前言：寻找写作灵感？中文期刊网用心挑选的下瘀血汤对肝癌细胞生物活性的影响，希望能为您的阅读和创作带来灵感，欢迎大家阅读并分享。
摘要：研究下瘀血汤对肝癌细胞的作用以及对 Ｎａｎｏｇ信号通路的影响。方法：将 ＨｅｐＧ２细胞分为空白血清组、低剂 量含药血清组、中剂量含药血清组；高剂量含药血清组，通过 ＭＴＴ、流式细胞仪、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ测肝癌细胞增殖、凋亡及侵袭情 况，实时 ＰＣＲ、蛋白质印迹法测 ＮａｎｏｇｍＲＮＡ、Ｂｃｌ ２、胱天蛋白酶 ３水平。结果：空白血清组肝癌细胞的 ＯＤ值及侵袭数量 高于中剂量、高剂量含药血清组（Ｐ＜０ ０５），肝癌细胞凋亡率低于低剂量、中剂量、高剂量含药血清组（Ｐ＜０ ０５），高剂量 含药血清组肝癌细胞 ＯＤ值及侵袭数量最少、凋亡最高；空白血清组肝癌细胞中 ＮａｎｏｇｍＲＮＡ及 Ｂｃｌ ２蛋白表达高于低剂 量、中剂量、高剂量含药血清组（Ｐ＜０ ０５），胱天蛋白酶 ３的蛋白表达水平低于低剂量、中剂量、高剂量含药血清组（Ｐ＜ ０ ０５），与低剂量、中剂量剂量含药血清组比较，高剂量含药血清组肝癌细胞中 ＮａｎｏｇｍＲＮＡ及 Ｂｃｌ ２蛋白表达明显降低 （Ｐ＜０ ０５），胱天蛋白酶 ３蛋白表达显著升高（Ｐ＜０ ０５）。结论：下瘀血汤通可抑制肝癌细胞的活性及其侵袭力、促进癌 细胞的凋亡，其作用机制可能调控与 Ｎａｎｏｇ信号通路，从而促进胱天蛋白酶 ３的表达、抑制 Ｂｃｌ ２水平有关。
关键词 ：下瘀血汤；肝癌细胞；Ｎａｎｏｇ信号通路；肝癌细胞活性；肝癌细胞凋亡；肝癌细胞侵袭；Ｂ细胞淋巴瘤 ２；胱天蛋白酶 ３
肝癌是一种发生在肝脏的恶性肿瘤，其发病率 较高，致死人数较多。据相关数据统计表明，世界上 每年约 ６０万人患肝癌，在我国，患有肝癌的人数占 全世界的 ５０％之多［ １ ２］ 。早期肝癌患者无明显的症 状，患者在检查时多为中晚期，因此导致肝癌晚期患 者在 ５年内的生存率仅有 ５％［ ３ ４］ 。对于癌症的治 疗，我国目前主要以手术以及化疗为主，但化疗的耐 药性较强，使得患者在的预后达不到理想目标。近 年来，中药在临床上对于治疗肝癌具有一定的优势， 中药中下瘀血汤最早用于妇女产后淤血等，根据近 年来的实验研究发现，下瘀血汤可抗肝纤维化、防治 肝硬化［ ５ ６］ 。下瘀血汤由生大黄、桃仁、錎虫等多为中药组成，周岱翰教授运用下瘀血汤治疗肝癌积累 了丰富经验［ ７］ 。Ｎａｎｏｇ（胚胎干细胞转录因子）是一 种与干细胞特性相关的转录因子，近年来研究表明， 癌细胞中的干细胞样特性（为高表达干细胞相关基 因特征）与肿瘤的恶性发展及预后联系密切，因此 Ｎａｎｏｇ在肿瘤中的作用引起了医学界的重视［ ８ ９］ 。 至今，在前列腺癌等多种癌症中均发现 Ｎａｎｏｇ的表 达异常，在 肺 癌 细 胞 体 内 成 瘤 的 过 程 中 也 发 现 Ｎａｎｏｇ的异常表达［ １０ １１］ ，但对于癌细胞活性的具体 作用机制目前为止尚不明确，因此本研究探讨下瘀 血汤对肝癌细胞的作用及对 Ｎａｎｏｇ的影响。
１ 材料与方法
１ .１ 材料
