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摘要：将草本泥炭用稀硫酸预处理后，经纤维素酶酶解、酵母发酵产乙醇，通过单因素实验和正交实验优化发酵工艺。确定最佳发酵工艺为：酵母加量０．１５％、发酵液ｐＨ值４．０、发酵温度３８℃、发酵时间５４ｈ，在此条件下，草本泥炭发酵产乙醇的酒精度可达到３．８２％ｖｏｌ。
关键词：草本泥炭；稀硫酸；发酵；乙醇
淀粉质原料［１］、糖蜜原料［２］已广泛用于制备生物乙醇，以木质纤维素为原料的第二代生物乙醇对实现碳中和目标具有重要意义［３－４］。草本泥炭由多种草本植物残体组成，含有丰富的纤维素、半纤维素，适合于生物乙醇的制备。张学才等［５］对酸法水解泥炭工艺及其水解液发酵制乙醇及单细胞蛋白进行了研究，发现酵母在泥炭水解液配制的培养基中繁殖力很强，且发酵滤液中含有乙醇。目前，我国的泥炭矿床类型主要以富营养草本泥炭为主，木本泥炭为辅，藓类泥炭次之［６］，常被用作园艺基质［７］和有机肥料［８］。路亚楠等［９］研究发现，酸预处理能使泥炭的比表面积显著增大、孔隙率提高，适合微生物定殖；李珺等［１０］研究发现，稀硫酸预处理泥炭能降解１．１７％纤维素、４．４４％半纤维素及９．３７％木质素；黄俊等［１１］研究发现，糖化发酵是木质纤维素生产燃料乙醇的关键步骤，对乙醇产量起决定性作用。在此，作者将草本泥炭用稀硫酸预处理后，经纤维素酶酶解、酵母发酵产乙醇，通过单因素实验和正交实验优化发酵工艺，拟为乙醇生产提供新途径。
１实验
１．１材料、试剂与仪器
草本泥炭，取自吉林；耐高温酿酒酵母，安琪酵母股份有限公司。Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７、乙醇、硫酸、Ｃ６Ｈ１２Ｏ６，分析纯，天津化学试剂三厂。高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；ＵＶ７６５型紫外可见分光光度计，上海精科。
１．２草本泥炭酶解发酵产乙醇
将草本泥炭粉碎，过１００目筛；称取草本泥炭粉末１０．０ｇ，按固液比１∶５（ｇ∶ｍＬ）加入５％稀硫酸于锥形瓶中，密封后置于１００℃水浴中加热１２０ｍｉｎ，取出冷却至室温；调节ｐＨ值至４．８，加入纤维素酶３．０ｇ，于５０℃下磁力搅拌８ｈ，然后迅速置于沸水浴中使纤维素酶失活，即得酶解液；调节酶解液ｐＨ值，加入一定量的耐高温酿酒酵母，充分搅拌后，置于一定温度水浴中发酵一定时间，采用紫外可见分光光度计测定发酵液在６００ｎｍ处吸光度，根据乙醇标准曲线计算乙醇体积，按下式计算酒精度（１００ｍＬ溶液中乙醇的体积，％ｖｏｌ）。本实验用酒精度反映草本泥炭酶解发酵产乙醇的效率。酒精度＝Ｖ０×ｃ×１００Ｖ×Ｖ１×ρ×１００％式中：Ｖ０为根据标准曲线计算得到的乙醇体积，ｍＬ；ｃ为乙醇标准溶液浓度，此处为０．０２ｇ•ｍＬ－１；Ｖ为样品溶液的体积，ｍＬ；Ｖ１为样品溶液稀释后的体积，ｍＬ；ρ为２０℃时乙醇密度，此处为０．７９ｇ•ｍＬ－１。
１．３发酵工艺优化
１．３．１单因素实验采用单因素实验分别考察酵母加量（０．０５％、０．１０％、０．１５％、０．２０％、０．２５％）、发酵液ｐＨ值（４．０、４．５、５．０、５．５、６．０）、发酵温度（３４℃、３６℃、３８℃、４０℃、４２℃）、发酵时间（４８ｈ、５４ｈ、６０ｈ、６６ｈ、７２ｈ）对草本泥炭发酵产乙醇的影响。１．３．２正交实验在单因素实验的基础上，选择酵母加量、发酵液ｐＨ值、发酵温度、发酵时间为考察因素，以酒精度为评价指标，进行Ｌ９（３４）正交实验进一步优化草本泥炭发酵产乙醇工艺，每组实验做３个平行。
２结果与讨论
２．１单因素实验结果
