前言：寻找写作灵感？中文期刊网用心挑选的维氏气单胞菌致病性与耐药性，希望能为您的阅读和创作带来灵感，欢迎大家阅读并分享。
维氏气单胞菌隶属弧菌科(Vibrionaceae)气单胞菌属(Aeromonas)，为革兰阴性杆菌，兼性厌氧型。气单胞菌广泛存在于各种水体生态系统中，比如淡水、沿海水域以及污水中［1］，能够经常从腹泻的人类［2］以及出血性败血症的鱼类中分离到［3］。研究表明，嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌以及维氏气单胞菌为3种主要的致病性气单胞菌，涵盖了气单胞菌中85%的临床病症来源［4］。目前在水产动物养殖上，对于气单胞菌致病性的研究主要为嗜水气单胞菌［5］，对维氏气单胞菌的致病性及分布关注并不多。团头鲂(MegalobramaamblycephalaYih)隶属硬骨鱼纲鲤形目鲤科鳊亚科，是我国重要的草食性经济鱼类之一，具有味美、生长快、抗病力强等特点，是江苏省南部地区的主要淡水养殖品种。出血病是团头鲂养殖过程中危害最严重、造成经济损失最大的病害，通常认为由嗜水气单胞菌引起［6］，使用抗生素进行防治［7］。然而，随着养殖密度的扩大、养殖水体的恶化以及抗生素的滥用，团头鲂出血病呈常发、难治的态势。本研究在江苏省常州市武进区某团头鲂养殖塘刚刚出现出血病后，即对该塘口的不同生态位进行细菌分离、鉴定及人工感染试验，同时分析菌株的毒力基因及耐药性，以期为团头鲂出血病的发病机理及分子流行病学研究提供基础数据，为该病的防控提供一定的理论基础。 1材料与方法 1．1发病塘口及菌株 2010年7月11日常州武进某团头鲂池塘出现大批团头鲂死亡的情况。塘口检查发现病鱼游动缓慢，摄食减少，肠道内食糜少或无，体表腹部、尾鳍以及鳃部有出血点，部分有大面积的皮肤溃烂。解剖检查发现一部分病鱼肝脏发白、肿大，一部分有溶血性腹水。采集该池塘病鱼21尾，利用选择性培养基分离细菌，分离位点包括鱼的肠道、体表黏液、鳃、腹腔、肝脏、肾脏等。同时采集该池塘的水样、底泥，利用选择性培养基分离水体、浮游生物和底泥中的细菌。 1．2主要试剂及培养基 细菌生化鉴定管、药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，RS培养基［8］、LB培养基为本课题组配制。 1．3细菌的分离、筛选 病鱼肠道、体表黏液、鳃、腹腔、肝脏、肾脏等位点用接种环划线RS固体培养基;将池塘水经25μm的膜或者滤纸过滤后，水体位点的菌株用过滤后的水涂RS培养基;浮游生物位点则是将滤纸浸入无菌生理盐水、振荡后，划线RS固体培养基;底泥经无菌生理盐水稀释后涂RS培养基。RS培养接种后，28℃培养24h。随机挑选5个单菌落划线接种LB固体平板。用氧化酶、接触酶、O/F、鸟氨酸脱羧酶对单菌落作进一步筛选，鸟氨酸脱羧酶阳性为维氏气单胞菌区别与其他气单胞菌的主要生化特性［9］。对4个生化指标都为阳性的菌株接种LB液体，28℃培养24h后，用15%液体甘油－80℃保存备用。 1．4维氏气单胞菌鉴定 1．4．1细菌DNA模板的制备 将保存在－80℃中的菌株，接种LB液体培养基，28℃培养18h，离心收集菌体，参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌总DNA，作为DNA模板。 1．4．2维氏气单胞菌管家基因测序与系统发育树的构建 根据气单胞菌16SrDNA和管家基因gyrB，通过构建系统发育树鉴定细菌菌株。16SrDNA引物为AER－F(5'－CTACTTTTGCCGGCGAGCGG－3');AER－R(5'－TGATTCCCGAAGGCACTCCC－3')［10］由上海生工合成。