１ .１ .１ 动物 选取 １０只 ６～８周龄健康 ＳＤ大鼠， 雄性，体质量（０ １２±０ ０２）ｋｇ，购自上海西唐生物公 司（动物合格证号：粤检证字第 ９５Ａ０８号）。常规饲 养，自由饮食饮水，饲养 １周后进行实验。人肝癌细 胞 ＨｅｐＧ２来自广州吉妮欧公司，置于 ３７℃、５％的 ＣＯ２培养箱内培养 ４ｈ，待细胞完全贴壁后，更换培 养液（１０％胎牛血清杜尔贝科改良伊格尔培养基 （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）），待细 胞融合度到 ８０％～９０％时，传代，吸弃培养基，磷酸 盐缓冲液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）冲洗 ３次， 胰蛋白酶（０ ２５％）消化，完全培养基中断。将剩余 贴壁细 胞 吹 打 脱 落，收 集 细 胞 悬 液 至 离 心 管 中 （１５ｍＬ）离心 ５ｍｉｎ，离心半径 ８ｃｍ，１５００ｒ／ｍｉｎ。 去上清液，重悬，按 １∶３比例接种到新的培养瓶，作 好标记，继续培养。取 ３～５代细胞用于实验。本研 究已通过南方医科大学珠江医院医学伦理委员批准 （伦理审批号：２０１７ ０７４）。 １. １. ２ 药物 下瘀血汤：生大黄（四川商宇药业公 司，批号：０７４１８０８０１），桃仁（上海哈灵公司，批号： １２０９５３ ２００７０５），錎 虫 （广 东 三 蓝 公 司，批 号： Ｚ１９９９１１０１），由南方医科大学珠江医院中药制剂室 煎制，浓度为每毫升含生药量 ０ ４ｇ。 １ .１. ３ 试剂与仪器 ＤＭＥＭ培养液（上海吉诺生物 公司，货号：ＣＭ０１０４），胎牛血清（杭州沃丰生物公 司，货号：ＳＦＢＥ），酶标仪（上海闪谱科技公司，型号： ＲｅａｄＭａｘ１９００），流式细胞仪（赛默飞世尔科技生命 科学产品，型号：ＡｔｔｕｎｅＮｘＴ），胰蛋白酶（上海实维 仪器技术公司，型号：９００２ ０７ ７）。
１. ２ 方法
１. ２ .１ 分组与含药血清制备 将培养的人肝癌细 胞 ＨｅｐＧ２采用数字随机法分为空白血清组、低剂量含药血清组、中剂量含药血清组、高剂量含药血清 组。１０只大鼠采用数字随机法分为正常组及下瘀 血汤汤组，常规喂养，下瘀血汤组灌服（２２ １５ｇ／ｋｇ） 水煎浓缩液，正常组给予同等剂量蒸馏水灌胃，２ 次／ｄ，共干预 １周，最后一次灌胃 ２ｈ后，正常组及 下瘀血汤组大鼠均戊巴比妥麻醉（３％），心脏取血， 分离血清，－２０℃保存备用。 １. ２ .２ 下瘀血汤干预方法 空白血清组：正常细胞 在 １５０μＬ１０％大鼠空白血清培养基 ＋１３ ５ｍＬ无 血清培养基；低剂量含药血清组：正常细胞在 ７５μＬ ２ ５％大鼠下瘀血汤含药血清 ＋７５μＬ７ ５％大鼠空 白血清培养基 ＋１３ ５ｍＬ无血清培养基；中剂量含 药血清组：正常细胞在 ７５μＬ５％大鼠下瘀血汤含药 血清 ＋７５μＬ５％大鼠空白血清培养基 ＋１３ ５ｍＬ无 血清培养基；高剂量含药血清组：正常细胞在１５０μＬ １０％大鼠下瘀血汤含药血清 ＋１３ ５ｍＬ无血清培 养基。 １. ２. ３ 检测指标与方法 １ .２ .３. １ ＭＴＴ检测各组肝癌细胞活性 将各组癌 细胞（３×１０３个／孔）接种到 ９６孔板中，贴壁后饥饿 ２４ｈ，待细胞的密度培养到 ５０％时，更换培养基，加 入 ＭＴＴ于 ３７ ５℃，５％ＣＯ２下培养，４ｈ后离弃上清 液，加入 ＤＭＳＯ，采用酶标仪于 ４９０ｎｍ波长下测定 光密度 ＯＤ值。 １ .２. ３ .２ 实时 ＰＣＲ检测各组 Ｎａｎｏｇ的表达 用 Ｔｒ ｉｚｏｌ裂解各组 ＨｅｐＧ２细胞，提取 ＲＮＡ并逆转录，将 逆转后所得的 ｃＤＮＡ进行荧光反应实验。