２．１．１酵母加量对草本泥炭发酵产乙醇的影响在发酵液ｐＨ值为４．０、发酵温度为４０℃、发酵时间为４８ｈ的条件下，考察酵母加量对酒精度的影响，结果如图１所示。在发酵过程中，酵母可以将发酵液中的还原糖转化为乙醇［１２］。由图１可知，随着酵母加量的增加，酒精度先升高后降低；当酵母加量为０．０５％时，酒精度为１．８６％ｖｏｌ，此时酵母不能充分利用发酵液中的糖分，即对草本泥炭的利用率较低；当酵母加量增至０．１５％时，酒精度达到最高，为２．４２％ｖｏｌ；当酵母加量继续增至０．２５％时，酒精度降至１．９９％ｖｏｌ，这是由于，过量的酵母会导致菌种老化［１３］。因此，酵母加量以０．１５％较为适宜。２．１．２发酵液ｐＨ值对草本泥炭发酵产乙醇的影响在酵母加量为０．１５％、发酵温度为４０℃、发酵时间为４８ｈ的条件下，考察发酵液ｐＨ值对酒精度的影响，结果如图２所示。在发酵过程中，适宜的ｐＨ值有助于酵母的繁殖［１４］。由图２可知，随着发酵液ｐＨ值的增大，酒精度逐渐降低；当发酵液ｐＨ值为４．０时，酒精度最高，为２．８７％ｖｏｌ；当发酵液ｐＨ值为６．０时，酒精度降至２．０１％ｖｏｌ。表明当酸性环境逐渐减弱时，过高的发酵液ｐＨ值会使酵母活性降低，不利于乙醇的合成［１５］。因此，发酵液ｐＨ值以４．０较为适宜。２．１．３发酵温度对草本泥炭发酵产乙醇的影响在酵母加量为０．１５％、发酵液ｐＨ值为４．０、发酵时间为４８ｈ的条件下，考察发酵温度对酒精度的影响，结果如图３所示。发酵温度是发酵过程中最重要的影响因素，温度过低不利于酵母的繁殖，温度过高会导致酵母死亡［１６］。由图３可知，随着发酵温度的升高，酒精度呈先升高后降低的趋势，当发酵温度为３８℃时，酒精度达到最高，为３．１４％ｖｏｌ；当发酵温度升至４２℃时，酒精度迅速降至２．６４％ｖｏｌ。这是由于，较高的发酵温度使酵母细胞活力下降，导致还原糖利用不完全，乙醇产量降低［１７］。因此，发酵温度控制在３８℃较为适宜。２．１．４发酵时间对草本泥炭发酵产乙醇的影响在酵母加量为０．１５％、发酵液ｐＨ值为４．０、发酵温度为３８℃的条件下，考察发酵时间对酒精度的影响，结果如图４所示。由图４可知，随着发酵时间的延长，酒精度先迅速升高后缓慢降低；当发酵时间为４８ｈ时，发酵未完成，酒精度为２．９７％ｖｏｌ；当发酵时间延长至６０ｈ时，酒精度达到最高，为３．６２％ｖｏｌ；继续延长发酵时间至７２ｈ时，酒精度降至３．３９％ｖｏｌ。这是由于，发酵时间过长，杂菌形成优势菌群，不利于酵母的繁殖［１８］，且部分乙醇转化为酯类物质，导致酒精度降低［１９］。因此，发酵时间控制在６０ｈ较为适宜。
２．２正交实验结果
由表１可知，最佳工艺组合为Ａ１Ｂ１Ｃ２Ｄ１，即酵母加量０．１５％、发酵液ｐＨ值４．０、发酵温度３８℃、发酵时间５４ｈ。此外，由极差分析可知，各因素对酒精度影响的大小顺序为：Ｃ＞Ｄ＞Ａ＞Ｂ，即发酵温度＞发酵时间＞酵母加量＞发酵液ｐＨ值，其中发酵温度对草本泥炭发酵产乙醇的影响最大。
２．３最佳工艺验证
将１０．０ｇ草本泥炭粉末经稀硫酸预处理和纤维素酶酶解后，在酵母加量为０．１５％、发酵液ｐＨ值为４．０、发酵温度为３８℃、发酵时间为５４ｈ的最佳发酵工艺下进行验证实验，酒精度达到３．８２％ｖｏｌ，优于正交实验的最佳预测值３．６７５９％ｖｏｌ，说明正交实验优化的发酵工艺可行。
３结论
将草本泥炭用稀硫酸预处理后，经纤维素酶酶解、酵母发酵产乙醇，通过单因素实验和正交实验优化得到的发酵工艺为：酵母加量０．１５％、发酵液ｐＨ值４．０、发酵温度３８℃、发酵时间５４ｈ，在此条件下，酒精度可达到３．８２％ｖｏｌ。
作者:李丽萍 马力通 杨世波 单位:内蒙古科技大学化学与化工学院 生物煤化工综合利用内蒙古自治区工程研究中心