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1牙齿组织的发育来源
颅面部发育是包含了多个不同发育来源的干细胞相互作用的复杂过程。牙齿包含至少2个胚层来源的组织，外胚层来源的口腔上皮形成牙釉质，中胚层形成牙齿其余结构，如牙髓、牙本质和牙骨质。而颅面部其他骨组织（如颅骨的扁骨）则主要来源于间充质前体细胞、中胚层前体细胞及细胞基质。牙齿组织发生始于胚胎发育第5周，并持续整个乳牙替换期。胚胎5周后，原始口腔上皮带形成并在未来牙板上下颌部增厚。上皮带内陷形成前庭板和牙板。成釉器的形成始于牙板下方并经历了牙齿发育3个阶段：蕾状期、帽状期、钟状期。在蕾状期，上皮细胞迁移至外胚间充质下方，外胚间充质细胞排列更加紧密包绕牙蕾。接着，在帽状期牙蕾细胞进一步增殖形成帽状结构。上皮细胞形成成釉器，外胚间充质细胞在成釉器下方增殖形成牙乳头。包绕牙乳头的地方形成牙囊。钟状期，成釉器内表面进一步加深，细胞开始分化。牙内皮细胞与牙乳头通过基膜相互作用。牙内皮细胞与牙乳头细胞停止增殖，细胞核迁移至基膜对侧，细胞伸长。牙内皮细胞成为牙釉质前体细胞并释放信号，牙乳头成为成牙本质细胞。成牙本质细胞不断分泌有机基质，即前期牙本质，成牙本质细胞渗出突起，胞体向牙髓中央移动。成牙本质细胞分泌羟基磷灰石及矿物质，前期牙本质成为牙本质。牙釉质前体细胞形成牙釉质，成为成釉细胞。牙根的发育与牙冠不同。内釉上皮与外釉上皮细胞层从颈环开始向下方生长形成牙根赫威特上皮根鞘。赫威特上皮根鞘诱导牙乳头分化为成牙本质细胞形成根部牙本质。成牙骨质细胞、牙周膜纤维细胞及牙槽骨成骨细胞这3种细胞对牙齿在牙槽窝中起到支持、平衡作用，并都来自牙乳头，统称为牙周组织。牙周膜的干细胞和前体细胞具有多种自我更新及分化潜能。
2种子细胞在牙髓再生中的策略
2.1利用干细胞进行牙髓再生
利用干细胞进行牙髓再生的定义是将外源性干细胞植入宿主根管系统中进行牙髓再生。被移植的细胞或来源于宿主体内或来源于异体细胞。这些细胞经过简单分离或通过培养扩增后用于牙髓再生。由于干细胞能够对微环境变化做出反应，进行细胞分化及细胞分裂，因此干细胞治疗能够有效地修复组织缺损。有许多研究表明，体内移植牙髓干细胞或其他种类干细胞可以在异位形成牙髓样组织。Huang等的研究报道了将根尖牙乳头干细胞或牙髓干细胞植入牙根并埋入小鼠背部，可以观察到牙髓样组织形成及牙本质的沉积。Cordeiro等报道了人脱落乳牙干细胞复合凝胶植入牙片后埋入小鼠背部皮下，可以观察到血管化牙髓样组织形成。细胞移植有许多优点，如可控制移植的细胞数量及优化最适宜牙髓再生的干细胞亚群。经分选的细胞具有更强能力，促使在根管中形成神经、血管及牙本质。Iohara等报道牙髓细胞中CD31-/CD146-或CD105+细胞亚群，比其他前体细胞具有更高自我更新能力及分化潜能。一些非牙源性间充质干细胞，如骨髓间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞也能形成牙髓样组织。尽管获得这些细胞会给患者造成创伤，但当牙源性间充质干细胞无法获取时，这些细胞可成为替代的候选细胞。关于干细胞移植进行牙髓再生的研究报道，主要集中于不同种类的干细胞复合支架材料，体内移植后进行原位或异位牙髓样组织再生观察的基础性工作。真正进入牙髓组织再生临床前或临床试验的研究报道较少。尽管这些基础研究工作具有科学意义，但在细胞移植技术在向临床治疗的转化过程中仍然遇到很多问题。首先，用于治疗的干细胞来源问题。如果使用的是源于非人种属的干细胞，将会由于免疫排斥的问题受到限制。具有免疫原性的细胞移植可能会引起免疫排斥及感染。细胞冷冻储存系统可能出现细胞流失，并增加额外花费。而传统组织工程技术中的种子细胞来源、培养技术、对支架的复合程度、植入体内后潜在的免疫原性、细胞活性等因素都限制了该技术的实际临床应用。