反应条件:94℃变性2min;接着30个循环:94℃30s，58℃30s，72℃60s;最后72℃延伸10min。取2μLPCR产物，用1．2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，片段大小953bp。有目的片段则判断该菌株为气单胞菌属。管家基因gyrB扩增引物:gyrB－3F(5'－TCCGGCGGTCTGCACGGCGT－3')和gyrB－14R(5'－TTGTCCGGGTTGTACTCGTC－3')［11］由上海生工合成。反应条件:94℃变性2min;接着30个循环:94℃30s，59℃30s，72℃90s;最后72℃延伸10min。取2μLPCR产物，用1．2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下拍照，片段大小为1100bp。PCR产物纯化后送上海生工序列测序。系统发育树的构建:将测序菌株的gyrB序列用Blast软件与GenBank数据库中相关的亲近物种进行相似性分析，并用Mega4．1中的Neighbor－Joining法构建系统进化树。 1．4．3维氏气单胞菌的生化特性 将菌株接种生化培养管后，28℃培养24h，观察并记录结果。生化特性包括赖氨酸脱羧酶、苯丙氨酸转氨酶、硝酸盐(还原)、硫化氢、明胶、葡萄糖、乳糖、β－半乳糖苷(ONPG)、山梨醇、赤鲜醇、卫矛醇、丙二酸盐等。 1．5维氏气单胞菌的人工感染 对确定为维氏气单胞菌的菌株进行人工感染试验，验证其致病性。具体方法为:将菌株单菌落接种LB液体培养基，28℃培养20h，将细菌浓度稀释为109CUF/mL。每个菌株腹部肌肉注射5尾鱼，鱼体重(100±3)g，注射剂量为每100g鱼体重0．5mL菌株。然后观察鱼的发病、死亡情况，统计24h、48h的死亡率，并对人工感染后具有典型症状的死鱼进行拍照、解剖以及优势菌的分离鉴定。 1．6维氏气单胞菌毒力基因的检测 用PCR检测气单胞菌的2种主要毒力基因。溶血素基因hly，片段大小597bp。引物为hly－F(5'－GGCCGGTGGCCCGAAGATACGGG－3')和hly－R(5'GGCGGCGCCGGACGAGACGGG－3')［12］。反应条件:94℃变性3min，接着30个循环:92℃30s，65℃30s，72℃60s;最后72℃延伸10min。细胞兴奋性肠毒素基因alt，片段大小442bp。引物为alt－F(5'－TGACCCAGTCCTGGCACGGC－3')和alt－R(5'－GGTGATCGATCACCACCAGC－3')［13］。反应条件:94℃变性3min;接着30个循环:92℃30s，60℃30s，72℃60s;最后72℃延伸10min。 #p#分页标题#e# 1．7维氏气单胞菌的药敏试验 吸取28℃培养24h的维氏气单胞菌的菌悬液100μL，均匀涂布LB平板，每个菌株药敏做3个重复，将选取的11种药敏纸片贴于平板上，于28℃恒温培养24h后测量抑菌圈直径，判断菌株对抗生素的敏感性。 2结果与分析 2．1维氏气单胞菌的筛选、鉴定 通过RS培养基和氧化酶、接触酶、O/F等气单胞菌主要生化特性的初筛选，以及鸟氨酸脱羧酶阳性等生化鉴定，得到56株疑似维氏气单胞菌。将56株疑似维氏气单胞菌菌株进行了管家基因的扩增，PCR产物纯化后送上海生工测序，扩增片段大小1100bp(图1)。将测序的结果在GenBank中进行同源性检索，并将它们与部分具有登录号的标准株进行系统发育树分析，最终确认该56株细菌都为维氏气单胞菌，部分菌株系统发育树见图2。不同生态位维氏气单胞菌聚类在一起。 2．2不同生态位维氏气单胞菌的分布情况 从不同生态位共分离得到56株维氏气单胞菌，其中肠道中菌株数量最多，为19株;其次为鳃、体表黏液、底泥、浮游生物，分别为13、12、6、3株;腹腔、肝脏、肾脏和水中很少，都只有1株维氏气单胞菌。 