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摘要：为了建立更加快速高效的测定肉制品中核苷酸的方法，文章以６种５′－单核苷酸钠盐（肌苷－５′－单磷酸二钠（５′－ＩＭＰ）、鸟苷－５′－单磷酸二钠（５′－ＧＭＰ）、胞苷－５′－单磷酸二钠（５′－ＣＭＰ）、腺苷－５′－单磷酸二钠（５′－ＡＭＰ）、尿苷－５′－单磷酸二钠（５′－ＵＭＰ）、黄苷－５′－单磷酸二钠（５′－ＸＭＰ））为标准品，制备混合标准溶液，通过色谱条件优化，建立了可同时测定这６种５′－单核苷酸的ＨＰＬＣ方法。具体色谱条件：Ｃ１８色谱柱，以甲醇（２％～１５％）和０．０５ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钾溶液（９８％～８５％）为流动相进行梯度洗脱，紫外检测波长２５０ｎｍ，柱温３０℃，进样量１０μＬ。在该检测条件下，６种５′－单核苷酸均能较好分离，线性相关系数均大于０．９９。将该方法用于冷鲜调理猪肉进行验证，发现其中的６种５′－单核苷酸均能一次性检出，每种５′－单核苷酸的加标回收率在８９％～１２６％之间，ＲＳＤ值在０．０４％～２．２１％之间。方法学验证结果表明，该方法操作便捷，准确度高，重现性好，可以用于肉制品中核苷酸含量的测定。
关键词：５′－单核苷酸；高效液相色谱法；肉制品
５′－单核苷酸广泛存在于蘑菇、水产品及畜禽肉中，目前发现的５′－单核苷酸主要有６种，包括肌苷－５′－单磷酸（５′－ＩＭＰ）、鸟苷－５′－单磷酸（５′－ＧＭＰ）、胞苷－５′－单磷酸（５′－ＣＭＰ）、腺苷－５′－单磷酸（５′－ＡＭＰ）、尿苷－５′－单磷酸（５′－ＵＭＰ）、黄苷－５′－单磷酸（５′－ＸＭＰ）［１－２］。其中，５′－ＩＭＰ、５′－ＧＭＰ、５′－ＡＭＰ、５′－ＸＭＰ是增味核苷酸，具有良好的协同增鲜作用，将其与鲜味氨基酸按照一定比例混合可极大提升产品的鲜味，从而达到改善食品风味和调节食欲的效果［３］。核苷酸对人体代谢具有积极意义，在配方奶粉中常添加多种核苷酸促进婴儿生长发育［４］。肉品中含有丰富的呈味核苷酸，不仅对增加肉品风味感知的厚度和复杂性具有重要贡献，还可以评价肉制品品质及新鲜度［５－６］。因此，测定肉类食品中５′－单核苷酸种类和含量对指导食品加工过程中的精准调控具有重要意义。目前，国内外对核苷酸的测定方法主要有紫外分光光度法、毛细管电泳法、亲水色谱法、离子色谱法和液相色谱法等［７］。其中，以液相色谱法最为常见。目前已有用液相色谱法测定肉中核苷酸含量的相关研究，但主要是检测原料肉中的５′－ＩＭＰ、５′－ＧＭＰ及其关联产物的含量。王卫等［８］用ＨＰＬＣ法建立了５′－ＩＭＰ含量的测定方法，并通过不同选育猪肉对该方法进行了验证；吴韬等［９］运用超高效液相色谱－四极杆飞行时间串联质谱检测了牦牛肉中５′－ＩＭＰ和５′－ＧＭＰ的含量；唐修君等［１０］通过ＨＰＬＣ探讨了冷藏和冷冻期间鸡肉中５′－ＩＭＰ、肌苷和次黄嘌呤含量变化，为解释鸡肉的风味损失提供了依据。但目前可同时检测肉制品中多种５′－单核苷酸的研究较少，而且检测成本高，为肉制品品质评价和控制带来诸多不便。因此，本文拟建立可同时测定肉制品中多种５′－单核苷酸的测定方法，以期为快速高效地检测肉制品中的核苷酸含量提供借鉴。
１材料与方法
１．１材料
冷鲜调理猪后腿（瘦肉）、调理猪里脊、风干牦牛肉、四川腊肉：均购于沃尔玛超市。
１．２主要试剂
