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干细胞培养技术范文1
【摘要】
目的： 建立胎鼠大脑皮层神经干细胞体外分离、培养、分化及鉴定的方法，探讨神经干细胞的基本生物学特性。方法： 取孕14 d胎鼠大脑皮层，吸管吹打机械分离制成单细胞悬液，采用无血清培养和胎牛血清诱导分化， 应用免疫荧光技术鉴定神经干细胞及其分化的子代细胞。结果： 从胎鼠大脑皮层分离的细胞呈神经巢蛋白（Nestin）免疫阳性并能在体外传代培养，血清诱导分化后的细胞可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白，诱导分化成的神经元能表达突触的特异性标志Synatophymin。结论： 分离和培养的细胞能表达神经干细胞的特异性标志物Nestin，并且具有很强的增殖能力和多向分化潜能，属于中枢神经系统的神经干细胞。
【关键词】 干细胞 大脑皮质 细胞培养 细胞分化 胚胎 大鼠 Sprague Dawley
［Abstract］ Objective: To establish a method for isolation， cultivation， differentiation induction， and identification of neural stem cells (NSCs) from embryonic rat in vitro， and explore the basic biological features of these cells. Methods： The mesencephalon of rat with conceptus age of 13 days was taken out and dissociated into single cell suspension mechanically， and then cultured in serumfree medium. Fetal bovine serum was used to induce cell differentiation. The isolated cells and their progeny were observed by using immunofluorescence technique. Result： The isolated cells showed nestin positive reaction and could be cultured in vitro in series. After being induced by fetal bovine serum， microtubuleassociated protein 2 (MAP2) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) which are specific antigens in neuron and astrocyte expressed in these cells， and synatophymin， a specific signal of synapse， was also expressed in the differentiated neurons. Conclusion： The isolated and cultured cells are NSCs of central nervous system， and possess strong capability of proliferation and potency of multidirectional differentiation.
［Key words］ stem cells; cerebral cortex; cell culture; cell differentiation; embryo; rats， spraguedawley
传统观念认为，哺乳动物的神经组织只有死亡，没有再生能力。自从上世纪90年代初科学家们分离、培养出神经干细胞(Neural stem cells，NSCs）以来，人们相继从各种动物及人的中枢神经系统分离、培养了NSCs[1，2] 。NSCs的发现不仅打破了神经元不会再生的传统观念，而且为许多以往难以治疗的神经系统疾病提供了新的治疗思路和途径。2007年6月利用细胞分离、无血清培养、血清诱导分化及免疫荧光等技术，证明了本实验所分离的细胞群为NSCs，以期为进一步使用和研究NSCs奠定理论及实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
DMEM/F12、B27、胎牛血清购自GIBCO公司，bFGF、Nestin抗体、突触素抗体Snaptophysin购自SIGMA公司，MAP2抗体、GFAP抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司，倒置相差显微镜及荧光显微镜为NIKON公司产品。
1.2 NSCs的分离培养[3～5]
成年雌性和雄性SD大鼠各1只，体重220～260 g，雌雄合笼后，检查阴栓，见阴栓计为孕0 d；孕14 d时取胎鼠，在解剖显微镜下仔细分离获得胎鼠大脑皮层，再用DHanks液漂洗，用眼科剪反复切割组织，再用200目细胞筛过滤，收集入离心管中，反复吹打，制成单细胞悬液，经细胞计数后，分装入50 ml培养瓶中，细胞数约为1×106/ml。培养条件: DMEM/F12 6 ml+B27120 μl + bFGF12 μ1，37 ℃， 5%CO2; 每6～7 d传代1次。
1.3 NSCs的诱导分化
取第4代传代培养的NSCs，将其吹打成单细胞后，以5×104/片细胞密度种于经0.1%多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，培养条件为: DMEM/F121.5 ml + B2730 μl + FBS 150 μl， 37 ℃，5%CO2，培养7 d。
1.4 免疫荧光单标法鉴定NSCs及其子代细胞
1.4.1 Nestin免疫反应阳性细胞
将悬浮培养的细胞团用4 %多聚甲醛固定30 min后涂在载玻片上，37 ℃烘干，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，加入一抗Nestin（1∶100）后4 ℃过夜，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，加入二抗兔抗羊TRITC(1∶100)后37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，荧光显微镜下观察。
