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【摘要】探讨定坤丹口服液与定坤丹水蜜丸对雌性去势大鼠模型的性激素调节作用，并对两种 剂型的药效进行对比。方法：将雌性 SD 大鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组（给予补佳乐 0. 12 mg/kg）、定坤丹水蜜丸组（给药剂量为 1. 75 g/kg）以及定坤丹口服液高、中、低剂量组（给药剂量分 别为 10、5、2. 5 mL/kg）。除空白组外，其余大鼠采用手术去除双侧卵巢的方法建立去势大鼠模型，术 后 1 周开始灌胃给药，每天灌胃 1 次，连续灌胃 4 周。给药期间观察大鼠一般状态；ELISA 法检测大鼠 血清中卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）、前列腺素 E2（PGE2）及前列腺素 F2α（PGF2α）水平的变化情况；取全血放入促凝管中测定凝血功能；摘取子宫计算脏器系数，并通过 HE 染色法检测大鼠子宫的病理变化。结果：给药期间，与模型组相比，定坤丹口服液中剂量组大鼠体 质量明显增加（P < 0. 01），与定坤丹水蜜丸组相比差异无统计学意义（P > 0. 05）；子宫指数结果显示， 与模型组相比，定坤丹口服液各剂量组、定坤丹水蜜丸组及阳性对照组大鼠子宫指数均较模型组显著 升高（P < 0. 01）；凝血功能结果显示，与模型组相比，定坤丹口服液高剂量组大鼠的 PT 值显著降低 （P < 0. 05），定坤丹口服液高、中剂量组及定坤丹水蜜丸组大鼠的 TT 值较模型组明显降低（P < 0. 01， P < 0. 05），定坤丹口服液与定坤丹水蜜丸组大鼠 PT 及 TT 值相比差异无统计学意义（P > 0. 05）；ELISA 结果显示，与模型组相比，定坤丹口服液各剂量组、定坤丹水蜜丸组大鼠血清 P、E2、PGE2 水平均不同 程度升高，LH、FSH、PGF2α 水平均不同程度降低（P < 0. 05 或 P < 0. 01），其中定坤丹口服液高剂量组 大鼠 PGE2 水平、中剂量组大鼠 FSH 的水平优于定坤丹水蜜丸组（P < 0. 01，P < 0. 05）；病理检查结果 显示，与模型组相比，各给药组大鼠子宫均有不同程度的萎缩，水蜜丸组及定坤丹口服液高剂量组大 鼠子宫萎缩情况减轻，间质细胞排列密集，两者相比无统计学意义。结论：定坤丹口服液与定坤丹水 蜜丸对去势大鼠模型均有显著的治疗作用，能升高大鼠血清 P、E2、PGE2 水平，降低 LH、FSH、FGF2α 水 平，二者药效无明显差异。
【关键词】定坤丹口服液；定坤丹水蜜丸；去势大鼠模型；卵巢功能不全；药效对比
定坤丹由红参、鹿茸、西红花等药物组成，具有滋 补气血、调经舒郁的功效，主要用于气血两虚、气滞血 瘀所致的月经不调、行经腹痛、崩漏下血、赤白带下、血 晕血脱、产后诸虚和骨蒸潮热等，被广泛应用于妇科疾 病，如卵巢功能不全、月经病、不孕症和更年期综合征 等［1］。目前定坤丹产品主要有口服液、水蜜丸与大蜜 丸 3 种剂型，其中定坤丹口服液具有口感好、吸收快且 起效迅速的优点，而定坤丹水蜜丸则具有作用缓慢、药 效持久且容易保存的优点。本实验通过复制雌性去势 大鼠模型，使大鼠处于卵巢功能缺失状态，从而引起大 鼠雌激素分泌紊乱，以此来探究定坤丹口服液及定坤 丹水蜜丸对卵巢功能的调节作用，同时对二者的药效 进行对比。
1 材料
1. 1 动物
健康雌性 SD 大鼠，SFP 级，200 只，体质量 180～ 200 g，由北京斯贝福生物技术有限公司提供，许可证 号：SCXK（京）2019－0010。大鼠饲养于清洁恒温环 境，平均温度 25 ℃，平均湿度 37%，15～20 次/h 全新 风，光照12 h明、12 h暗。
1. 2 主要药物、试剂与仪器
