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摘要:间充质干细胞成骨分化能力异常减弱和成骨细胞数量异常下降都会导致生物体内骨代谢紊乱，诱导骨质疏松症的发生。线粒体在MSC多能性保持和成骨分化过程中具有十分重要的作用，通过能量代谢、抗氧化途径、代谢相关信号通路、线粒体生物发生、线粒体动力学和线粒体自噬等参与间充质干细胞成骨分化的调控，形成了复杂的调节网络。本文综述了MSC成骨分化中线粒体的重要功能和作用，以及部分通过调节线粒体功能发挥抗骨质疏松治疗的药物，为进一步探讨间充质干细胞成骨分化功能失调的机制提供新的思路，为临床治疗骨质疏松症提供新的靶点。
关键词:线粒体;间充质干细胞;成骨细胞;成骨分化
成骨细胞和破骨细胞功能的动态平衡在维持正常骨代谢和骨骼结构中至关重要［1］。间充质干细胞(mesenchymalstromalcell，MSC)是多能分化干细胞，在健康状态下能够分化为成骨细胞、成脂细胞和成软骨细胞，并维持自我更新和分化的平衡。MSC向成骨细胞分化能力异常减弱和成骨细胞数量异常减少均会导致骨稳态平衡破坏，从而引起骨量丢失、骨微结构破坏，诱导骨质疏松症的发生［2-3］。线粒体是主要的细胞供能细胞器，是细胞内的半自主调节细胞器。近年来，大量研究揭示了线粒体在干细胞维持和分化中的重要机制和作用［4-5］。研究［6］表明，线粒体与MSC功能及其成骨分化过程密切相关。所以，本文通过综述线粒体在MSC成骨分化中的重要功能和作用，为进一步研究MSC成骨分化功能失调的机制和骨质疏松治疗的药物靶点提供新的思路。
1线粒体在MSC成骨分化中的作用
1.1线粒体功能
1.1.1线粒体能量代谢参与MSC成骨分化:细胞内能量代谢包括细胞质中的糖酵解和线粒体中的氧化磷酸化反应。MSC主要依赖糖酵解产能，无论是在体内、体外或者低氧环境都更有利于MSC保持增殖和分化潜能。在MSC分化过程中，成软骨分化同样依赖于糖酵解供能，而成骨分化和成骨细胞则更多的通过线粒体氧化磷酸化获取能量［7］。在成骨分化的过程中，细胞耗氧量和内源性ATP生成量都会显著提高，抑制线粒体功能并阻碍成骨分化［8-9］。Gao等［9］使用剂量为1μmol/L的细胞呼吸复合物抑制剂Ｒotenone抑制MSC线粒体复合物I的活性，体外成骨诱导后发现抑制剂组茜素红染色和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性显著降低，提示MSC的成骨分化受到显著抑制。Hollenberg等［10］使用乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)抑制剂草氨酸盐处理C3H10T1/2细胞系和人MSC细胞系，拮抗了细胞糖酵解反应，细胞的成骨矿化能力显著提高，动物实验中使用草氨酸盐显著提高了小鼠长骨骨量及其生物力学强度。所以，MSC从糖酵解到线粒体氧化磷酸化产能的生物学转换在成骨分化过程扮演十分重要角色，通过药物干预线粒体氧化磷酸化途径成为潜在的治疗骨质疏松症的措施。
1.1.2线粒体抗氧化途径参与MSC成骨分化:成骨分化过程中，能量代谢向氧化磷酸化转变后，在细胞内产生大量的活性氧(reactiveoxygenspecies，ＲOS)，同时激活线粒体抗氧化途径，抑制内源性的ＲOS累积［11］。在MC3T3-E1细胞系中活性氧水平升高会抑制细胞成骨矿化能力，因此激活MSC抗氧化途径可以提高细胞成骨能力和促进体内骨形成［12］。外源性的H2O2同样降低了细胞成骨分化过程中ALP活性，延缓或抑制成骨分化，而使用抗氧化药物则可以恢复线粒体功能，促进MSC的成骨分化［13-14］。线粒体具有酶和非酶抗氧化防御系统，非酶抗氧化系统包括细胞色素C、维生素C、还原性辅酶Q10等成分，酶系统包括Mn-sod、谷胱甘肽还原酶、过氧化物酶等［8］。