扩增条件 为，９４℃预变性 ５ｍｉｎ后，９４℃ ３０ｓ，５５℃ ３０ｓ， ７２℃ １ｍｉｎ，共 ３５ｃｙｃｌｅ，７２℃延长 １０ｍｉｎ，以甘油 醛 ３ 磷酸脱氢酶（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３ ｐｈｏｓｐｈａｔｅＤｅｈｙ ｄｒｏｇｅｎａｓｅ，Ｇ３ＰＤＨ）为内参。引物序列见表 １。１ .２. ３ .３ 蛋白质印迹法检测 Ｂｃｌ ２、胱天蛋白酶 ３ 的表达 将 ＨｅｐＧ２细胞细胞进行裂解并提取核蛋 白，并对核蛋白的浓度进行测量，分装后，保存在零 下 ２０℃的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶 液进行混均，按照 ４∶１的比例进行电泳。后将蛋白 样品（５０μｍ）转移聚偏二氟乙烯（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅｆｌｕｏ ｒｉｄｅ，ＰＶＤＦ）膜上，脱脂奶粉封闭 １ｈ。加入 １抗按１∶１００稀释后孵育过夜，ＴＴＢＳ漂洗 ３次，１０ｍｉｎ／次， 最后加入 ２抗对溶液稀释，常温封闭。取出 ＰＶＤＦ 膜，漂洗 １次／隔 １０ｍｉｎ，共 ３次，二氨基联苯胺（３， ３′ ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＤＡＢ）显色后照相，后计算其蛋 白表达含量。 １. ２. ３ .４ 流失细胞仪检测各组肝癌细胞的凋亡情 况 收集细胞（２×１０５／孔）接种于 ６孔板中，胰蛋白 酶消化，完全培养基终止；ＰＢＳ清洗，进行细胞计数， １２５０ｒ／ｍｉｎ，离心半径 ８ｃｍ，离心 ６ｍｉｎ，弃上清，混 入 ５００μＬＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（结合缓冲液）重悬。加入 ５μＬＡｎｎｅｘｉｎＶ ＦＩＴＣ混匀、１０μＬ碘化丙啶（Ｐｒｏｐｉｄ ｉｕｍＩｏｄｉｄｅ，ＰＩ）混匀，室温避光孵育 ５～１５ｍｉｎ，随即 进行流式细胞仪检测。 １ .２ .３ .５ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ法检测各组肝癌细胞的侵袭力 各组 ＭＣＦ ７细胞接种与 ６孔板中，将 ５０ｍｇ／Ｌ 的基质胶稀释后加入小室上层，３７℃下呈凝胶状 态，细胞数目为 １×１０５／ｍＬ，上室中加入细胞悬液， 下室中加入少量胎牛血清培养基，３７ ５℃，培养２ｄ， 取出 培 养 基，拭 去 残 留 细 胞，现 配 结 晶 紫，每 孔 ５００μＬ，将小室放入，２５℃染色 ３０ｍｉｎ，ＰＢＳ清洗 １ 次，晾干。显微镜观察每个样本连续选 ５清晰视野 进行数量统计，然后计算器平均数。
１ .３ 统计学方法
采用 ＳＰＳＳ２１ ０统计软件进行 数据分析，采用单因素方差分析或重复测量方差分 析，计量资料采用均数 ±标准差（珋ｘ±ｓ）表示，以 Ｐ＜ ０ ０５为差异有统计学意义。
２ 结果
２ .１ 肝癌细胞活性比较
４组肝癌细胞 ＯＤ值随着 时间的延长均有所增加，空白血清组与低剂量含药 血清组在不同时间点的细胞活性均较为接近（Ｐ＞００５）空白血清组在 ２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ时 ＯＤ值均高于 中剂量、高 剂 量 含 药 血 清 组，差 异 有 统 计 学 意 义 （Ｐ＜００１），低剂量含药血清组、中剂量含药血清 组、高剂量含药血清组任意 ２组比较，差异有统计学 意义（Ｐ＜０ ０１）。见表 ２。