2．3维氏气单胞菌的生化特性 绝大部分菌株具有维氏气单胞菌标准株的生化特性，表现为赖氨酸脱羧酶(+)、苯丙氨酸转氨酶(－)、硝酸盐(还原，+)、硫化氢(－)、明胶(+)、葡萄糖(+)、乳糖(－)、β－半乳糖苷(+)、山梨醇(－)、赤鲜醇(－)、卫矛醇(－)、丙二酸盐(－)。不同生态位维氏气单胞菌的生化指标没有显著差异(表1)。 2．4维氏气单胞菌的人工感染试验 攻毒后24h死亡率为0、20%、40%、60%、80%、100%的菌株数量分别为35、13、4、3、0株，攻毒后48h死亡率为0、20%、40%、60%、80%、100%的菌株数量分别为11、19、9、10、5、2株。2/3死鱼具有发病症状，1/4死鱼体表症状明显，体表、尾鳍、腹鳍、腹部等部位具有明显的斑块状出血，有的死鱼腹部、下颌处具有许多点状出血，解剖后，腹腔有不同程度的腹水，肝、脾等红肿。死鱼的病变情况与自然病例相似。表2为部分菌株人工感染死亡率。不同生态位菌株致死率没有明显差异。 2．5维氏气单胞菌部分毒力基因的检测 细胞兴奋性肠毒素基因alt的检测率为26．8%，溶血素基因hly的检测率为48．2%，同时具有2种毒力基因的菌株占19．6%。图3、图4为部分菌株2种毒力基因扩增条带。由于有的生态位菌株数量很少，单独区分各个生态位的毒力基因进行比较，有些生态位菌株数量太少，不能进行统计。将生态位划分为外界环境(底泥、浮游生物、水体)和鱼体环境(体表黏液、鳃、肠道等)进行比较可以发现:外界环境中的alt、hly、alt+hly的检测率分别只有10%、40%、10%，鱼体环境中alt、hly、alt+hly的检测率分别为30．4%、47.8%、21．7%，要明显大于外界环境(表3)。 2．6维氏气单胞菌的药敏试验结果 维氏气单胞菌对氨苄西林耐药率为100%，对复方新诺明、诺氟沙星、洛美沙星耐药率也分别高达94．6%、94．6%、91．1%，对恩诺沙星、左氟沙星、氧氟沙星耐药率也在70%以上。敏感性方面，维氏气单胞菌对多黏菌素、庆大霉素的敏感率分别为64．3%、48．2%，对其他的抗生素敏感性都非常低(表4)。比较不同生态位的菌株耐药性结果显示:外界环境中菌株对多黏菌素、庆大霉素、阿米卡星的敏感率分别高达100%、100%、80%，而对应的鱼体菌株敏感率分别只为19.6%、37．0%、10．9%。综合11种抗生素敏感率S外环境、S鱼体的比例分别为36．7%、10．7%，耐药率R外环境、R鱼体的比例分别为40%、67．2%(图5)。 3讨论 RS选择性培养基以及氧化酶、接触酶、鸟氨酸脱羧酶等对维氏气单胞菌具有很好的筛选性。池塘中共分离到56株维氏气单胞菌，分布数量肠道(19)＞鳃(13)＞体表黏液(12)＞底泥(6)＞浮游生物(3)＞腹腔=肝脏=肾脏(1)。说明维氏气单胞菌主要寄生在肠道、鳃以及体表黏液等位点。 通过塘口病鱼细菌的分离鉴定以及攻毒试验，发现维氏气单胞菌存在致病菌株，能够引起团头鲂细菌性出血病，为细菌性出血病的致病菌之一。这一结果与Song等［14］、Rahman等［15］的研究结果是一致的。Song等认为维氏气单胞菌为一种人类的条件致病菌，能够引起腹泻和肠外细菌感染，比如伤口感染、败血症等［14］。Rahman等从患有肠炎的病鱼中分离得到了14株维氏气单胞菌，证明了它们具有致病性，能够引起鱼体出血［15］。 目前对于细菌的鉴定主要为16SrDNA。但是也存在一些局限性，如由于16SrDNA的高度保守型，且包含的信息量较少，使得相似率很高的属内物种不能得到很好的区别，又如由于16SrDNA基因横向转移等现象，使得由此基因计算的系统发育结果具有很大的局限性［16］。