核苷酸标准品：５′－ＧＭＰ、５′－ＣＭＰ、５′－ＵＭＰ、５′－ＩＭＰ、５′－ＡＭＰ、５′－ＸＭＰ，均为色谱纯，购于美国Ｓｉｇｍａ公司。甲醇：色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司。氢氧化钾、磷酸二氢钾、三氯乙酸：均为分析纯，购于成都市科隆化学品有限公司。
１．３仪器
Ａｇｌｉｅｎｔ１１００高效液相色谱仪美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司；ＨｙｐｅｒｓｉｌＯＤＳ２－Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５．０μｍ）大连依利特分析仪器有限公司；ＴＧＬ－１６５０高速冷冻离心机四川蜀科仪器有限公司；万能粉碎机ＩＫＡ公司；ｐＨ计上海仪天仪器股份有限公司；溶剂过滤器天津津腾实验设备有限公司；ＫＱ３２００ＤＢ数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司。
１．４标准曲线
分别准确称取６种核苷酸标准品各５０．０ｍｇ，用纯水溶解后定容至５０ｍＬ，分别配制浓度为１ｍｇ／ｍＬ的母液，分别量取不同体积的母液混合并稀释成系列浓度，５′－ＩＭＰ浓度范围为４～２００μｇ／ｍＬ，５′－ＸＭＰ浓度范围为１．６～１２８μｇ／ｍＬ，其他４种核苷酸浓度范围为０．６４～３２μｇ／ｍＬ。分别取不同浓度的混合核苷酸标准液１０μＬ上机测定，根据保留时间，以峰面积与所对应的核苷酸浓度作图，并绘制标准曲线。
１．５样品的制备
以冷鲜调理猪后腿肉为原料，均匀取肉眼５０ｇ，剁碎后置于液氮中冷冻１０ｍｉｎ，利用超微粉碎机将其粉碎成粉，准确称取２０．００ｇ肉粉，置于５０ｍＬ塑料离心管中，加入ＴＣＡ溶液，混匀，于４℃冰箱中放置２ｈ，取出后以５０００ｒ／ｍｉｎ的转速离心１０ｍｉｎ，将上清液转入１００ｍＬ烧杯中，用３ｍｏｌ／Ｌ的ＫＯＨ溶液调ｐＨ至６．５，用定性滤纸过滤至５０ｍＬ容量瓶中，超纯水定容摇匀，样液过０．４５μｍ滤膜，用ＨＰＬＣ进样分析，外标法定量，平行测定３次。
１．６结果计算
样品中核苷酸的计算公式如下：Ｘ＝Ｃ×Ｖｍ×１０００。式中：Ｘ表示样品中核苷酸的含量，ｍｇ／ｇ；Ｃ表示由标准曲线上查出的样品测定液中相当于某种核苷酸的浓度，μｇ／ｍＬ；Ｖ表示样品提取液的体积，ｍＬ；ｍ表示样品的质量，ｇ。
１．７色谱条件
采用ＥｌｉｔｅＣ１８色谱柱（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ×５μｍ），流动相Ａ为纯甲醇，流动相Ｂ为０．０５ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钾溶液，对样品进行梯度洗脱（洗脱程序见表１），柱温：３０℃，流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ，进样量：１０μＬ。在此色谱条件的基础上，对其他色谱参数进行优选
１．８滋味活性值
（ｔａｓｔｅａｃｔｉｖｅｖａｌｕｅ，ＴＡＶ）ＴＡＶ＝样品中某呈味物质的绝对浓度该物质的味道阈值。
１．９数据处理与分析
采用Ｅｘｃｅｌ软件对数据进行处理，结果以“平均值±标准差”表示。
２结果与分析
２．１样品前处理条件的优化