定坤丹口服液（山西广誉远国药有限公司，批号： 4112011002）；定坤丹水蜜丸（山西广誉远国药有限公 司，批号：3282011096）；补佳乐戊酸雌二醇片（Bayer， 批号：583A）。 大鼠孕酮（P）ELISA 试剂盒（批号：202104）、大鼠 雌二醇（E2）ELISA 试剂盒（批号：202104）、大鼠促卵泡 刺激素（FSH）ELISA 试剂盒（批号：202104）、大鼠黄体 生成素（LH）ELISA 试剂盒（批号：202104）、大鼠前列 腺素 E2（PGE2）ELISA 试剂盒（批号：202104）、大鼠前 列腺素 F2α（PGF2α）ELISA试剂盒（批号：202104）均购 自江苏酶免实业有限公司；C5 微孔板检测仪（美国 伯腾）。
2 方法
2. 1 去势大鼠模型的建立
全部大鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组、 定坤丹水蜜丸组（水蜜丸组）以及定坤丹口服液高剂量 组（高剂量组）、定坤丹口服液中剂量组（中剂量组）、定 坤丹口服液低剂量组（低剂量组）。雌性大鼠腹腔注射 10%水合氯醛溶液麻醉，仰卧位固定于大鼠板上，剃毛 消毒后，沿腹部正中线距阴道口 2. 5 cm 处切开，使用 剪刀在正中定位处打开约 1. 5～2 cm 的皮肤切口。除 空白组外，其余大鼠分离两侧输卵管进行结扎，结扎后 完整摘除两侧卵巢，分两层缝合切口，用无菌生理盐水 冲洗伤口，碘伏消毒；空白组大鼠仅切开，不结扎。术 后连续 3 d 各组大鼠腹腔内注射青霉素 4 万 IU/d 以预 防感染，6 d 后拆线，结扎术后大鼠可正常存活即为去 势大鼠模型复制成功。
2. 2 分组给药
术后 1 周开始灌胃给药，按人与大鼠体表面积换 算系数确定给药剂量。高、中、低剂量组分别灌胃定坤 丹 口 服 液 10、5、2. 5 mL/kg，阳性对照组予补佳乐 0. 12 mg/kg，水蜜丸组给予定坤丹水蜜丸 1. 75 g/kg，空 白组和模型组大鼠灌服等剂量蒸馏水，每天灌胃 1 次， 连续灌胃4周。每周称量大鼠体质量，调整给药剂量。
2. 3 标本采集
末次给药结束后，禁食不禁水 12 h，10% 水合氯醛 溶液麻醉后进行大鼠腹主动脉取血，一部分放入抗凝 管中测定凝血功能，另一部分放入 EP 管中室温静置 2 h后3 000 r/min离心20 min，取上清，制备血清，−20℃ 保存。摘取大鼠子宫，并称取子宫的质量，计算子宫指 数。子宫组织用生理盐水冲洗后，立刻置于 10% 甲醛 中固定。 子宫指数 = 子宫质量（g）/体质量（g）×100%
2. 4 ELISA 法检测
大鼠血清中 FSH、LH、E2、P、PGE2、 PGF2α含量 严格根据 ELISA 试剂盒说明书步骤进行操作， 检测大鼠血清中 FSH、LH、E2、P、PGE2 和 PGF2α 的 含量。
2. 5 HE染色观察
大鼠子宫组织病理变化 生理盐水冲洗后，立刻将子宫置于 10% 的甲醛溶 液中固定，石蜡包埋，切片，HE 染色，200 倍光镜下观 察子宫内膜损伤等病理形态学的变化情况。
3 结果
3. 1 各组大鼠一般状态及子宫指数比较
造模期间，空白组大鼠皮毛光滑，摄食、饮水规 律，体质量持续稳定增长；模型组大鼠毛发暗淡无光 泽 ，情 绪 易 激 惹 ，体 质 量 较 空 白 组 明 显 增 加（P < 0. 01）。给药后，与模型组相比，中剂量组大鼠体质 量继续增加（P < 0. 01），水蜜丸组大鼠体质量有增加 趋势，但差异无统计学意义（P > 0. 05）；定坤丹口服 液各剂量组与水蜜丸组大鼠相比，差异无统计学意 义（P > 0. 05）。模型组大鼠子宫指数较空白组明显 降低（P < 0. 01）；定坤丹口服液各剂量组、水蜜丸组 及阳性对照组大鼠子宫指数较模型组显著升高（P < 0. 01）；中、低剂量组与水蜜丸组相比，差异无统计学 意义（P > 0. 05）。见表 1。
