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摘要： 目的 探讨五味子降酶胶囊的质量控制方法。方法 采用薄层色谱法（TLC）鉴别五味子降酶胶囊中的五味子、板蓝根；采用高效液相色谱法（HPLC）测定五味子中五味子醇甲的含量。结果 薄层鉴别斑点清晰，分离效果好，专属性强；含量测定中五味子醇甲在0.033 37～0.533 92 μg范围内，与峰面积线性关系良好（r=0.999 5）。结论 方法操作简单，专属性和重现性良好，可作为五味子降酶胶囊的质量控制方法。
关键词： 中草药； 五味子属； 色谱法，高效液相； 色谱法，薄层； 五味子降酶胶囊； 板蓝根； 五味子醇甲
慢性肝炎在我国发病率高并呈上升趋势，其活动期往往伴随 ALT（谷丙转氨酶）、AST（谷草转氨酶）、TBi L（总胆红素）等指标的升高。中医认为，慢性肝病的病因往往是正气不足、饮食不节，以致损伤脾胃，脾胃不能化湿，则湿热内生，因脾伤肝，造成肝胆脾胃不和，从而加剧了正气的损伤，导致肝炎的发生；另外，正气不足，极易感染疫毒。古人云：邪之所干，其气必虚。说明本证是本虚标实证。我院肝病科老中医经过多年临床摸索，认为慢性肝病病人正气虚为本，外感或内生湿热为标，治疗上要攻补兼施。五味子降酶胶囊正是在此基础上研制而出，其由五味子、女贞子、板蓝根、败酱草四味药组成，具有补益肝肾、清热解毒、凉血止痛的功效；用于肝胆湿热型胁痛、积聚证，症见乏力、纳差、腹胀、胁肋部疼痛等。方中五味子性温，味酸、甘，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效，现代药理研究表明五味子具有保肝降酶的作用，是多种保肝药的主要成分，为君药［1-2］；女贞子味甘苦性凉，具有补益肝肾、清虚热、明目的功效，与五味子合用，增强其补益肝肾的作用，为臣药；板蓝根味苦性寒，具有清热解毒、凉血的功效；败酱草味辛、苦，具有清热解毒、消肿排脓、活血止痛的功效，与板蓝根辅助起到清肝胆祛湿热的作用，故二药为佐药。四药合用，攻补兼施，攻邪不伤正，扶正不留邪。五味子降酶胶囊在我院临床运用多年，效果显著。为了更好地控制制剂质量，保证临床疗效，特对处方中各药味进行研究，以建立质量标准，严把制剂质量。
1 仪器与试药
1.1 仪器
U-3000 型高效液相色谱仪（赛默飞）；FA2004型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；ZF-2 型三用紫外仪（上海安亭电子仪器厂）；KQ-300DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH 型数显恒温水浴锅（常州国宇仪器制造有限公司）；DHG-9055A 型鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。
1.2 试药
五味子对照药材（中国食品药品检定研究院，批号 120922-201309）；五味子醇甲对照品（中国食品药品检定研究院，批号 110857-201513）；精氨 酸 对 照 品（中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 ，批 号140685-201707）；五味子降酶胶囊（太和县中医院，批号 20190621、20190623、20190625）；五味子（亳州市沪谯药业有限公司，批号 1902220328），女贞子（亳州市沪谯药业有限公司，批号 1901120124），板蓝 根（ 亳 州 市 沪 谯 药 业 有 限 公 司 ，批 号1904250252），败酱草（亳州市沪谯药业有限公司，批号 1903210211），以上饮片经我院副主任中药师王虎鉴定均为正品；甲醇（Scc Bayer，色谱纯）；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。
2 薄层鉴别
2.1 五味子的薄层鉴别
取五味子降酶胶囊的内容物 1 g，加三氯甲烷 20 m L，加热回流 30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加 1 m L三氯甲烷使溶解，作为供试品溶液；另取按处方比例及生产工艺制成的不含五味子的五味子降酶胶囊，按上述方法制成阴性对照溶液；再取五味子对照药材 1 g，同法制成对照药材溶液；再另取五味子醇甲对照品，加甲醇溶解，制成每1毫升含五味子醇甲1 mg的溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典 2015 年版四部通则0502）试验，分别吸取上述四种溶液各 5 μL，点于同一硅胶 GF254薄层板上，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂，上行展开，距薄层板上沿 1 cm 时取出，晾干，置三用紫外仪（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应 Rf 位置处，显相同颜色的斑点；而阴性样品在此位置处无斑点。说明该方法专属性强，可作为该制剂中五味子的鉴别方法。
