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导游致谢词范文1
[关键词]甘草；愈伤组织；药用次生代谢产物；HPLC；指纹图谱；差异度
甘草是世界上最古老也是最常用草本药材之一，大量使用和长期过度开发使得世界上的野生甘草资源面临枯竭的危机。甘草植物细胞和组织培养是生产药用材料尤其是其活性成分的一种有意义的技术。但是到目前为止，所有有关甘草细胞诱导和培养的研究报道只关注愈伤组织诱导条件对细胞中某类特定的次生代谢产物合成的影响[1-5]，未见关于不同诱导条件对甘草愈伤组织次生代谢产物多样性影响的报道。尽管诱导培养获得的细胞与野生或人工种植的甘草药材含有相似的活性次生代谢产物，但是如果它们的次生代谢产物有显著差异，它们的药用价值是不相同的。同时，作为一个培养生产中药植物药用成分或组分的技术，合适的细胞株系建立和选择与其次生代谢产物多样性密切相关。因此，本实验旨在利用一种简单快速的方法来评价不同诱导培养条件对甘草愈伤组织次生代谢产物多样性的影响，具体来说是结合对愈伤组织的总黄酮化学分析和HPLC指纹图谱分析来定性定量评估不同诱导培养条件下甘草愈伤组织的次生代谢产物多样性的差异以及甘草愈伤组织与道地种植的甘草药材的差异，从而为高产药用次生代谢产物以及植物细胞作为替代药材的甘草细胞株系的筛选提供实验依据。
1材料与方法
1.1样品 甘草种子和三年生甘草根均购自新疆神农有限公司，经天津中医药大学李天祥教授鉴定为胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.，GI）和光果甘草（G. glabra L.，GG）；乙腈（NO.100269，SK Chemicals，Korea）和冰乙酸（天津光复精细化工研究所）均为色谱级；实验中所用到的其他的化学品除有特别说明外，均为分析级药品。
1.2种子萌发 挑选充实饱满的胀果甘草和光果甘草种子，用玻璃砂研磨去除表面蜡质种皮，自来水冲洗7～10遍，用75%的乙醇消毒20 s后，用无菌水冲洗5～7遍，接着用3.68 mmol・L-1HgCl2溶液消毒7～8 min，再用无菌水冲洗7～10遍，用无菌滤纸吸干种子表面水分后接种到MS0（不添加激素）琼脂培养基上[6]，置于黑暗条件下，25 ℃培养。3 d后，种子萌发出新鲜的嫩芽。
1.3愈伤组织诱导和继代 胚轴和子叶是文献中最常用的甘草愈伤组织诱导的2种外植体，成功率较高[1-2，7]。本研究选择这2种外植体进行研究，将萌发11 d后的无菌苗胚轴切成约0.5 cm的小段，子叶切成约0.5 cm2的小块接种到诱导培养基上（MS基本培养基+激素+质量分数为3%的蔗糖+质量分数为0.7%的琼脂），pH 5.8。根据文献选择的其他典型的愈伤组织诱导的激素组成和光照条件见表1[2，5，8]。25 ℃培养，8 d后，进行第1次继代，继代的愈伤组织的培养条件和培养基组成与愈伤组织诱导相同，继代周期为21 d[9]。
1.4愈伤组织分析样品的制备 不同诱导条件下获得的甘草愈伤组织连续继代4次，生长稳定后，取培养1个周期的愈伤组织，45 ℃干燥至恒重，然后将愈伤组织研磨成粉末，取0.2 g甘草愈伤组织粉末加入10 mL 70%乙醇，室温下放置24 h，超声提取30 min，放冷至室温，补足溶液到刻度，取上清过0.45 μm滤膜备用。
1.5总黄酮含量的测定 准确量取2 mL样品溶液，加入0.5 mL质量分数为10%KOH，涡旋混匀，室温下放置5 min，加 70%乙醇到10 mL，涡旋混匀，室温下放置90 min，以 70%乙醇为空白对照，在400 nm波长下测定样品吸光度，以甘草苷为对照品绘制标准曲线。
1.6HPLC色谱分析条件 Agilent 1100高效液相色谱仪（配有G1314A紫外检测器、G1311四元梯度泵、G1379A在线脱气装置、G1329B自动进样器），Agilent 1100化学工作站；色谱柱为Apollo C18柱（4.6 mm×250 mm，粒径5 μm）。检测波长254 nm；流速为1 mL・min-1；检测温度为25 ℃；进样量20 μL，流动相A乙腈，B 1%醋酸溶液，流动相梯度为0 min，90% B；15 min， 80% B；35 min， 70% B；45 min，50% B；50 min，40% B；55～65 min，30% B；70 min，50% B；75 min，70% B；80 min，90% B。
1.7数据分析 本实验中的所有数据都是采用至少3个重复，以±s表示。采用单因素方差法（One-Way ANOVA）分析不同诱导培养条件对甘草愈伤组织总黄酮含量的影响。采用中药指纹图谱相似度评价系统（2004，A版）分析愈伤组织次生代谢产物的多样性的差异。