gyrB管家基因是指所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。Yáńez等比较了gyrB与16SrDNA两种方法在气单胞菌系统发育树构建方面的应用，得出了gyrB与16SrDNA具有相同的建树结果;但是在种间的鉴定方面，gyrB具有更高的分辨能力［11］。本试验通过gyrB测序，基因比对与具有登录号的已知菌株相似率大都在98%以上，具有很高的分辨率。 维氏气单胞菌与嗜水气单胞菌一样具有多种毒力因子。由于其致病机理的复杂性，没有一种单独的毒力因子能够解释。对于多种毒力因子的综合分析已经成为检测潜在致病菌的一种手段［17］。Yousr等对维氏气单胞菌的hly毒力基因检测，检测率为67%［18］。Castilho等对不同来源(临床、食物、环境等)气单胞菌各个种的毒力基因的分布情况进行了研究，认为气单胞菌各个种(包括维氏气单胞菌)存在并表达多种毒力基因，都能够成为潜在的致病菌［19］。Rahman等从患有肠炎的病鱼中分离得到了14株维氏气单胞菌，与水体环境、腹泻儿童中分离到的气单胞菌进行了生化分型、毒力基因、凝血反应等比较，结果显示，鱼体上分离到的菌株具有全部的毒力基因，环境中菌株具有部分毒力基因［15］。本研究通过对维氏气单胞菌2种毒力基因进行了PCR检测，检测率分别为26．8%(alt)和48．2%(hly)。与国外维氏气单胞菌毒力基因检测率相比，本试验中的2种毒力基因的检测率明显偏低。(alt+、hly+)、(alt+、hly－)、(alt－、hly+)、(alt－、hly－)4种毒力基因菌株型的48h致死率分别为41．8%、35%、32．3%、29．2%，说明死亡率与这2种毒力基因可能存在一定的正相关性。#p#分页标题#e# 本试验中不同生态位毒力基因的分布不同，鱼体环境菌株的alt、hly、alt+hly检测率都要明显大于外界环境中毒力基因的检测率，说明这2种毒力基因在感染鱼体病原菌致病机理方面可能具有重要的意义。国外也有相关的对于不同生态位点的维氏气单胞菌毒力基因的检测。Rahman等［15］比较了鱼体、环境和人类腹泻物上Cytotoxin、Hly、Toxin等3种毒力基因的差异，结果显示，鱼体上的这3种毒力基因的检测率均为100%，要明显大于其他2个环境中毒力基因的检测率，与本试验的结果一致，即鱼体上分离到的菌株具有更强的毒力基因携带率，说明鱼体上菌株具有更高的潜在致病性。 Das等对15株气单胞菌的耐药性进行了研究，认为所有菌株对氨苄青霉素敏感，对链霉素耐药，93.3%的菌株对红霉素、磺胺嘧啶、新生霉素耐药，而对利福平、氯霉素的耐药率只分别为66%、20%［20］。黎炯等对1株罗非鱼维氏气单胞菌的药敏试验表明，分离菌株对米诺环素、链霉素、头孢克洛、头孢唑啉、氧氟沙星、恩诺沙星等抗生素敏感，对乙酰螺旋霉素、苯唑青霉素、麦迪霉素、四环素等抗生素则具有耐药性［5］。本试验中维氏气单胞菌对多黏菌素、庆大霉素敏感，对其他抗生素大多表现耐药性。说明本试验中的56株维氏气单胞菌耐药谱较广。值得注意的是，不同生态位维氏气单胞菌耐药性存在一个规律，即鱼体(体表黏液、鳃、肠道、肝脏、腹腔)上的维氏气单胞菌耐药谱明显高于外界环境(水体、底泥、浮游生物)中的菌株。说明能够侵入鱼机体使其发病的菌株大多为耐药谱较广的菌株。 综上所述，维氏气单胞菌作为气单胞菌属的一个种，与嗜水气单胞菌一样也具有致病性，能够引起鱼类出血死亡;池塘维氏气单胞菌主要分布于鱼体表黏液、鳃以及肠道中;部分维氏气单胞菌具有alt、hly2种毒力基因，且2种毒力基因可能与致病性相关;鱼体上分离到的维氏气单胞菌的毒力基因携带率要大于外界环境;维氏气单胞菌对大多数抗生素具有耐药性，且鱼体上分离到的菌株的耐药谱要显著大于外界环境中菌株对药物的耐药谱。