2.2无细胞移植的牙髓再生治疗
牙髓再生的临床转化，不仅要满足安全、有效两个基本条件，还应考虑到简便、实用和经济的原则。哈佛大学干细胞与再生生物学研究中心的研究发现，在多种组织再生过程中都存在体内干细胞的迁移和募集现象，称为干细胞归巢（stemcellshoming）。这些募集的机体自身干细胞都不同程度地参与了创伤愈合和组织再生的过程。现已证实，机体干细胞归巢可以通过2种完全不同的途径来实现：一种是非血流依赖性的运动，主要是近距离的细胞募集，例如缺损组织相邻干细胞龛中的干细胞可以感应损伤产生的信号分子，通过主动的变形虫样运动，到达组织缺损区域，发挥再生作用；另一种是血流依赖性迁徙，主要是远程机体干细胞龛（例如骨髓）中干细胞的动员和归巢，包括细胞感受信号刺激，动员机体干细胞龛中干细胞入血，随血流（bloodflow）远程迁徙，最后到达损伤区域局部毛细血管，穿透血管壁，参与组织修复过程。由于减少了潜在的污染、过高的成本、免疫排斥以及复杂的体外规模培养技术等缺点,利用细胞因子和趋化因子等实现细胞归巢,可放大宿主自我修复潜能,因此细胞归巢技术似乎比细胞移植具备更多的优势。现在已经证实干细胞巢/巢存在于体内很多成体组织或器官中,包括脑、骨髓、外周血、血管、骨骼肌肉、皮肤、牙齿、心脏、肠、肝、卵巢上皮和睾丸等。尽管干细胞归巢的生物机制尚未完全阐明，但归巢的干细胞参与组织修复再生的现象已经引起了学者的高度关注，并在动物研究中得到证实。Kim等学者通过细胞归巢技术观察到牙髓样组织的异位再生。他们通过对临床拔除的人离体牙进行根管预备，包括牙髓拔除及机械预备，通过高温灭菌去除牙齿中的生物活性及有机成分，采用生长因子复合胶原支架植入离体牙内，经过3~6周大鼠皮下体内移植，可以观察到全长根管内形成牙髓血管、牙本质及神经复合物。该研究首次描述了通过内源性细胞归巢技术进行牙髓再生。他们选用一些生长因子如成纤维细胞生长因子，血管内皮细胞生长因子，神经生长因子（NGF）以及骨形态发生蛋白-7（,BMP-7）用于牙髓再生。细胞归巢的含义来源于骨髓移植后，造血干细胞（HSC）在体内的迁移，从骨髓到外周最终到达干细胞龛内。细胞归巢技术的最大优势在于能够利用宿主体内的细胞进行组织再生，从而避免外源性细胞处理过程。
3生物支架材料在牙髓再生中的应用
不论是细胞移植还是自体细胞归巢进行牙髓组织再生，生物支架材料的选择都是非常重要的考虑因素。使用能维持干细胞生存以及血管神经再生的支架材料，使组织工程牙髓进入临床应用变得更为现实。牙髓组织再生的支架材料应该具有如下特征：有合适的空隙率，便于植入干细胞或前体细胞及生长因子传递营养物质；具有可控的生物降解性，植入机体内的支架材料可被自体组织取代；优良的生物机械性，可供软硬组织附着的良好的生物活性；良好的生物相容性，无免疫排斥。目前牙髓组织再生的研究多集中于异位再生。天然多聚材料因含有天然的细胞外基质成分而具有良好的生物相容性及生物降解性。