1.4.2 MAP2 、GFAP、Snaptophymin免疫反应阳性细胞
取诱导分化的NSCs的细胞盖玻片用4%多聚甲醛固定30 min，37 ℃烘干，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，分别加入一抗MAP2（1∶100）、GFAP（1∶100）和Snaptophysin（1∶100）后4 ℃过夜，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，分别加入二抗羊抗兔FITC(1∶100)和羊抗兔Cy3(1∶100)后37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，荧光显微镜下观察。
2 结果
2.1 NSCs的形态学特征及鉴定
由孕14 d胎鼠大脑皮层分离培养的原代细胞， 接种后立即在相差显微镜下观察，细胞呈悬浮的圆形状，边界清楚，折光性强，绝大部分单个存在。经6～7 d无血清加bFGF培养后，细胞呈球状集落， 95 %以上的NSCs球呈悬浮生长，细胞增殖旺盛（图1）。原代培养时，培养瓶中可见一些细胞碎片和一些贴壁的杂细胞，但经传代后，这些杂质均减少甚至消失，且生长状态良好。在相差显微镜下，NSCs呈球形或椭圆形，大小不一。经Nestin免疫荧光染色鉴定显示神经干细胞球呈红色荧光（图2）。
2.2 NSCs的诱导分化及其鉴定
胎鼠大脑皮层神经干细胞的分离培养、分化及鉴定在NSCs培养液中加入10%胎牛血清3 h后，NSCs球即开始贴壁和分化，6 h后即可明显发现有突起从团块边缘长出，24 h后有少数细胞分化为有突起的细胞，以后分化的细胞逐渐增多，从细胞球周围迁移出，呈放射状排列（图3）；随着时间的推移，突起不断增粗与延长并互相连接成网状，7 d时在相差显微镜下NSCs球周围可见分化成胞体圆形丰满的神经元样细胞和突起粗大的胶质细胞样细胞。免疫荧光染色显示，在胎牛血清的诱导分化下NSCs能分化成表达各种相应特异性标志的终末细胞，即表达MAP2的神经元（图4）、表达GFAP的星形胶质细胞（图5）；同时，从NSCs分化而来的神经元能表达突触素（图6）。
3 讨论
NSCs是指在哺乳动物中枢神经系统内具有多向分化潜能和自我复制能力的一群细胞，由于具有广阔的应用前景而受到神经科学领域众多研究者的关注，在治疗恶性胶质瘤、神经系统损伤、中枢神经系统慢性退行性疾病（帕金森病、亨廷顿病）等方面已取得丰硕的成果[6～8]。
NSCs在哺乳动物中枢神经系统内分布非常广泛，本实验从大脑皮层取材，采用机械分离法来制备NSCs悬液，实验效果比较理想。NSCs悬液的制备有酶消化法和机械分离法，但以酶消化法使用居多。由于在实际操作中很难从客观上准确地把握酶作用的最佳时间点，往往导致消化不足而不易获得单细胞悬液；或消化过度造成细胞受损而导致细胞活力下降甚至死亡。并且，在NSCs表面具有针对许多神经生长因子的受体[9]，当采用酶消化法来获取NSCs时， 可能会引起细胞表面受损而致使一部分受体丢失，而这些受体对于NSCs 维持其干细胞的未分化状态是必需的。所以采用显微解剖和吸管吹打等机械分离方法来制备NSCs悬液是神经干细胞分离中较为理想的方法。
本实验发现在原代培养时，培养瓶中可见大量的细胞碎片和一些贴壁的细胞，但经传代3～5代后，这些杂质逐渐减少甚至消失。这主要是由于培养液中所含的bFGF只对NSCs具有促进分裂和增殖作用[10，11]，而其他杂细胞在该培养液中无法生长。因此，原代细胞中大部分非NSCs会发生死亡，而NSCs不仅可以存活，还可以分裂和增殖，形成神经干细胞球，从而经过多次传代后， NSCs可以得到纯化。
Nestin是神经干细胞的一个标志物，本实验培养的细胞通过免疫荧光观察培养的细胞球均呈Nestin免疫反应阳性，提示组成细胞球的细胞为NSCs。当在培养液中加入10％的胎牛血清后，NSCs可以分化为神经元样细胞和胶质细胞样细胞。免疫荧光显示，诱导分化7 d后NSCs可以分化为表达MAP2的神经元和表达GFAP的星形胶质细胞，证明了NSCs具有多向分化潜能。同时，本研究观察到从NSCs诱导分化成的神经元突起上有分化较好的串珠样排列的膨体，突触素免疫荧光染色阳性，显示其已经具备接受信息的结构基础，表明分化的神经元能够合成和运输神经递质，行使可能的生理功能[12]。
实验从孕14 d胎鼠大脑皮层分离培养的细胞团具备NSCs的三大特征：Nestin免疫反应阳性、分裂增殖能力和多向分化潜能，由此证明了所分离培养的细胞是NSCs。并且，由血清诱导分化而来的神经元具备一定的生理功能，可以用于进一步的实验研究。
参考文献
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干细胞培养技术范文2
【关键词】 骨髓基质干细胞;诱导分化;成骨细胞
【中图分类号】R414.1【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2010)009-0010-01
骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells, BMSCs)是一类具有分化潜能的成体干细胞,在特定条件下可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、神经细胞等多种细胞,被认为骨组织工程中的最佳种子细胞。本实验通过贴壁培养法和密度梯度离心法分离成年大鼠骨髓基质干细胞,定向成骨分化,并检测细胞表面标志、碱性磷酸酶活性和细胞矿化作用。
材料和方法
1 材料
1.1 实验动物。成年wistar 大鼠,雌雄不限,体重150~180 g ,由浙江大学华家池动物实验中心提供。
1.2 实验试剂。胎牛血清,胰蛋白酶(Hyclone),(杭州四季清生物技术有限公司),B一甘油磷酸纳(Sigma,USA),地塞米松(Sigma,USA),维生素C(Sigma,USA),小鼠抗大鼠OC单克隆抗体(R-D,USA),兔抗大鼠CD4(BA0532)、CD44(BA0321)、CD54(BA0541)、CD105(BA1725)、Fibronectin(BA1772)、Collagen Ⅰ(BA0325)、EGFR1(B0485)亲和纯化抗体(武汉博士德公司)
2 方法