Chen等［11］研究发现，成骨分化过程中超氧化物歧化酶2和过氧化氢酶表达量显著提高，降低细胞内ＲOS水平，进而提高MSC的成骨分化能力。Gao等［9］研究证明，在MSC中敲除线粒体Mn-sod，能够抑制细胞成骨分化，而Sirt3是一种关键线粒体相关蛋白，能够通过FOXO3a去乙酰化、增强超氧化物歧化酶2的活性等机制减少ＲOS产生，在Sirt3敲除小鼠模型中同样出现了明显的成骨障碍和骨质疏松表型。同样，铁离子过载能够激活线粒体中渗透性转换，诱导成骨细胞中的ＲOS大量产生，形成铁死亡，从而达到抑制细胞成骨能力［15］。当使用外源性的物质减少细胞内ＲOS含量，能够达到促进MSC成骨分化，达到治疗骨质疏松的目的。Jin等［16］使用唑来膦酸与MSC共培养，发现能够逆转H2O2造成的ＲOS水平升高，上调ALP、ＲUNX2和BGLAP的水平，并且以剂量依赖性的方式提高BMSC中ALP的活性和细胞成骨矿化能力。因此，在MSC成骨分化过程中，线粒体的抗氧化途径与氧化磷酸化能量代谢产生的大量ＲOS维持着关键平衡，对成骨能力至关重要。
1.1.3线粒体代谢相关信号通路参与MSC成骨分化:线粒体在氧化磷酸化产生ATP的同时，还参与了细胞内信号通路的调节，通过细胞内信号通路参与间充质干细胞的成骨分化。β-catenin信号通路在成骨分化过程中至关重要，Lee等［17］研究发现，成骨分化时细胞内线粒体氧化磷酸化水平上调，导致乙酰辅酶A含量增加，促进β-catenin的乙酰化和稳定，从而激活β-catenin信号通路及其下游成骨相关信号分子，如ＲUNX2和OSX等［8］。除此以外，Notch信号通路，Hif-1α［18］等同样参与线粒体代谢信号通路的调节。
1.2线粒体的生物发生参与MSC成骨分化
线粒体的生物发生过程通过原有线粒体的生长和分裂发生，与细胞周期、细胞功能、氧化应激等密切相关。2008年，Chen等［11］研究发现，在人MSC成骨分化过程中，线粒体膜电位、呼吸酶复合物、耗氧量和细胞内ATP含量均升高，mtDNA的拷贝数增加，成骨诱导促进线粒体的生物发生。An等［19］发现，Wnt-3a通过增加线粒体发生来促成骨分化，而当在研究中使用线粒体生物发生抑制剂zidovudine，则显著抑制了间充质干细胞的成骨分化能力。过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgammacoactivator1-alpha，PGC-1α)是线粒体生物发生的主要调节因子，在成骨分化过程中起到十分重要作用。Yu等［20］研究证明，PGC-1α完全敲除的骨骼干细胞的碱性磷酸酶活性较低、矿化成骨能力较差，而PGC-1α过表达则显著增强了Ｒunx2、Ibsp、Col1a1和Bglap等成骨标记基因的表达，增强了细胞的成骨能力。而在体内实验中，作者发现PGC-1α的表达随着年龄增加而减少，其缺失促进骨骼老化过程中的骨质流失，并增加了骨髓内的脂肪含量。
1.3线粒体动力学参与MSC成骨分化
根据细胞功能和需求不同，线粒体通过融合、裂变、降解等线粒体动力学行为满足MSC细胞需求。在未分化的间充质干细胞中，线粒体呈破碎球形，随着间充质干细胞的成骨分化、成脂分化和成熟，线粒体呈细长型，均匀的分散在整个细胞质内［21-22］，而这些形态和分布变化与细胞代谢的转变相关［23］。线粒体融合主要由GTPase同源物Mfn1和Mfn2介导，Forni等［24］研究发现，线粒体膜蛋白Mfn2调节了线粒体融合，Mfn2敲低可以导致线粒体融合和耗氧量减少，从而导致间充质干细胞分化受损，Mfn2敲低阻碍成骨钙化和抑制Ｒunx2等成骨关键基因的表达。同时，线粒体的嵴形态在成骨分化中扮演重要角色。mitofilin/mic60是线粒体接触位点和嵴系统核心成分，mitofilin不足会导致碱性磷酸酶活性降低，减弱成骨矿化能力。成骨分化时，mitofilin表达增加，从而与线粒体转录因子A和B2相互作用，促进线粒体DNA转录，增强氧化磷酸化代谢活性［25］，而当敲低mitofilin后，线粒体膜稳定性受抑制，同时抑制了mtDNA转录和ATP产生，最终成骨分化受到显著抑制，导致成骨缺陷［26］。所以，线粒体动力学在MSC成骨分化中具有重要作用，通过干预线粒体的融合、裂变、降解等线粒体动力学行为，能够实现调节MSC成骨分化和成骨细胞的功能。