2.2 板蓝根的薄层鉴别
取五味子降酶胶囊的内容物 1.75 g，加水 60 m L，加热回流 1 h，滤过，滤液上钠型 732 型阳离子交换树脂（柱长 10 cm，内径 1.5cm），水洗至洗液呈中性，再用 2 mol/L 的氨水溶液150 m L 洗脱，弃去前 50 m L 洗脱液，收集后 100 m L洗脱液，蒸干，残渣加稀乙醇 1 m L使溶解，作为供试品溶液。另取按处方比例及生产工艺制成的不含板蓝根的五味子降酶胶囊，按上述方法制成阴性对照溶液；再取板蓝根对照药材 1 g，同法制成对照药材溶液；再另取精氨酸对照品，加甲醇溶解，制成每1 毫升含精氨酸 0.5 mg 的溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典 2015 年版四部通则 0502）试验，分别吸取上述四种溶液各 5 μL，点于同一硅胶 G薄层板上，以无水乙醇-氨水（3∶2）为展开剂，上行展开，距薄层板上沿 1 cm 时取出，晾干。喷以茚三酮试液，置 105 ℃鼓风干燥箱中加热到斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应 Rf位置处，显相同颜色的斑点；而阴性样品在此位置处无斑点。说明该方法专属性强，可作为该制剂中板蓝根的鉴别方法。
3 含量测定（中国药典2015年版四部通则0512试验）
3.1 波长的选择
用甲醇为空白试剂，在200～400 nm 范围内对五味子醇甲进行波长扫描。结果显示，五味子醇甲在 216 nm、251 nm 附近有最大吸收。同时参考药典及文献中“五味子醇甲”的含量测定方法，确定本品的测定波长为250 nm。
3.2 色谱条件及系统适用性试验
色谱柱用1ODS 柱（依利特，Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm）；流动相为甲醇-水（65∶35）；流速为 1 m L/min；柱温设30 ℃；检测波长为 250 nm。理论板数以五味子醇甲峰计算应不低于2 000。进样量为5 μL。
3.3 溶液的制备
3.3.1 对照品溶液的制备
精密称取五味子醇甲对照品适量，加甲醇制成每 毫升含 30 μg 的溶液，即得。
3.3.2 供试品溶液的制备
精密称取混匀的装量差异项下的本品内容物 0.75 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 25 m L，称定重量，超声处理（功率250 W，频率 20 k Hz）20 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密移取 5m L 续滤液至 10 m L 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
3.4 专属性试验
取缺五味子的五味子降酶胶囊，按“3.3.2”方法制成阴性样品溶液。精密吸取对照品、供试品及阴性样品三种溶液各 5 μL，按“3.2”条件进样，记录色谱图。见图1。结果可见，供试品的色谱图中，在与五味子醇甲峰相同保留时间处显相同的色谱峰；而阴性样品在 此 时 间 处 无 色 谱 峰 。 阴 性 无 干 扰 ，方 法 专 属性强。
3.5 线性关系考察
精密称取五味子醇甲对照品适量，加甲醇溶解，制成浓度为 0.333 7 g/L 的对照品溶液作为储备液。精密移取1 m L储备液至10 m L容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成浓度为 0.033 37g/L 溶液作为工作液。按“3.2”条件，分别精密吸取工作液 1 μL、2 μL、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL 进样，记录峰面积。以五味子醇甲的进样量为横坐标，峰面 积 为 纵 坐 标 ，进 行 线 性 回 归 ，得 回 归 方 程 Y= 35.486X+0.174 6，r=0.999 5。由此说明，五味子醇甲在 0.033 37～0.533 92 μg 范围内与峰面积呈较好的线性关系。
3.6 精密度考察