2.1 BMSCs的分离和培养:成年wistar大鼠麻醉后处死,无菌条件下取股骨.用含10%FBS的高糖DMEM培养液冲洗骨髓腔.制成骨髓单细胞悬液。接种于培养皿中,置37℃、5%CO2培养。于72h半量更换培养液,以后每3d半量换液1次。加入成骨诱导培养液进行分化培养.对照组加入等量基础培养液。
2.2 免疫细胞化学检测rBMSCs的表面标志: 取生长良好的3~5代rBMSCs以1.2×105/ml细胞悬液以1ml接种于盖玻片,待细胞单层融合至65%左右时,细胞爬片采用SP检测。
2.3 rBMSCs成脂向诱导分化:取生长良好的3~5代rBMSCs接种培养,贴壁24h后换用成脂诱导剂,取诱导30d后的细胞进行苏丹Ⅳ染色。
2.4 rBMSCs骨向诱导分化:取生长良好的3~5代rBMSCs接种培养,贴壁24h后换用成骨诱导剂,取诱导15d、30d后的细胞进行矿化结节染色。
3 结果
3.1 原代培养的BMSCs接种24h后,即出现零星贴壁细胞。72h后开始增殖,生长良好,贴壁较均匀。BMSCs呈纺锤状,有突起。约10d时,细胞汇合成片,其融合率可达到80%~90%,有接触抑制现象。
3.2 rBMSCs表达出许多的非特异性的表面标志物。DAB显色CD44、CD54、CD105、Fibronectin、Collagen Ⅰ、EGFR1阳性,CD34阴性。
3.3 rBMSCs脂向诱导分化培养中细胞形态出现明显的变化:扁平,多为原盘状,可见细胞突起。细胞诱导10d后胞浆中出现致密的黑色点状物,被大量的“小白点”状的脂滴前体分割。14d后,出现少量高折光性脂滴,随着时间推进,不断增多并形成大脂滴。绿色滤光片下可见清晰的脂滴;苏丹Ⅳ染色显示红色脂滴。
3.4 rBMSCs骨向诱导分化培养中,诱导15d就有较多高折光性小颗粒沉积,并可见局部融合,30d时,可见大量结节,几乎覆盖整个细胞层。
4 讨论
骨髓基质细胞又被称为“间充质干细胞”或“骨源性干细胞”。近年来研究发现还可以分化为星形胶质、少突胶质细胞及神经元,所以又称为多潜能成体干细胞。分离骨髓间充质干细胞有多种方法:免疫磁珠分离法[1]和流式细胞仪法[2]因费用高、需骨髓量大、操作复杂而较少应用。全骨髓法[3]即贴壁细胞分离法虽方法简单但所获细胞纯度不高;密度梯度离心法[4]是根据骨髓中各细胞成分比重不同离心分离培养,简单易行,所获得的细胞纯度较高。
本实验选用密度梯度离心法分离培养的细胞经过3~5代的传代,细胞形态趋于一致;免疫荧光检测显示培养的细胞CD44、CD54、CD105、Fibronectin、Collagen Ⅰ、EGFR1阳性,CD34阴性。于文献报道[5]相一致。虽然这些不是特异性的细胞表面标志物,但可以用以鉴别参考。
多向分化潜能是骨髓基质干细胞最重要的生物学特性[6~7]。本研究表明分离培养的细胞在体外诱导的情况下,既可以诱导为脂肪细胞,又可以诱导成为成骨细胞。因此,体外诱rBMSCs骨向分化可以很好地模拟骨髓基质干细胞向骨祖细胞、成骨前体细胞、成骨细胞、骨细胞分化的整个过程,是体外研究成骨功能及骨代谢的理想细胞生物模型。
参考文献
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干细胞培养技术范文3
【关键词】 消化液； 添加物； 牛胚胎干细胞； 克隆效率
胚胎干细胞（ES细胞）是具有全能性的哺乳动物早期胚胎细胞或原始细胞。胚胎干细胞在分化抑制的培养条件下，可以未分化状态无限增殖。近年来有关牛类ES细胞分离与克隆的研究已经取得较大进展[1-2]。笔者为探讨添加物和消化液对牛胚胎干细胞克隆效率的影响，通过从牛鲜胚内细胞团（ICM）中分离获得牛类ES细胞后进行克隆，在培养细胞中添加胰岛素生长因子和消化液，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 牛胚采集 在自然期，对健康经产黑白花奶牛母进行人工受精后68 d经非手术方法从牛子宫取胚胎。将待采集胚胎的母牛固定在床位上，在尾椎硬膜外腔注射 2% 盐酸利多卡因麻醉。按规定方法在冲洗两侧子宫角。冲出的胚胎要在立体显微镜下检查。在100倍实体解剖显微镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度、与透明带的间隙以及变性情况等[3-4]。
1.2 溶液配制 细胞基础培养液：DMEM+0.1 mM 2-mercap-toethanol（在此基础上，添加不同浓度的血清及各种细胞因子）；细胞基础消化液：胰蛋白酶+EDTA（在此基础上，两者浓度有所调整）。
1.2.1 饲养层制备 选取新生健康黑白花牛犊制备成纤维细胞，取3代内对数生长期MEF， 终浓度10μg/ml 丝裂霉素C处理 3.5 h， D-PBS充分洗涤，消化细胞调整细胞浓度为1×105个/ml，种植在经 0.1%明胶包被的4孔培养板中，置37 ℃、5% CO2培养箱培养待用，用前更换成胚胎干细胞培养基。
1.2.2 胚胎处理和胚胎培养条件 基础培养液为DMEM培养基+15%NBS+0.1mmol/L 0.1 μmol/L Na2SeO3+β琉基乙醇。室温下培养牛胚胎及ES细胞。
1.2.3 ICM初次传代 将ICM细胞体外培养6～7 d后，当细胞繁殖到一定数目时，选择未分化的细胞进行传代。操作如下：用玻璃针剥离覆盖在ICM表面的滋养层细胞后挑出ICM，用PBS洗涤液清洗后，置入0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液中处理后，将细胞转入15%的血清培养液中，制备细胞团悬混液。培养条件同上。
1.2.4 牛ES细胞继代克隆 ICM细胞培养35 d后，饲养层表面可出现类似ES细胞的集落。弃去培养液，用PBS液洗涤集落，再用玻璃针剥脱隆起明显、排列紧密的ES细胞集落，再用毛细吸管将集落移入培养液中。
1.3 研究方法 在DMEM培养基中加入10 ng/ml的IGF（设为IGF组）观察牛ES细胞的克隆结果与未加IGF（设为对照组）时做比较，在离散ICM和ES集落时，分别用0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液（A组）和0.04%EDTA消化液+0.25%胰蛋白酶消化液（B组），作用时间控制为2 min，温度37 ℃。
1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行统计处理，计数资料采用 字2检验，以P
2 结果
不同条件对牛ES细胞克隆的影响情况，具体结果见表1。
3 讨论