在核苷酸提取方法上，常用高氯酸作为核苷酸的提取剂，但是核苷酸在强酸性条件下不稳定［１１］。为优化核苷酸的提取方法，本文采用三氯乙酸（ＴＣＡ）作为核苷酸的提取剂。ＴＣＡ是食品检测中常用的蛋白质沉淀剂［１２－１３］，本实验考察了不同浓度的ＴＣＡ溶液（５％、１０％、１５％）沉淀肉中蛋白质的作用。结果发现３种浓度的ＴＣＡ处理的样品无明显差异，溶液均出现分层，下层为白色沉淀，上清液近乎无色透明，无明显絮状悬浮物，静置后稳定性好。由于样品中的核苷酸含量已经确定，而ＴＣＡ溶液的主要作用是除杂和促进蛋白质沉淀，所以基于完全去除样品中蛋白质的目的和检测成本控制，选择５％的ＴＣＡ溶液作为蛋白质沉淀剂。基于５％的ＴＣＡ溶液，本实验还考察了添加不同体积的提取液对５′－单核苷酸测定的影响。由于猪肉中除５′－ＩＭＰ和５′－ＸＭＰ含量较高外，其他核苷酸含量均较低，过多的提取剂不利于检测出所有核苷酸，因此最终确定５％ＴＣＡ的添加量为４０ｍＬ。
２．２色谱条件的选择
２．２．１紫外检测波长的优选紫外吸收波长的选择直接决定待测组分能否被仪器检出，不同物质的紫外最大吸收波长不同，在最大吸收波长处测定可以尽量避免其他物质的干扰，因此合适的波长可直接衡量检测方法的准确度和可靠性［１４］。通过紫外分光光谱扫描，得出６种核苷酸的特征光谱，由图１可知，５′－ＩＭＰ、５′－ＧＭＰ、５′－ＣＭＰ、５′－ＡＭＰ、５′－ＸＭＰ、５′－ＵＭＰ的最大吸收波长在２４８～２６０ｎｍ之间。在该波长范围内同时测定６种核苷酸，６种核苷酸均有紫外吸收，但每种核苷酸的吸收强度不同。通过比较不同波长下混合核苷酸的出峰情况，发现当检测波长为２５０ｎｍ时，６种核苷酸的信号值较大，各峰之间能很好分离，且峰形对称。２．２．２流动相洗脱方法的优选基于６种核苷酸之间的性质差异，本实验分别使用了甲醇－磷酸二氢钾溶液等度洗脱和梯度洗脱方法，结果表明，等度洗脱（甲醇浓度分别为５％、１０％、１５％、２０％、５０％）时，部分核苷酸色谱峰出现不同程度的拖尾和拓宽，相邻的色谱峰之间交叉掩盖，色谱峰分离度差。按表１进行梯度洗脱时，由图２可知，在最佳紫外波长２５０ｎｍ条件下，系统平衡快，基线稳定，标准品和样品中６种核苷酸均能完全分离，样品中待测组分与其他杂质峰分开，降低了杂质峰的干扰，分析时间短，峰形对称。６种核苷酸标准品出峰顺序和保留时间分别为５′－ＣＭＰ：４．９９２ｍｉｎ，５′－ＵＭＰ：５．７９３ｍｉｎ，５′－ＧＭＰ：７．９４５ｍｉｎ，５′－ＩＭＰ：８．４２３ｍｉｎ，５′－ＸＭＰ：９．１４８ｍｉｎ，５′－ＡＭＰ：１４．２８７ｍｉｎ。调理猪肉样品中核苷酸出峰顺序和保留时间为５′－ＣＭＰ：４．９９０ｍｉｎ，５′－ＵＭＰ：５．８４３ｍｉｎ，５′－ＧＭＰ：８．０６３ｍｉｎ，５′－ＩＭＰ：８．５２６ｍｉｎ，５′－ＸＭＰ：９．３０９ｍｉｎ，５′－ＡＭＰ：１４．４２３ｍｉｎ，样品和标准品中待测组分保留时间基本相同。
２．３方法学验证
２．３．１标准曲线在１．７的液相色谱条件下，以不同浓度的混合核苷酸标准品溶液分别进样，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。６种核苷酸标准曲线见图３，回归方程、相关系数、浓度范围、样品检测限见表２。结果显示，在一定浓度范围内，６种核苷酸浓度和色谱峰面积之间相关性良好。２．３．２精密度取同一调理猪后腿肉样品，在１．７条件下连续进样５次。由表３可知，样品中５′－ＣＭＰ、５′－ＵＭＰ、５′－ＧＭＰ、５′－ＩＭＰ、５′－ＸＭＰ和５′－ＡＭＰ多次重复测定的相对标准偏差为１．０８％、０．３６％、３．３５％、０．２９％、１．７８％和０．３８％，表明该方法测定调理猪肉中的核苷酸具有较高的精密度。