1.4线粒体自噬参与MSC成骨分化
线粒体自噬能够清除受损线粒体，以此保证细胞内线粒体功能和质量。线粒体自噬通过选择性隔离和降解功能失调或衰老的线粒体，在干细胞维持中发挥了重要作用。研究人员发现，将MSC置于21%氧含量条件下培养，氧化应激会激活Pink1/Parkin介导的线粒体自噬途径，诱导MSC释放包含完整线粒体或线粒体结构的囊泡，囊泡内含有细胞溶质微管相关蛋白轻链3(LC3-I)和自噬相关蛋白12，当使用巴弗洛霉素A1或低浓度(3～5μmol/L)氯喹药物阻断线粒体自噬时，MSCs表现出明显的细胞凋亡。PINK1(PTEN-inducedkinase1)是线粒体中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞线粒体自噬的关键调节因子，其缺乏会影响线粒体稳态、导致受损线粒体积累［27］，而在MC3T3-E1细胞系中，PINK1是成骨分化的正调节因子，敲低PINK1会损害成骨分化过程中线粒体稳态［28］，在成骨分化过程中，线粒体自噬缺陷导致MSC成骨分化过程中无法维持健康线粒体而降低骨量［29］，而在Pink1－/－小鼠中，卵巢切除后加剧骨质流失［28］。以上表明线粒体自噬对于MSC成骨分化至关重要，但是深层次的机制仍需要进一步研究［30］。
2靶向线粒体的骨质疏松治疗策略
目前对于骨质疏松和骨衰老的细胞疗法中，包括移植健康MSCs，使用促进MSCs成骨、抑制破骨细胞功能的药物等。线粒体功能相关，如能量代谢、活性氧和抗氧化途径等，在MSCs的成骨分化和功能维持中起到至关重要的作用，调节线粒体功能相关的药物越来越多的展现出抗骨衰老和治疗骨质疏松的功能(表1)。白藜芦醇是一种天然多酚类化合物，是SIＲT1和AMPK信号通路的激活剂，提高PGC-1α活性，从而增强线粒体功能，促进MSC成骨分化。另一方面，白藜芦醇［26］能够上调mitofilin表达调节线粒体稳定性，延缓MSCs衰老，同时能够增加碱性磷酸酶活性和钙沉积，增加线粒体mtDNA拷贝数，在成骨分化过程中促进线粒体生物发生，从而提升成骨分化能力。此外，白藜芦醇还能够显著改善MSCs内的氧化应激［31］。二甲双胍在体外能够促进MSCs的成骨分化，调节正常和糖尿病缺陷MSC的成骨分化和骨再生。二甲双胍［32］具有抗氧化作用，能够上调SIＲT3蛋白的表达减轻成骨细胞的氧化应激反应［33］。雷帕霉素是广泛应用的mTOＲ抑制剂，可以通过激活线粒体自噬改善线粒体呼吸并且促进线粒体自我更新和质量控制。研究［34］发现，雷帕霉素能够在多种小鼠骨质疏松动物模型中改善MSC成骨分化能力，挽救骨量丢失。许多中药也能够影响线粒体代谢，其中有效成分如肉桂苷A［35］、三七皂苷Ｒ1［36］、芍药苷-3-O-葡萄糖苷［37］等在修复线粒体损伤方面也具有重要作用。三七皂苷Ｒ1［36，38］作为天然小分子，能够抑制JNK信号通路激活，拮抗活性氧诱导的线粒体损伤，恢复成骨细胞活力和成骨分化功能。3总结线粒体的稳定是细胞功能维持的核心，线粒体功能障碍或失调，将会影响间充质干细胞多能性维持和增殖分化能力(图1)，也会影响成骨细胞的成骨矿化能力。线粒体在骨骼及相关组织的发育和稳态维持等方面具有关键作用。以线粒体为靶点的药物在治疗骨质疏松等领域已经取得了一定的进展，如何维持线粒体氧化磷酸化功能、降低ＲOS水平、维持线粒体稳态、促进线粒体生物发生，成为骨质疏松和骨衰老治疗的新的方向。
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作者:胡淼 孟怡辰 周许辉 单位:海军军医大学长征医院骨科