胚胎干细胞具有全能性，能再体外条件下分化为各器官系统细胞，亦可在分化抑制的情况下进行未分化状态克隆，胚胎干细胞克隆技术广泛运用于转基因动物、嵌合体的制作和克隆动物的生产，目前有关牛胚胎克隆的研究取得了重大进展[4-5]。为探讨不同条件对牛ES细胞克隆的影响，笔者探讨了在不同浓度消化液及在胰岛素生长因子作用下，牛ES细胞克隆的变化。牛ES细胞在以上配置的培养液中培养形成ES细胞集落胚数/枚ES 2枚，细胞最大传代数2代。在培养液中加入10 ng/ml的IGF牛ES细胞集落胚数为3枚，细胞最大传代数4代，可见IGF对牛ES细胞克隆有促进作用。在ICM细胞与ES细胞分离时用0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液处理2 min，形成ES细胞集落胚数/枚ES 9枚细胞最大传代数4代。用0.04%EDTA消化液+0.25%胰蛋白酶消化液分离牛ES细胞集落胚数为8枚，细胞最大传代数4代。因此，在分离ICM细胞和ES细胞时注意，选择适当浓度的消化液，且作用时间不宜过长[6-8]。通过本实验可得出在进行牛ES细胞培养时，可利用一定的添加物促进ES细胞克隆，促进其繁殖，而对于分离ICM和ES细胞的消化液，须严控其浓度和作用时间。
参考文献
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干细胞培养技术范文4
【关键词】 骨髓基质干细胞；CD分子；5-溴脱氧尿嘧啶核苷
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2016.32.091
【Abstract】 Objective To briefly research culture， identification and mark of rabbit bone marrow stroma stem cells. Methods Bone marrow cells of young rabbits were cultured by adhesion method for purification by repeated passage， and cell surface antigen was detected by flow cytometry. Bone marrow stroma stem cells marked by 5-bromodeoxyuridine （BrdU） was injected into rabbit brain for immunofluorescent staining of brain paraffin section after 2 weeks. Results Bone marrow cells cultured by adhesion method provided purified cells suitable for long-term culture in vitro. CD31 had negative rate as 5.67%， CD34 had negative rate as 4.31%， CD45 had negative rate as 4.42%， CD44 had positive rate as 98.82%. CD71 had positive rate as 99.17%. CD90 had positive rate as 98.23%. CD31， CD34 and CD45 showed negative outcome， and CD44， CD71 and CD90 showed positive outcome. BrdU was suitable to be taken by bone marrow stroma stem cells in DNA synthesis. Conclusion Adhesion method provides bone marrow stroma stem cells with high purification， and BrdU can be used as ideal marker for in vivo tracking bone marrow stroma stem cells.
【Key words】 Bone marrow stroma stem cells； CD molecule； 5-bromodeoxyuridine
骨髓基质细胞是一种不具有造血功能的细胞， 由于该细胞容易取材， 并且可以体外扩增以及多向分化等优点， 逐渐成为受到广泛研究[1-4]。本文作者主要对兔骨髓基质干细胞的培养、鉴定以及标记作简单探究。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂 ①材料：本文选择的研究对象为幼兔， 主要来源于内蒙古实验动物中心。②试剂：主要有Gibco生产的胎牛低血清糖DMEM， 由Serotec公司生产的CD71、CD31、CD45mAb， 由Sigma生产的MTT、BrdU， 由Biolegend公司生产的经异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CD45和CDmAb， 剩余试剂则由我国生产。
1. 2 方法
1. 2. 1 原代培养骨髓基质干细胞 将幼兔采用脱颈的方式将其处死， 在充分消毒以后取出两侧的股骨， 中断股骨并反复用肝素生理盐水进行冲洗， 主要是将骨髓细胞冲出， 将冲出的骨髓细胞加入至容量为200 ml的LG-DMEM培养液中， 将其在室温为37℃环境中进行培养， 培养2 d后更换一半培养液， 以后每隔1～2 d在更换一半的培养液， 等到7～8 d后便可以实现1次传代[5-8]。
1. 2. 2 骨髓基|干细胞鉴定 将经上述步骤培养出的第六代并且已纯化的骨髓基质干细胞消化， 在计数之后将其倒入离心管内， 使用磷酸盐缓冲液（PBS） 0.01 mol/L洗涤1次， 离心的时间控制在5 min， 离心的转速为800 r/min， 离心成功后， 再将其加入至200 μl的PBS重悬细胞中， 加入FITC分别标记出小兔的CD31、CD34、CD45、CD90、CD44、CD71， 在室温为37℃以及无关的环境下反应1 h， 待反应结果后， 在使用聚甲醛40 g/L进行固定， 最后检测流式细胞数[9-12]。
1. 2. 3 BrdU标记骨髓基质干细胞的体外研究 选择处于对数生长期的骨髓基质干细胞开展细胞爬片， 等到细胞生长到一半时加入BrdU， 待2 d后取出玻璃片用PBS 0.01 mol/L洗涤， 运用多聚甲醛固定好后开展免疫组化和免疫荧光染色， 最后封面进行观察。
