体基因家族编码[1]。MT分子可与自由基结合，具有多种重要的生理功能[2]，抗氧化损伤，防止机体衰老功能增强机体应激能力。
本次实验，我们首次用免疫细胞化学方法检测了HBE胞核表达，A549和BE1细胞系，同样有癌细胞的胞浆表达。从实验结果可得到，MT在非小细胞肺癌转移起促进作用，并且这种作用是在细胞浆上发挥的。MT的表达可能是非小细胞肺癌发生的早期事件，在非小细胞肺癌发生演变中起促进作用。
参考文献