２ .２ 肝癌细胞中 ＮａｎｏｇｍＲＮＡ的表达结果比较
空白血清组肝癌细胞中ＮａｎｏｇｍＲＮＡ的水平高于低剂量、中剂量、高剂量含药血清组，差异有统计 学意义（Ｐ＜００１），低剂量含药血清组、中剂量含药 血清组、高剂量含药血清组任意 ２组肝癌细胞中 ＮａｎｏｇｍＲＮＡ的水平比较，差异有统计学意义（Ｐ＜０ ０１）。见表 ３。
２ .３ 肝癌细胞中 Ｂｃｌ２
胱天蛋白酶 ３蛋白表达结 果比较 空白血清组肝癌细胞中 Ｂｃｌ２的蛋白表达 水平高于低剂量、中剂量、高剂量含药血清组（Ｐ＜００１），胱天蛋白酶 ３的蛋白表达水平低于低剂量、 中剂量、高剂量含药血清组（Ｐ＜００１）；低剂量、中 剂量、高剂量含药血清组 ３组肝癌细胞中 Ｂｃｌ ２、胱 天蛋白酶 ３蛋白任意 ２组比较，差异均有统计学意 义（Ｐ＜００１）。见图 １、表 ４。
２. ４ 肝癌细胞凋亡率比较
空白组肝癌细胞凋亡 最少，随着药物剂量的增加肝癌细胞凋亡增加，Ｑ２ 与 Ｑ４相加显示肝癌细胞凋亡数量。见图 ２。空白 血清组肝癌细胞凋亡率与低剂量含药血清组比较明 显降低（Ｐ＜０ ０１），中剂量含药血清组肝癌细胞凋 亡率高于低剂量含药血清组（Ｐ＜０ ０１），与中剂量 含药血清组比较，高剂量含药血清组肝癌细胞凋亡 率显著升高（Ｐ＜０ ０１）。见表 ５。
２. ５ 肝癌细胞侵袭能力比较
空白血清组肝癌细 胞的侵袭数量高于低剂量含药血清组（Ｐ＜００１）， 中剂量含药血清组肝癌细胞的侵袭数量低于低剂量 含药血清组（Ｐ＜０ ０１），高剂量含药血清组肝癌细 胞的侵袭数量最少，显著低于其他 ３组（Ｐ＜０ ０１）。 见图 ３、表 ６。
３ 讨论
研究发现诱发肝癌因素有多种，如病毒性肝炎、 酒精性肝病等，患有乙肝、肝硬化患者肝癌发病率较 高［ １２］ 。肝癌干细胞是肝癌的起始细胞，是一种具有 很强的增殖分化能力的细胞，目前 Ｎａｎｏｇ是肝癌干 细胞的标志物，其对于干细胞的增殖分化等具有一 定的调控作用［ １３］ ，有关研究发现，肝癌干细胞的增 殖分化越强时，Ｎａｎｏｇ的表达水平越高，但目前为止 未发现有何中药物可调控其的表达，本研究探讨药 物对 Ｎａｎｏｇ的影响以及对肝癌细胞的作用。 图 ３ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ法检测各组肝癌细胞侵袭力 （结晶紫染色，×４００） 表 ６ 各组细胞凋亡率比较（珋ｘ±ｓ，％） 组别 细胞凋亡率 空白血清组 ８２ ３５±７ ２６ 低剂量含药血清组 ７５ １８±６ ７５中剂量含药血清组 ６２２３±５８２高剂量含药血清组 ５４２７±６ ５７注：与空白血清组比较，Ｐ＜０ ０１；与低剂量含药血清组比 较，Ｐ＜０ ０１；与中剂量含药血清组比较，Ｐ＜０ ０１ 下瘀血汤中大黄具有清瘀热、活血化瘀等作用， 其性寒，药性沉稳；桃仁具有去除瘀血的功效，善于 破除血滞［ １４］ ；下瘀血汤中大黄的有效成分大黄素根 据多种研究证实可阻碍多种肿瘤细胞的分化及增 殖。根据相关研究表明，下瘀血汤中的桃仁可抗血 栓、抗肿瘤等作用；土鳖虫可破血逐瘀消积，具有促 进胃癌等癌细胞凋亡等作用。