1. 2. 4 BrdU标记骨髓基质干细胞的体内研究 在幼兔颅内注射经过BrdU标记的骨髓基质干细胞， 3周后脱颈处死并取出脑， 在穿刺点附近开展石切片后开展免疫荧光染色。具体步骤为：首先， 常规脱蜡至水， 分别用30 ml/L 过氧化氢（H2O2）、2 mol/L 氯化氢（HCl）、4 g/L的胃蛋白酶、10 g/L
牛血清白蛋白室温封闭约10 min， 加入2 mol/L HCl， 室温下孵育30 min， 再将4 g/L的胃蛋白酶室温孵育30 min， 然后兔抗BrdUmAb（1∶100）在湿盒中孵育过夜， 温度为4℃；然后将TRITC标记抗兔免疫球蛋白G（IgG）（1∶100）在室温下孵育40 min， 最后在用PBS和蒸馏水洗涤， 封片观察[13-16]。选择同一个组织切片随机选择6个不同的视野分别计算阳性率， BrdU标记阳性率=6个不同的视野分别计算阳性率/6个视野细胞总数×100%。
2 结果
2. 1 骨髓基质干细胞培养结果 在对小兔骨髓基质干细胞培养的初期， 能够看见很多悬浮的细胞， 再培养2 d后发现了一些形状为纺锤形的贴壁细胞呈分散状态， 在经过数次更换培养液后， 贴壁上的细胞数量不断减少直至消失， 4 d后可以发现贴壁的纺锤细胞数量增加， 并且呈成簇分布， 但是依然含有其他细胞， 但是在经过数次传代培养以后， 混杂细胞逐渐纯化， 细胞初期的以集落增长， 但是在第六代之后均为均匀分布的纺锤形。
2. 2 骨髓基质干细胞的鉴定 经鉴定发现， CD31的阴性率为5.67%， CD34的阴性率为4.31%， CD45的阴性率为4.42%， CD44的阳性率为98.82%， CD71的阳性率为99.17%， CD90的阳性率为98.23%。
2. 3 骨髓基质干细胞体内外标记 将小兔的骨髓基质干细胞免疫组化以后， 结果可以观察到呈棕色的阳性细胞分布， 选择相同的组织片中6个视野不同进行观察， 并将阳性率计算出来， 然后再分别计算不同的标本， 经计算， BrdU标记的细胞所占的比例为87.6%。在运用免疫荧光染色之后发现细胞核染色显著， 但若将BrdU标记骨髓基质干细胞注入体内， 3周以后依然可以看到明显的BrdU着色， 并且在穿刺位置还发现密集的细胞。
3 讨论
骨髓基质干细胞属于一类具有多向分化潜能的干细胞， 当理化环境不同和受到细胞因素诱导时， 可以进一步向成软骨、成骨、脂肪以及纤维细胞系等[17-19]进行多方向性扩增和分离， 并且骨髓基质干细胞还容易被外源基因感染， 因此当前成为基因治疗和组织工程的较理想的靶细胞。因此如何获取并纯化骨髓基质干细胞已经成为医学界研究的重大课题。分离和纯化骨髓基质干细胞的基本原则为细胞的粘附性。当前， 从骨髓中获得基质干细胞常采用两种途径[20]：①为梯度离心法获得干细胞；②为全骨髓细胞培养。
本研究通过贴壁法培养幼年兔骨髓细胞可获得较纯化的细胞， 并能在体外长期培养， 结果提示：骨髓基质干细胞培养在对小兔骨髓基质干细胞培养的初期， 能够看见很多悬浮的细胞， 再培养2 d后发现了一些形状为纺锤形的贴壁细胞呈分散状态， 在经过数次更换培养液后， 贴壁上的细胞数量不断减少直至消失， 4 d后可以发现贴壁的纺锤细胞数量增加， 并且呈成簇分布， 但是依然含有其他细胞， 但是在经过数次传代培养以后， 混杂细胞逐渐纯化， 细胞初期的以集落增长， 但是在第六代之后均为均匀分布的纺锤形。骨髓基质干细胞的鉴定：经鉴定发现， CD31的阴性率为5.67%， CD34的阴性率为4.31%， CD45的阴性率为4.42%， CD44的阳性率为98.82%， CD71的阳性率为99.17%， CD90的阳性率为98.23%。骨髓基质干细胞体内外标记：将小兔的骨髓基质干细胞免疫组化以后， 结果可以观察到呈棕色的阳性细胞分布， 选择相同的组织片中6个视野不同进行观察， 并将阳性率计算出来， 然后再分别计算不同的标本， 经计算， BrdU标记的细胞所占的比例为87.6%。在运用免疫荧光染色之后发现细胞核染色显著， 但若将BrdU标记骨髓基质干细胞注入体内， 3周以后依然可以看到明显的BrdU着色， 并且在穿刺位置还发现了密集的细胞。
综上所述， CD31、CD34、CD45 的结果为呈阴性， CD44、CD71、 CD90的结果为阳性。BrdU可掺DNA合成期的骨髓基质干细胞， 由此得出贴壁法可获得高纯度的骨髓基质干细胞， BrdU可作为骨髓基质干细胞体内示踪的理想标记物， 依此可以作为检测骨髓基质干细胞的一个依据。
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干细胞培养技术范文5
试管和女性
卡里姆等人提取带有XY男性染色体的胚胎干细胞作为“种子”，置入维生素A酸和其衍生物的溶液中，结果发现约有20％的细胞会转变成早期的细胞或者是精原细胞。经过进一步培养，一些细胞继续分裂、成长、延长，并且长出尾巴，可以自由游动，最后形成可辨认的细胞。卡里姆认为，这些细胞是“完全成熟，有用的”，还给它们取了一个名字――试管。
卡里姆等人培养试管的过程是，先提取男性的胚胎干细胞，然后将其转换成生殖系干细胞，再把后者培养成精原干细胞，最后把精原干细胞转换成单倍体的精母细胞，即只有23条染色体的细胞，最后成为成熟的。
这些人造看起来具有的一些特点，如某些蛋白质形态是独有的，其中一种处于尾部的蛋白质对于卵子的分裂至关重要。有尾巴和头，在显微镜下可以_清晰地看见用尾巴进行运动。
这一成果意味着可以从新的途径上帮助不育患者，甚至从根本上改变人类生殖的方式，不需要男人也可以繁衍后代。例如，不需要男性的生殖细胞。可以提取男性的皮肤细胞，植入4个基因，使细胞的基因重新编排，变成具备胚胎干细胞功能的皮肤干细胞，也称为诱导性多能干细胞。这种细胞与胚胎干细胞一样，可以诱导分化为多种细胞，同样也可能诱导分化成，从而利用这种来治疗不育。
当然，如果研究顺利，未来也许可以提取女性自身的胚胎干细胞、骨髓干细胞或皮肤细胞，诱导其分化，成为，再用这样的与卵子结合，用以繁衍人类。此时，人类社会就可以不需要男性了。不过，目前这只是一种设想，因为在一年前卡里姆的研究小组就做过类似的研究。2008年1月，卡里姆提出申请，打算从女性捐赠者的骨髓中取出干细胞，然后使用现在试管内培养的方法将女性的骨髓干细胞转变成，并认为这种“女性”可以在两三年内培养成功。但迄今这种研究一直没有成功。
当然，即使“女性”还没有培育出来，也并不意味着未来不可能出现，而且现在出现的试管也已经是人工生殖技术的进步了，至少从试管婴儿再向前迈出了一步，到达了试管的新阶段。
真“精”需要“火”来炼
即便用胚胎干细胞培养出了，但这样的是真还是假，是具有的功能，还是徒有其表的假?