2结果与讨论
2.1不同诱导培养条件对甘草愈伤组织总黄酮含量的影响 为考察不同诱导培养条件对甘草愈伤组织总黄酮含量的影响，分别选取了一些典型的诱导条件包括甘草种属、外植体、光照条件和激素组合进行了5组试验，见表1。其中，处理组A和B，C和D，A和C，D和E分别考察2种甘草种属、光和暗条件、2种外植体、2种激素组合对甘草愈伤组织总黄酮含量的影响，结果见图1。
在本研究中，采用甘草苷为对照品，以甘草苷的浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标，测得甘草苷对照品的回归曲线为Y= 0.015 8X，R2=0.999 1，实验表明对照品质量浓度在20～100 μg・L-1与吸光度A呈良好的线性关系。检测栽培甘草根和甘草愈伤组织中总黄酮的含量，结果表明，5种诱导培养条件下获得的愈伤组织中总黄酮的质量分数为15～60 mg・g-1干重，比相同种属栽培甘草根中总黄酮的含量（GI为120 mg・g-1干重，GG为55 mg・g-1干重）要低很多。相同培养条件下，不同种属的甘草诱导的愈伤组织中总黄酮的含量不同，胀果甘草诱导的愈伤组织（处理A）中总黄酮为25 mg・g-1干重，高于光果甘草诱导的愈伤组织（处理B）中总黄酮的15 mg・g-1干重；24 h连续光照条件下诱导培养的愈伤组织（处理D）总黄酮的质量分数（60 mg・g-1干重）要远高于24 h黑暗条件下（处理C）培养的愈伤组织总黄酮（20 mg・g-1干重），这与杨世海等[9]利用乌拉尔甘草下胚轴为外植体在白色光照（荧光灯连续照射）和黑暗（24 h）培养愈伤组织进行有效成分分析时，得出的愈伤组织在光照条件下合成的黄酮类化合物的总量是黑暗条件下合成的化合物总量的2倍的结论一致。处理D，E的甘草愈伤组织中总黄酮含量都很高，但相差不大，见图1。在选取考察的5个诱导培养条件中，胀果甘草的子叶为外植体在光照下诱导时选取的这2个激素都比较适合进行甘草愈伤组织总黄酮的生产。实验结果采用单因素方差分析法（One-Way ANOVA）进行分析，甘草种属、外植体和光照条件对甘草愈伤组织中总黄酮的含量具有极其显著的影响，然而，激素组合对甘草愈伤组织中总黄酮的含量无显著影响，见表2。植物细胞中黄酮类化合物的合成受诱导培养条件的影响，这与杨世海等[10]以乌拉尔甘草胚轴为外植体，以不同类型的培养基、不同培养基pH、培养基中添加不同激素等条件诱导并培养甘草愈伤组织，得到的愈伤组织中黄酮类化合物的含量不同的结论一致。
2.2甘草愈伤组织次生代谢产物的多样性的差异 本文采用中药指纹图谱相似度评价系统（2004，A版）通过比较愈伤组织样品HPLC图中的峰面积、峰数量计算HPLC图的相似度，从而获得其差异度。5种典型诱导培养条件下甘草愈伤组织的次生代谢产物的多样性组成的HPLC图。用7种甘草黄酮及三萜类化合物作为对照品检测诱导培养的甘草愈伤组织的化合物组成，结果显示活性次生代谢产物甘草苷[11]、异甘草苷、甘草素[12]、甘草查尔酮A[13]、甘草酸以及异甘草素[14]都存在于本实验中培养的甘草愈伤组织中，见图2。
采用中药指纹图谱相似度评价系统计算不同诱导培养条件下的愈伤组织指纹图谱间的相似度，差异度为1减去相似度值。首先，分析对甘草愈伤组织总黄酮含量具有极其显著影响的诱导培养条件（甘草种属、光照条件和外植体），结果显示，甘草种属（差异度=0.27）、光照条件（差异度=0.45）对甘草愈伤组织次生代谢产物的多样性具有非常显著的影响，诱导培养条件外植体（差异度=0.16）对甘草愈伤组织次生代谢产物的多样性具有显著的影响；接着，分析对甘草愈伤组织总黄酮含量无显著影响的诱导培养条件（激素组合），结果表明，激素组合对甘草愈伤组织次生代谢产物的多样性具有非常显著影响（差异度=0.37），见表2。
采用中药指纹图谱相似度评价系统还可以得出甘草愈伤组织指纹图谱之间的共有峰和非共有峰。分析对甘草愈伤组织次生代谢产物多样性具有显著影响的诱导培养条件，结果显示不同的诱导培养条件下的甘草愈伤组织指纹图谱间共有峰及非共有峰的数量并没有显著的差别（A和B，A和C，C和D，D和E）。
进一步对甘草愈伤组织中的峰面积占总峰面积百分比大于5%的色谱峰进行分析，可以看出相同色谱峰在不同指纹图谱中的峰面积是不同的，即同一化合物在不同的愈伤组织中含量是不同的，例如化合物3和化合物6分别在诱导培养条件C，D中含量最高，每个指纹图谱中出现在38.17 min的化合物的峰面积都远远高于其他4种化合物的峰面积。分别将每个指纹图谱中5个化合物的峰面积相加在一起进行分析，结果显示对甘草愈伤组织中5种主要化合物的总含量影响由大到小依次为光照条件、激素组成、外植体和甘草种属。