3. 2 各组大鼠凝血功能指标比较
模型组大鼠PT、TT较空白组显著升高（P < 0. 01）； 高剂量组大鼠 PT值较模型组降低（P < 0. 05），高、中剂 量组及水蜜丸组的 TT值较模型组显著降低（P < 0. 01， P < 0. 05）；定坤丹口服液各剂量组与水蜜丸组大鼠 PT 及TT值相比，差异无统计学意义（P > 0. 05）。见表2。
3. 3 各组大鼠性激素指标比较
与空白组相比，模型组大鼠血清 P、E2、PGE2 水平 显著降低，FSH、LH、PGF2α 水平显著增高（P < 0. 01）； 与模型组相比，定坤丹口服液各剂量组、水蜜丸组大鼠 血清 P、E2、PGF2α 水平均不同程度升高，LH、FSH、 PGE2 水平均不同程度降低（P < 0. 05，P < 0. 01），其中 中剂量组大鼠的 FSH 水平以及高、中剂量组大鼠的 PGE2 水平较水蜜丸组改变更明显（P < 0. 05），其余指 标无统计学意义（P > 0. 05）。
3. 4 各组大鼠子宫病理形态的比较
与空白组比较，模型组大鼠子宫明显萎缩，内膜上 皮及子宫腺上皮细胞呈小圆柱状，质核比下降，子宫内 膜层变薄，间质细胞呈纺锤形，细胞变小，肌层萎缩变 薄；与模型组相比，各给药组大鼠子宫均有不同程度的 萎缩，水蜜丸组及定坤丹口服液高剂量组子宫萎缩情 况减轻，间质细胞排列密集，两者相比无显著差异。
4 讨论
定坤丹始于清乾隆年间，为宫廷秘方，乾隆帝因其 可“安定坤富”而将其命名为“定坤丹”。该方由红参、 鹿茸、西红花等中药组成，由四君子汤、四物汤、逍遥 散、八珍益母丸、理中丸、柴胡疏肝散等经典名方化裁， 共行补益气血、滋补肝肾、调经舒郁、健脾行气、温中祛 寒、活血止痛之功效，用于气血两虚、气滞血瘀所致的 月经不调、行经腹痛、崩漏下血、赤白带下、血晕血脱、 产后诸虚和骨蒸潮热等。 现代药理研究发现，定坤丹在原发性卵巢功能不 全（POI）的治疗中具有良好的效果［2-3］。POI 的发病原 因包括遗传学、免疫学、医源性、环境和生活方式等因 素［4］。LH、FSH、E2、P作为女性卵巢功能不全的早期标 志物，在疾病的发生过程中可表现为 LH、FSH 含量升 高，E2、P含量降低，其中 FSH 最为敏感［5］。女性的卵泡 发育、性激素水平的调节以及正常生殖功能的维持主 要依靠下丘脑－垂体－卵巢轴，E2、FSH 和 LH 是女性 生殖轴的重要激素［6］，其中 E2受 LH 和 FSH 的调节，共 同维护女性生殖系统正常的生理功能［7］。有研究表 明，前列腺素与子宫收缩有密切关系，其中研究较多的 是 PGF2α 和 PGE2，PGF2α 可促进子宫收缩，而 PGE2 则对子宫收缩产生抑制作用［8-9］。 本实验通过摘除大鼠卵巢复制雌性去势大鼠模 型，使大鼠处于卵巢功能缺失的状态，并在此基础上进 行定坤丹口服液与定坤丹水蜜丸的药效对比。实验结 果表明，定坤丹口服液和水蜜丸均能不同程度升高大 鼠血清 P、E2、PGE2 水平，降低 LH、FSH、PGF2α 水平， 证明定坤丹能够通过调节大鼠雌激素紊乱的状态从而 促进卵巢功能的恢复，另外给药后 TT降低也说明出定 坤丹能够促进凝血功能的改善。 水蜜丸是指药材细粉以水和蜂蜜按适当比例混匀 为黏合剂制成的药丸，其作用缓慢，药效持久，优点在 于使用的蜂蜜量较少，含水量低，可便于长期保存和服 用。口服液剂是以中药汤剂为基础，提取中药内的有 效成分，并按照注射剂的加工工艺合成的口服液体制 剂，具有服用剂量小、味道好、吸收快、奏效迅速和质量 稳定等优点。通过本实验对定坤丹口服液和水蜜丸进 行药效学对比，结果显示二者具有相似的治疗效果，因 此可以在不同的应用场景根据使用人群的偏好进行选择。
作者:张润涛 李佳 高乔 节笑笑 刘聪 倪艳 康永 张爱荣 赵惠淳 单位:山西省中医药研究院 山西广誉远国药有限公司