英国剑桥大学生理学及生殖学教授阿奇姆・苏拉尼认为，卡里姆所培养出来的那些不过是“类似的细胞”，“要成为真正的细胞还有很长的路要走”。
人造或试管的本质在于，是否与男性自然生成的一样有生殖功能。现在看来这是一个未知数，但基于过去的研究，试管很有可能不具备真正的的功能。
胚胎中基因的开启与甲基有关，因为甲基可能阻止许多基因的表达。早在两年多前，同样是卡里姆的研究小组就利用小鼠的胚胎干细胞培养出了小鼠的。为了验证这些试管是否具有真正的功能，卡里姆研究小组把培育出的小鼠的试管注入母鼠的卵子，成功地形成胚胎，并把这些胚胎植入代孕母鼠体内培养，最后成功地孕育出了小老鼠。但结果是，那些小老鼠后来全部死亡。研究人员推测，可能是人造中的甲基阻断了一些关键基因的表达，从而造成小鼠后代的死亡。大量研究已经发现，DNA(染色体)的甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA的甲基化可引起基因的失活。因此，这一次卡里姆想在人造的试验中验证是否是因甲基的原因造成孕育后代的不成功。
另外，即使人造(试管)培育出来了，而且也有正常的经过减数分裂后的23条染色体，但也并非是有正常功能的。例如，正常的需要有一些帮助其完成正常功能的基因。例如，其中一种叫做动力蛋白基因，如果没有这个基因或该基因失活，的尾部不能弯曲，就不能让正常游动去与卵子结合。
还有一种情况是，和卵子表面质膜上都有一种能分别识别对方的识别蛋白，双方中任何一方的识别蛋白缺失或不正常，也会让和卵子相见但不能相识，也就不能怀孕。卡里姆研究小组的试管是否缺失某些蛋白，或只是因为甲基化的原因而阻止了一些关键基因的表达，从而让人造不具备正常的功能，这只能用受精实验来验证。
而且用试管培育试管小鼠的成功率极低。卡里姆研究小组在大约400个受精卵中仅培育出7只鼠崽。而且，即使成功孕育后，幼鼠的存活时间也极短。其中1只幼崽出生后很快死亡，其余6只在5个月后死亡，但正常老鼠平均寿命约为2年。因此，用老鼠的试管孕育的后代即使可以存活，也逃不过夭亡的命运。以此推论，即使卡里姆研究小组培育出的人的试管能孕育出后代，也很有可能寿命不长。
不要行不通
虽然很多专家对卡里姆等人的试管表示了极大的怀疑，而且以往的研究结果也证明目前的试管并不安全，但这并不意味着纽卡斯尔大学完成的这项研究是毫无意义的。相反，很多研究人员认为，这项研究不仅有意义，而且令人感兴趣。因为这有利于今后对产生过程的探索，了解的功能和功能缺失的秘密，也因此有助于治疗不育男性，但是现阶段还不可能取代男性自然生成的。
早在卡里姆之前，有更多的研究想要证明绕过男(雄)性也可以孕育后代，克隆(无性繁殖)就是一种典型方法，但这种方法以克隆羊多莉的失败而遭到普遍反对。此后，日本研究人员在英国《自然》杂志发表文章称，他们未用雄性而只用两只雌鼠的卵子就孕育出了一个正常的后代，取名叫做Kaguya(月亮女神)。这也是繁衍后代不需要雄性的极好例子。
但是，多莉与月亮女神的单性生殖不完全一样。多莉是由一只母羊的乳腺细胞核植入另一母羊的去掉细胞核的卵子中孕育的，而月亮女神是由两个不同的卵子融合创造的。而且这一研究用了598个老鼠的卵子制造出了足够多的能生长发育的胚胎，然后植入26只雌鼠体内，最后只有24只雌鼠怀孕。这些雌鼠妊娠的结果是，有18个胚胎胎死腹中，同时也成活了10个胎儿，但其中只有两只分娩下来。最后，只有一只是正常的幼鼠，即月亮女神。
显然这个过程比克隆多莉耗时耗钱，也耗精力。当然。这种单性生殖研究唯一的意义是证明单性也可以创造生命，也即不用雄(男)性也可以繁衍后代，但是，这样的技术可以用于人类或其他高等生物吗?不要说伦理和法律上会有很多阻力，就是这种技术产生出来的后代结果也与多莉一样，身上充满多种遗传缺陷，早衰并提前死去(多莉是因多种绝症和顽症而被处以安乐死的)。那么，用这样的技术产生的生命有什么用呢?