在耿燕楠［ １５］ 研究下 瘀血汤对胃癌细胞的实验中表明，其可促进胃癌细 胞的凋亡并抑制其生长。根据张浩等［ １６］ 研究发现， 下瘀血汤通过下调核仁纺锤相关蛋白 １（Ｎｕｃｌｅｏｌａｒ Ｓｐｉｎｄｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎ１，Ｎｕｓａｐ１）的表达进而阻 碍肝癌细胞的增殖，同时又促使肝癌细胞凋亡加速。 本研究的结果与上述研究结果相似。 肝癌干细胞具有自我复制、多项分化及自我增 殖的功能，在体外特定条件下培养可抑制其分化， Ｎａｎｏｇ可通过结合靶基因调控区，可有效的抑制其 分化基因的表达［ １７］ 。Ｎａｎｏｇ在肝癌细胞中水平生 升高是由于 Ｎａｎｏｇ具有自我分化分能力，在受到刺 激后表达增高可影响癌细胞发展进程，使其分化增 加，导致癌症恶化。曾金敏等［ １８］ 研究 Ｎａｎｏｇ对膀胱 癌作用机制中发现，Ｎａｎｏｇ被沉默后基质金属蛋白 酶 ２、基质金属蛋白酶 ９的表达降低，且侵入到衬垫 •６３７２• ＷＯＲＬＤＣＨＩＮＥＳＥＭＥＤＩＣＩＮＥ Ｏｃｔｏｂｅｒ．２０２２，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．１９膜外侧的 Ｔ２４细胞减少，其癌细胞侵袭力降低。杨 晓文等［ １９］ 对肝癌细胞的研究中提出，下调 Ｎａｎｏｇ的 水平，可抑制癌细胞的增殖。本研究与上述研究结 果相似，因此本研究认为，下瘀血汤可能是通过下调 Ｎａｎｏｇ水平减少癌细胞的活性。 Ｂｃｌ ２（Ｂ细胞淋巴瘤 ２）是凋亡抑制的标志物， 可聚集机体内突变的物质，促使癌细胞发生发展， Ｂｃｌ ２可通过 Ｐ２７来抑制细胞周期 Ｇ１／Ｓ转换，具有 抑制细胞凋亡的作用［ ２０］ 。刘晓宇和张红［ ２１］ 研究半 边莲煎剂对肝癌的作用及对肝癌中 Ｐ２７及 Ｂｃｌ ２的 影响时发现，半边莲煎剂可以抑制肝癌的发展，其作 用机制可能与半边莲抑制剂减弱了 Ｂｃｌ ２的表达、 提高了 Ｐ２７的表达有关。大黄是下瘀血汤中的一味 中药材。孙玮［ ２２］ 研究乳腺癌的研究中提出，大黄可 降低 Ｂｃｌ ２的水平，促进癌细胞的凋亡。 胱天蛋白酶 ３是由多腺苷二磷酸核糖聚合酶 及 ＡＰＤ 核糖组成细胞凋亡的执行蛋白酶，是一种凋 亡信号蛋白，对于细胞凋亡凋亡有正向促进作用，当 细胞凋亡时，多腺苷二磷酸核糖聚合酶的联系被切 断，使锌指结构与催化区域分离，导致功能发挥异 常，加剧凋亡［ ２３］ 。孙媛和李青山［ ２４］ 等通过沙利度 胺联合叶酸、氟尿嘧啶、奥沙利铂（ＦｏｌｉｎｉｃＡｃｉｄＦｌｕ ｏｒｏｕｒａｃｉｌＯｘａｌｉｐｌａｔｉｎ，ＦＯＬＦＯＸ）促进了肝癌细胞凋亡 的研究发现，其作用机制与激活胱天蛋白酶 ３信号 通路有关。根据耿燕楠［ １５］ 的研究表明，下瘀血汤对 于胃癌裸鼠移植瘤生长抑制作用的研究发现，下瘀 血汤对胃癌裸鼠异种移植瘤的抑制率为 ３６５％，其 机制与调控胱天蛋白酶 ３、Ｂｃｌ ２蛋白表达有关，这与 本研究结果相似，说明下瘀血汤促进肝癌细胞凋亡可 能与下调 Ｂｃｌ２、提高胱天蛋白酶 ３的表达有关。 综上所述，下瘀血汤通可抑制肝癌细胞的活性 及其侵袭能力、促进癌细胞的凋亡，其作用机制可能 调控与 Ｎａｎｏｇ信号通路，从而促进胱天蛋白酶 ３的 表达、抑制 Ｂｃｌ ２水平有关。
作者:莫国臻 黄关璇 石宇昕 吴秀芹 曹传辉 单位:南方医科大学珠江医院