２．３．３重现性取同一调理猪后腿肉样品６份，按１．５操作制备供试样液，再在１．７色谱条件下测定呈味核苷酸含量，结果见表４。６种核苷酸变异系数在０．４０％～４．３７％范围内，表明该方法测定调理猪肉中的核苷酸具有较高的重复性（ｎ＝６）。２．３．４样品稳定性取同一调理猪后腿肉样品，分别在放置１，３，６，１０，１３ｈ后测定６种核苷酸含量，结果见表５。实验表明，样品溶液在１０ｈ内５′－ＣＭＰ、５′－ＵＭＰ、５′－ＧＭＰ、５′－ＩＭＰ、５′－ＸＭＰ、５′－ＡＭＰ的ＲＳＤ分别为４．４２％、０．８０％、６．３５％、０．８４％、２．９９％、０．８２％（ｎ＝３），稳定性良好，因此，样品制备后最好在１０ｈ内完成测定。２．３．５加标回收率在调理猪后腿肉样品中分别准确加入不同含量的核苷酸标准混合液，各测定３次，计算回收率和变异系数，结果见表６。结果显示，５′－ＣＭＰ、５′－ＵＭＰ、５′－ＧＭＰ、５′－ＩＭＰ、５′－ＸＭＰ、５′－ＡＭＰ的回收率在８９％～１２６％范围内，变异系数在０．０４％～２．２１％之间，表明该方法测定调理猪肉中的核苷酸具有较高的精准度，可应用于肉制品中核苷酸的分析检测。．
２．４不同肉制品中核苷酸的种类及含量测定
通过本研究建立的方法，在３种肉制品中均检测出６种５′－单核苷酸。由表７可知，调理猪里脊中５′－ＩＭＰ含量最高，其他５种核苷酸含量均较低，５′－ＩＭＰ对调理猪里脊滋味贡献最大，这与赵艳等［１５］的研究结果相同。风干牦牛肉相比于其他两种肉制品５′－ＩＭＰ、５′－ＧＭＰ、５′－ＡＭＰ含量均较高，这可能是形成风干牦牛肉特殊滋味的重要原因。５′－ＵＭＰ在风干牦牛肉和四川腊肉中含量均最高，这可能与其特殊的加工工艺有关，５′－ＵＭＰ本身无增味的功效，但具有维持免疫系统功能、促进肠道成熟等作用［１６］。
２．５鲜味评价
水溶性成分造就了肉制品复杂的滋味，通常用呈味强度值（ｔａｓｔｅａｃｔｉｖｉｔｙｖａｌｕｅ，ＴＡＶ）考察物质对滋味的贡献大小［１７－１８］。当ＴＡＶ大于１时，表明该物质对肉制品的整体滋味有重要贡献，值越大贡献越大，反之则影响不大。５′－ＧＭＰ、５′－ＩＭＰ、５′－ＡＭＰ是典型的增味核苷酸［１９］，由表８可知，３种肉制品中，调理猪里脊和风干牦牛肉中５′－ＩＭＰ的ＴＡＶ＞１，５′－ＧＭＰ和５′－ＡＭＰ的ＴＡＶ＜１，说明５′－ＩＭＰ对调理猪里脊和风干牦牛肉的滋味具有重要贡献，而５′－ＧＭＰ和５′－ＡＭＰ对滋味的贡献较小；呈味核苷酸对四川腊肉滋味的贡献不明显，其风味主要来源于挥发性成分、粗蛋白、脂肪酸及氨基酸等物质［２０－２１］。
３结论
本实验建立了可同时测定６种５′－单核苷酸的ＨＰＬＣ方法，具体色谱条件：Ｃ１８色谱柱，以甲醇（２％～１５％）和０．０５ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钾溶液（９８％～８５％）为流动相进行梯度洗脱，紫外检测波长２５０ｎｍ，柱温３０℃，进样量１０μＬ。在该检测条件下，６种５′－单核苷酸均能较好分离，线性相关系数均大于０．９９。通过将该方法用于冷鲜调理猪肉进行验证，发现其中的６种５′－单核苷酸均能一次性检出，每种５′－单核苷酸的加标回收率在８９％～１２６％之间，ＲＳＤ值在０．０４％～２．２１％之间。方法学验证结果表明，该方法操作便捷，准确度高，重现性好，能用于肉制品中核苷酸含量的测定。
作者:李慧 张应杰 母运龙 钱琴 彭海川 张鹏程 张崟 单位:成都大学肉类加工四川省重点实验室