干细胞培养技术范文6
[关键词] 骨髓; 间充质干细胞; 兔; 细胞培养
[中图分类号] R329.2+8 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)05-29-03
Effects of Adherence and Density Gradient Centrifugation Methods on Biological Characteristlcs of Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells Cultured in Vitro
LI Ting1 SUN Jinhu1 ZHAO Liang2 LI Shuai1
1.College of Stomatology,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;2.The people’s Hospital of Hechi City,Hechi 546300,China
[Abstract] ObjectiveTo study the effects of adherence and density gradient centrifugation(DGC) methods on biological characteristics of rabbit marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro. MethodsRabbits aged 2 months were used to isolate marrow mesenchymal stem cells(MSCs). MSCs with adherence and DGC methods were cultured,passaged,amplified and purified in vitro. The living characteristics and adhesive rate of the primary and generations were observed respectively. The growth curve was drawn. The cell cycles and cystoskeleton were tested to study the different MSCs separated methods on the proliferation and metabolism of MSCs. ResultsMSCs were intact and fibroblast cell-shaped. Adhering spindle-shaped cells with higher cytoactive were observed in the adherence and DGC separation groups. The MSCs of primary culture in the adherence group showed more rapid proliferation,earlier colony confluence and shorter time for passage compared with DGC separation group. ConclusionThe MSCs separated by adherence showed a rapid proliferation,earlier colony confluence and shorter time for the first passage.
[Key words]Marrow; Mesenchymal stem cells; Rabbit; Cell culture
骨髓基质中存在骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),其具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等多向分化潜能,是组织工程学技术的重要的种子细胞[1]。目前,国内外已分离培养出骨髓间充质干细胞(MSC),但尚无统一的分离培养方案。虽然有多种MSCs的分离方法,但密度梯度离心法和贴壁分离法是目前骨髓间充质干细胞最常用的分离培养方法。本实验应用密度梯度离心分离法与贴壁分离法对骨髓间充质干细胞进行分离培养,并比较分析这两种分离法对MSC生物学特性的影响,为选择对MSCs损伤小、易于贴壁生长和操作简单的MSCs分离方法提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料
DMEM/F-12培养基(Gibco,USA),胰蛋白酶(Gibco,USA),EDTA(sigma,USA),胎牛血清(Gibco,USA),其他均为国产分析纯试剂。碘化丙啶、噻唑蓝和二甲基亚砜均为SIGMA产品,Percoll为Pharmacia公司产品。实验动物日本大耳白兔12只,体重2kg左右,雌雄随机,动物饲养条件为25℃,湿度60%~ 70%。
1.2 方法
1.2.1 骨髓细胞的制备 用3%戊巴比妥钠将兔全身麻醉,用脱毛剂脱去兔后下肢的毛发,用3%的碘酊和75%酒精彻底消毒兔后下肢后移入工作台,铺无菌巾,解剖出胫骨上、下端,用骨钻分别在胫骨上端和下端打孔,暴露骨髓腔。用7号针头刺入两侧骨端的骨孔内,用加有肝素的DMEM 培养基反复冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞悬浮液备用。
1.2.2 离心分离法制备MSCs 将骨髓细胞悬浮液贴壁加入到预置等体积1.077g/L的Percoll淋巴细胞分离液的离心管中,2000r/min离心20min。吸取中间乳白色的界面层,与5倍体积的生理盐水混匀后1000r/min离心5min,除去残留的Percoll成分。用磷酸盐缓冲液洗涤1次,然后均采用F12-DMEM 培养液(含体积分数为0.1的进口胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素)重悬细胞,按1×105的密度接种于25mL培养瓶中,37℃、0.05%的CO2饱和湿度下培养,3d后首次更换培养液,弃去未贴壁细胞,此后2~3d换液1次。
1.2.3 贴壁分离法制备MSCs 将骨髓冲洗液放入平皿,再抽出平皿中液体对髓腔进行二、三次冲洗。用吸管反复吹打呈单细胞悬液,每个胫骨的骨髓单细胞悬液经接种入一个25mL培养瓶中,于37℃ 、体积分数为0.05的CO2孵箱饱和湿度培养,5d后首次更换培养液,弃去未贴壁细胞,此后每三四天换液1次。