综上所述，对甘草愈伤组织中总黄酮的含量具有显著影响的诱导培养条件对次生代谢产物的多样性也具有显著的影响[15]，对甘草愈伤组织中总黄酮含量影响小的诱导培养条件对次生代谢产物的多样性也有可能会有显著影响（表2），这是因为甘草愈伤组织中的次生代谢产物除黄酮外，还有许多其他的化合物。在这4种诱导培养条件中，光照条件对愈伤组织次生代谢产物的多样性的影响最显著（差异度=0.45），这可能是因为一些甘草次生代谢产物的基因只有在光照条件下才能表达，黑暗条件下这些基因不表达或黑暗条件抑制这些基因的表达[16]。
2.3甘草愈伤组织与人工栽培的甘草药材次生代谢产物多样性的比较 三年生胀果甘草和光果甘草中许多次生代谢产物的含量都高于甘草愈伤组织，然而，甘草愈伤组织中也有部分次生代谢产物的含量高于人工种植的甘草，如异甘草苷和甘草素见图2，3。以人工种植的胀果甘草的指纹图谱为对照图谱，计算典型诱导培养下的甘草愈伤组织指纹图谱与同种属的人工种植的胀果甘草根指纹图谱的相似度，进而计算差异度，结果处理A，C，D，E中的甘草愈伤组织与人工种植的胀果甘草的指纹图谱差异度分别为0.90，0.95，0.94，0.86；以人工种植的光果甘草的指纹图谱为对照图谱，处理B与它的指纹图谱差异度为0.92，可以看出甘草愈伤组织次生代谢产物的多样性与人工种植的甘草药材之间差别极其显著。
3结论
本实验采用总黄酮化学分析和HPLC指纹图谱分析相结合的方法成功评价了典型诱导培养条件对甘草愈伤组织次生代谢产物多样性的影响，不同诱导培养条件下的愈伤组织次生代谢产物的多样性也明显不同，光照条件（差异度=0.45）和激素组成（差异度=0.37）对愈伤组织次生代谢产物的多样性影响最大。比较甘草愈伤组织的指纹图谱和人工种植的甘草根的指纹图谱，可以发现一些新的色谱峰，至于这些色谱峰所对应的化合物是不是新的化合物，需要结合HPLC-MS-NMR等方法进一步分析，如果产生系列新的化合物可以进一步建立一个新的化合物库，为药用植物资源的深度开发提供来新的资源。
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Significant impact of different induction conditions on metabolic
diversity of callus cell lines of Glycyrrhiza sp.
LIU Feng-cai1， LV Jian-ming2， WU Xiu-zhen1，2， ZHANG Wei1，2*
（1.Department of Biochemical Engineering， School of Chemical Engineering， Tianjin University， Tianjin 300072， China；
2.Tianjin Acelbio Biotechnology Co.， Ltd.， Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine，
Tianjin 300457， China）
[Abstract] The purpose of this study was to evaluate the impact of callus induction and culture conditions on secondary metabolic diversity of the callus cell lines of traditional Chinese medicinal plant Glycyrrhiza sp. （Glycyrrhiza） by combined chemical analysis and HPLC fingerprint. These callus induction conditions included two Glycyrrhiza species， two types of explants， light and dark conditions， and two combinations of hormones. The evaluation was firstly based on the contents of total flavonoids in the callus by chemical analysis and one way ANOVA. The content of total flavonoids in callus was significantly （P