Zhang等使用胶原海绵、多孔陶瓷及纤维状钛网复合牙髓干细胞进行研究，4周后可以观察到牙本质涎蛋白的表达，裸鼠皮下植入细胞支架材料6~8周后，可以看到支架材料表面有牙本质涎蛋白的表达及结缔组织再生，而陶瓷组织则有钙化组织形成。聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸(PGA)和二者共聚物，是目前组织工程领域应用最广泛的材料之一。El-Backly等将从兔牙牙髓中提取的DPSC复合于PLGA上，并植入家兔皮下，12d后观察到牙骨质及管状牙本质的形成。Huang等将人SCAP及DPSC分别与PLGA复合并接种于长约6～7mm，孔径约2.5mm的牙本质管中，一端使用三氧矿物聚合物封闭1mm后植入裸鼠皮下，3月后观察发现，在管腔内充满有血管化的牙髓样组织;在牙本质管内壁上有连续的牙本质样物质沉积。这些材料的生物相容性好，降解速率可控，具有良好可塑性，能满足不同复合方法和置入条件的需要。胶原是一种天然的蛋白质，可从动物的皮肤、骨骼、韧带等组织中提取，因其优越的生物相容性、生物可降解和弱抗原性而被广泛应用于组织工程支架材料。Prescott等将DPSC联合牙基质蛋白(dentinmatrixprotein1，DMP1)与胶原支架复合后，接种于牙本质片上并植入裸鼠皮下，6周后观测到了牙髓样组织生成。通过细胞归巢技术，胶原凝胶溶液复合多种生长因子（如PDGF,FGF,VEGF等）可以观察到牙髓组织异位再生。
4生长因子在牙髓再生中的考虑
牙髓干细胞在牙髓组织中的增殖、分化、生存及活力受到多种信号分子、受体及转录因素的调控。不论采用干细胞移植技术还是基于细胞归巢技术进行牙髓再生研究，生长因子对牙髓细胞的作用均不可忽视。不同的信号通路参与调控牙髓再生的全过程，由多条信号通路交织成的调节网络在牙髓再生过程中发挥着必不可少的作用。牙髓细胞表达多种不同的生长因子，这些生长因子协同在病理生理条件下调节牙髓的血管形成及牙本质形成。血小板衍生生长因子（PDGF）是由血小板释放的生长因子，在血管形成及细胞增殖过程中发挥作用。有研究表明，PDGF能促进人牙髓组织中成纤维细胞增殖，并增强成骨细胞中VEGF表达并促进牙髓损伤部位血管形成。体内研究中，将根管处理后的人牙埋入大鼠背部，可以观察到PDGF能促进牙髓牙本质样组织形成。BMP2与VEGF是牙髓牙本质复合体中发现的生长因子，参与牙髓愈合反应过程。最近的研究表明VEGF与BMP2以剂量依赖方式相互作用，并在牙髓血管形成中发挥作用。转化生长因子在牙齿及牙本质发育过程中发挥作用。研究表明，TGF-β1能刺激Ⅰ型胶原合成，增强碱性磷酸酶活性，促进牙髓细胞增殖。Melin等学者研究表明TGF-β1参与调节牙髓组织的细胞增殖、迁移、细胞外基质形成过程。TGF-β1对根尖牙乳头来源及其他类型的细胞均有趋化作用。在细胞招募阶段，TGF-β1这种趋化性可以吸引更多的干细胞或前体细胞至牙齿受损部位。
5结语
综上所述，如何通过组织工程技术进行牙髓再生治疗，获得有活力的牙髓组织这一问题已经受到越来越多的关注。学者们开展了许多体内外研究，无论是干细胞移植还是无细胞移植的牙髓再生，已经获得了一些肯定的结果，但真正做到牙髓再生的临床转化工作，还有许多问题亟待解决。如何通过简单、低成本、易于操作的牙髓治疗方式让牙髓恢复活力，成为目前学者们竞相思考的问题。
作者：李琳 王佐林 单位：同济大学口腔医学院口腔生物医学及转化医学实验室牙体牙髓教研室