精密吸取“3.5”中的工作液 5μL，在“3.2”条件下连续进样测定 6次，记录峰面积。结果五味子醇甲的平均峰面积 6.127 0，相对标准差（RSD）=0.16%，说明仪器具有较好的精密度。
3.7 重复性试验
精密称取五味子降酶胶囊（批号20190621）内容物 0.75 g，共 6份，分别制成供试品溶液，在“3.2”条件下进样并计算含量。结果 6 份样品的平均含量为 2.40 mg/g，RSD=0.32%，说明该方法重复性较好。3.8 样品稳定性试验 精密称取五味子降酶胶囊（批号 20190621）内容物 0.75 g 制成供试品溶液，分别于制成后 0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样，测定峰面积。结果平均峰面积 6.719 8、RSD=0.44%。由此可知，样品室温条件下24 h内基本稳定。3.9 加样回收试验［16］精密称取已知含量的五味子降酶胶囊 6 份（每份约 0.40 g），精密加入“3.5”项下的储备液 2.5 m L，按上述方法及色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表 1。由表 1可知，样品平均回收率为 100.07%，RSD=0.57%。说明该方法准确度较高。3.10 样品含量测定 取连续3 批的五味子降酶胶囊，按所述的样品处理方法及色谱条件进样测定，计算五味子醇甲的含量，批号 20190621、20190623、20190625 的制剂含量每粒分别为 0.84 mg、0.85 mg、0.85 mg。
4 讨论
4.1 含量测定指标成分及薄层鉴别方法的确定
五味子主要含五味子醇甲、五味子乙素等成分，根据《中国药典》2015 年版、《中药制剂质量及稳定性研究技术指导原则》首选君药、贵重药、毒性药材制订含量测定项目的要求，故选择君药五味子中五味子醇甲作为 HPLC 测定的指标成分；同时用五味子醇甲及五味子对照药材进行 TLC 鉴别，结果斑点清晰、专属性强，能清楚地反映五味子的薄层特征。板蓝根化学成分复杂，主要含（R，S）-告依春、靛蓝、精氨酸等化学成分。本研究曾用化学鉴别法鉴别板蓝根中的氨基酸，阴性虽无干扰，但化学鉴别方法简单，特异性差，不足以作为板蓝根的鉴别方法；用 TLC 法鉴别板蓝根中的（R，S）-告依春，阴性亦有干扰，专属性不强［17］；靛蓝的含量较低，TLC 鉴别斑点不清晰，不易检出；而精氨酸经过钠型 732型阳离子交换树脂处理，再用氨水溶液洗脱提纯后，分离效果好，专属性强，斑点显色清晰，故可作为本制剂中板蓝根的鉴别方法。败酱草收载于地方炮制规范中，主要含齐墩果酸、败酱烯等化学成分，本研究曾用 TLC 法鉴别处方中的败酱草［18］，但阴性干扰明显，专属性不强。女贞子亦含有齐墩果酸，与败酱草相互干扰，同时含有女贞苷、特女贞苷等化学成分，由于工艺及处方量的影响，用 TLC 法鉴别女贞子中特女贞苷，斑点不清晰、分离效果差且阴性有微弱的干扰［19］。根据《中药制剂质量及稳定性研究技术指导原则》鉴别项的要求“对主要药味进行研究，选择专属性强、灵敏度高、重现性好、操作简便的鉴别方法纳入标准正文”，故将五味子、板蓝根的薄层鉴别方法收入质量标准，女贞子、败酱草的薄层鉴别尚需进一步研究。
4.2 含量测定提取方法及溶剂的选择
药典及文献［20-21］中五味子醇甲的提取有超声法及加热回流法两种。本研究曾考察了两种提取方法五味子醇甲的含量高低，发现超声提取含量略高但不明显。综合考虑操作的简易程度及能源消耗，故本试验选择超声法作为 HPLC 的提取方法。溶剂选择方面，本研究比较了分别用甲醇、乙醇、50% 甲醇超声后五味子醇甲的含量高低，发现三种溶剂处理的色谱峰分离度及不对称性均较好，色谱图差别不明显；而甲醇处理五味子醇甲的含量最高，故选择甲醇作为五味子醇甲的提取溶剂。
4.3 含量限度的确定
受工艺及生产实际的影响，制剂含量往往较投料的理论含量下降明显。而制成制剂后，饮片指标成分含量进入制剂的比率称为转移率。本制剂五味子粉碎入药，有效成分损耗较少。研究测定了五味子降酶胶囊及投料的五味子的含量，计算平均转移率为 75.59%。由处方计算，本制剂每粒含五味子饮片 0.14 g，根据《中国药典》2015 年版“五味子”的含量限度，并结合转移率及工业化生产实际，暂定本制剂的含量限度为不低于每粒 0.40 mg。由于含量测定批次有限，故转移率及制剂含量限度尚需进一步考察。
5 结论
采用 TLC 法鉴别处方中的五味子及板蓝根的方法专属性强、斑点清晰，HPLC 法测定五味子中五味子醇甲的含量方法分离度高、重现效果好，可作为五味子降酶胶囊的薄层鉴别及含量测定方法收入质量标准中。
作者：任路路 姚大洋 任莹 李小伟 单位：太和县中医院制剂室 安徽守正中药饮片有限公司