1.3 细胞计数、细胞形态学观察
在倒置显微镜下,每天观察贴壁分离培养、密度梯度离心培养条件下的原代及传代细胞的生长情况和活体形态特征。MSCs活力测定取1～3代传代细胞,制成单细胞悬液,以0.4% 台盼蓝作为染色剂,用细胞计数板计数活细胞和死细胞,共3次,取3次平均值,计算细胞活力:活细胞率(%)=活细胞数/(总细胞数-着色细胞数)×100。骨髓间充质干细胞按2×104/孔接种于24孔培养板中。分别于接种后第2,3,4,5,6,7天收集4个复孔细胞(注:原代培养细胞于接种后4d换液时开始,即4,5,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15,16),用酚酞蓝拒染法计数活细胞。根据计数结果绘制生长曲线。取MSCs按2×104个细胞/孔接种于24孔培养板内,从接种后第2天起,每日随机收集4个复孔细胞用计数,取均数描记生长曲线。
1.4 MSCs传代培养
原代细胞长满单层后,即可进行传代,首先弃去培养液,用CMF-PBS液洗细胞两次后,加入消化液(0.25%胰蛋白酶+0.01% EDTA)约1mL,消化约5min,倒置显微镜下证实细胞已完全分离(此时镜下可见细胞呈圆球形),加入4mL含血清培养基,反复轻轻吹打成单细胞悬液,离心并用无血清培养基洗涤1次后重新加入含血清培养基计数,按所需密度传代培养或冷藏。
1.5 MSCs细胞的HE、Gimas染色及细胞骨架制备
Gimas及HE染色采用文献报道方法,细胞骨架制备按参考文献[2]方法。
1.6 MSCs流式细胞仪观察制样
按文献[2]的方法制备观察样本,用流式细胞光度计(FCM)检测,采用激发波长为488nm的氩离子激光,DNA被PI着色成红色荧光,蛋白质被FITC着色成绿色荧光,打印出各组细胞周期所占百分比,计算增殖指数(proliferation index,PIX)衡量细胞的增殖活性,PIX=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%。两组检测数据用均数±标准差(χ±s)表示,各项指标差异显著性用t 检验。
2 结果
2.1 细胞形态学观察
2.1.1 密度梯度离心法 细胞培养24h后,均可见大圆形细胞与少量小圆形细胞悬浮于培养液中,4d首次换液后可见少量细胞呈短梭形、多角形细胞及三角形,培养到12~14d细胞增殖铺满至80%左右,15~16d细胞增殖逐渐汇合成单层细胞。传代后至第3代时细胞形态较均匀,呈长梭形集落状分布。
2.1.2 贴壁分离法 细胞培养24h后,均可见数目较多的小圆形细胞、血细胞悬浮于培养液中。4d时首次换液后可见到梭形、多角形细胞及三角形的贴壁细胞;第7~ 8天可见这些细胞呈集落样分布;至第10~12天细胞增殖铺满至80%左右,14~15d时增殖逐渐汇合成单层细胞。Gimas 染色可见细胞核为紫红色,圆形或椭圆形,镜下可见分裂相细胞,两种分离方法未见不同。(图1)
2.2 细胞活性检测
密度梯度离心法:活细胞率为96.2%,贴壁分离法:活细胞率为98.7%,组间比较差异无显著性(P>0.05)。
2.3 细胞生长曲线
见图4,应用密度梯度离心法与贴壁分离法第1代细胞生长曲线测定结果是密度梯度离心法的MSCs生长期比贴壁分离法MSCs的生长曲线延迟1~2d。第2、3代细胞生长曲线测定结果,细胞生长曲线基本相似,在培养1d时,细胞量稍有减少;第2天开始至第6天,细胞呈指数生长,细胞数迅速增长,7d进入平台期,此后细胞数目无显著改变,细胞增殖减慢(图2)。
2.4 培养MSCs细胞骨架观察
镜下可见细胞骨架主要结构形式为环形排列,贯以辐射状微管组成圆形蜘蛛网形,细胞间有角形的突起。随着细胞传代次数的增大,细胞骨架逐渐过渡到以梭形细胞骨架为主要形式(图3)。
2.5 培养MSCs的细胞周期
第3代MSCs培养72h后,经PI和FITC双染在流式细胞仪下观察分析可见细胞增殖活跃,细胞蛋白质含量较丰富。贴壁法MSC:G1期细胞为67.5%,G2期细胞为28.9%,S期细胞为3.6%,细胞增殖指数为(PIX)32.5%,离心法MSC:G1期细胞为68.2%,G2期细胞为28.1%,S期细胞为3.7%,细胞增殖指数为(PIX)31.8%,经统计学分析贴壁法和离心法MSC的PIX差别无意义(表1)。
3 讨论
骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是具有不断增殖和自我更新能力的成体干细胞之一,在适当的条件下,可分化为成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞[3-7]。获得大量高纯度的MSCs是将MSCs用于研究或临床治疗的基础,目前用于分离MSCs的方法主要有贴壁分离法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。其中后两者由于所需仪器昂贵、对MSCs损伤较大加之骨髓间充质干细胞尚未发现其特有的表面标志,故较少应用[3]。目前常用方法仍为贴壁法和密度梯度离心法。
本实验采用贴壁法分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,随着细胞传代,去除其它可贴壁的杂质细胞,传过三代后细胞形态趋向一致,获得较为纯化的梭形成纤维样细胞(MSCs)。应用密度梯度离心法在原代培养获得的细胞,仍需用贴壁法进一步纯化,并且其操作步骤复杂,离心过程中不可避免地造成细胞损失或损伤,同时发现其原代培养时细胞的活性和生长曲线都迟于贴壁法分离的MSCs,而且MSCs贴壁所需的时间较贴壁分离法长,这可能与离心过程中丢失了骨髓微环境中对骨髓间充质干细胞生长有利的细胞因子和促贴附物质有关。原代培养中可见离心法的MSCs纯度较贴壁法的MSCs大,但随着细胞的传代,两者之间的差别逐渐消失。本实验发现应用离心分离法与贴壁分离法经过传代都可获得活性好、形态均一的骨髓间充质干细胞,但在实验过程中要避免软组织的细胞污染冲洗出的骨髓细胞,对所用试剂尽量做到现用现配。同时应用离心分离法时应注意时间不能过长,离心力不能过大,尽量减少细胞的损伤。本研究揭示虽然密度梯度离心法理论上可在原代获得较纯化的细胞,但仍需用贴壁法进一步纯化,而且容易发生细胞污染和损伤等,因此其并不具有明显优势,相反贴壁分离法具有方法简单、细胞损伤小等优点。
总之,本实验应用的两种方法均可获得可靠的MSCs。对原代培养的MSCs,贴壁分离法具有对MSCs损伤小、易于贴壁生长和操作简单等优点,但其MSCs纯度较离心分离法稍低。经过多次传代后采用两种方法所获得的MSCs的生物学特性已无区别,均可获得具有良好的活性的MSCs。
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